The Korean Society For Biotechnology And Bioengineering
[ Research Paper ]
Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 33, No. 1, pp.49-55
ISSN: 1225-7117 (Print) 2288-8268 (Online)
Print publication date 31 Mar 2018
Received 12 Feb 2018 Revised 14 Mar 2018 Accepted 19 Mar 2018
DOI: https://doi.org/10.7841/ksbbj.2018.33.1.49

PANI/Ba-Alginate 고정화 효소반응기를 이용한 Cadaverine 연속 생산 공정 개발

최혜지 ; 이중헌*
조선대학교 생명화학공학과
Continuous Production of Cadaverine Using PANI/Ba-Alginate Enzyme Reactor
Hyeji Choi ; Jung Heon Lee*
Department of Chemical and Biochemical Engineering, Chosun University, Gwangju 61452 leejh@mail.chosun.ac.kr

Correspondence to: Department of Chemical and Biochemical Engineering, Chosun University, Gwangju 61452, Korea Tel: +82-62-230-7159, Fax: +82-62-230-7866 e-mail: leejh@mail.chosun.ac.kr


© 2017 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering

Abstract

The production of cadaverine (1,5-diaminopentane) can be achieved through the decarboxylation of L-lysine catalyzed by lysine decarboxylase (LDC). This enzyme require pyridoxal 5’-phospate (PLP) as a cofactor to increase conversion and yield. In this work, immobilization of LDC with polyaniline nanofiber (PANI) and Ba alginate (PANI/Ba-alginate) was developed to improve production rates and stability. We also developed a continuous cadaverine production process using PANI/Ba-alginate enzyme reactor. The optimal conditions for cardaverine production were 4% alginate concentration and 0.5 M BaCl2. Developed PANI/Ba-alginate LDC composite was very stable and its enzyme activity was maintained over 90% for 6 days continuous operation. The continuous enzyme reactor (CSTR) was operated for 144 h with a constant flow rate and achieved continuous cadaverine production. When the residence time was 33 h, 86% cadaverine conversion was achieved from 300 mM of lysine.

Keywords:

cadaverine, lysine decarboxylase, CSTR, polyaniline

1. INTRODUCTION

환경 문제와 함께 증가하는 에너지 수요는 지속가능한 산업 발전을 촉진했다. 이에 석유 화학 제품 생산의 대안으로 친환경적이고 재생산이 가능한 미생물 기반 생산 시스템인 바이오 기반의 새로운 생산물들이 개발되어지고 있는데 그중 하나가 cadaverine이다 [1-4]. 석유 화학 제품인 폴리아마이드계 나일론은 자연분해가 되지 않아 축적되는 문제와 유한한 자원으로부터 고갈되어 대체할 수 있는 자원의 필요성이 대두되고 있다. 이에 최근 엔지니어링 플라스틱의 산업동향은 환경 친화성을 위한 식물 기반의 다양한 바이오매스를 이용한 polyamide (PA) 중합기술이 개발되고 있는데 cadaverine은 나일론 5.4, 5.6, 5.10과 같은 석유 기반 폴리아미드의 대체 물질로 사용되어 많은 산업적 응용에 있어서 중요 기반 화학물질이다 [5,6]. 바이오매스를 이용한 PA 5.10은 상업용 PA 6 및 PA 6.6의 기계적 특성을 가지고 있어 기존의 석유 화학 나일론을 대체할 수 있는 가능성을 제시할 수 있다. 폴리아마이드계 나일론은 단량체인 지방족 diamine과 지방족 carboxylic acid의 반응으로 아마이드 결합의 형성으로 나일론으로 합성되어진다 [7-9]. 본질적으로 cadaverine은 동물조직의 부패 중에 단백질 가수 분해에 의해 생성되는 오염물질로 석유 산업에서 cadaverine은 일반적으로 tetrahydropyran에서 생산되어 질 수 있는 1,5-dichloropentane, glutaraldehyde의 출발 물질로부터 생산된다 [10,11]. 산성 스트레스로부터 미생물 세포를 보호하기 위해 세균 대사 경로에서 lysine 탈 카르복실화 효소의 촉매 작용으로 합성될 수 있다. 즉 lysine decarboxylase (LDC)에 의해 L-lysine이 biotransformation되어 cadaverine이 생산되어진다. LDCs에 의한 L-lysine의 생체 변형은 통상적인 생산 공정이 확립되어 있고, lysine 가격이 저렴할 뿐만 아니라 lysine 산업의 심각한 과용 용량 상황으로 새로운 것을 원하고 있어 지난 몇 년 동안 lysine에 대한 응용이 주목을 받고 있다 [12,13]. 고정화된 효소는 재사용이 가능하여 가격 경쟁력이 높아지고 반응 생성물의 분리 정제가 용이하고, 비슷한 조건에서 한 가지 이상의 효소를 동시에 사용하는 공정이 가능하다. 효소 고정화에 이용되는 지지체들은 dextran, agarose 등 대부분 유기 고분자 화합물로 구성되었다. 그러나 이는 기계적 물성에 한계가 있으며 고온 고압에서 구조가 파괴되는 단점을 가지고 있다. 최근 발전하고 있는 나노 기술 분야와 관련하여 나노 구조 물질들이 개발되어지고 있다. 상업용 lysine을 기질로 사용하여 lysine 탈 카르복실화 효소를 발현하는 Pseudomonas aeruginosa가 발효를 통해 cadaverine 전환공정에 이용되었다.

