The Korean Society For Biotechnology And Bioengineering
[ Research Paper ]
Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 33, No. 2, pp.83-88
ISSN: 1225-7117 (Print) 2288-8268 (Online)
Print publication date 30 Jun 2018
Received 04 Apr 2018 Revised 25 Apr 2018 Accepted 27 Apr 2018
DOI: https://doi.org/10.7841/ksbbj.2018.33.2.83

Clostridium autoethanogenum 배양에서 배지조성이 균주 성장과 생성물 생산에 미치는 영향

안보혜 ; 박소은 ; 김영기*
한경대학교 화학공학과, 해양과학기술연구센터
Effect of Medium Composition on Cell Growth and Product Formation in Clostridium autoethanogenum Culture
Bohye Ahn ; Soeun Park ; Young-Kee Kim*
Department of Chemical Engineering and Research Institute for Marine Science and Technology, Hankyong National University, Anseong 17579

Correspondence to: Department of Chemical Engineering and Research Institute for Marine Science and Technology, Hankyong National University, Anseong 17579, Korea Tel: +82-31-670-5206, Fax: +82-31-670-5209 e-mail: kim@hknu.ac.kr


© 2018 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering

Abstract

In this work, optimization of the culture medium in the fermentation process of Clostridium autoethanogenum, an acetogenic microorganism, to produce ethanol from synthesis gas, was examined to improve the ethanol production. The components of culture medium, such as fructose, NH4Cl, and K2HPO4, were selected as influence factors for cell growth and ethanol production. As the concentration of fructose increased, the cell mass increased from 0.178 to 1.069 at yeast extract of 0.5 g/L and the cell mass increased from 0.715 to 2.260 at yeast extract of 5 g/L. But the ethanol production decreased when the concentration of fructose was higher than that of base medium (5 g/L). And the specific ethanol productivity was the highest when fructose was not used. Cell growth and ethanol production were not significantly influenced by NH4Cl concentration, however growth inhibition was observed at 30 g/L of NH4Cl. As the concentration of K2HPO4 increased, both of cell growth and ethanol production increased. From experiments with NH4Cl and K2HPO4, specific ethanol productivities were higher when low quantity of yeast extract (0.5 g/L) was used.

Keywords:

acetogen, bioethanol, culture medium, optimization, Clostridium autoethanogenum

1. INTRODUCTION

화석 연료의 사용은 환경 문제와 자원 고갈을 초래하며, 이를 극복하기 위한 여러가지 시도 중 하나로 바이오연료와 같은 재생 에너지의 개발 및 활용이 활발히 이루어지고 있다 [1]. 바이오 에탄올은 바이오가스와 함께 가장 오랫동안 연구 개발이 이루어졌고, 상업적 생산도 활발히 이루어지고 있다. 1세대 바이오에탄올 생산 기술은 옥수수, 사탕수수와 같은 농업생산품을 원료로 활용하여 개발되었으며, 자원고갈과 환경오염의 대책으로 상업적인 성공을 이루었다 [2]. 하지만 이와 같은 곡물계 바이오매스의 수확을 위해서는 대규모의 경작지가 필요하고 재배에 오랜 시간이 걸리며 작황에 영향을 받는 문제가 있었고, 특히 식량 용도로도 사용 가능한 생산품을 원료로 사용함에 따라 식량 수급과 가격 급등의 문제를 야기하였다. 이에 대한 대안으로 리그노셀룰로오즈를 기반으로 하는 목질계 바이오매스를 이용한 바이오에탄올 생산 기술이 개발되었다 [3]. 목초, 폐지, 목재칩 등을 포함하는 목질계 바이오매스는 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스와 리그닌으로 이루어져있으며, 바이오매스 중 셀룰로오즈의 화학적 가수 분해나 효소 분해를 통해 생성된 당을 발효하여 에탄올을 얻는 것을 2세대 바이오에너지 생산 기술이라고 할 수 있다 [4]. 리그노셀롤로오스의 화학적, 생물학적 가수분해를 위해서는 리그닌의 제거가 필요하며, 이를 위한 전처리 과정이 들어가면 공정이 복잡해지고 경제성이 낮아지는 문제가 있다. 화학적 가수분해나 효소 반응과는 달리 가스화 (gasification)는 리그닌을 비롯한 바이오매스의 모든 성분을 합성 가스 (synthesis gas)로 전환시킬 수 있으며, CO, CO2, H2 및 N2로 구성된 합성가스를 이용할 수 있는 능력을 가지는 박테리아에 의해 발효되어 에탄올, 부탄올 등 바이오연료로 전환가능하다 [5-8]. Clostridium autoethanogenum과 같은 acetogen은 혐기 조건에서 Wood-ljungdahl pathway를 통하여 에탄올과 아세트산 등의 유용산물을 생산할 수 있다 [9,10]. 합성가스 중 CO는 acetogen의 주 탄소원으로 사용되고, 수소는 전자공여체 (electron donor)로 사용된다. Acetogen는 acetyl-CoA를 생성하며, 이 acetyl-CoA가 에탄올과 아세트산으로 전환되는 과정을 거친다. 생산된 아세트산은 아세트알데하이드를 거쳐 에탄올로 다시 전환될 수 있다 [11-14]. 이러한 일련의 과정에서 일어나는 반응식을 정리하면 식 (1)-(7)과 같다 [15].

