The Korean Society For Biotechnology And Bioengineering
[ Research Paper ]
Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 32, No. 4, pp.256-264
ISSN: 1225-7117 (Print) 2288-8268 (Online)
Print publication date 31 Dec 2017
Received 22 Sep 2017 Revised 23 Oct 2017 Accepted 25 Oct 2017
DOI: https://doi.org/10.7841/ksbbj.2017.32.4.256

모시잎추출물의 단회 · 반복투여 독성 및 복귀돌연변이능 평가

정상원1 ; 황진택1, 2, *
1한국식품연구원 대사영양연구본부 영양식이연구단
2과학기술연합대학원 식품생명공학과
Single and Repeated Dose Oral Toxicity Study and Bacterial Reverse Mutation Test of Boehmeria nivea (L.) Gaud. Extract in Sparague-Dawley rats
Sangwon Chung1 ; Jin-Taek Hwang1, 2, *
1Korea Food Research Institute, Wanju 55365 jthwang@kfri.re.kr
2Department of Food Biotechnology, University of Science & Technology, Daejeon 305-333

Correspondence to: *Korea Food Research Institute, Wanju 55365, Korea Tel: +82-63-219-9315, Fax: +82-63-219-9876 e-mail: jthwang@kfri.re.kr


Copyright Ⓒ 2017 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering

Abstract

Boehmeria nivea (L.) Gaud. has been widely cultivated in Southeast Asia area including Korea and used for disease prevention in Korea. However, safety studies have not been reported yet. In this study, we performed the single dose toxicity test, repeated dose toxicity test and bacterial reverse mutation test to evaluate the safety of 70% ethanolic extract of Boehmeria nivea (L.) Gaud. (EBN). In the single dose toxicity test, EBN was orally administered to Sprague-Dawley (SD) rats at the concentrations 0, 500, 1,000, and 2,000 mg/kg for 14 days. EBN did not cause mortality and LD50 was assessed to be over 2,000 mg/kg. Similarly, SD rats were administered at doses of 0, 500, 1,000 and 2,000 mg/kg for 14 days in the repeated dose toxicity test, and EBN also caused neither mortality, unusual signs of general behavior, nor significant changes in bodyweight, food intake, or organ weights. Some hematological parameters such as white blood cell, lymphocyte, and large unstained cell and serum biochemical estimates including total protein significantly changed but in a non-dose dependent manner. Other estimates were not significantly different between treatment and control groups. Moreover, EBN was negative in reverse mutation test using Salmonella Typhimurium (TA98, TA100, TA1535, and TA1357) and Escherichia coli (WP2uvrA) regardless of application of the metabolic activating system (S9 mix). Therefore, we suggest that EBN could be used as nontoxic material for functional food development.

Keywords:

ethanolic extract of Boehmeria nivea (L.) gaud, single dose toxicity, repeated dose toxicity, reverse mutation test, sprague-dawley rats

1. INTRODUCTION

모시풀 (Boehmeria nivea (L.) Gaud.)은 쐐기풀목 쐐기풀과 (Urticeae)의 여러해살이풀로, 동아시아가 원산지이며 우리나라에서는 충남 한산, 전남, 경북, 제주 등에서 주로 재배되고 있다. 예로부터 모시풀의 껍질과 줄기는 섬유재료로 옷을 만드는데 사용되어 왔고 뿌리와 잎은 한방 치료에 사용되었으며 식품으로서는 떡을 만들어 섭취하거나 전통 차로 섭취 되어오고 있는데 최근 많은 연구자들을 통하여 풍부한 생리활성 물질과 질병 예방 효과가 과학적으로 보고되고 있다 [1,2]. 모시잎에 존재하는 주요 생리활성 물질은 페놀류 및 플라보노이드로 함유량이 각각 149 mg/g과 49 mg/g으로 높은 수준이며, 칼슘, 칼륨, 마그네슘의 무기질과 비타민 E 등의 영양성분도 풍부하다 [3]. 특히, 항산화 활성을 나타내는 지표 중의 하나인 DPPH radical 소거능은 우리나라에서 약재로 많이 사용되는 모과잎, 은행, 오디보다 높아 항산화 효과가 뛰어난 것을 알 수 있다 [3]. 또한 모시잎이 폐암과 간암 세포의 성장을 저해하고 [4], 지질대사를 개선시켜 고지혈증을 예방하고 지방 축적을 억제하여 비만을 억제하는 효과를 나타낸다는 연구결과도 보고되고 있어 [5], 여러 가지 대사성 및 만성질환 예방을 위한 식품소재로서의 활용가치가 기대되고 있다.

모시풀과 같은 천연물을 이용한 식·의약품 시장은 규모가 전 세계적으로 1,000조원에 이르고 연간 8~10%씩 성장하고 있다 [6]. 천연물로 건강기능식품 및 의약품을 개발하면, 합성물질보다 개발기간이 짧고 안전하며, 합성물질과는 달리 하나의 천연물에 다양한 유효성분 및 기능이 존재해 질병 발생과 관련된 대사 기전에 작용하는 임상적 효과가 강화된다는 이점 때문에 세계 각국에서 연구가 활발히 진행되고 있다 [7]. 미국은 NCI에서 1,550속, 3,390종 식물과 114,000개 추출물을 확보하여 관리하고 있으며 천연화합물 중심으로 항암제, AIDS 등의 치료제를 연구 중에 있고, 건강보조식품 또한 시장규모가 현재 200억 달러 이상으로 추정되고 있다 [7]. 유럽의 독일이나 프랑스에서도 천연물 추출물의 자체 또는 은행잎 혹은 겨우살이와 같은 분획물을 이용하여 천연물 식·의약품 시장을 성장시키고 있다 [8]. 우리나라에서도 천연물을 활용한 의약품 개발 및 건강기능식품개발이 활발하게 진행 중에 있으며 이에 따라 각 천연물의 안전성에 대한 과학적 근거가 중요시되고 있다 [9,10]. 그러나 아직까지 각각의 천연물에 대한 안전성 연구는 미흡한 실정인데 한 예로, 쥐방울과 (Aristolochiaeae)에 함유되어 있는 아리스톨로킨산 (Aristolochic acid)은 항염증제로 여러 나라에서 오랫동안 사용되어 온 천연물인데, 최근 사람이 아리스톨로킨산이 다량 함유된 다이어트 제제를 장기 복용했을 때 신장독성과 발암성이 나타난다고 보고된 적이 있다 [11]. 때문에 천연물을 활용하여 의약품으로 사용하거나 기능성 식품의 원료로 사용할 때에는 안전성에 대한 명확한 근거가 필수적이다.

