The Korean Society For Biotechnology And Bioengineering
[ Research Paper ]
Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 33, No. 3, pp.145-154
ISSN: 1225-7117 (Print) 2288-8268 (Online)
Print publication date 30 Sep 2018
Received 30 Jul 2018 Revised 03 Sep 2018 Accepted 03 Sep 2018
DOI: https://doi.org/10.7841/ksbbj.2018.33.3.145

표고버섯의 추출물 첨가에 의한 Lactococcus lactis PK-8의 생리활성 증진에 대한 연구

석지원 ; 박상국 ; 오계헌*
순천향대학교 자연과학대학 생명시스템학과
Studies on the Enhancement of the Physiological Activities of Lactococcus lactis PK-8 by Addition of the Extracts Derived from Shiitake Mushrooms
Ji-Won Seok ; Sang-Kook Park ; Kye-Heon Oh*
Department of Life Science and Biotechnology, Soonchunhyang University, Asan 31538 Korea +82-41-530-1353 +82-41-530-1350 kyeheon@sch.ac.kr

Correspondence to: *Department of Life Science and Biotechnology, Soonchunhyang University, Asan 31538, Korea Tel: +82-41-530-1353, Fax: +82-41-530-1350 e-mail: kyeheon@sch.ac.kr


© 2018 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering

Abstract

The purpose of this work was to investigate various physiological activities of Lactococcus lactis PK-8 isolated from shiitake mushrooms and to assess the efficacy of enhanced activities by the addition of mushroom extracts. Initially, we characterized the physiological and biochemical properties of this strain. Phylogenetic analysis using 16S rRNA sequencing was utilized for identification, and the strain was assigned and designated as L. lactis PK-8. Phylogenetic tree of the strain was plotted based on 16S rRNA sequence comparisons. Various physiological activities (e.g., tyrosinase inhibitory activity, ACE inhibitory activity, antioxidant activity, SOD-like activity, depletion of sodium nitrite, antibacterial acticity) of L. lactis PK-8 cultures with 10% mushroom extracts were evaluated and compared to the cultures without the extracts. According to the results, all of the physiological activities evaluated in this work were considerably higher in L. lactis PK-8 cultures with 10% mushroom extracts than in the cultures without the extracts. In consequence, this study demonstrated that shiitake mushroom extracts would be effective for enhancing the physiological activities of L. lactis PK-8.

Keywords:

Shiitake mushroom, Mushroom extracts, Physiological activity, Lactococcus lactis PK-8

1. INTRODUCTION

프로바이오틱스 (probiotics)는 적절한 양을 섭취했을 때, 장내 미생물 균형을 유지시킴으로써 숙주의 건강을 증진시키는 살아있는 미생물을 말하며, 항암작용, 면역증강작용, 혈중 콜레스테롤의 감소, 젖당 불내증 완화 능력, 비뇨생식기의 미생물 오염 억제작용, 설사 예방 및 완화 등의 효과가 있는 것으로 알려져 있다 [1,2]. 미국식품의약국 (food and drug administration, FDA)에 따르면, 젖산균 (lactic acid bacteria, LAB)은 일반적으로 안전한 미생물로 보고되고 있으며, 자연계에 널리 존재한다 [3,4]. 젖산균은 다양한 자연서식지에서 발견된다. 우리나라의 전통음식인 김치와 간장, 된장, 고추장과 같은 장류, 막걸리 등의 발효 식품 및 음료에서 뿐만 아니라, 요구르트, 치즈와 같은 발효 유제품에서도 흔히 발견된다. 사람이나 동물의 장, 여성의 질, 구강, 토양 등 자연계에 널리 분포하여 인간의 생활과 밀접한 관계를 맺고 있다. 오늘날 젖산균은 사람의 건강보조제, 동물의 사료, 양식장의 환경개선제 등의 다양한 분야에서 프로바이오틱 (probiotics)으로 이용되고 있다 [5,6].