CO+H2O→H2+CO2(1) 
4CO+2H2O→CH3COOH+2CO2(2) 
6CO+3H2O→CH3CH2OH+4CO2(3) 
2CO+2H2→CH3COOH(4) 
2CO+4H2→CH3CH2OH+H2O(5) 
4H2+2CO2→CH3COOH+2H2O(6) 
6H2+2CO2→CH3CH2OH+3H2O(7) 

가스화를 이용한 바이오매스의 합성가스로의 전환과 생물 촉매를 이용한 합성가스로부터 바이오 에탄올 생산은 최근 연구가 본격적으로 이루어지고 있다. 하지만, acetogen의 느린 성장 속도, 낮은 에탄올 생산성은 공정의 실용화 및 상업화에 걸림돌이 되고 있다. 이 문제를 해결하기 위해서 유전공학적 균주 개량과 함께 반응기 설계 최적화 등 공정공학적 접근이 이루어지고 있다 [16,17]. 본 연구에서는 합성가스의 생물학적 전환을 위한 생체 촉매로 acetogen의 하나인 C. autoethanogenum을 사용하여, 연구가 미진한 배양배지 조성 변화에 따른 미생물 성장과 에탄올 생산 향상을 시도하였다. 배양배지 최적화를 위해 배지 성분 중 fructose, NH4Cl, 그리고 K2HPO4의 농도의 변화에 따른 균주의 성장과 에탄올, 아세트산 생산에 미치는 영향을 고찰하였다.


2. MATERIALS AND METHOD

2.1. 실험 재료 및 배양배지

실험에 사용된 Clostridium autoethanogenum JA1-1 (DSM 10061) 균주는 German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ)에서 구입하였다. 배양을 위한 기본배지 조성은 다음과 같다. 기본 배지는 NH4Cl 1.0 g/L, K2HPO4 0.33 g/L, MgCl2 0.52 g/L, CaCl2·2H2O 0.1 g/L, KCl 0.33 g/L, NaCl 1.0 g/L, NaHCO3 1.0 g/L, yeast extract 0.5 g/L, resazurin 0.001 g/L, L-cysteine·HCl 0.5 g/L, Na2S·9H2O 0.5 g/L, fructose 4 g/L, 1 M phosphate buffer solution 10 mL/L, trace element solution 10mL/L, vitamin solution 1 mL/L로 구성된다. Trace element solution은 nitrilotriacetic acid 1.5 g/L, MgSO4·7H2O 3.0 g/L, MnSO4·H2O 0.5 g/L, NaCl 1.0 g/L, FeSO4·7H2O 0.1 g/L, CoSO4·7H2O 0.18 g/L, CaCl2·2H2O 0.10 g/L, ZnSO4·7H2O 0.18 g/L, CuSO4·5H2O 0.01 g/L, KAl(SO4)2·12H2O 0.02 g/L, H3BO3 0.01 g/L, Na2MoO4·2H2O 0.01 g/L, NiCl2·6H2O 0.03 g/L, Na2SeO3·5H2O 0.0003 g/L, Na2WO4·2H2O 0.0004 g/L, vitamin solution은 biotin 20 ml/L, folic acid 20 mg/L, pyridoxine·HCl 100 mg/L, thiamine·HCl 50 mg/L, riboflavin 50 mg/L, nicotinic acid 50 mg/L, D-Ca-pantothenate 50 mg/L, p-aminobenzoic acid 50 mg/L, vitamin B12 10 mg/L, lipoic acid 50 mg/L으로 이루어져 있다. 실험에 사용된 합성가스는 MS 동민가스 (Gyeonggi-do, Korea)에서 주문 제조하여 공급되었으며 20 vol% CO, 20 vol% CO2, 10 vol% H2, 50 vol% N2의 조성으로 구성되어있다.