따라서 본 연구에서는, 모시잎추출물이 건강기능식품 개발에 활용될 수 있도록 기초 근거 자료를 생산하고자 독성평가 및 미생물 복귀돌연변이 시험을 실시하여 안전성을 평가하였다.


2. MATERIALS AND METHODS

2.1. 시험 시료 및 제조

본 실험에 사용한 모시풀 (Boehmeria nivea (L.) Guad.)은 서천군청으로부터 공급받았으며 본 연구진에서 선행연구로 게재된 논문에서와 동일하게 추출물을 제조하였는데 모시잎을 건조 후 분말화한 후에 70% 주정을 이용하여 추출하였고 동결건조 후에 분말 상태로 사용하였으며 이것을 모시잎추출물 (EBN)이라 명명하였다 [12]. 본 연구에서 실시된 시험은 비임상시험관리기준 (Good Laborotory Practice, GLP)을 충족하는 안전성 평가기관으로 인정받은 한국건설생활환경시험연구원 (서울 금천구)에 의뢰하여 실시하였으며 식품의약품안전처의 기준에 따라 수행되었다.

2.2. 단회투여 독성시험

모시잎추출물의 단회투여 독성시험을 위해, (주)오리엔트바이오 (경기도 성남시)에서 Sprague-Dawley (SD) 계통의 7주령 암수 랫드를 공급받아 사용하였다. SD 계통의 랫드는 일반 독성시험에 널리 사용되어 비교할 수 있는 근거가 풍부하여 선택하였다 [13,14]. 입수된 실험동물은 암수 각 22마리로, 입수 시 체중은 수컷 198.6~219.0 g, 암컷 169.5~182.3 g이었으며, 입수 후 7일 간 순화기간을 두어 순화기간 중 특이한 증상을 보이지 않은 건강한 동물만 시험에 사용하였다. 투여개시 전일 측정한 체중은 수컷 232.8~251.5 g, 암컷 182.5~197.3 g이었고, 이때의 체중을 순위화하여 무작위법으로 대조군과 3개의 시험군 (500, 1,000 및 2,000 mg/kg)으로 암수 각 5마리씩 배정하여 총 40마리를 사용하였다. 투여량은 단회투여독성에서 일반적으로 사용되는 상한 값인 2,000 mg/kg을 고용량군으로 설정한 뒤, 공비를 2로 두어 나머지 군을 설정하였다 (0, 500, 1,000 및 2,000 mg/kg). 대조군에는 멸균증류수가 투여되었다. 투여 전 하루 밤 동안은 절식시킨 후 투여 당일 오전에 경구투여용 존데를 이용하여 강제로 단회 경구 투여 하였고, 투여 3~4시간 후에는 사료를 재공급하였다. 모든 실험동물에 대해 일반증상관찰과 체중측정을 실시하였다. 투여 당일에는 투여 30분 후 및 이후 6시간까지 매 시간마다 일반증상을 관찰하고, 이후 14일까지는 매일 1회 실시하였다. 또한 투여 전, 투여 후 1, 4, 7 및 14일에 체중을 측정하였다. 투여 후 14일째에는 실험동물을 부검하여 육안으로 모든 장기를 검사하였다. 본 시험은 식품의약품안전처 ‘비임상시험관리기준 (고시 제2009-183호)’과‘의약품등의독성시험기준 (고시 제2009-116호)’의 단회투여독성시험에 따라 수행되었다.

2.3. 반복투여 독성시험

모시잎추출물의 반복투여 독성시험을 위해, (주)오리엔트바이오 (경기도 성남시)에서 Sprague-Dawley (SD) 계통의 5주령 암수 랫드를 공급받아 사용하였다. 입수된 실험동물은 암수 각 25마리로, 입수 시 체중은 수컷 130.9~152.6 g, 암컷 104.3~117.1 g이었으며, 입수 후 7일 간 순화기간을 두어 순화기간 중 일반증상을 보인 건강한 동물만 시험에 사용하였다. 투여개시 전일 측정한 체중은 수컷 201.7~228.4 g, 암컷 147.1~170.9 g이었고, 이때의 체중을 순위화하여 무작위법으로 대조군과 3개의 시험군 (500, 1,000 및 2,000 mg/kg)으로 암수 각 5마리씩 배정하여 총 40마리를 사용하였다. 투여량은 단회투여 독성시험 결과 모든 시험군에서 시험물질에 의한 이상증상 및 독성변화가 관찰되지 않아, 상한값 2,000 mg/kg을 고용량군으로 설정한 뒤, 공비를 2로 두어 나머지 군을 0, 500, 1000 mg/kg으로 설정하였다. 1회/일, 7일/주, 2주간, 오전 중에 경구 투여용 존데를 이용하여 강제로 경구 투여하였다. 2주 동안 반복투여를 하면서 모든 실험동물의 일반증상, 체중변화, 사료섭취량 등을 관찰하고, 안검사, 요검사, 혈액학적 검사, 혈액생화학적 검사 및 부검을 실시하였다. 투여 직후 사망여부, 증상의 종류 및 정도를 1일 1회 기록하는 것으로 일반 증상을 관찰하였고, 체중은 입수 시, 군 분리 시, 투여 시, 투여 후 주 1회, 그리고 부검일에 측정하였다. 사료섭취량은 투여 개시 시 및 주 1회에 측정하였는데, 체중측정일 전날 사료 급여량을 측정하고 체중 측정일 당일에 잔량을 측정하여 1일 사료섭취량을 마리당 평균섭취량 (g/rat/day)으로 산출하였다.

안검사는 군 분리시와 투여 마지막 주에 눈의 외관을 육안으로 관찰하는 것으로 시행하였고, 요검사는 투여 마지막 주에 시험군별로 동물을 대사케이지에서 신선요를 채집한 뒤 요당 (glucose), 유로빌리노겐 (urobilinogen), 빌리루빈 (bilirubin), 아질산염 (nitrite), 케톤체 (ketone body), 백혈구 (leukocyte), 요비중 (specific gravity), 단백질 (protein), 잠혈 (Occult blood), pH를 요검사용 시험지 (SIEMENS)와 요자동분석장치 (CliniTek 50, SIEMENS, Germany; MAI-050-01)를 이용하여 측정하였고, 육안으로 요색조를 관찰하였다.

