The Korean Society For Biotechnology And Bioengineering
[ Research Paper ]
Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 32, No. 4, pp.271-278
ISSN: 1225-7117 (Print) 2288-8268 (Online)
Print publication date 31 Dec 2017
Received 22 Sep 2017 Revised 08 Nov 2017 Accepted 09 Nov 2017
DOI: https://doi.org/10.7841/ksbbj.2017.32.4.271

과민면역 조절 효과를 가진 Lactobacillus rhamnosus IDCC 3201의 틴달화 유산균 개발: 틴달화 공정 최적화, 사균체 정량법 검증 및 in vitro 효능평가

김영후 ; 이병훈 ; 강재훈 ; 강대중*
일동제약(주) 중앙연구소
Development of Tyndallized Lactobacillus rhamnosus IDCC 3201 with Immunomodulation: Optimization, Validation, and in vitro Evaluation
Young-Hoo Kim ; Byeonghun Lee ; Jae-Hoon Kang ; Dae-Jung Kang*
Bioprocess Engineering Team, Research Laboratories, ILDONG pharmaceutical Co., Ltd., Hwaseong 18449 djkang@ildong.com

Correspondence to: *Bioprocess Engineering Team, Research Laboratories, ILDONG pharmaceutical Co., Ltd., Hwaseong 18449, Korea Tel: +82-31-371-2887, Fax: +82-31-371-2900 e-mail: djkang@ildong.com


Copyright Ⓒ 2017 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering

Abstract

We developed tyndallized (heat-treated) lactic acid bacteria with anti-allergic effect. Tyndallization process was established with Lactobacillus rhamnosus IDCC 3201 isolated from Korean breast milk-fed infant. Thermal death times for Lactobacillus rhamnosus IDCC 3201 were evaluated to identify optimal tyndallization temperature. Then, validation of direct counting method for calculating the number of dead bacterial cells was performed. The cell counting method was successfully validated on linearity, precision, and accuracy. To evaluate immunomodulatory effect of Lactobacillus rhamnosus IDCC 3201 tyndallizate (RHT3201), cytokine production was carried out with determination of interleukin (IL) 4, IL-12, and IFN-γ in mouse splenocytes from OVA-sensitized BALB/c mice. Treatment of RHT3201 down-regulated type 2 helper T (Th2) cytokine IL-4 and upregulated type 1 helper T (Th1) cytokines such as IL-12 and IFN- γ dose dependently. The immunomodulation was induced by improving the balance between Th1 and Th2 cytokines. Therefore, we finally developed tyndallized lactic acid bacteria with superior anti-allergic effect.

Keywords:

Lactobacillus rhamnosus IDCC 3201, tyndallization, direct counting method, validation, immunomodulation

1. INTRODUCTION

인체에 공생하는 장내 세균총 (gut microbiota)은 위장관 내에서 유해균의 우점화를 억제하고 장 기능을 유지하는데 중요한 역할을 담당한다 [1]. 그러한 장내 세균은 장 기능뿐 아니라 면역 조절자로서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다 [2]. 프로바이오틱스로 일컬어지는 다양한 유익균은 장 내에서 toll-like receptor (TLR) 시그널을 매개하여 선천성 면역반응 (innate immune response)을 일으키게 되며 [3], 대표적인 프로바이오틱스인 Lactobacillus속 균주들의 경우 그람 양성 세균으로서 peptidoglycan (PGN) 등과 같은 세포벽 성분 등이 면역 세포의 싸이토카인 (cytokine) 생성을 변화시켜 면역 조절 기능을 갖는다 [4]. 또한, 프로바이오틱스 균이 생성하는 유기산 등이 포함된 대사물 역시 면역 조절에 기여할 수 있다 [5].

아토피나 비염 등으로 대표되는 알레르기는 인체에 침입한 항원에 대하여 과다 면역을 일으키는 질환이다. T 세포는 항원 종류나 수용체에 따라 type-1 T helper (Th1) 세포 또는 type-2 T helper (Th2) 세포로 분화하는데, 특히 Th2 세포의 싸이토카인인 interleukin (IL) 4, IL-5, IL-13 등의 과다 분비는 B세포를 통한 체액성 면역을 과도하게 발현시켜 immunoglobulin E (IgE) 생성량이 급격히 증가하게 되고 실제로 다수의 알레르기 환자에게서 이러한 높은 혈중 IgE 수치가 확인된다 [6]. 이미 보고된 연구에 따르면 특정 프로바이오틱스는 Th2 싸이토카인을 감소시키고 Th1과의 균형을 향상시켜 알레르기 억제 효과를 가질 수 있다 [7].