2.2. 실험 방법

2.2.1. 배지조성 변화 배양실험

250 mL 백색 메디아병에 75 mL의 배양 배지를 넣은 후 특수 제작된 마개의 유입튜브에 N2를 3~5분 동안 연속적으로 퍼지하여 배지 내 산소를 제거하였다. 계대배양을 통해 얻어진 균주 배양액을 배지의 10 vol% 접종하고 균주가 접종된 배지에 합성가스를 5~7분 동안 주입하였다. 메디아병 내의 압력은 120 kPa 내외로 대기압보다 약간 높게 유지되도록 조절하였다. 합성가스가 주입된 메디아병은 온도가 37oC로 유지되는 shaking incubator에서 200 rpm의 교반 조건으로 배양하였다. 배양액의 시료 채취는 마개에 준비된 유출튜브에 주사기를 설치하여 수행하였다. 배지 조성에 따른 영향을 관찰하기 위해 사용된 영향인자는 fructose, NH4Cl, K2HPO4의 세가지 성분을 선정하여 사용하였다. 균주의 성장과 에탄올/아세톤의 생산에 영향인자가 끼치는 영향 파악을 위해 기본 배지에 해당 영향인자의 조성을 변화시켜 배양실험을 수행하였다. Fructose의 기본배지에서의 농도는 4 g/L이지만, 본 연구에서는 0, 5, 10, 15 g/L의 농도에서 실험을 통해 성장과 생산에 미치는 영향을 파악해 보았다. 기본 배지에서 NH4Cl과 K2HPO4의 농도는 각각 1.0 g/L와 0.33 g/L이며, 본 연구에서는 NH4Cl은 1.0, 10, 30 g/L, K2HPO4는 0.33, 3.3, 33 g/L의 농도에서 실험을 통해 배지 조성이 배양에 미치는 영향을 분석하였다. Clostridium 속의 배양에서 환원력 부족이 균주 성장에 끼치는 영향이 매우 큰 것으로 알려져 있으며, 이에 대응하고자 yeast extract를 과량 사용할 경우 균주 성장은 크게 향상되나, 에탄올 생산에는 도움이 되지 않거나 악영향을 끼치는 것으로 알려져 있다 [3,10,12]. 따라서 본 연구에서 배지 성분의 변화에 따른 성장과 생산 특성 변화를 보려는 시도가 환원력 부족에 의해 저해되는 것을 피하기 위하여, yeast extract를 기본 배지에서 농도인 0.5 g/L와 그 10배인 5.0 g/L 사용한 실험을 동시에 수행하였다.

2.2.2. 분석 방법

균주의 성장을 분석하기 위하여 UV-vis 분광광도계 (Optizen POP, Mecasys Co., Korea)를 이용하여 600 nm에서 배양액의 optical density를 측정하였다. 측정된 optical density는 사전에 작성된 검량곡선에 의해 세포건조질량으로 변환하였다. 배양액 시료 내 에탄올과 아세트산의 농도는 high performance liquid chromatograph (HPLC, LC-20AT, Shimadzu Co., Tokyo, Japan)를 이용하여 측정하였으며, 컬럼은 Aminex HPX-87H column (300 mm × 7.8 mm; Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA)를 사용하고, 측정 온도는 60oC를 유지하였다. 배양액을 원심 분리하여 균주와 액상을 분리한 후, 균주가 없는 상등액을 pore size 0.45 μm인 syringe filter (6784-1304, Whatman, Germany)를 사용하여 여과하여 HPLC 분석에 사용하였다. 이동상은 5 mM 황산 용액을 0.6 mL/min의 유량으로 공급하였으며, refractive index detector를 이용하여 에탄올과 아세트산의 농도를 분석하였다 [18].