혈액학적 검사는 WBC (White blood cell count), RDW (Red cell distribution width), RBC (Red blood cell count), PLT (Platelet), HGB (Hemoglobin conc.), MPV (Mean Platelet Volume), HCT (Hematocrit), 백혈구감별계산, MCV (Mean corpuscular volume), LUC (Large unstained cells), MCH (Mean corpuscular hemoglobin), Retic (Reticulocyte), MCHC (Mean corpuscular hemoglobin conc.)를 검사하였다. 본 항목은 동물을 하룻밤 절식시킨 후 CO2 가스로 마취한 후 개복하여 복대동맥의 혈액을 채취해 항응고제 EDTA-2K가 있는 tube에 수집하여 혈액분석기 (ADVIA 2120, SIEMENS, Germany; MAI-105-01)를 이용하여 검사하였다.

혈액생화학적 검사는 채혈한 혈액을 10분간 3,000 rpm으로 원심분리하여 얻은 혈청으로 혈액생화학검사기 (Hitachi7180, HITACHI, Japan; MAI-059-01)를 사용하여 분석하였다. 검사 항목은 AST (Aspartate aminotransferase), ALB (Albumin), ALT (Alanine aminotransferase), BIL (Total bilirubin), ALP (Alkaline phosphatase), A/G ratio (Albumin-globulin ratio), GGT (Gamma(γ)-glutamyl transferase), TG (Triglyceride), LDH (Lactate dehydrogenase), UA (Uric acid), BUN (Blood urea nitrogen), Ca (Calcium), CRE (Creatinine), IP (Inorganic phosphorus), GLU (Glucose), Cl (Chloride), CHO (Total cholesterol), Mg (Magnesium), TP (Total protein), Na (Sodium), CPK (Creatine phosphokinase), K (Potassium)이다.

부검은 투여 종료 후 실시하였고 모든 장기를 육안으로 관찰하였다. 고환, 전립선, 난소, 자궁, 비장, 간장, 부신, 신장, 심장, 폐, 뇌, 흉선에 대해서는 전자저울로 중량을 측정하였다. 본 시험은 식품의약품안전처 ‘비임상시험관리기준 (고시 제2009-183호)’, ‘의약품등의독성시험기준 (고시 제2009-116호)’ 및 OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 407 ‘Repeated Dose 28-day Oral Toxicity Study in Rodents’를 바탕으로 수행되었다.

2.4. 미생물 복귀돌연변이시험

시험균주는 히스티딘 요구성 균주인 Salmonella typhimurium TA98, TA100, TA1535, TA1357 (Molecular Toxicology Inc., NC, USA)과 트립토판 요구성 균주인 Escherichia coli WP2 uvrA (Molecular Toxicology Inc., NC, USA)를 사용하였다. 균주는 균현탁액 0.8 mL와 DMSO 0.07 mL에 분주동결 방법으로 -80°C에서 보존하였다. 시험은 37°C에서 20분 배양 후 관찰하는 preincubation법으로써 대사활성화계를 사용하는 대사활성화법과 대사활성화계를 사용하지 않는 직접법을 병행하였다. 대사활성화효소로는 S9 mix (Molecular Toxicology Inc., NC, USA)로, SD male 랫드에 유도물질 (Aroclor 1254)을 도살 5일 전 단회 복강 투여 후 간 조직을 균질화하여 유도한 후 -80°C에 보관하여 사용하였다. 적용농도는 농도결정시험에 기반하여 5,000 μg/plate를 최고농도로 하여 대사활성화법 및 직접법 모두 공비를 2로 두고 5단계로 나누어 각 0,313, 625, 1,250, 2,500, 5,000 μg/plate로 적용하였으나, 양성 대조물질의 경우, 시험 균주의 종류에 따라 최고 농도를 다르게 설정하였다. 각 plate는 시험물질용액 0.05 mL, 균현탁액 0.1 mL, Top agar 2.0 mL와 대사활성화법의 경우 S9 mix 0.5 mL, 직접법의 경우 0.1 M Phosphate buffered saline 0.5 mL가 첨가된 조건에서 37°C에서 48시간 동안 배양되었고, 시험물질은 65°C에서 30분간 가열하여 저온살균한 후, 멸균증류수에 용해하여 조제하였다. 콜로니 수는 콜로니카운터 (SUNTEX Model 570)를 사용하여 90 mm 직경의 plate에 생성된 콜로니 수를 계측하였고, 생육저해유무는 육안으로 관찰하였다. 균 농도는 표준작업수순서의 단계희석법에 의한 생균수 측정방법에 따라 측정하였다 [15]. 무균시험은 최소 글루코즈 한천배지에 0.1 mL의 S9 mix 및 시험물질용매를 각각 top agar와 함께 중층시켜 37°C에서 48시간 배양 후 관찰하였다. 시험결과는 대사활성계의 유, 무에 관계없이 최소 1개 균주에서 플레이트 당 복귀된 집락 수가 농도 의존적이거나 하나 이상의 농도에서 음성 대조군에 비해 2배 이상 명확하고 재현성 있는 증가를 나타낼 때 양성으로 판정하였다 [16]. 본 시험은 식품의약품안전처 ‘비임상시험관리기준 (고시 제 2009-183호)’, ‘의약품등의독성시험기준 (고시 제2009-116호)’, OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 471 ‘Bacterial Reverse Mutation test’ 및 한국건설생활환경시험연구원 표준작업수순서 (KCL/MIC)에 따라 수행되었다.

2.5. 통계처리

모든 통계분석은 SPSS 12.0K 프로그램을 사용하였다. Oneway ANOVA test를 이용하여 군간 유의성을 확인하였고, 군간 비교는 등분산이 인정된 경우 Duncan test, 등분산이 인정 되지 않은 경우는 Dunnett’s T test를 사용하였다.