젖산균은 다양한 생리활성 기능을 가지고 있는 것으로 알려져 있다; 멜라닌 (melanin) 합성에 관여하는 효소 중 하나인 tyrosinase 저해활성은 미백물질 선별단계에서 필수적이다. 이는 tyrosinase가 세포 내에서 활성화되어 멜라닌이 과잉생산되면 색소침착이 일어나 피부노화 및 손상을 가져오는 것을 방지한다 [7,8]; ACE (angiotensin-converting enzyme)는 인체 내에서 혈압조절기작 중의 하나인 renin-angiotensin 계에서 혈압상승과 유지에 중요한 작용을 하는 효소로서 [9], ACE의 저해활성은 angiotensin II의 생성저해, aldosterone 분비감소, 혈관확장제인 bradykinin의 증가 등을 통하여 혈압을 낮추어 줄 수 있다 [10]; 항산화능은 체내에 형성된 라디칼과 활성산소를 제거하여 세포노화, 암, 심혈관계 질환 등의 생체 내에서 심각한 생리적인 장애를 유발하는 요인을 제거하는 기능을 가진다 [11]; SOD-유사활성은 체내에 생성된 활성산소를 제거하는 것과 관련이 있다. SOD (superoxide dismutase)는 체내에서 생성된 활성산소를 과산화수소로 전환시키며, 과산화수소는 카탈라아제 (catalase) 또는 과산화효소 (peroxidase)에 의하여 물과 산소로 전환된다 [12]; 아질산염은 2급 및 3급 아민류(amines)와 반응하여 니트로스아민 (nitrosamine)을 생성하는 것으로 알려져 있다 [13]. 아질산염의 소거 (scavenging)는 일정 농도 이상의 아질산을 섭취하면 청색증 (methemoglobinemia), 빈혈성저산소증 등이 나타날 수 있는데, 이러한 중독 현상을 감소시킬 수 있다; 젖산균은 여러 항균활성인자를 생성하여 부패성 미생물 및 병원성 미생물에 대하여 생장억제 능력을 가지고 있다 [14]. 항균활성능력은 장내 균총의 개선을 통하여 장 건강을 향상시킬 수 있다.

본 연구에서는 표고버섯으로부터 분리한 젖산균인 Lactococcus lactis PK-8을 분리하여, 생리생화학적 특성조사를 실시하였다. 또한 이 세균의 배양에 버섯추출물을 첨가하였을 때, tyrosinase 저해활성, ACE 저해활성, 항산화능, SOD-유사활성, 아질산염 소거능, 항균활성 등의 여러 가지 생리활성 증진에 미치는 영향에 대하여 조사하였다.


2. MATERIALS AND METHOD

2.1. 젖산균의 분리 및 배양

충남 천안지역 농가에서 재배한 유기농 표고버섯으로부터 젖산균을 분리하였다. 버섯을 잘게 잘라 100 mL의 멸균된 생리식염수가 담긴 플라스크에 넣고 37oC의 분당 160회로 회전하는 배양기에서 30분간 진탕한 후, 실험벤치에서 2시간 동안 부유물이 가라앉을 때까지 방치시켰다. 0.002% bromophenol blue (BPB)가 첨가된 MRS (Difco Co., Detroit, MI, USA) 고체평판배지에 100 μL의 상등액을 도말하여, 37oC에서 48시간동안 배양하였다. 배양된 고체배지 상에서 노란색을 띠는 집락을 선별하였으며, 3회에 걸쳐 순수배양의 계대를 통하여 4개의 균주를 분리하였다. 이 균주들 가운데 균주의 생육과정에서 생장이 왕성하고 노란색이 가장 우세한 균주를 선별하였다. 분리세균은 MRS 액체배지에 접종하여 진탕배양기에서 배양 유지하며 본 실험에 사용하였다.

2.2 버섯 추출물의 준비

생리식염수 100 mL가 들어있는 플라스크에 세절한 표고버섯 10 g을 첨가하여 30분간 방치한 후, 믹서로 갈아 분쇄하고 원심분리 (4,000 rpm, 10분)하여 상등액을 얻었다. 그 상등액은 0.45 μm의 membrane filter로 여과시켜 표고버섯추출물을 획득하였다. 선행연구에서 추출물을 5-30% 농도로 MRS 배지에 첨가하여 tyrosinase 저해활성, ACE 저해활성, 항산화능, SOD-유사활성으로 예비실험을 실시한 결과 가장 우수한 효과를 나타낸 10% 표고버섯 추출물이 첨가된 젖산균 배양배지를 본 실험에 사용하였다 (데이터 미제시).

2.3. 젖산균의 형태학적 관찰 및 생화학적 특성조사

버섯에서 분리한 젖산균을 MRS 고체평판배지에 도말하여 단일 집락의 형태를 확인하였으며, 그람염색법을 통하여 위상차 현미경으로 형태학적 특성을 관찰하였다. 분리세균에 대하여 glucose, citrate, starch, gelatine의 이용여부, methyl red (MR) 시험, voges-proskauer (VP) 시험, Klingler iron agar (KIA)에서 H2S 생성여부, tryptone 배지에서 indole 생성여부, litmus milk 이용여부, catalase 및 oxidase 반응 등의 여러 가지 생화학적 특성조사를 실시하였다.