대개의 섭취용 프로바이오틱스 제품은 생균을 사용한다. 하지만 죽어있는 균체 (사균) 역시 면역 조절자로서 역할을 할 수 있음이 밝혀진 바 있다 [8]. 배양된 균체를 사균화 하는 방법은 열처리 (tyndallization)가 대표적이며 [9], 대표적인 프로바이오틱스 균주인 L. rhamnosus GG (LGG)의 열처리 사균에 의한 아토피 피부염 예방 효과가 규명된 바 있다 [10].

본 연구팀은 기 연구에서 아토피와 같은 과다면역질환 개선 역할을 할 수 있는 유산균을 개발하기 위하여 한국인 모유 영양아의 분변으로부터 23종의 유산균을 분리하고 탁월한 항 알레르기 효능을 가진 Lactobacillus rhamnosus IDCC 3201을 선별한 바 있다 [11]. 이번 연구에서는 기존에 다양하게 출시되는 생균 프로바이오틱스와 차별화 된 사균 원료를 개발하기 위하여, L. rhamnosus IDCC 3201 tyndallizate (RHT3201)의 온도별 사균화 조건을 확립하고 사균체 정량 시험법에 대한 검증 (validation)을 수행하였다. 또한, 최적화 공정에 따라 제조된 원료를 사용하여 항 알레르기 효과에 대한 in vitro 효능평가를 진행하였으며 사균화 방법에 따른 효능 차이를 확인하였다.


2. MATERIALS AND METHOD

2.1. 사용 균주 및 배지

서울, 경기 소재의 산후조리원에서 사전 동의 후 신생아 분변에서 분리한 유산균인 L. rhamnosus IDCC 3201 (GenBank AY 094065)을 사용하였다. 분리된 균주를 MRS (de Man-Rogosa-Sharpe) broth (Becton, Dickinson and Company, USA)에 배양한 다음 glycerol 농도가 20% (v/v)가 되도록 혼합하고 -80°C에 보관하며 사용하였다.

2.2. Tyndallization 공정 최적화

2.2.1. 생균수 측정 (Viable cell count)

배양액 또는 원료 내의 생균수를 측정하기 위하여 0.9% NaCl 용액을 분석수로 하여 시료를 10배씩 다단희석한 다음 MRS 한천배지에 접종하여 도말하였다. 접종된 한천배지는 37°C 에서 72시간 동안 배양한 다음 생성된 집락을 계측하여 희석 배수를 환산하여 생균수를 확인하였다.

2.2.2. RHT3201의 tyndallization 온도 별 사균율

Tyndallization에 의한 온도별 사균율을 확인하기 위하여 L. rhamnosus IDCC 3201를 효모추출분말 기반 배지에 10% (v/v) 접종하고 18시간 동안 배양한 후 생육곡선 상 정상기 (stationary phase) 상태의 배양액을 8000×g로 10분간 원심분리 하여 균체를 수거하였다. 수거된 균체는 50, 60, 70, 80, 90°C의 조건으로 각각 중탕하여 처리 시간에 따라 mL당 생균수를 측정하였다. 처리 온도에 따른 사멸률을 파악하기 위하여 생균수가 10배 감소하는 동안 걸리는 시간인 D값 (D-value, decimal reduction time)을 확인하였다 [12].

2.2.3. RHT3201의 제조 공정 단계별 사균율

배양하여 수거한 균체를 각 온도별로 2시간 동안 tyndallization하여 사균화하고 동결건조하였다. 상등액은 전체 양의 10%의 양을 감압 농축기 (N-1100, EYELA, Japan)를 사용하여 가열하며 사균화와 동시에 10배 농축한 다음 옥수수 전분 (Daesang, Korea)을 농축액의 절반의 양 혼합하여 동결건조하였다. 최종적으로 분말화 된 균체와 상등액 농축물을 분쇄하여 혼합하고 옥수수 전분을 1:1 비율로 혼합하여 RHT3201을 제조하였다. 이 때, 배양 종료, 원심분리, tyndallization, 동결건조, 분쇄, 혼합 등의 각각의 공정에서 생균수를 측정하여 공정 간 사균율을 파악하였다.