3. RESULTS AND DISCUSSION

3.1. 단회투여 독성시험

모시잎추출물의 단회투여독성 및 개략적인 치사량을 알아보기 위해 SD계통 암수 랫드를 사용하여 시험물질을 단회 경구 투여하고, 투여 후 14일간 일반증상, 체중변화, 사망 유무 및 부검소견을 관찰하였다. 실험기간 동안 사망동물은 없었으며, 특이한 일반증상을 보이는 실험동물도 관찰되지 않았다(data not shown).

체중은 시험물질 투여 전, 투여 후 1, 4, 7 및 14일에 측정하였고 변화를 관찰한 결과, 정상적인 체중 증가만 있었고 대조군과 시험물질 투여군 간에 유의한 변화는 관찰되지 않았다 (Table 1). 실험 14일째 모든 생존동물의 장기를 부검한 결과, 수컷 대조군 중 2마리의 실험동물에서 양측 고환의 소형화가 발견된 사례가 있었다. 하지만 시험물질 투여 군에서는 발견되지 않아, 시험물질의 영향은 아닌 것으로 판단하였다 (data not shown). 그 외 모든 시험동물에서는 특이한 소견이 관찰되지 않았다. 본 시험의 결과에 따라 모시잎추출물의 반수치 사량 (LD50)은 >2,000 mg/kgb.w.로 판단하였다.

Body weight of SD rats in single dose toxicity study of EBN

3.2. 반복투여 독성시험

모시잎추출물의 반복투여 독성시험을 14일간 SD계통 암수 랫드를 사용하여 실시하였다. 실험기간 동안 특이한 일반증상을 보이거나 사망한 시험동물은 없었다 (data not shown). 체중과 (Table 2) 사료섭취량에서도 (Table 3) 유의미한 변화는 없었다. 안 검사와 요 검사 결과, 암컷과 수컷 모든 군에서 이상소견 혹은 시험물질과 관련된 변화는 관찰되지 않았다 (data not shown).

Body weight of SD rats in repeated dose toxicity study of EBN

Food consumption of SD rats in repeated dose toxicity study of EBN

혈액학적 검사결과 (Table 4), 암컷 최고용량 투여군 (2,000 mg/kg)의 백혈구 (WBC)와 림프구 (LY)는 대조군, 500 및 1,000 mg/kg 투여군에 비해 유의하게 증가하였다 (WBC p<0.01, LY p<0.05). LUC (Large unstained cell) 또한 500 및 1,000 mg/kg 투여군과 비교하였을 때 유의하게 증가하였다 (p<0.01). 하지만, 용량의존성을 보이지 않아 모시잎추출물의 영향은 아닌 것으로 판단하였다. 그 외 시험군의 시험항목에서는 유의한 변화가 관찰되지 않았다.

Hematological estimates of SD rats in repeated dose toxicity study of EBN

혈액생화학적 검사결과 (Table 5), 수컷의 모든 시험물질 투여군의 총 단백질 (TP)이 대조군과 비교했을 때 유의하게 감소하였고 (p<0.05), 암컷 최고용량 투여군 (2,000 mg/kg)의 Cl (Chloride)가 대조군, 500 및 1,000 mg/kg 투여군과 비교하여 유의하게 증가하였다 (p<0.01). 그 외 시험군의 시험항목에서는 유의한 변화는 관찰되지 않았다. 식물 추출물의 독성 평가에서는 간과 신장의 기능과 관련된 지표 변화가 중요한데, AST (Asparate amonitransferase), ALT (Alanine aminotransferase), ALP (Alkaline phosphatase)가 증가한 경우 간 질환이나 간 독성을 일으킨다고 알려져 있다 [17]. 하지만 본 연구의 암컷과 수컷의 모든 시험 군에서 AST, ALT, ALP의 유의한 변화는 없었으므로, 모시잎추출물이 간 기능 손상에는 영향을 미치지 않는 것으로 판단된다. 반면, 총 단백질 (TP), 알부민 (ALB), 글로불린의 감소는 간의 합성 기능의 저하 혹은 간세포 기능이 손상된 것을 나타낸다 [17]. 본 연구에서의 수컷의 총 단백질 수치가 유의하게 낮아졌지만, 0, 500, 1,000, 2,000 mg/kg 투여군 총 단백질 수치가 각각 6.0±0.1, 5.6±0.1, 5.7±0.2, 5.6±0.3 g/dL으로, 용량 의존적이지 않아 독성의 영향은 아닌 것으로 생각된다. 또한 암컷 2,000 mg/kg 투여군의 Cl 수치가 유의하게 증가하였지만 (103±1.1 mmol/L), 4주간의 반복투여 독성평가에서 나타날 수 있는 Cl 수치 범위 (81.5~105.5 mmol/L)에 속하기 때문에 독성의 영향은 아닌 것으로 판단하였다 [18]. 그 외, 모든 시험동물에 대한 부검결과, 이상소견은 관찰되지 않았다 (data not shown). 장기중량 측정 결과에서도 암컷의 2,000 mg/kg 투여군 심장 상대 장기 중량 (체중 대비 장기 중량%)이 1,000 mg/kg 투여군에 비해 약 0.1% 감소한 것 이외에 유의한 변화는 관찰되지 않았다 (Table 6).

Serum biochemical estimates of SD rats in repeated dose toxicity study of EBN

Organ weight of SD rats in repeated dose toxicity study of EBN

3.3. 미생물 복귀돌연변이시험

모시잎추출물의 발암성 유발 여부를 알아보기 위해 히스티딘 요구 성 균주인 Salmonella typhimurium TA98, TA100, TA1535 및 TA1357과 트립토판 요구 성 균주인 Escherichia coli WP2uvrA을 사용하여 유전독성시험 중 미생물 복귀돌연변이 시험을 실시하였다. 시험물질과 대사활성계 (S9 mix)의 무균성을 알아보기 위해 무균시험을 실시했으나, 미생물에 의한 오염은 없었다. 또한, 양성대조군 및 음성대조군의 각각의 균주에서 유발된 복귀집락수가 양성 및 음성으로 판단한 수치 범위 내에 있으므로 본 시험은 적절히 실시되었다고 판단하였다 (data not shown). Table 7에는 Salmoella Typhimurium 4개 균주 및 Escherichia coli 균주를 이용하여 복귀돌연변이 집락 수를 관찰한 결과를 나타내었다. 돌연변이 유발성 여부의 판정은 다음의 두 가지로 결정한다. 최소 1개 균주에서 대사활성계의 유무에 관계없이 플레이트 당 복귀된 집락수가 농도 의존성을 나타내거나, 하나 이상의 농도에서 재현성 있는 증가를 나타내지만, 음성대조군에 비해 2배 이상 명확하게 증가할 때 양성으로 판정한다 [16]. 본 시험에서는 대사활성계의 유무에 관계없이 모든 균주에서 균의 생육저해가 나타나지 않았다. 또한, 각 균주에서 대사활성계의 유무에 관계없이 시험물질 농도가 증가함에 따라 집락수가 농도 의존적으로 증가하지 않았고, 양성으로 판단할 만큼 수가 증가되지 않았다.