3. RESULTS AND DISCUSSION

3.1. Fructose 농도에 따른 영향

C. autoethanogenum의 fructose의 농도 변화에 따른 균주 성장 변화를 Fig. 1에 도시하였다. Yeast extract를 0.5 g/L 사용한 배지에서는 fructose를 사용하지 않은 경우 균주의 성장이 이루어지지 못하였으며, 5 g/L의 fructose 농도 이상에서 균주 질량은 12시간에 최대값이 도달하였다. Fructose 농도를 5, 10, 15 g/L로 증가시키며 투입할 때 균주의 최종 OD는 0.647, 1.010, 1.069로 증가하였다 (Fig. 1(a)). Yeast extract 5 g/L을 사용한 배양에서는 fructose 농도를 0에서 15 g/L까지 증가시킬수록 균주의 최종 OD는 0.715, 1.473, 1.906, 2.260으로 증가하였다 (Fig. 1(b)). 이상의 결과로부터 yeast extract가 충분히 공급될 경우, 배지 내 fructose 농도를 증가시켜 균주 성장 향상이 가능함을 확인하였다. C. autoethanogenum의 배양에 fructose 농도가 에탄올 및 아세트산 생산에 미치는 영향을 파악하기 위하여 36시간 배양 후 에탄올과 아세트산 농도를 분석하여 Table 1에 비교하였다. 실험 결과, fructose 농도를 증가시키면 아세트산의 생산 농도는 증가하지만, 에탄올의 생산 농도는 5 g/L의 fructose를 사용하였을 때 0.222 g/L (yeast extract 0.5 g/L), 0.249 g/L (yeast extract 5 g/L)로 가장 높고, 그 이상의 fructose 투입은 에탄올 생산농도를 감소시켰다. 하지만, 에탄올 비생산성은 균주 농도에 따라 달라지므로 fructose를 사용하지 않은 경우에 가장 높게 나타났다. Yeast extract 농도가 높을 때 생산되는 에탄올 농도는 더 높았으나, 비생산성은 전반적으로 낮아졌다.

Fig. 1.

Time course of cell mass in C. autoethanogenum culture at various fructose dose with (a) yeast extract of 0.5 g/L and (b) yeast extract of 5 g/L.

Product formation properties in C. autoethanogenum culture according to fructose concentration

3.2. NH4Cl 농도에 따른 영향

배지 내 NH4Cl의 농도 변화에 따른 C. autoethanogenum의 성장과 에탄올, 아세트산 생산 특성의 변화를 분석하고자 하였다. 균주의 성장과 유용산물 생산에 yeast extract 투입농도가 미치는 영향이 매우 크므로, 기본배지의 yeast extract 농도인 0.5 g/L와 10배에 해당하는 5 g/L의 농도에 대해 동일한 NH4Cl의 농도 변화 조건에 대한 실험을 통하여 결과를 도출하였다. Fig. 2(a), 2(b)는 각각 yeast extract 농도 0.5 g/L와 5 g/L에서 얻은 균주 성장 곡선이다. Yeast extract의 농도와 관계 없이 유사한 성장 특성을 보였으며, NH4Cl의 농도가 1 g/L, 10 g/L 일 때 균주 성장 특성은 거의 같으며, 30 g/L의 농도로 과량 투입할 경우 성장이 저해되는 현상을 보였다. 이상에서 언급된 실험에서 배양액을 분리하여, 상등액의 에탄올과 아세트산 생산농도를 분석하였으며, 이를 이용하여 에탄올/아세트산 생산비, 에탄올 비생산성을 계산하여 비교한 결과가 Table 2에 있다. Yeast extract와 NH4Cl의 농도 변화에 따른 에탄올, 아세트산 생산농도, 생산비율은 뚜렷한 차이를 관찰할 수 없었다. 하지만, Fig. 2(a), 2(b)를 비교하면 알 수 있듯이 yeast extract의 농도를 0.5에서 5 g/L로 올리면 약 2배의 균주 밀도가 나타나며, 따라서 에탄올 비생산성은 균주 밀도가 작지만 거의 동일한 에탄올 생산농도를 얻을 수 있는 yeast extract를 0.5 g/L 사용한 경우가 약 2배 이상 높다.

