The Korean Society For Biotechnology And Bioengineering
[ Review Paper ]
Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 33, No. 2, pp.63-69
ISSN: 1225-7117 (Print) 2288-8268 (Online)
Print publication date 30 Jun 2018
Received 24 Apr 2018 Revised 18 May 2018 Accepted 21 May 2018
DOI: https://doi.org/10.7841/ksbbj.2018.33.2.63

Type-3 Copper 효소로서 티로시나아제의 구조 및 기능적 특성에 관한 고찰

강응수 ; 김선영 ; 최유성*
충남대학교 응용화학공학과
Structural and Functional Properties of Tyrosinases as a Type-3 Copper Enzyme
Eungsu Kang ; Sun Young Kim ; Yoo Seong Choi*
Department of Chemical Engineering & Applied Chemistry, Chungnam National University, Daejeon 34134

Correspondence to: Department of Chemical Engineering & Applied Chemistry, Chungnam National University, Daejeon 34134, Korea Tel: +82-42-821-5682, Fax: +82-42-822-8995 e-mail: biochoi@cnu.ac.kr


© 2018 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering

Abstract

Tyrosinases, as a representative type-3 copper enzyme (two copper ions in the active site), catalyze the ortho-hydroxylation of monophenols and the oxidation of diphenols. It is ubiquitously distributed in various organisms all around the nature world. The catalytic mechanism of tyrosinases was intensively studied for a long time. On the other hand, some structural data have been reported recently. This review summarizes the structural information of overall three-dimensional structure and active site region. The overall structure can be divided into three domains and some characteristic conserved sequences are observed, although tyrosinases do not have a common structure in all species. The catalytic mechanism is based on the structural characteristics that are significantly important to understand the functional properties in tyrosinases, which can be efficiently applied into industrial and biomedical applications of the enzymes.

Keywords:

enzyme, tyrosinase, monophenolase, diphenolase

1. INTRODUCTION

티로시나아제 (tyrosinase)는 활성부위 (active site)에 구리 (copper)를 함유하고 있는 대표적인 효소로서, 미생물, 곰팡이, 절지동물, 식물, 동물에 이르기까지 다양한 생명체에서 널리 발견되고 있다 [1]. 티로시나아제는 기본적으로 L-tyrosine을 L-3,4-dihydroxyphenylalanine ( L-DOPA)로 전환하는 monophenolase 활성과 L-DOPA를 Dopaquinone으로 전환하는 diphenolase 활성을 갖는 효소로 알려져 있으나, L-tyrosine과 L-DOPA 이외에 다양한 페놀 및 카테콜 그룹을 함유하는 물질의 산화반응을 또한 촉매한다 [2,3]. 이러한 측면에서 티로시나아제는 동물의 멜라닌 (melanin) 색소의 생합성, 사과 및 바나나와 같은 과일의 갈변 현상, 여러 무척추동물에서의 상처 부위 경화, 박테리아의 경우 자외선으로부터 DNA 보호 등 다양한 생명 현상에 관여하며, 산업적 측면에서 의약품, 플라스틱, 항산화제, 농화학물질의 합성과 관련된 카테콜 유도체의 생합성, 카테콜 그룹을 포함하는 고분자 생체재료, 극미량의 방향족 화합물 양을 측정하는 바이오센서, 폐수에 존재하는 방향족 물질의 독성 제거 등 다양한 분야에 활용될 가능성이 높다 [4].