Bacterial reverse mutation assay of SD rats in bacterial reverse mutation assay of EBN


4. CONCLUSION

본 시험에서는, 모시잎추출물의 건강기능식품으로서의 개발 가능성을 확인해 보고자 SD계통의 암수 랫드를 사용하여 단회 및 반복투여 독성시험을 실시하였고, Salmonella typhimurium의 히스티딘 요구 성 균주인 TA98, TA100, TA1535 및 TA1357과 Escherichia coli의 트립토판 요구 성 균주인 WP2 uvrA을 사용하여 미생물 복귀돌연변이시험을 실시하여 모시 잎추출물에 대한 안전성을 평가하였다. 단회 투여 독성시험에서 SD계통 암수 랫드에 0, 500, 1,000, 2,000 mg/kg의 농도로 14일간 시험물질을 단회 경구 투여 한 후 일반증상, 체중변화, 사망 유무 및 부검소견을 관찰한 결과, 사망동물은 없었으며, 특이한 일반증상을 보이는 실험동물 또한 관찰되지 않았다. 시험물질 투여 군에서 체중변화나 특이한 부검소견이 발견되지 않아, 시험물질의 영향은 아닌 것으로 판단하였다. 이에 따라 모시잎추출물의 반수치사량 (LD50)은 2,000 mg/kgb.w. 이상으로 판단하였다. 모시잎추출물을 같은 농도로 14일간 반복 경구 투여한 결과, 실험기간 동안 사망동물 및 특이한 일반증상은 관찰되지 않았으며, 시험물질 투여군의 사료 섭취량과 체중도 유의하게 증가하지 않았다. 안 검사와요 검사에서도 이상 소견이 발견되지 않았다. 혈액학적 검사결과 모시잎추출물 투여군에서 백혈구 (WBC), 림프구 (LY), LUC (Large unstained cell)가 증가하였으나 용량의존성을 보이지 않았고, 혈액생화학적 검사 결과 모시잎추출물 투여군에서 총 단백질 수치가 감소하고 Cl수치가 높아졌으나 용량 의존적이지 않거나 정상수치 범위에 속하기 때문에 모시잎 추출물의 독성에 의한 것이라고는 판단할 수 없었다. 그 외 모든 시험동물에 대한 부검결과 이상소견은 관찰되지 않았고, 장기중량 측정결과에서도 특이한 변화는 관찰되지 않았다. 또한 복귀돌연변이 시험에서는 대사활성계의 유무에 관계없이 모시잎추출물을 최고농도까지 처리했으나 집락수의 현저한 증가가 발견되지 않았다. 이상의 결과를 종합해 볼때, 모시잎추출물은 독성을 나타내지 않고 복귀돌연변이를 유발하지 않는 것으로 사료된다.

Acknowledgments

본 연구는 서천군청 및 농림축산식품부 식품기능성평가지원사업으로부터 지원받아 수행된 결과로 이에 감사드립니다. 또한 서천군청에 제출된 모시추출물 안전성평가 최종 보고서를 기반으로 작성되었습니다.

References

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Table 1.

Body weight of SD rats in single dose toxicity study of EBN

Group (mg/kg) Body weight (g)
0 day 1 day 4 day 7 day 14 day
All values are expressed as Mean±SD.
Male
0 (n=5) 242.3±7.4 273.2±4.1 298.0±9.1 316.5±13.0 354.2±20.8
500 (n=5) 243.4±4.7 274.1±7.5 295.2±10.4 319.0±12.7 355.1±21.7
1,000 (n=5) 243.0±5.5 271.1±5.6 292.3±5.7 312.6±8.6 345.5±10.0
2,000 (n=5) 244.0±5.8 276.1±9.7 295.6±14.4 316.8±17.9 358.9±22.0
Female
0 (n=5) 189.8±4.5 209.8±5.5 221.5±10.0 229.7±12.9 252.4±12.8
500 (n=5) 188.6±5.5 206.1±6.6 216.8±13.3 230.3±15.1 251.0±16.5
1,000 (n=5) 190.7±4.4 213.5±7.6 230.3±9.7 238.6±10.2 257.9±13.4
2,000 (n=5) 189.6±5.1 209.7±5.6 225.3±5.5 225.5±15.3 253.6±15.1

Table 2.

Body weight of SD rats in repeated dose toxicity study of EBN

Group (mg/kg) Body Weight (g)
0 week 1 week 2 week Necropsy
All values are expressed as Mean±SD.
Male
0 (n=5) 217.2±7.1 281.4±10.6 331.2±14.6 315.0±12.7
500 (n=5) 217.9±4.9 287.1±8.0 342.6±11.3 329.4±11.3
1,000 (n=5) 217.7±5.9 280.4±10.7 329.4±15.9 316.4±14.0
2,000 (n=5) 216.8±4.5 286.9±11.0 325.2±26.4 319.2±15.1
Female
0 (n=5) 161.2±7.9 188.4±9.6 207.8±7.7 201.3±8.4
500 (n=5) 159.1±4.7 187.3±5.0 207.0±8.3 200.9±7.0
1,000 (n=5) 158.5±7.2 183.8±11.9 208.9±13.1 201.9±13.8
2,000 (n=5) 162.0±6.4 187.9±6.9 217.1±9.6 207.2±10.1

Table 3.