본 연구에서는 lysine을 반응물로 사용하여 cadaverine을 생산하는 공정개발에서 연속 생산 반응공정을 완성하기 위해 PANI/Ba-alginate 효소 복합체를 이용하였다. 전도성을 지닌 PANI/Ba-alginate에 고정화 된 효소는 전체 전환반응의 안정성을 증가시키고 장시간 cadaverine 생산을 가능하게 하였다. 또한, 연속식 효소 반응기의 반응조건을 최적화함으로써 생산성이 향상된 연속공정을 개발하였다.


2. MATERIALS AND METHOD

2.1. 실험재료

2.1.1. 사용균주

본 실험에서 사용된 균주는 Pseudomonas aeruginosa (KCTC 22063) 유래에 lysine decarboxylase 발현하는 유전자가 들어있는 균을 사용하였다. 37oC에서 15시간 배양한 뒤 50% glycerol (Duksan, Korea)과 50:50 (v/v) 비율로 섞어 -70oC deep freezer (DF8517, Il-shin Bio Co.)에 보관 사용하였다.

2.1.2. 배양조성

본 연구에서는 발효조성으로 glucose (Duksan, Korea), (NH4)2 SO4, KH2PO4, K2HPO4, NaCl, MgSO4 (Ducksan, Korea)를 사용하였고 미량 원소인 CaCl2·2H2O, CuSO4·5H2O, NaMoO4·2H2O, CoCl2·6H2O, MnO4·7H2O, FeSO4·7H2O, ZnSO4·7H2O을 첨가하였으며, 소포제로는 anti-form 204 (Sigma-Aldrich, USA)를 사용하였다. 제조한 배양액은 121oC에서 15분 멸균하여 효소 생산을 진행하였다.

2.1.3. 배양 조건

본 배양에서는 ammonium sulfate 2 g/L, sodium chloride 1 g/L, magnesium sulfate 1 g/L제조 후 potassium monobasic 1 g/L, potassium dibasic 1 g/L, glucose 20 g/L에서 각 200 mL, 접종시킨 균 200 mL, distillation water 1400 mL를 넣어 총 2 L의 배양액을 제조하였다. 배양액을 121oC에서 15분 멸균한 뒤, 발효의 안전성을 위해 trace salt 1 mL/L와 antiform 1.5 mL/L는 3 mL syringe를 이용해 넣어주었다. 제조한 배양액을 37oC, 300 rpm에서 15시간 진행하였고 pH 6.5는 3 N NaOH을 이용해 조절하였다. 이후 배양된 균체량의 측정을 위해 UV-visible을 사용하여 600 nm에서 실험을 진행하였다.