2.3. 사균체 정량법 검증 (Validation)

2.3.1. 총 균체수 측정 (직접계수법, Direct counting method)

배양액 또는 원료 분말에 포함된 균체의 개수는 2.5×10-4 mm3의 구획들로 이루어진 Neubauer counting chamber (Marienfeld-Superior, Lauda-Königshofen, Germany)를 사용하여 측정하였다. 시료를 0.25 M NaOH (또는 Phosphate-buffered saline (PBS), 증류수 등)로 102배 희석한 다음, 0.25 M NaOH과 glycerol이 8:1로 혼합된 용액을 희석수로 이용하여 다단희석하였다. 원료 희석액을 400배율로 관찰하여 25개의 소구획에 포함된 균체의 개수를 계측하고, 총 사균체 개수는 아래 식을 통해 계산한다.

총 사균체 개수 (mL 당) = 평균 균체 개수 (개/소구획) × mm3 당 소구획 개수 (400 소구획/mm3) × 103 mm3/mL × 희석배수

2.3.2. RHT3201 원료의 사균체 측정 시험법 검증

균체수를 정량하는 방법인 집접계수법의 타당성을 입증하기 위해 직선성, 정밀성 및 정확성을 검증하였다. 직선성을 확인하기 위하여 1.0×1011 cells/g 농도인 L. rhamnosus IDCC 3201의 균체 농축 건조물을 2배씩 희석한 다음, 농도별 균체 개수를 측정하여 표준곡선을 작성하였다. 정밀성 확인을 위하여 한 시료에서 얻은 검체를 10회 반복 측정한 병행정밀성과 동일 시료로부터 모든 분석 과정을 두 작업자가 각각 10회 반복 확인하는 실험실내 정밀성으로 진행하였다. 정확성 확인을 위하여 2.55×1010 cells/g의 RHT3201 원료에 표준시료를 1.0, 2.0 및 3.0×1010 cells/g의 농도로 첨가하여 각각의 이론값 대비 실측값의 회수율로 나타냈다.

2.4. 항 알레르기에 대한 in vitro 효능평가

2.4.1. RHT3201 처리에 의한 Th1/Th2 균형 변화

RHT3201이 갖는 항알레르기 효능을 확인하였다. BALB/c 마우스에 2 mg의 Al(OH)3과 1 mg의 ovalbumin (OVA)을 복강주사로 부스팅시키고 6일 경과 후 동일하게 2차 부스팅하였다. 13일째 CO2 gas를 처리하여 희생시킨 마우스에서 비장을 무균적으로 적출하고, 10% FBS와 1 mg/mL의 OVA이 함유된 DMEM 배지에 5×106 cells/mL의 농도로 현탁하여 비장세포를 준비하였다. 96 well plate의 각 well에 비장세포 현탁액 (5×106 cells/mL)을 분주하고, RHT3201을 증류수에 현탁하여 제조한 시료를 1.0 × 104, 105, 106, 107, 108 cells/well이 되도록 첨가한 후 37°C, 5% CO2 배양기에서 7일간 배양하였다. 양성 대조군으로서 LGG를 RHT3201과 동일한 공정으로 제조하여 1.0×108 cells/well의 농도로 처리하였다. 배양 종료 후 배양액 중의 IL-4, IL-12, IFN-γ를 cytoset kit (Biosource International, Camallino, USA)를 이용하여 측정하였다.

2.4.2. 균체 사균화 방법에 따른 in vitro 효능평가

균체 사균화 방법에 따른 효능 차이를 확인하기 위하여 상등액이 포함되지 않은 순수 사균만을 사용하여 효능평가를 진행하였다. L. rhamnosus IDCC 3201의 배양액을 원심분리하여 균체를 얻은 후 PBS로 2회 세척한 다음 균체를 두 군으로 나누어 한 군은 RHT3201 제조 공정과 같이 70°C 이상의 온도에서 tyndallization하고 동결건조하여 수거하였고, 다른 한군은 데시케이터에서 24시간 동안 실온건조한 다음 UV를 조사하여 열처리 없이 사균화하였다. 두 원료를 2.4.1과 같은 방법으로 비장세포에 105, 106 및 107 cells/well의 농도로 처리하여 싸이토카인 생성능을 확인하였다.