활성부위에 두 개의 구리를 포함하는 티로시나아제는, 단지 diphenolase 활성만을 갖는 카테콜 산화효소 (catechol oxidase)와 리그닌 생합성/분해에 관여하는 라카아제 (laccase) 및 무척추동물의 호흡에서 산소운반체로 쓰이는 헤모시아닌 (hemocyanin) 등과 구조적으로 비슷한 특성을 지니고 있다. 구리는 생물체 내에서 몇몇 단백질의 활성부위에 존재하여 전자전달 (electron transfer)을 수반하는 다양한 생물학적 반응에 관여하고 있다. 활성부위에 구리를 함유하는 단백질은 대체적으로 활성부위에 있는 구리 주위의 환경과 분광학적 특성에 의해 Type-1, Type-2, Type-3 등의 형태로 분류되며, 여기서 티로시나아제는 4개의 헬릭스 (helix)에 위치하는 6개의 히스티딘 잔기에 의해 보존된 활성부위가 각각 3개의 히스티딘 잔기에 의해 배열된 두 개의 구리와 산소 (dioxygen)를 매개로 한 정방정계 (tetragonal)의 구조를 이루는 Type-3 copper family에 속한다 (Fig. 1(A)) [3,5,6]. 본 논문에서는 지금까지 밝혀진 티로시나아제의 3차 구조 정보를 바탕으로 티로시나아제의 전체적인 구조적 특성과 구조에 기반한 활성부위의 기능적 특성에 대하여 고찰하려 한다.

Fig. 1.

(A) The active site structure of mushroom tyrosinase (A. bisporus); The side chains of histidine residues are rendered as sticks, while copper ions (brown) and bridging oxygen (red) are described as spheres [31]. (B) the typical architecture of the core domain of tyrosinases [8]. (C) Tyrosinase from B. megaterium and its characteristic sequence motifs for copper binding. (D) C-terminal domain (red) and central domain (blue) of melB tyrosinase from A. oryzae [25]. (E) Tyrosinase from S. castaneoglobisporus in complex with caddy protein (shown in cyan).


2. 티로시나아제의 구조적 특성

티로시나아제는 모든 종에서 공통적인 구조로 나타나지 않고, 발견되는 균주의 특성, 조직 분포 및 세포에서의 발현 위치에 따라 다양한 단백질 서열 및 크기, 단백질의 당화 패턴, 효소 활성화 등 여러 측면에서 다르게 보고되고 있다. 구체적으로, 다양한 후생동물 (metazoan), 진핵생물종 (eukaryotic species), 원핵생물종 (prokaryotic species)의 게놈정보 및 계통발생학적/구조적 분석에 기초하였을 때, 시그널펩타이드 (signal peptide)를 함유하여 외부로 분비되는 티로시나아제 (α-subclass)와 세포의 시토졸 (cytosol)에 존재하는 티로시나아제 (β-subclass) 그리고 세포막에 결합하는 형태 (γ-subclass)로 분류되고 있고 [7], 특히 박테리아 유래의 티로시나아제의 경우는 단백질의 구조와 기능적 측면에서, caddie 단백질의 존재 여부, C-말단 도메인 (C-terminal domain)의 존재 여부, 구조적 유사성은 낮지만 반응 특성이 유사성 측면에서 5가지 형태로 구분되고 있다 [8]. 하지만 전반적으로 볼 때, 티로시나아제의 전체 구조는 크게 N-말단 도메인 (N-terminal domain), C-말단 도메인, 중심 도메인 (central domain)의 세 부분으로 나뉘어지며, 각각의 효소는 모든 도메인을 갖고 있거나 일부 도메인만으로 구성된다 [9,10].