Food consumption of SD rats in repeated dose toxicity study of EBN

Group (mg/kg) Daily mean food consumption (g)
0 week 1 week 2 week
All values are expressed as Mean±SD.
Male
0 (n=5) 25.8±1.5 26.6±0.4 27.7±2.2
500 (n=5) 26.3±0.4 28.0±1.5 31.3±1.8
1,000 (n=5) 25.4±2.5 25.0±0.6 29.0±3.6
2,000 (n=5) 25.1±2.5 27.4±5.0 24.5±10.9
Female
0 (n=5) 17.1±3.2 17.1±1.9 16.1±2.2
500 (n=5) 18.5±2.3 17.5±0.0 18.1±2.8
1,000 (n=5) 17.6±1.7 18.0±2.7 17.7±1.8
2,000 (n=5) 18.0±2.8 17.0±1.0 19.0±0.2

Table 4.

Hematological estimates of SD rats in repeated dose toxicity study of EBN

Hematological parameters Group (mg/kg)
0 500 1,000 2,000
All values are expressed as Mean±SD.
Abbreviations: WBC, White blood cell: NE, Neutrophils; LY, Lymphocyte; MO, Monocyte; EO, Eosinophil; BA, Basophil; NE%, Percent of neutrophils; LY%, Percent of lymphocyte; MO%, Percent of monocyte; EO%, Percent of eosinophil; BA%, Percent of basophil; RBC, Red blood cell; Hb, Hemoglobin; HCT, Hematocrit; MCV, Mean corpuscular volume; MCH, Mean corpuscular hemoglobin; MCHC, Mean corpuscular hemoglobin concentration; RDW, Red cell distribution width; PLT, Platelet; MPV, Mean platelet volume; LUC, Large unstained cell; Reti, Reticulocyte.
a: Significantly different compared with control(0), 500, 1,000 mg/kg group (p<0.01)
b: Significantly different compared with control(0), 500, 1,000 mg/kg group (p<0.05)
c: Significantly different compared with 500, 1,000 mg/kg group (p<0.01)
Male
WBC (K/μL) 10.36±2.15 9.71±2.57 9.60±2.12 10.87±2.05
Ne (K/μL) 1.12±0.23 1.09±0.17 0.86±0.58 1.56±0.34
LY (K/μL) 8.94±2.08 8.31±2.35 8.46±1.65 8.93±2.01
MO (K/μL) 0.16±0.04 0.18±0.10 0.13±0.06 0.20±0.03
EO (K/μL) 0.04±0.03 0.03±0.01 0.03±0.02 0.04±0.01
BA (K/μL) 0.01±0.01 0.01±0.01 0.01±0.00 0.01±0.00
NE (%) 11.1±2.8 11.9±3.6 8.6±3.8 14.7±3.8
LY (%) 86.0±3.0 85.1±3.5 88.4±4.2 81.6±4.2
MO (%) 1.6±0.5 1.8±0.7 1.4±0.5 1.9±0.6
EO (%) 0.3±0.2 0.3±0.1 0.3±0.1 0.4±0.1
BA (%) 0.1±0.1 0.1±0.0 0.1±0.0 0.1±0.0
RBC (M/μL) 7.20±0.46 6.89±0.37 6.98±0.32 7.05±0.33
Hb (g/μL) 14.8±1.0 14.2±0.6 14.3±0.7 14.6±0.5
HCT (%) 47.4±1.4 44.5±1.3 45.9±2.1 45.9±1.6
MCV (fL) 65.9±2.3 64.7±2.0 65.8±1.9 65.2±1.5
MCH (pg) 20.6±0.6 20.6±0.6 20.5±0.4 20.7±0.4
MCHC (g/dL) 31.2±1.3 31.9±0.9 31.2±0.5 31.8±0.6
RDW (%) 12.2±0.7 12.2±0.4 11.7±0.3 11.8±0.2
PLT (K/μL) 1267±166.6 1376±90.6 1362±85.1 1386±147.9
MPV (fL) 11.3±0.7 10.8±0.8 10.8±1.3 10.9±0.9
LUC (%) 0.10±0.05 0.09±0.05 0.12±0.02 0.15±0.04
Reti (%) 4.85±0.60 4.84±0.70 4.12±0.30 4.32±0.27
Female
WBC (K/μL) 7.17±2.02 6.31±0.35 7.09±1.34 10.18±2.08a
Ne (K/μL) 0.52±0.09 0.66±0.17 0.70±0.22 1.02±0.41
LY (K/μL) 6.45±1.94 5.43±0.21 6.17±1.24 8.86±1.83b
MO (K/μL) 0.08±0.04 0.10±0.03 0.11±0.04 0.11±0.02
EO (K/μL) 0.02±0.01 0.04±0.03 0.03±0.03 0.04±0.02
BA (K/μL) 0.01±0.01 0.01±0.00 0.00±0.01 0.01±0.00
NE (%) 7.6±2.0 10.3±2.2 10.0±2.8 10.0±3.0
LY (%) 89.6±2.2 86.0±2.8 86.9±2.6 87.0±3.1
MO (%) 1.1±0.5 1.6±0.3 1.5±0.3 1.1±0.3
EO (%) 0.3±0.2 0.6±0.4 0.5±0.4 0.4±0.3
BA (%) 0.1±0.0 0.1±0.0 0.1±0.1 0.1±0.1
RBC (M/μL) 7.40±0.37 7.05±0.18 7.08±0.36 6.98±0.35
Hb (g/μL) 15.2±0.5 14.2±0.2 14.4±0.6 14.5±0.8
HCT (%) 46.3±2.0 43.4±0.9 43.6±1.8 43.8±1.5
MCV (fL) 62.6±2.8 61.6±1.0 61.6±1.3 62.8±2.1
MCH (pg) 20.6±0.8 20.2±0.5 20.4±0.3 20.7±0.7
MCHC (g/dL) 32.9±0.4 32.8±0.6 33.1±0.4 33.0±0.9
RDW (%) 10.8±0.2 11.0±0.4 10.8±0.3 11.0±0.3
PLT (K/μL) 1330±129.8 1330±96.9 1327±78.6 1409±111.3
MPV (fL) 10.5±1.3 10.3±0.7 9.0±0.8 10.4±1.1
LUC (%) 0.09±0.04 0.08±0.01 0.08±0.01 0.15±0.04c
Reti (%) 2.72±0.65 2.82±0.69 3.26±0.70 3.40±0.34

Table 5.