2.5. 통계분석

모든 결과는 각각 3배수로 분석하여 모든 과정을 3회 반복 실험한 결과를 평균 (mean) ± 표준편차 (standard deviation, SD)로 표시하였다. 통계 처리는 independent Student’s t-test로 처리하였고 p<0.05일 때 유의성이 있는 것으로 간주하였으며, 모든 데이터 분석은 SPSS Statics 19.0 (SPSS Inc., Chicago, USA)를 사용하여 수행되었다.


3. RESULT AND DISCUSSION

3.1. Tyndallization에 의한 사균율

Tyndallization에 의한 사균화 공정을 최적화하기 위하여 L. rhamnosus IDCC 3201의 배양액을 온도별로 중탕 열처리하였을 때 시간에 따른 생균수 변화를 확인하였다 (Fig. 1A). 50°C와 60°C에서는 180분 동안 열처리하여도 완전히 사균화 되지 않았지만, 70, 80 및 90°C에서는 각각 180, 90, 60분만에 완전히 사멸되었다. 이 결과를 바탕으로 L. rhamnosus IDCC 3201의 D값을 도출한 결과 50, 60, 70, 80, 90°C에서 각각 58.5, 27.8, 21.0, 9.8, 4.9분이었다 (Fig. 1B). 70°C와 80°C 간의 D값이 두 배 이상 차이 나는 것으로 볼 때 tyndallization을 진행하기에 효율성을 갖춘 최소 온도는 70~80°C일 것으로 생각된다. RHT3201 원료를 제조하는 공정의 각 단계에서의 생균수를 확인한 결과, 열처리 단계에서의 온도가 70°C 이상일 때 최종 원료의 생균수가 3.0×102 CFU/g 미만으로 거의 사멸된 것을 알 수 있었다. 열처리 과정뿐 아니라 동결건조와 분쇄 과정을 거치면서도 사멸률이 증가하는 것을 확인하였다 (Table 1). 따라서 L. rhamnosus IDCC 3201을 사균화하기 위한 최적 tyndallization 조건은 70°C 이상임을 확인하였다.

Fig. 1.

(A) Change in viable cells in culture broth by several temperature conditions. (B) Thermal death curve for stationary-phase cells of L. rhamnosus IDCC 3201 at several temperatures.

Comparison of change in viable cells between two tyndallization temperatures as the production steps progress

3.2. 사균체 시험법 검증

사균체를 정량하기 위한 시험법으로 사용된 직접계수법을 검증하기 위하여 직선성, 정밀성 및 정확성을 확인하였다. 직선성을 확인하기 위해 7.8×108 cells/g에서부터 1.0×1011 cells/g까지의 농도 구간에서 25개 소구획 균체수와의 표준곡선을 나타냈다 (Fig. 2). 상관계수 (R2) 값은 1로 높은 직선성을 보였으며, 적어도 이 농도 구간에서는 직접계수법을 통해 측정 가능한 범위임을 확인하였다. 제조 검체를 반복 측정한 병행 정밀성 실험에서는 상대표준편차 (%RSD) 값이 1.8을 나타냈고, 동일 시료로 전체 분석 과정을 반복하는 정밀성 실험에서는 두 시험자의 분석 결과 상대표준편차가 각각 2.4와 2.9를 나타냈다 (Table 2, 3). RHT3201 원료에 농도를 알고 있는 표준시료를 세 가지 농도로 첨가한 후 회수율을 확인한 결과 전체 평균 100.3%로 매우 높은 정확성을 보유한 시험법이라는 것을 확인하였다 (Table 4). 이러한 결과로 미루어 볼 때 배양을 통한 콜로니 생성이 불가능한 사균체의 경우 본 연구에서 시험법 검증이 완료된 직접계수법을 활용하면 정량이 가능하다는 것을 확인하였다.

Fig. 2.