중심 도메인은 대체로 산소와 결합하는 하나의 motif, 구리와 결합하는 두 개의 motif를 공통적으로 포함한다. 산소와 결합하는 하나의 motif는 (방선균 (S. castaneoglobisporus) 및 바실러스 (B. megaterium) 유래의 티로시나아제 서열에서 대표적으로 보이는) PYWDW 형태의 서열로 구성되어 있고 일부 서열의 차이는 있으나 대체적으로 여러 균주에서 공통적으로 나타나고 있다 (Fig. 1(B)). 두 개의 산화된 구리 이온 자리는 CuA와 CuB을 포함하는 보존된 6개의 히스티딘 잔기를 중심으로 구성되어 있으며, 그 중 CuB 자리가 CuA 자리보다 더욱 잘 보존된 아미노산 서열에 의해 형성된다 (Fig. 1(C)) [9,11]. 일부 누룩곰팡이 (A. oryzae) 및 우미균 (V. spinosum) 유래의 티로시나아제의 경우 시스테인 (cysteine) 잔기가 첫 번째 CuA 자리를 안정화하는 데 매우 중요한 역할을 하는 것으로 보여지기도 한다 [8]. 또한, C-말단 도메인이 존재하는 일부 박테리아와 진핵생물 티로시나아제에서는 중심 도메인의 뒷부분에 Yx(Y/F) motif가 보존되고 있는데, 이는 티로시나아제 N-말단 근처의 아르기닌 (arginine) 잔기와 수소결합을 형성하여 caddie 단백질이 존재할 경우 이를 해리하거나 C-말단 도메인이 제거된 티로시나아제를 안정화하는데 관여하는 것으로 여겨지고 있다 [8,12].

한편, N-말단 도메인은 세포 내에서 티로시나아제의 최종 위치를 지정한 이후 분해되는 일종의 수송 펩타이드 (transit peptide) 역할을 하는 것으로 여겨진다 [13-16]; 식물에 존재하는 티로시나아제의 N-말단 도메인은 효소를 엽록체로 향하게 하고, 사람과 쥐에서는 멜라노좀 이동 (melanosome transfer)과 연관되어 있다고 판단된다. 세포질에 존재하는 곰팡이의 티로시나아제는 별도의 수송 펩타이드가 존재하지 않고, 방선균 및 우미균과 같은 일부 박테리아에서는 TAT 시그널펩타이드가 효소의 분비에 관여하고 있다.

누룩곰팡이 (A. oryzae) 및 우미균 (V. spinosum) 유래의 티로시나아제에서 주로 보고된 C-말단 도메인은 중심 도메인과 연결되어 티로시나아제의 활성 부위 입구를 막아 티로시나아제가 전구효소 (pro-enzyme)로 존재하도록 하는 역할을 한다 (Fig. 1(D)). 티로시나아제의 활성은 C-말단 도메인의 존재 하에서도 종종 나타나지만 단백질 분해효소에 의해 C-말단 도메인이 절단되었을 때 최적일 것으로 여겨지며, 세포 밖에서 단백질의 인위적 구조변화 (conformational change) 유발을 통해 활성부위를 열어 효소를 활성화시키는 것 또한 가능하다 [6,14]. 방선균 (S. castaneoglobisporus) 유래의 티로시나아제는 C-말단 도메인을 포함하고 있지 않지만, C-말단 도메인과 유사하게 별도의 caddie 단백질에 의해 활성부위가 보호되고 있다 (Fig. 1(E)) [10]. 반면 바실러스 (B. megaterium) 유래의 티로시나아제는 앞에서와 마찬가지로 C-말단 도메인을 포함하고 있지 않지만, 방선균 유래의 티로시나아제와 달리 별도의 caddie 단백질이 없어 그 자체로 항상 활성을 띄는 형태를 유지하기도 한다 [17]. 하지만 누룩곰팡이 (A. oryzae) 유래의 티로시나아제처럼 별도의 C-말단 도메인이 존재하지 않음에도 불구하고 효소의 활성부위가, 앞의 바실러스 유래의 것과 달리, 외부로 노출되지 않은 경우도 있다 [18].