Fig. 2.

Time course of cell mass in C. autoethanogenum culture at various NH4Cl dose with (a) yeast extract of 0.5 g/L and (b) yeast extract of 5 g/L.

Product formation properties in C. autoethanogenum culture according to NH4Cl concentration

3.3. K2HPO4 농도에 따른 영향

배지 내 K2HPO4의 농도 변화에 따른 C. autoethanogenum의 성장과 에탄올, 아세트산 생산 특성의 변화를 분석하였다. 앞선 실험에서 확인하였듯이 균주의 성장과 유용산물 생산에 미치는 yeast extract 투입농도의 영향이 매우 크므로, 기본배지에서 yeast extract 농도인 0.5 g/L와 10배에 해당하는 5 g/L의 농도에 대해 동일한 K2HPO4의 농도 조건에서 실험을 반복하여 결과를 얻었다. Fig. 3(a), 3(b)는 각각 yeast extract 농도 0.5 g/L와 5 g/L에서 얻은 K2HPO4 농도별 균주 성장 곡선이다. Yeast extract의 농도가 0.5 g/L인 경우에는 K2HPO4 농도를 0.33, 3.3, 10 g/L로 증가시킬 때 균주의 최종 OD가 0.432, 0.561, 0.754로 증가하였다 (Fig. 3(a)). Yeast extract 농도 5 g/L에서 얻은 실험 결과도 K2HPO4 농도가 증가됨에 따라 균주의 성장이 증가하는 특성을 보였으며, yeast extract를 0.5 g/L 투입한 경우보다 동일한 K2HPO4 농도에서 균주 농도가 약 3배 증가하였다 (Fig. 3(b)). 배양액 내 에탄올과 아세트산 생산 농도 분석을 기반으로, 에탄올/아세트산 생산비, 에탄올 비생산성을 계산하여 비교한 결과가 Table 3에 있다. Yeast extract 농도가 0.5 g/L인 경우에는, K2HPO4의 농도 변화에 따른 에탄올, 아세트산 생산농도의 뚜렷한 변화를 관찰할 수 없었다. 하지만, yeast extract의 농도를 0.5에서 5 g/L로 증가시킨 실험에서는 K2HPO4 농도 증가에 따라 에탄올과 아세트산의 생산농도가 0.124 g/L에서 0.309 g/L로, 0.181 g/L에서 0.303 g/L로 의미있게 증가하는 것을 볼 수 있다. 앞선 실험에서와 마찬가지로 에탄올 비생산성은 균주 밀도의 변화가 더 큰 영향을 끼치므로, yeast extract를 0.5 g/L 사용한 경우 더 큰 값을 나타내고 있다.

Fig. 3.

Time course of cell mass in C. autoethanogenum culture at various K2HPO4 dose with (a) yeast extract of 0.5 g/L and (b) yeast extract of 5 g/L.

Product formation properties in C. autoethanogenum culture according to K2HPO4 concentration