Calibration curve of direct counting for L. rhamnosus IDCC 3201 cell bodies

Repeatability of direct counting for bacterial cell bodies

Precision of direct counting for bacterial cell bodies

Accuracy of direct counting for bacterial cell bodies

3.3. RHT3201 처리에 의한 Th1/Th2 균형 변화

Fig. 3은 RHT3201를 농도별로 처리한 비장세포의 in vitro 싸이토카인 생성능을 확인한 결과이다. IL-4 등의 Th2 싸이토카인은 면역글로불린 클래스 전환 (immunoglobulin class switch)을 통해 IgE 생성을 유도하는 것으로 알려져 있다 [13]. RHT3201은 OVA에 의해 증가한 IL-4의 생성을 농도 의 존적으로 억제하였다 (Fig. 3A). 1.0 × 105 cells/g 이상의 농도에서 control에 비해 IL-4의 농도가 매우 유의적으로 감소한 것을 알 수 있다. Th1 싸이토카인인 IL-12와 IFN-γ는 IgE 합성을 저해하여 알레르기 진행을 억제하는 것으로 알려져 있는데 [14], RHT3201의 처리에 의해 두 Th1 싸이토카인인 IL-12와 IFN-γ이 농도 의존적으로 유의적인 증가가 유도된 것을 확인할 수 있다 (Fig. 3B and 3C). Th1과 Th2 싸이토카인 간의 농도 비율은 알레르기 반응 유발을 야기시키는 중요한 요소라 할 수 있다 [15]. RHT3201 투여군에서는 IFN-γ/IL-4 비율이 농도 의존적으로 증가한 것을 확인할 수 있으며, 처리 농도가 높아짐에 따라 알레르기 반응 억제능이 증가하는 것을 알 수 있었다 (Fig. 3D). 한편, RHT3201과 동일한 공정으로 제조하여 양성 대조군으로 사용된 1.0×108 cells/g의 LGG의 사균체 원료 처리 결과와 비교했을 때 RHT3201 처리군은 유의적인 차이를 보였다. 따라서, RHT3201은 tyndallization된 사균 원료로서 처리되었을 때 항 알레르기 효능을 보유하였음을 확인할 수 있었다.

Fig. 3.

Influence of RHT3201 on (A) IL-4, (B) IL-12, and (C) IFN-γ cytokines production by splenocyte isolated from ovalbumin (OVA)-sensitized BALB/c mice. (D) IFN-γ/IL-4 ratios were represented by relative values to normal group. Statistical significance was represented as *p<0.05, **p<0.01, and ***p<0.001 compared to control. #p<0.05, ##p<0.01, and ###p<0.001 compared to LGG. Abbreviations: Normal, OVA non-treated group; Control, OVA treated group (negative control); LGG, tyndallized L. rhamnosus GG (108).

3.4. 균체 사균화 방법에 따른 in vitro 효능평가

L. rhamnosus IDCC 3201의 균체와 상등액이 각각 항 알레르기 효능을 가짐을 기 연구를 통해 확인한 바 있다 [11]. 그리고 본 연구에서는 균체와 상등액 농축물이 모두 포함된 RHT 3201 최종 원료를 사용하여 농도 의존적인 효과를 확인하였는데, 균체를 사균화하는 방법에 따른 효능 차이가 존재하는지 확인하기 위하여 RHT3201과 동일한 tyndallization 및 동결건조공정으로 제조한 원료와 실온건조 및 UV 조사를 통해 사균화한 균체 원료 간의 효능 차이를 비교하였다. 두 실험군 모두 처리한 세 농도에서 IL-4 수치가 컨트롤에 비해 농도 의존적으로 유의성 있게 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 그뿐만 아니라, tyndallization 원료를 처리한 경우 동일한 사균수를 처리한 UV 조사 원료를 처리한 경우에 비해 유의적으로 더 낮은 IL-4 농도를 보였다 (Fig. 4A). 두 실험군 간의 IFN-γ/IL-4 비율을 비교한 결과 tyndallization을 통해 사균화한 원료 처리군이 UV 조사를 통해 사균화 한 원료 처리군보다 유의하게 높은 것을 알 수 있었다. 이러한 결과를 통해 L. rhamnosus IDCC 3201 균주는 tyndallization을 통해 사균화한 원료에서 극대화된 항 알레르기 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다. 본 연구팀의 기 연구에서 L. rhamnosus IDCC 3201가 tyndallization과 동결건조를 거치면서 균체가 파쇄되고 세포질 성분 (lysate)이 용출되었을 것으로 생각되는 SEM 촬영 결과를 보고한 바 있다 [16]. 그렇게 파쇄되고 세포질 성분이 용출되어 생긴 DNA나 세포막 성분 (PGN, Lipoteichic acid, pili 등)에 의해 높은 면역 조절 기능을 갖게 되었을 것으로 생각된다.