3. 티로시나아제의 활성부위

티로시나아제의 활성부위는 반응 기질인 phenolic 화합물과 산소와 상호작용하며, 활성부위의 산화된 수준에 따라 (oxy)-티로시나아제, (met)-티로시나아제, (deoxy)-티로시나아제의 세 가지 형태로 나타난다 (Fig. 2) [19-22]. (oxy)-티로시나아제는 여섯 개 히스티딘 (histidine) 잔기의 질소와 두 개의 구리이온 (Cu2+)이 산소와 결합하여 생성된 정방정계 구조의 활성부위를 갖는 형태로, monophenol을 기질로 활용하여 diphenol로 전환하는 반응에 관여하거나 diphenol과 결합하여 quinone을 생성하고, 그 자신은 (met)-티로시나아제의 형태로 변환된다. (met)-티로시나아제는 정제된 티로시나아제에서 가장 많이 나타나는 형태로 활성부위의 구조가 (oxy)-티로시나아제와 비슷하지만 두 개의 구리이온 (Cu2+)에 산소 대신 수산기가 연결되어 있고, diphenol을 quinone으로 전환한 후 그 구조가 (deoxy)-티로시나아제의 형태로 변환된다. monophenol은 (met)-티로시나아제와 결합은 가능하나 이러한 형태의 효소에 의해서 산화반응이 일어나지는 않는다. 마지막으로 (deoxy)-티로시나아제는 산소 또는 수산기가 결합되어 있지 않은 Cu+-Cu+ 형태로, 산소가 존재할 경우 빠르게 산소와 결합하여 티로시나아제의 활성의 띄기 위한 (oxy)-티로시나아제로 구조가 바뀐다. 일부 diphenolase 활성 경로로 phenolic 화합물과 반응하는 (oxy)-티로시나아제의 경우, 활성부위에 있는 하나의 구리이온 (Cu2+)이 중성화 (Cu0)되면서 불활성화 되고 확산에 의해 활성부위로부터 밖으로 나가게 되기도 한다 (suicide inactivation).

Fig. 2.

Oxidation states and reaction mechanism of tyrosinase [13].

활성부위에 구리이온의 존재는 촉매 활성에 매우 중요하다. 단백질 외부에서 활성부위로의 구리이온이 어떻게 유입되는지에 대하여 아직까지 명확히 밝혀지지는 않았지만, 티로시나아제는 각각의 구조와 주어진 환경에 맞추어 개별적으로 다른 메커니즘을 통해 구리가 활성부위에 도입되는 것처럼 보인다; 동물세포와 효모로부터 유래한 티로시나아제는 구리이온의 도입을 위해 시스테인 (cysteine)과 메티오닌 (methionine) motif를 활용하여 구리 metallochaperone 및 트랜스포터를 이용한다 [23,24]. 누룩곰팡이 (A. oryzae)와 방선균 (S. castaneoglobisporus)과 같이 caddie 단백질이 존재하는 티로시나아제는 caddie 단백질 및 티로시나아제 C-말단 도메인에 존재하는 보존된 (구리 metallochaperone에서 발견되는) CXXC motif의 도움을 받아 구리를 활성부위에 도입한다 [25,26]. 반면, 바실러스 (B. megaterium) 유래 티로시나아제와 같이 C-말단 도메인 또는 caddie 단백질이 존재하지 않는 경우는 단백질의 표면에 노출되어 있는 메티오닌 (methionine) 또는 히스티딘 (histidine) 잔기로부터 활성부위로 구리 전달을 위한 네트워크를 구성하여 구리를 활성부위에 도입한다 [27]. 한편, 활성부위에 도입된 구리는 단백질 내에서 구조적으로 안정적으로 유지되며 효소 반응에 관여하기도 하지만, 활성부위에서 결합력이 약하여 단백질 구조 내에 안정적으로 존재하지 않고 쉽게 단백질 밖으로 용출되기도 한다 [28]. 이러한 특징은 티로시나아제를 이용한 효소 반응시 구리 이온에 대한 추가적인 고찰을 필요로 한다. 한편, 활성부위의 CuB 자리를 구성하는 히스티딘과 약 3~5 A 거리에 공통적으로 존재하는 메티오닌 잔기 또한 구리의 활성부위 도입에 관여하는 것으로 보인다 [13]. 이러한 보존된 메티오닌 잔기는 활성부위의 히스티딘 잔기의 배향을 안정화할 뿐만 아니라 티로시나아제 반응 중에 생성되고 활용되는 H2O2를 포획하여 H2O2가 세포에 미칠 수 있는 영향을 억제하고 효소의 활성을 조절하는 데에도 활용된다고 판단된다 [29].