2.1.4. 효소 활성도 측정

배양액을 4oC, 3000 rpm에서 15분간 원심분리를 한 뒤 상등액은 버리고 남은 cell만 취해 20 mM sodium phosphate buffer (pH 6.0)를 사용하여 50배 농축하였다. 농축액을 초음파 파쇄기 (VCX 500, Betatek Inc.)를 이용해 강도 32%로 40분간 분해시키는 과정에서 cell과 효소를 분리하였다. 생산된 효소 활성도 측정은 L-lysine, Pyridoxal 5′-phosphate hydrate (Sigma-Aldrich, USA), Toluene (OCI, Korea), Potassium carbonate, Sodium acetate (Duksan, Korea), TNBS (TCI, Japan)를 사용하였다 [11]. 이를 4oC, 8000 rpm에서 10분간 원심분리를 통해 상등액을 회수하였다. 추출된 효소와 조효소로 사용되는 PLP, 기질 100 mM lysine을 각각 6:1:4의 비율로 37oC에서 30분간 반응시킨 후, heating block을 이용해 100oC에 10분 동안 불활성화시켰다. 이후 원심분리된 sample을 UV detector로 분석 가능한 범위로 희석하여 실험을 진행하였다. 각각 희석된 sample 140 μL에 0.5 M sodium acetate (pH 5.0) 860 μL, K2CO3 1 mL, 0.1% TNBS 1 mL를 넣어 43oC에서 5분간 320 rpm으로 반응하였다. 반응액의 cadaverine을 측정하기 위해 유기용매인 toluene 2 mL 넣어 20초간 vortaxing을 하면서 추출하고 20분간 상온방치하였다. UV-visible을 이용해 335 nm에서 분리된 toluene층을 측정한다. 측정한 흡광도 값으로 구한 cadaverine 농도는 L-lysine과 반응한 전환율을 나타내었다. 즉, cadaverine 농도가 높을수록 효소의 활성도가 높다는 것을 의미한다.

2.2. 연속식 Cadaverine 생산

2.2.1. 효소 고정화

나노 구조 물질들은 굉장히 넓은 표면적을 가지고 양자 효과에 의한 특이한 물성을 보이므로 기존의 효소 고정화의 영역을 넘어 효소의 고정화 양을 늘려 연료전지나 바이오센서에 응용할 수 있는 훌륭한 고정화 담체가 될 수 있다. 본 연구에서는 고정화 담체로 전도성 고분자인 polyaniline nanofiber (PANI)을 이용하여 단백질을 구성하고 있는 아미노산 잔기를 알데하이드, 아민, 카르복실, 에폭시 그룹 등과의 반응에 의해 표면에 고정화를 시켜 효소의 용출과 변성을 제한시켜 안정성을 증대시키고자 하였다.

2.2.2. Polyaniline nanofiber (PANI)

Polyanilline nanofiber는 높은 안정성, 쉬운 합성 방법과 산화상태로 최종적으로 아닐린 단량체를 변화시킴으로써 전기 전도성 제어의 실현 가능성으로 인해 유망한 전도성을 지닌 중합체 중 하나이다. 또한 화학적 증기에 노출 되었을 때 산-염기의 감도와 시간 반응이 개선되어 표면적이 큰 다공성 특성을 나타내었다 [14,15]. 표면 기능화 전도성 중합체 기반 나노 물질은 효소의 고정화에 적합한 매질을 제공하며 고정 후에 효소활성을 유지할 수 있는 큰 장점을 가지고 있다 [13]. 일반적으로 PANI의 표면은 사실상 비활성인 것으로 간주되는데 이를 알데하이드기 (-CHO), 하이드록실기 (-OH), 카복실기 (-COOH) 및 아미노기 (-NH2)와 같은 극성 화학그룹의 결합을 통해 폴리 아닐린의 소수성 포면을 친수성으로 전환시킴으로써 완전히 또는 부분적으로 불활성인 표면을 특정 물질에 보다 적극적으로 인식시킬 수 있다 [16-20]. 이러한 성질을 이용해 본 실험에서는 아미노기를 가진 lysine decarboxylase와 결합하여 고정화를 진행하였다.

2.2.3. Polyaniline nanofiber 제조

고정화 담체 제조 시약으로는 99% Aniline, Ammonium persulfate (Sigma-Aldrich, USA), HCl (OCI, Korea)에서 구입하여 실험을 진행하였다. 99% aniline과 1 M HCl을 3:20 (v/v)의 비율로 제조한 뒤, ammonium persulfate를 1 M HCl에 0.1%가 되도록 500 mL를 제조하여 각각 만들어진 용액을 짙은 청남색으로 변할 때까지 강하게 흔들어 반응시켰다. 이후 상온에서 orbital shaker에서 150 rpm, 20시간 동안 반응을 진행한 뒤 원심분리기를 이용해 8000 rpm에서 15분씩 distilled water (pH 3.5)로 5회 세척하여 50배 농축시켰다. 이를 보관하여 bead 제조 시 사용하였다.