Fig. 4.

(A) Influence of tyndallized and UV-treated L. rhamnosus IDCC 3201 cells on IL-4 cytokine production by splenocyte isolated from ovalbumin (OVA)-sensitized BALB/c mice. (B) Comparison of IFN-γ/IL-4 ratios between tyndallized and UV-treated cells. IFN-γ/IL-4 ratios were represented by relative values to normal group. *p<0.05, **p<0.01, and ***p<0.001 compared to control. #p<0.05 and ##p<0.01 compared to UV-treatment. Abbreviations: Normal, OVA non-treated group; Control, OVA treated group (negative control); T5, 105 tyndallized cells; T6, 106 tyndallized cells; T7, 107 tyndallized cells; UV5, 105 UV-treated cells; UV6, 106 UV-treated cells; UV7, 107 UV-treated cells.


4. CONCLUSION

최근 사회적인 문제로 대두되고 있는 아토피 등의 알레르기 질환은 완치가 가능한 치료제가 존재하지 않는다. 증상 억제를 위해 사용되는 스테로이드 등의 제제는 내성과 같은 부작용에 노출되어 있기 마련이다. 이러한 과다 면역 질환을 제어하기 위한 대체제로 프로바이오틱스가 각광받아 왔고, 그러한 가능성을 여러 연구에서 확인한 바 있다 [17,18]. 본 연구에서는 L. rhamnosus IDCC 3201의 균체를 그대로 섭취하는 것보다 tyndallization을 통해 제조된 사균체를 섭취하는 것이 더 높은 항 알레르기 효과를 가지는 것을 in vitro 실험을 통해 입증하였다. 살아있는 균체인 프로바이오틱스의 경우 대개 안정성이 떨어져 저장 요건이 까다롭고 사멸할 경우 예상된 효과를 기대하지 못한다는 단점이 존재한다. 하지만 본 연구에서 사용한 L. rhamnosus IDCC 3201은 프로바이오틱스로 사용되는 균주로서 섭취 안전성이 뛰어날 뿐 아니라, 최적화된 tyndallization 공정에 의해 제조된 RHT3201은 사멸한 상태의 사균체 원료이기 때문에 부작용이나 보관 안정성에 대한 고민이 훨씬 적다 [8]. 본 연구에서 최적화된 tyndallization 공정에 의해 제조된 사균체 원료의 효능을 입증하였고 바이오마커로서 정량하는 시험법 역시 검증하였기 때문에, 인체 적용시험 등의 추가적인 효능 근거를 확보한다면 RHT3201의 제품화를 통해 알레르기 질환의 예방 및 치료에 기여할 수 있을 것이다.

Acknowledgments

본 결과는 농림축산식품부의 재원으로 농림식품기술기획평가원 (고부가가치식품기술개발사업)의 지원을 받아 연구되었음 (116017032SB010).

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Fig. 1.

Fig. 1.
(A) Change in viable cells in culture broth by several temperature conditions. (B) Thermal death curve for stationary-phase cells of L. rhamnosus IDCC 3201 at several temperatures.

Fig. 2.

Fig. 2.
Calibration curve of direct counting for L. rhamnosus IDCC 3201 cell bodies

Fig. 3.

Fig. 3.
Influence of RHT3201 on (A) IL-4, (B) IL-12, and (C) IFN-γ cytokines production by splenocyte isolated from ovalbumin (OVA)-sensitized BALB/c mice. (D) IFN-γ/IL-4 ratios were represented by relative values to normal group. Statistical significance was represented as *p<0.05, **p<0.01, and ***p<0.001 compared to control. #p<0.05, ##p<0.01, and ###p<0.001 compared to LGG. Abbreviations: Normal, OVA non-treated group; Control, OVA treated group (negative control); LGG, tyndallized L. rhamnosus GG (108).