Serum biochemical estimates of SD rats in repeated dose toxicity study of EBN

Serum biochemical parameters Group (mg/kg)
0 500 1,000 2,000
All values are expressed as Mean±SD.
Abbreviations: AST, Asparate amonitransferase; ALT, Alanine aminotransferase; ALP, Alkaline phosphatase; GGT, Gamma(γ)-glutamyl transferase; LDH, Lactate dehydrogenase; BUN, Blood urea nitrogen; CRE, Creatinine; GLU, Glucose; CHO, Total cholesterol; TP, Total protein; CPK, Creatine phosphokinase; ALB, Albumin; T-BIL, Total bilirubin; A/G ratio, Albumin/Globulin ratio; TG, Triglyceride; UA, Uric acid; Ca, Calcium; IP, Inorganic phosphorus; Cl, Chloride; Mg, Magnesium; Na, Sodium; K, Potassium.
a: Significantly different compared with control group (p<0.05)
b: Significantly different compared with control(0), 500, 1,000 mg/kg group (p<0.01)
Male
AST (IU/L) 110±19.5 140±67.5 123±29.7 108±32.7
ALT (IU/L) 44±7.6 50±7.5 47±5.1 43±11.0
ALP (IU/L) 1145±213.6 1016±160.2 1042±116.5 1053±124.3
GGT (IU/L) 1±0.4 1±0.5 1±0.4 1±0.0
LDH (IU/L) 955±389.2 1461±1196.2 1173±684.2 943±446.4
BUN (mg/dL) 19.0±3.3 19.1±3.8 18.7±2.7 17.7±1.0
CRE (mg/dL) 0.50±0.07 0.52±0.08 0.52±0.06 0.50±0.06
GLU (mg/dL) 143±42.0 140±47.5 172±24.1 143±36.9
CHO (mg/dL) 106±18.9 94±19.1 87±11.2 82±7.5
TP (g/dL) 6.0±0.1 5.6±0.1a 5.7±0.2a 5.6±0.3a
CPK (U/L) 485±149.6 847±640.5 591±277.6 502±184.1
ALB (g/dL) 2.4±0.1 2.4±0.2 2.3±0.1 2.3±0.2
T-BIL (mg/dL) 0.05±0.02 0.04±0.02 0.04±0.02 0.03±0.02
A/G ratio 0.68±0.02 0.72±0.06 0.69±0.02 0.72±0.02
TG (mg/dL) 50±31.6 47±25.4 46±16.8 54±25.3
UA (mg/dL) 2.7±0.9 2.6±0.5 2.6±0.6 2.7±0.3
Ca (mg/dL) 11.4±0.2 11.4±0.2 11.5±0.5 11.5±0.3
IP (mg/dL) 12.7±1.3 13.5±1.7 13.4±1.7 13.5±1.8
Cl (mmol/L) 100±1.1 100±0.7 100±1.3 100±1.8
Mg (mg/dL) 3.2±0.6 3.2±0.4 3.2±0.3 3.1±0.4
Na (mmol/L) 143±0.5 141±1.9 141±1.1 142±0.7
K (mmol/L) 5.7±0.8 6.0±0.6 5.6±0.4 6.0±0.2
Female
AST (IU/L) 84±8.1 81±12.2 88±12.7 94±29.6
ALT (IU/L) 37±7.7 34±5.8 37±3.0 38±10.0
ALP (IU/L) 651±59.7 660±34.1 626±177.2 829±173.2
GGT (IU/L) 1±0.7 1±0.0 1±0.4 1±0.0
LDH (IU/L) 359±180.6 293±183.4 499±330.1 660±525.9
BUN (mg/dL) 16.8±2.3 17.1±2.1 16.0±1.4 16.5±1.9
CRE (mg/dL) 0.53±0.02 0.49±0.03 0.52±0.04 0.52±0.04
GLU (mg/dL) 114±21.3 131±40.2 149±43.4 142±33.0
CHO (mg/dL) 106±11.6 98±18.8 100±16.7 112±15.7
TP (g/dL) 5.8±0.3 5.7±0.4 5.5±0.3 5.7±0.2
CPK (U/L) 249±64.4 233±81.8 277±119.6 340±181.9
ALB (g/dL) 2.6±0.1 2.5±0.2 2.4±0.2 2.5±0.1
T-BIL (mg/dL) 0.03±0.01 0.04±0.01 0.04±0.01 0.03±0.01
A/G ratio 0.80±0.05 0.79±0.02 0.79±0.07 0.78±0.02
TG (mg/dL) 38±6.5 25±4.7 34±12.5 41±16.1
UA (mg/dL) 2.2±0.4 2.2±0.3 2.1±0.2 2.2±0.3
Ca (mg/dL) 11.4±1.0 11.1±0.7 11.0±0.6 10.9±0.2
IP (mg/dL) 11.4±0.8 10.9±0.6 10.9±1.0 11.4±0.5
Cl (mmol/L) 101±0.4 102±0.5 102±0.5 103±1.1b
Mg (mg/dL) 3.0±0.2 2.8±0.3 2.8±0.2 2.8±0.3
Na (mmol/L) 142±0.5 140±2.0 141±1.3 141±0.8
K (mmol/L) 5.7±0.6 5.8±0.6 5.5±0.7 6.2±0.4

Table 6.