2.2.4. Alginate bead 제조

Alginate 폴리머를 이용해 bead를 형성하는 방법으로는 2가 양이온과 alginate를 결합시키는 이온결합의 원리를 이용해 만들어 진행하였다. Sodium alginate 4% 25 mL를 80~85oC에서 heating과 stirring을 동시에 진행하였다. 투명해질 때 까지 녹인 뒤, 배양을 통해 얻어진 lysine decarboxylase를 넣어 충분히 교반하고 이전 실험에 제조한 polyaniline nanofiber를 20 mg을 넣고 약 5분간 반응시켰다. 이 혼합액을 주사기를 이용하여 구형 형태로 각각의 bead 생성용액인 0.5 M Barium chloride (Sigma-Aldrich, USA) 100 mL에 적하하였다. 제조되어진 bead의 평균 직경은 2 mm였으며, 증류수로 세척한 후 4oC에서 5시간동안 경화시킨 뒤 연속식 생산 반응실험에 사용되었다.

2.2.5. 연속 효소반응기

본 연구에서 사용된 반응기는 cadaverine 생산에 있어 중요인자를 고려하여 연속 반응기를제작하여 사용하였다. 초기 반응기의 반응물의 구성은 제조한 PANI-alginate bead, 조효소로 사용되는 20 mM PLP, 기질인 300 mM lysine을 총 100 mL 기준으로 각각 3:0.5:2의 비율로 넣어주었다. 기질의 농도를 300 mM로 설정한 이유는 이전의 연구에서 1000 mM의 농도에 따른 기질 저해반응 실험을 수행한 결과, 300 mM 이상의 농도에서는 반응속도가 감소함을 보였다. 반응기에는 기질인 300 mM lysine을 0.05 mL/min으로 일정하게 공급해주면서 130 rpm의 연속 교반반응기에서 반응시켰다. 이 때 체류시간은 33시간으로 진행하였다. 기질-효소 반응에서 온도는 최적온도인 42oC로 하였으며 pH는 5.5로 제어하며 반응을 진행하였다. 실험값은 3회 반복 측정한 후에 평균값을 구하고 표준편차를 표시하였다.


3. RESULTS AND DISCUSSION

3.1. PANI를 활용한 alginate-LDC 고정화

단량체의 높은 전환을 위한 연속 생산 공정에서 고려해야 할 점은 반응기의 안정성과 생산성이다. 이러한 점에서 효소를 고정화하여 사용하는 것이 중요한 부분이다. 효소의 고정화를 위해 alginate bead로 만들어 반응을 진행하였다. Fig. 1은 PANI-alginate bead를 제작하여 반응기 생산 공정을 진행하였을 때, 효소 고정화한 bead의 SEM 이미지이다. 저배율 SEM 화상은 표면이 smooth한 모습을 볼 수 있으며 고해상도 SEM 이미지에서는 Bead의 표면이 다공성 nanofiber로 구성되어 있음을 확인할 수 있었으며 LDC의 고정화 표면적이 넓음을 관찰할 수 있었으며 기질인 lysine의 물질 전달이 용이함을 볼 수 있었다.

Fig. 1.

SEM images of LDC immobilized PANI/Ba-alginate beads after LDC immobilization (A) immobilized beads, (B) enzyme reactor, (C) SEM images (×100), (D) SEM images (×1.0K), (E) SEM images (×10.0K), and (F) SEM images (×50.0K).