한편, 활성부위의 CuA와 CuB 자리 위쪽의 입구 방향에 외부로부터의 접근을 억제하고 있는 아미노산 잔기들이 공통적으로 존재한다. 이러한 잔기들은 페닐알라닌 (phenylalanine), 티로신 (tyrosine)과 같은 방향족 아미노산 및 루이신 (leucine), 발린 (valine)과 같은 소수성 아미노산으로 구성되어 있으며, 원하지 않는 효소반응을 억제하거나 활성부위에서 반응기질의 배향 조절에 관여하여 경우에 따라서는 monophenolase 및 diphenolase 반응성에 중요한 역할을 하기도 한다 [13]. 뿐만 아니라, 구조적으로 보존되어 있는 H2O 분자가 지금까지 알려진 티로시나아제에 공통적으로 존재한다. 이러한 H2O는 티로시나아제에서 보존된 아스파라진 (apparagine)과 글루타메이트 (glutamate)에 의해 적절히 배열되어 활성화되고, 효소반응 시 monophenol로부터 하나의 proton을 뽑아내어 diphenol로의 전환에 관여한다 (Fig. 3) [17,30]. 그리고 이러한 보존된 아스파라진과 글루타메이트 잔기는 티로시나아제의 monophenolase 활성에 결정적이며, 티로시나아제와 구조가 매우 유사하지만 monophenolase 활성이 없는 카테콜산화효소 (catechol oxidase)에서는 나타나지 않아 [30], 티로시나아제의 특징적인 반응특성인 monophenolase 활성에 대한 이해를 더욱 높이고, 공학적 측면에서 효소를 개발/활용하는 데 발판이 될 것으로 판단된다.

Fig. 3.

Deprotonation and binding of a phenolic substrate in the active site of a tyrosinase [30].


4. 산업적 활용 측면에서 티로시나아제의 이해

현재 추출에 의해 얻어진 버섯 유래의 티로시나아제는 상업적으로 Sigma에서 판매되고 있으나, 추출을 통해 균질의 동일 효소를 얻기 어려울 뿐만 아니라 (batch-to-batch variability), 티로시나아제 이외에 라카아제 (laccase), 베타-글루코시다아제 (β-glucosidase), 셀룰라아제 (cellulase), 키티나제 (chitinase) 등 특정되지 않은 다른 효소를 또한 불순물로 일부 포함하고 있다 [31,32]. 이런 측면에서 티로시나아제 유전자를 이용하여 외래 균주에서 재조합 단백질로 생산하는 전략은, 목적에 맞게 효소를 설계/개량하는 경우에도 상대적으로 매우 유용하여 효율적인 전략이 될 수 있다. 하지만 티로시나아제의 경우 단백질의 접힘 특성에 기인하여 재조합 균주에서 활성이 잘 나타나도록 발현하기 어려워, 다양한 생명체에 매우 널리 분포하고 있음에도 불구하고 지금까지 보고된 재조합 티로시나아제는 상대적으로 많지 않다 [4,33]. 그리고 단백질의 생화학적 메커니즘 이해를 위한 돌연변이 유발 연구 이외에, 산업적 활용을 고려한 효소의 활성과 안정성, 그리고 기질특이성 향상을 위한 효소 개량 연구 사례도 많이 보고되고 있지 않다. 몇몇 예로 C-말단 도메인을 갖고 있는 티로시나아제에서 C-말단 도메인을 제거하여 재조합 티로시나아제에서 효소 활성을 약 100배정도 증가시키거나 [34] 효소의 활성을 유지하면서 동시에 효소의 안정성과 monophenolase 활성을 높인 경우 [28], monophenolase/diphenolase 활성비가 높게 보고되었으나 효소의 활성이 낮아 티로시나아제의 돌연변이 유발을 통해 활성을 높이고자 하는 시도 등이 있다 [35].