Fig. 4.

Fig. 4.
(A) Influence of tyndallized and UV-treated L. rhamnosus IDCC 3201 cells on IL-4 cytokine production by splenocyte isolated from ovalbumin (OVA)-sensitized BALB/c mice. (B) Comparison of IFN-γ/IL-4 ratios between tyndallized and UV-treated cells. IFN-γ/IL-4 ratios were represented by relative values to normal group. *p<0.05, **p<0.01, and ***p<0.001 compared to control. #p<0.05 and ##p<0.01 compared to UV-treatment. Abbreviations: Normal, OVA non-treated group; Control, OVA treated group (negative control); T5, 105 tyndallized cells; T6, 106 tyndallized cells; T7, 107 tyndallized cells; UV5, 105 UV-treated cells; UV6, 106 UV-treated cells; UV7, 107 UV-treated cells.

Table 1.

Comparison of change in viable cells between two tyndallization temperatures as the production steps progress

Process Scale (mL or g) Viable cell count (CFU/mL or CFU/g)
70°C 80°C
Cultivation 8,000 770,000,000 ± 57,000,000
Centrifugation 200 28,000,000,000 ± 1,900,000,000
Tyndallization 200 66,000 ± 12,000 < 300
Freeze-drying 40 730 ± 88 < 300
Mixing & Milling 100 < 300 < 300
Dilution 200 < 300 < 300

Table 2.

Repeatability of direct counting for bacterial cell bodies

No. Dilution rate Bacterial cell count in 25 sqaures (cells) Counting result (108 cells/g)
1 1000 163 260.8
2 1000 158 252.8
3 1000 159 254.4
4 1000 155 248.0
5 1000 156 249.6
6 1000 161 257.6
7 1000 157 251.2
8 1000 158 252.8
9 1000 154 246.4
10 1000 161 257.6
Mean - 158.2 253.1
SD - 2.9 4.6
%RSD - 1.8 1.8

Table 3.

Precision of direct counting for bacterial cell bodies

No. Dilution rate Tester 1 Tester 2
Bacterial cell count in
25 sqaures (cells)
Counting result
(108 cells/g)
Bacterial cell count in
25 sqaures (cells)
Counting result
(108 cells/g)
1 1,000 158 252.8 156 249.6
2 1,000 156 249.6 158 252.8
3 1,000 164 262.4 164 262.4
4 1,000 155 248.0 155 248.0
5 1,000 159 254.4 162 259.2
6 1,000 154 246.4 153 244.8
7 1,000 159 254.4 157 251.2
8 1,000 166 265.6 162 259.2
9 1,000 156 249.6 167 267.2
10 1,000 160 256.0 155 248.0
Mean - 158.7 253.9 158.9 254.2
SD - 3.9 6.2 4.6 7.3
%RSD - 2.4 2.4 2.9 2.9

Table 4.

Accuracy of direct counting for bacterial cell bodies

Added quantity
(cells/g)
No. Dilution rate Average Number of bacterial
cell count in 25 sqaures (cells)
Theoretical content
(108 cells/g)
Actual content
(108 cells/g)
Recovery rate (%)
1.0 × 1010 1 1000 222.7 355 356.3 100.4
2 1000 224.0 355 358.4 101.0
3 1000 220.0 355 352.0 99.2
Mean - 222.2 355 355.6 100.2
SD - 2.0 0 3.3 0.9
%RSD - 0.9 0 0.9 0.9
2.0 × 1010 1 1000 285.0 455 456.0 100.2
2 1000 289.3 455 462.9 101.7
3 1000 287.7 455 460.3 101.2
Mean - 287.3 455 459.7 101.0
SD - 2.2 0 3.5 0.8
%RSD - 0.8 0 0.8 0.8
3.0 × 1010 1 1000 347.3 555 555.7 100.1
2 1000 346.7 555 554.7 99.9
3 1000 344.7 555 551.5 99.4
Mean - 346.2 555 554.0 99.8
SD - 1.4 0 2.2 0.4
%RSD - 0.4 0 0.4 0.4