3.2. PANI 첨가에 따른 cadaverine 생산

Alginate에 P. aeruginosa의 발효로 얻어진 lysine decarboxylase를 고정화하여 만든 bead는 물리적 흡착이 낮아 반응이 진행됨에 따라 bead swelling 현상이 일어나며 장시간 반응에서 낮은 전환율을 보여 연속 생산에는 적합하지 않다고 판단되었다. 이를 보완하고자 직접 제작한 전도성을 지닌 다공성 nanofiber에 고정화시켜 만든 bead를 제조하여 실험을 진행하였다. alginate-enzyme bead는 초반 24시간까지는 53%의 전환율을 보이다가 60시간까지 진행되었을 때에 전환율이 12%까지 떨어짐을 보였다. PANI-alginate-enzyme bead는 초반 24시간은 67%의 전환율에서 36시간에 91%라는 높은 전환율을 보였으며 최종 60시간까지 53%로 유지가 되는 모습을 보였다. 이전 실험과는 달리 bead의 깨짐 현상이 일어나지 않았고, 반응 시 높은 전환율을 유지하는 모습을 Fig. 2에 나타내었다. 이로써 lysine deacarboxylase에 PANI를 접합한 alginate bead의 사용이 더욱 효율적임을 확인하였으며 이후 진행되는 대용량 bioreactor의 장시간 반응 시 높은 전환율과 안전성이 예상되었다.

Fig. 2.

Changes in cadaverine conversion before (-O-) and after (-∇-) PANI addition (pH 5.5, 130 rpm and τ = 33 hr).

3.3. 2가 양이온에 따른 전환율 변화

알긴산은 물에 녹지 않으나 그 알칼리염은 물에 녹아 점질성이 매우 큰 용액을 만든다. 이것은 피막 형성 능력이 높고, 수분과의 반응이 빠른 것이 특징이다. 고분자 알긴산은 수분과 결합하여 그물구조인 막을 만든다. 음이온보다는 배열이 쉽게 변하는 양이온에 의해 안정성이 변하기 때문에 주로 alginate와 2가 양이온을 반응시켜 사용된다. 일반적으로 칼슘이온 (Ca2+)이 많이 사용되지만 장시간 반응시 bead의 풀림 현상이 발생하게 되는데 이는 기질인 lysine의 용매 phosphate buffer에 노출된 Ca-alginate bead는 짧은 시간 동안에 Ca2+이온의 용출되기 때문이다. 이런 단점을 보완하기 위해 기존 연구자들은 폴리머의 이온결합에 사용하는 2가 양이온인 Ca2+ 이온을 포함한 여러 가지 Ba2+, Zn2+, Mn2+, Cu2+, Co2+와 같은 이온으로 대체 [21]한 alginate에 PANI를 첨가한 bead로 cadaverine 전환 공정을 시행하였다.

이러한 보완점을 적용하여 본 실험에서도 여러 가지 2가 양이온을 사용하여 cadaverine으로 전환되는 수율의 차이를 비교하였다 (Fig. 3). 일정하게 cadaverine 생성 전환율이 높아지는 시간인 30시간을 기준으로 비교하여 보았을 때, Cu2+이온은 거의 cadaverine이 생성되지 않았고, Mg2+과 Mn2+이온은 20% 이하의 전환율을 보였으며 Ca2+이온과 Ba2+이온에서 높은 수율을 얻음을 보였다. 장시간 반응으로 보았을 때 bead의 파열이 발생하는 Ca2+이온보다 Ba2+이온이 전반적으로 안정적인 효소반응을 수행하기에 적합하였다.

Fig. 3.

Effect of various divalent cations on cadaverine conversion (pH 5.5, 130 rpm and τ = 33 hr).

3.4. Alginate 농도의 변화에 따른 전환율

알긴산은 김, 파래, 다시마, 미역과 같은 해조류의 30%를 차지하는 섬유질 성분으로 세포벽에 풍부하게 존재하며, 만누론산과 L-글루론산 2가지로 이루어진 직쇄형 다당류의 중합체로 가지사슬이 없이 무작위로 결합해 이루어진 고분자이다. 알긴산에는 친수성 작용기인 히드록시기 (-OH)가 있지만 탄소수가 많고 분자량이 커서 물에 용해되기 어렵다. 하지만 알긴산이 음이온으로 전환되면 용해도가 증가하게 되는데 그 이유는 알긴산에 존재하는 카르복실기 (-COOH)가 -COO의 형태가 되어 친수성을 나타내기 때문이다. 알긴산은 용해도가 큰 나트륨 이온이나 칼륨 이온이 포함되어 있을 경우에는 물에 잘 용해되지만, 용해도가 작은 칼슘이온이나 바륨이온이 포함되어 있을 때에는 이온과 결합하여 물에 녹지 않는 겔이 생성되는데, 이 겔이 alginate bead가 된다. 이러한 alginate bead는 알긴산의 함량에 따라 비드의 뭉침 정도가 변하게 되는데, 농도가 높을수록 강도가 강해져 반응온도와 반응시간에 따라 비드의 풀림 현상이 줄어들어 장시간 반응 동안 안정적으로 cadaverine 생산이 가능하게 되었다.