Organ weight of SD rats in repeated dose toxicity study of EBN

Absolute organ weight (g) Group (mg/kg)
0 500 1,000 2,000
All values are expressed as Mean±SD.
a: Significantly different compared with 1,000 mg/kg group (p<0.05)
Male
Body weight 315.0±12.7 329.4±11.3 316.4±14.0 319.2±15.1
Testis (Lt.) 1.4±0.2 1.5±0.1 1.3±0.1 1.4±0.2
%Body weight 0.5±0.1 0.5±0.0 0.4±0.0 0.4±0.1
Testis (Rt.) 1.4±0.2 1.5±0.2 1.4±0.1 1.4±0.2
%Body weight 0.4±0.1 0.5±0.1 0.4±0.0 0.4±0.1
Prostate 0.4±0.1 0.5±0.2 0.4±0.1 0.5±0.1
%Body weight 0.1±0.0 0.2±0.0 0.1±0.0 0.2±0.0
Spleen 0.8±0.1 0.8±0.1 0.7±0.1 0.9±0.1
%Body weight 0.3±0.0 0.2±0.0 0.2±0.0 0.3±0.0
Liver 10.5±0.8 11.0±0.3 10.9±0.7 10.9±1.3
%Body weight 3.3±0.2 3.4±0.1 3.4±0.2 3.4±0.3
Adrenal gl. (Lt.) 0.03±0.01 0.02±0.00 0.02±0.00 0.03±0.00
%Body weight 0.01±0.00 0.01±0.00 0.01±0.00 0.01±0.00
Adrenal gl. (Rt.) 0.02±0.01 0.02±0.01 0.02±0.00 0.02±0.00
%Body weight 0.01±0.00 0.01±0.00 0.01±0.00 0.01±0.00
Kidney (Lt.) 1.3±0.2 1.3±0.1 1.3±0.1 1.3±0.0
%Body weight 0.4±0.1 0.4±0.0 0.4±0.0 0.4±0.0
Kidney (Rt.) 1.3±0.2 1.3±0.1 1.3±0.1 1.3±0.1
%Body weight 0.4±0.1 0.4±0.0 0.4±0.0 0.4±0.0
Heart 1.2±0.1 1.2±0.1 1.2±0.1 1.2±0.1
%Body weight 0.4±0.0 0.4±0.0 0.4±0.0 0.4±0.0
Lung 1.7±0.3 1.6±0.3 1.8±0.7 1.8±0.4
%Body weight 0.5±0.1 0.5±0.1 0.6±0.2 0.6±0.1
Brain 2.0±0.1 2.0±0.1 2.0±0.1 1.9±0.1
%Body weight 0.6±0.0 0.6±0.0 0.6±0.0 0.6±0.0
Thymus 0.7±0.2 0.7±0.2 0.6±0.1 0.6±0.1
%Body weight 0.2±0.1 0.2±0.1 0.2±0.0 0.2±0.0
Female
Body weight 201.3±8.4 200.9±7.0 201.9±13.8 207.2±10.1
Ovary (Lt.) 0.03±0.01 0.04±0.01 0.04±0.01 0.04±0.01
%Body weight 0.02±0.00 0.02±0.00 0.02±0.01 0.02±0.01
Ovary (Rt.) 0.04±0.01 0.04±0.01 0.04±0.01 0.05±0.01
%Body weight 0.02±0.00 0.02±0.00 0.02±0.01 0.02±0.01
Uterus 0.5±0.3 0.4±0.1 0.5±0.2 0.6±0.2
%Body weight 0.3±0.1 0.2±0.0 0.2±0.1 0.3±0.1
Spleen 0.5±0.1 0.5±0.1 0.6±0.1 0.5±0.1
%Body weight 0.3±0.0 0.2±0.0 0.3±0.0 0.2±0.0
Liver 6.5±0.5 6.9±1.1 7.1±0.6 7.1±0.7
%Body weight 3.2±0.2 3.4±0.4 3.6±0.2 3.4±0.2
Adrenal gl. (Lt.) 0.03±0.00 0.03±0.00 0.03±0.00 0.03±0.00
%Body weight 0.01±0.00 0.02±0.00 0.02±0.00 0.01±0.00
Adrenal gl. (Rt.) 0.03±0.01 0.03±0.00 0.03±0.00 0.03±0.01
%Body weight 0.01±0.00 0.01±0.00 0.01±0.00 0.01±0.00
Kidney (Lt.) 0.8±0.1 0.8±0.1 0.8±0.0 0.8±0.0
%Body weight 0.4±0.0 0.4±0.1 0.4±0.0 0.4±0.0
Kidney (Rt.) 0.8±0.1 0.8±0.1 0.8±0.0 0.9±0.0
%Body weight 0.4±0.0 0.4±0.0 0.4±0.0 0.4±0.0
Heart 0.8±0.0 0.9±0.1 1.0±0.1 0.8±0.1
%Body weight 0.4±0.0 0.4±0.1 0.5±0.1 0.4±0.0a
Lung 1.4±0.1 1.3±0.1 1.2±0.2 1.4±0.4
%Body weight 0.7±0.1 0.6±0.0 0.6±0.1 0.7±0.2
Brain 1.9±0.0 1.8±0.1 1.9±0.1 1.9±0.1
%Body weight 0.9±0.1 0.9±0.0 0.9±0.1 0.9±0.1
Thymus 0.5±0.1 0.5±0.1 0.5±0.2 0.5±0.1
%Body weight 0.2±0.1 0.2±0.0 0.3±0.1 0.3±0.1

Table 7.

Bacterial reverse mutation assay of SD rats in bacterial reverse mutation assay of EBN

Metabolic activation Dose (μg/plate) Number of colony/plate
Base-pair substitution type Frameshift type
TA100 TA1535 WP2uvrA TA98 TA1537
All values are expressed as Mean±SD.
S9 mix (-) 0 68±1.2 9±3.5 24±3.5 20±8.7 8±1.5
313 80±16.3 8±4.2 23±5.6 19±3.5 5±1.5
625 73±7.8 7±3.6 24±3.5 16±3.0 3±1.0
1,250 82±2.1 8±2.5 24±4.6 17±4.6 6±1.5
2,500 87±12.2 7±3.8 20±8.7 19±2.5 6±1.2
5,000 102±10.5 5±1.0 25±3.6 25±8.0 5±1.5
S9 mix (+) 0 85±5.7 6±3.1 25±5.3 24±4.0 8±1.2
313 85±5.3 9±1.7 21±1.5 21±3.1 7±4.6
625 89±6.8 8±1.7 18±3.0 20±2.5 8±1.7
1,250 86±5.1 10±2.5 20±4.0 19±8.1 8±1.2
2,500 95±2.6 7±2.6 20±8.9 20±5.9 7±3.2
5,000 86±7.2 8±2.6 23±4.2 21±6.2 7±3.2
Positive Controls S9 mix (-) Positive controls AF-2 NaN3 AF-2 AF-2 9-AA
Dose (μg/plate) 0.01 0.5 0.01 0.1 80
Number of colony 473±31.1 261±11.1 107±4.7 510±9.3 2619±54.6
S9 mix (+) Positive controls 2-AA 2-AA 2-AA 2-AA 2-AA
Dose (μg/plate) 1.0 2.0 10 0.5 2.0
Number of colony 680±35.8 224±16.1 367±38.8 373±8.1 271±9.0