산업적 측면에서 티로시나아제의 활용은, 멜라닌 생합성에서부터 파킨슨 질환에 대한 주요 약물로 사용될 수 있으면서 동시에 다양한 생체재료의 표면 코팅에 활용될 수 있는 DOPA 제조, 카테콜 그룹을 포함하고 있는 의약품 중간체 및 phytochemicals의 생합성, DOPA를 함유하는 생체고분자물질 제조와 더불어 이를 가교하여 얻을 수 있는 바이오소재 등 다양하다 [4]. 특히, 화학적 반응 경로에 의한 카테콜 유도체의 제조는 상대적으로 환경친화적이지 않은 화합물의 사용과 더불어 복잡한 다단계의 반응을 요구하면서도 그 수율이 낮아, 별도의 cofactor 없이도 다양한 기질에 대하여 monophenolase 활성을 갖는 티로시나아제의 생화학적 특성은 산업적 활용 측면에서 매우 흥미롭다. 하지만, 통상적으로 알려진 티로시나아제의 monophenolase 활성은 diphenolase 활성에 비하여 수십~수백 배 이상 낮고, 일부 카테콜의 경우 중성/약염기성 및 높은 온도에서 안정성이 낮다 [36,37]. 이러한 측면에서 높은 효소 활성을 갖고 있으면서 동시에 monophenolase/diphenolase 활성비를 증가시키고자 하는 여러 시도가 있었으나, 지금까지 알려진 diphenolase에 비해 monophenolase 활성이 뛰어난 효소는 풋마름병원균 (R. solanacearum) 및 해양극지고세균 (C. N. koreensis)에서 얻어진 티로시나아제 정도여서 [28,37], 추가적인 단백질의 3차원 구조에 대한 이해를 바탕으로 티로시나아제의 monophenolase와 diphenolase 활성의 구조 및 메커니즘 적 차이에 대한 연구가 더욱 필요할 것으로 판단된다.


5. CONCLUSION

티로시나아제는 특징적인 monophenolase 반응과 diphenolase 반응을 촉매하여, 멜라닌의 생합성으로부터 다양한 의약품 중간체 및 카테콜 화합물의 민감한 검출에 활용될 가능성이 높은 대표적인 Type-3 copper 효소이다. 본 논문에서는 미생물에서부터 동물에 이르기까지 널리 분포되어 있는 티로시나아제의 전반적인 구조와 더불어 촉매 반응을 수행하는 활성부위의 구조적/생화학적 특성에 대하여 정리하였다. 이러한 티로시나아제에 대한 구조/기능적 정보는 자연계에서 일어나는 monophenolase와 diphenolase 반응의 생화학적 특성을 이해하는 발판이 될 것이고, 바이오화학/바이오소재를 포함하는 다양한 생명공학 분야에 상기 효소를 효율적으로 활용하기 위한 직관적인 정보를 제공할 것이 기대된다.

Acknowledgments

본 연구는 2016년도 충남대학교 학술연구비의 지원을 받아 수행되었습니다. 이에 감사드립니다.

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Fig. 1.

Fig. 1.
(A) The active site structure of mushroom tyrosinase (A. bisporus); The side chains of histidine residues are rendered as sticks, while copper ions (brown) and bridging oxygen (red) are described as spheres [31]. (B) the typical architecture of the core domain of tyrosinases [8]. (C) Tyrosinase from B. megaterium and its characteristic sequence motifs for copper binding. (D) C-terminal domain (red) and central domain (blue) of melB tyrosinase from A. oryzae [25]. (E) Tyrosinase from S. castaneoglobisporus in complex with caddy protein (shown in cyan).

Fig. 2.

Fig. 2.
Oxidation states and reaction mechanism of tyrosinase [13].

Fig. 3.

Fig. 3.
Deprotonation and binding of a phenolic substrate in the active site of a tyrosinase [30].