본 연구에서는 1, 2, 3, 4, 5% 각각 다른 함량을 가지는 PANI/Ba-alginate bead를 제조하여 cadaverine 전환율에 미치는 영향을 실험하였다. Fig. 4은 algnate 농도에 따른 영향을 나타내었다. 이때 전환율 (%)은 체류시간인 4%를 사용한 경우 86%로 가장 높은 전환율의 결과를 보여주었다. 1%의 alginate bead는 장시간 반응 시 약간의 풀어짐 현상이 있었으나 50%의 전환율을 나타냈다. 5% alginate bead의 경우 풀어짐 현상은 없었으나 알긴산 함량이 높아 비드 내부로 기질이 전달되지 못해 효소와 기질이 충분히 반응을 하지 못하는 단점이 발생하였다. Fig. 4의 결과에서 확인할 수 있듯이 3~4% alginate bead가 대체로 높은 전환율과 안정성을 보였으며, 3% 알긴산염은 안정적인 전환율의 시간이 짧아 평균적인 cadaverine 전환율이 짧은 반면 4% 알긴산염은 전환율이 86%로 보다 안정적으로 생산하는 모습을 보였다. 이후 연속식 cadaverine 생산의 알긴산염 최적 농도는 4%로 제작해 진행하였다.

Fig. 4.

The effect of alginate concentrations on cadaverine conversion. (pH 5.5, 130 rpm and τ = 33 hr).

3.5. Barium chloride 농도 변화에 따른 전환율

알긴산의 글루론산 유닛의 함량이 많을수록 굳고 견고한 다공성 젤을 형성하여 2가 양이온과 가교결합이 되어 있는 경우는 수축과 팽윤이 빈번히 발생하지 않고 본래의 형태를 유지한다. 이전 실험에서 여러 종류의 2가 양이온을 반응시킨 결과 Ba2+이온을 가지는 barium chloride를 이용하여 진행하였다. Cadaverine 생산 최적화 조건을 확립하기 위해 barium chloride의 농도별 실험을 통해 확인하였다. Ba-alginate만을 사용한 결과 [22]로는 0.1 M에서 가장 높은 activity를 보였고, 농도를 점차 증가할수록 전환율이 감소하는 결과를 보여주었다. 농도가 높은 0.5 M에서는 전환율이 감소하여 65%의 전환율을 나타냈다. PANI/Ba-alginate를 사용하고 장기간 운전하는 본 연구에서는 Fig. 5에서 보이듯이 이전에 발표된 결과와는 다른 경향을 보였다. 이때 전환율 (%)은 이전의 alginate 농도와 관련된 그래프와 마찬가지로 체류시간인 33시간에서의 가장 높은 86%를 보였으며 다른 농도의 경우에는 낮게 나타났다. 모든 농도에서 40% 이상의 전환율을 보였으며, 0.5 M BaCl2가 가장 높은 전환율을 나타났다. 0.2 M BaCl2 또한 높은 cadaverine 생산성을 보였지만, 연속운전 30시간 이후 0.5 M BaCl2를 사용한 경우보다 안정성에서 뒤떨어지는 경향이 나타나 barium chloride 최적 농도를 0.5 M로 하여 연속 반응기를 운전하였다.

Fig. 5.

The effect of barium chloride concentration on cadaverine conversion. (pH 5.5, 130 rpm and τ = 33 hr).