4. CONCLUSION

본 연구에서는 배지 내 영향인자로 선정된 fructose, NH4Cl, K2HPO4의 농도 변화에 따라 acetogenic bacteria인 C. autoethanogenum의 성장과 산물 생성 특성이 받는 영향을 비교, 분석하였다. Yeast extract의 농도가 균주 성장과 산물 생성에 미치는 영향이 크므로 기본 배지에서의 농도인 0.5 g/L와 10배 공급한 5 g/L에 대하여 동일한 실험을 반복하였다. 실험결과로부터 NH4Cl은 균주 성장과 산물 생산에 뚜렷하게 긍정적 영향을 주지 못하며 오히려 기본배지 내 농도의 30배에 해당하는 30 g/L로 과잉공급하면 성장저해가 일어나는 것을 확인하였다. Fructose와 K2HPO4의 투입량 증가는 균주 성장과 산물 생산을 향상시키는 효과를 보였으며, 특히 yeast extract를 5 g/L 사용하였을 때 성장 및 생산 향상 효과가 뚜렷이 나타났다. 하지만, yeast extract를 5 g/L로 과량 사용할 때 균주 성장 증가 효과보다 더 큰 에탄올 생산농도 증가는 이루어지지 못하므로, yeast extract 0.5 g/L 실험이 에탄올 비생산성은 더 크게 나타났다. 본 연구의 결과는 배지 조성의 변화가 균주 성장과 에탄올 생산성 증가를 모두 이루기는 어려우며, 성장단계와 생산단계의 최적 배지조성이 다를 수 있다는 가능성을 보여주고 있으며 합성가스로부터 에탄올 생산을 acetogenic bacteria 배양공정의 최적화에 기초로 활용될 수 있다.

Acknowledgments

이 논문은 과학기술정보통신부의 재원으로 C1 가스 리파이너리 사업단의 지원 (NRF-2018M3D3A1A01017994)과 교육부의 재원으로 한국연구재단의 지원 (NRF-2018R1D1A1B07043323)을 받아 수행한 연구입니다.

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Fig. 1.

Fig. 1.
Time course of cell mass in C. autoethanogenum culture at various fructose dose with (a) yeast extract of 0.5 g/L and (b) yeast extract of 5 g/L.

Fig. 2.

Fig. 2.
Time course of cell mass in C. autoethanogenum culture at various NH4Cl dose with (a) yeast extract of 0.5 g/L and (b) yeast extract of 5 g/L.

Fig. 3.

Fig. 3.
Time course of cell mass in C. autoethanogenum culture at various K2HPO4 dose with (a) yeast extract of 0.5 g/L and (b) yeast extract of 5 g/L.

Table 1.

Product formation properties in C. autoethanogenum culture according to fructose concentration

Fructose conc.
(g/L)
OD600 EtOH conc.
(g/L)
Acetic acid conc.
(g/L)
EtOH/Acetic
acid ratio
EtOH specific
productivity (g/g)
Yeast extract
0.5 g/L
0 0.178 0.087 0.136 0.639 0.686
5 0.647 0.222 0.512 0.433 0.359
10 1.010 0.112 0.984 0.114 0.113
15 1.069 0.094 1.179 0.080 0.089
Yeast extract
5 g/L
0 0.715 0.135 0.297 0.455 0.196
5 1.473 0.249 0.548 0.455 0.168
10 1.906 0.184 1.041 0.177 0.095
15 2.260 0.175 1.547 0.113 0.076

Table 2.

Product formation properties in C. autoethanogenum culture according to NH4Cl concentration

NH4Cl conc.
(g/L)
OD600 EtOH conc.
(g/L)
Acetic acid conc.
(g/L)
EtOH/Acetic
acid ratio
EtOH specific
productivity (g/g)
Yeast extract
0.5 g/L
1 0.676 0.178 0.306 0.583 0.275
10 0.687 0.197 0.292 0.673 0.298
30 0.473 0.191 0.324 0.590 0.439
Yeast extract
5 g/L
1 1.270 0.217 0.344 0.629 0.170
10 1.405 0.193 0.339 0.569 0.136
30 1.105 0.171 0.257 0.665 0.155

Table 3.

Product formation properties in C. autoethanogenum culture according to K2HPO4 concentration

K2HPO4 conc.
(g/L)
OD600 EtOH conc.
(g/L)
Acetic acid conc.
(g/L)
EtOH/Acetic
acid ratio
EtOH specific
productivity (g/g)
Yeast extract
0.5 g/L
0.33 0.432 0.163 0.134 1.217 0.414
3.3 0.561 0.168 0.153 1.098 0.318
10 0.754 0.191 0.121 1.574 0.261
Yeast extract
5 g/L
0.33 1.353 0.124 0.181 0.684 0.091
3.3 1.671 0.168 0.246 0.683 0.099
10 2.204 0.309 0.303 1.020 0.137