3.6. 연속 효소반응기 (Continous stirred tank reactor)의 운전 결과

본 실험에서는 반응물과 같은 상으로 존재하는 촉매인 균일 촉매 PLP를 첨가하여 진행하였다. 반응기의 역할은 각 단계의 반응을 진행함에 있어 빠르고 완벽하게 반응이 진행될 수 있는 최적의 조건을 유지시켜주는 데 있다. 본 연구에서의 반응기 설계는 cadaverine 생산에 있어 중요인자를 고려하여 연속 효소반응 공정을 개발하여 운영하였다. 기질인 300 mM lysine을 총 100 mL 기준으로 각각 3:0.5:2의 비율로 넣어주었다. 기질의 농도를 300 mM로 설정한 이유는 이전의 연구에서 10 mM부터 1000 mM의 농도에 따른 기질 저해반응 실험을 수행한 결과, 300 mM 이상의 농도에서는 반응속도가 감소함을 보였다. 반응기의 반경쟁적 저해반응으로 예측되어 이후 반응은 전환반응이 가장 효율적인 300 mM에서 진행하였다. 반응기에는 기질인 300 mM lysine을 0.05 mL/min으로 일정하게 공급해주면서 130 rpm의 연속교반 반응기에서 반응을 진행시켰다. 이 때 체류시간은 33시간이며 총 반응 시간은 144시간으로 진행하였다. Fig. 6에 표시된 것과 같이 144시간까지 PANI와 함께 고정화된 Ba-alginate 비드는 풀어짐 현상이 없으면서 안정적으로 반응이 진행되었으며 cadaverine 전환율이 80~90%로 유지되는 결과를 확인할 수 있었다.

Fig. 6.

Cadaverine conversion with CSTR (100 mL reaction volume, pH 5.5, 130 rpm and τ = 33 hr) using optimization conditions.


4. CONCLUSION

본 연구에서는 바이오기반 생산물 중에 하나인 cadaverine을 효율적으로 전환시키기 위한 최적화 반응공정을 개발하여 144시간 동안 86% 이상의 전환율을 나타내는 cadaverine 연속생산 공정을 개발하였다. 고정화 효소의 안정성 및 활성도 향상을 위해 PANI를 Ba-alginate에 분산시켜 효소 고정화율을 향상시키고 연속반응의 안정성을 향상시켰다.

Cadaverine 연속생산 최적조건을 탐색하기 위해 알긴산염 농도, 2가 양이온 선택, 및 2가 양이온 농도에 따른 cadaverine 전환율을 측정하였다. 전환 반응 시 고정화 효소 풀어짐 현상을 보완하기 위해 알긴산염 농도를 1%부터 5%까지 수행하였을 때 4% 함량을 가진 비드가 안정적으로 운전되어 최대 86% cadaverine 수율을 보였다. 그리고, 비드 생성 시 중요한 역할을 하는 2가 양이온은 바륨을 선택하였다. MgCl2, MnCl2 및 CuCl2는 전체적인 cadaverine 전환 수율이 낮았고 CaCl2는 장시간 반응 시 phosphate buffer에 노출되어 비드에서 칼슘이온의 용출현상을 촉진하기 때문에 전환에 있어 좋지 않은 영향을 미쳤다. 선택된 BaCl2를 농도별로 확인하였을 땐 0.5 M에서 30시간 이후까지 비드풀림 없이 안정성을 유지하는 경향을 확인하였다. 이러한 최적조건들을 적용하여 연속 효소반응기에 적용하였을 때 24시간부터 144시간까지 80% 이상의 전환율을 유지하면서 최대 91% cadaverine 전환 수율을 보여 안정적인 연속 전환공정이 가능함을 보였다.

Acknowledgments

이 논문은 2015년도 조선대학교 학술연구비의 지원을 받아 연구되었음.

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Fig. 1.

Fig. 1.
SEM images of LDC immobilized PANI/Ba-alginate beads after LDC immobilization (A) immobilized beads, (B) enzyme reactor, (C) SEM images (×100), (D) SEM images (×1.0K), (E) SEM images (×10.0K), and (F) SEM images (×50.0K).

Fig. 2.

Fig. 2.
Changes in cadaverine conversion before (-O-) and after (-∇-) PANI addition (pH 5.5, 130 rpm and τ = 33 hr).

Fig. 3.

Fig. 3.
Effect of various divalent cations on cadaverine conversion (pH 5.5, 130 rpm and τ = 33 hr).

Fig. 4.

Fig. 4.
The effect of alginate concentrations on cadaverine conversion. (pH 5.5, 130 rpm and τ = 33 hr).

Fig. 5.

Fig. 5.
The effect of barium chloride concentration on cadaverine conversion. (pH 5.5, 130 rpm and τ = 33 hr).

Fig. 6.

Fig. 6.
Cadaverine conversion with CSTR (100 mL reaction volume, pH 5.5, 130 rpm and τ = 33 hr) using optimization conditions.