2.4. 젖산균의 BIOLOG 분석시험

버섯으로부터 분리한 젖산균의 다양한 탄소원 이용능력에 근거한 BIOLOG 분석시스템을 이용하여 실시하였다. 분리세균의 순수배양된 단일집락을 5% 혈액이 첨가된 BIOLOG universal growth (BUG) 고체평판배지에 도말하여, 37oC에서 24시간 동안 배양하였다. 배양된 균주는 생리식염수에 현탁시키고, 혼탁도를 35% (±3%)로 조절하여 GP2 MicroplateTM (BIOLOG, Hayward, USA)에 100 μL씩 접종한 후, 48시간 동안 배양하였다. 배양된 Microplate는 BIOLOG automated Micro-Station instrument를 사용하여 탄수화물의 이용여부를 조사하였다.

2.5. 16S rRNA 염기서열의 계통수 분석

분리 균주의 계통수 (phylogenetic tree)를 작성하기 위하여 16S rRNA 유전자를 중합효소연쇄반응 (PCR)으로 증폭하였다. Genomic DNA는 컬럼 방식의 G-spinTM Genomic DNA Extraction Kit (Intron, Korea)을 사용하여 추출하고, universal primer인 27F primer (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3‘)와 1492R primer (5'- TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3')를 이용하였다. PCR은 genomic DNA를 주형으로 PCR premix (GenDEPOT, Korea)를 이용하여 수행되었으며, 수행조건은 변성 (denaturation) (94oC, 1분), 냉각 (annealing) (60oC, 1분), 신장 (elongation) (72oC, 1분) 단계를 33회 반복한 뒤, 72oC에서 15분간 유지하였다. PCR을 통하여 증폭된 DNA 단편을 전기영동한 후, agarose extraction kit (Intron, Korea)를 이용하여 gel 상에서 회수하고, 부분적인 염기서열을 결정하였다.

2.6. 젖산균의 생장에 따른 pH 변화

버섯추출물이 미첨가된 대조구 (이하 대조구)와 10% 첨가된 두 개의 MRS 액체배지 100 mL에 준비된 젖산균을 각각 접종하여 진탕배양기 (37oC, 160 rpm)에서 72시간 동안 배양시키면서 세균의 생장과 배양기간 중 pH의 변화를 6시간 간격으로 측정하였다. 젖산균의 생장은 배양액 1 mL를 취하여 생리식염수로 희석한 뒤, MRS 고체평판배지에 100 μL를 도말하여, 37oC에서 48시간 동안 배양한 후, 생성된 집락의 수 (colony forming unit, CFU)를 직접 계수하여 생장곡선으로 작성하였다. pH의 변화는 6시간 간격으로 배양액의 3 mL을 4,000 rpm에서 3분간 원심분리하여 얻은 상등액의 pH를 측정하였다.

2.7. 유기산 생성 측정 및 HPLC 분석

분리된 젖산균에 의해서 생성되는 유기산을 분석하기 위하여 HPLC를 사용하였다. 분석에 사용된 HPLC system은 Gilson UV/VIS-151 detector가 부착된 Gilson 사의 제품을 사용하였고, 컬럼 (column)은 Supelcogel C-610H (300 nm × 7.8 mm, 입자크기 9 μm)를 사용하였다. HPLC 운전조건이 이전에 보고된 방법에 따라 실행하였다 [15]. 유기산 생성의 정량분석은 분석용 표준품과 배양액으로부터 채취한 시료를 대상으로 실시하였다. 분석용 표준품은 젖산과 아세트산을 각각 1:1 비율로 혼합한 100 mM, 200 mM, 300 mM, 400 mM, 500 mM 등을 제조하여 사용하였다. 분석 시료는 24시간 간격으로 채취한 배양액을 13,000 rpm에서 원심분리하여 상등액을 얻어 준비하였다. 모든 시료는 0.45 μm syringe filter로 여과하였으며 Hamilton syringe를 이용하여 20 μL를 주입하였다. 표준품을 분석하여 나온 결과를 표준정량곡선으로 도식화하고, 배양액을 분석하여 그 결과 수치를 표준정량곡선에 대입·산출하여 유기산을 각각 정량하였다.

2.8. 생리활성 실험을 위한 배양상등액 및 시약 제조

버섯추출물이 10% 첨가된 MRS 액체배지와 대조구 배지에 젖산균을 각각 약 1.0×104 CFU/mL를 접종하여, 진탕배양기 (37oC, 160 rpm)에서 72시간 동안 배양하였다. 배양상등액은 6시간 간격으로 각각의 배지에서 배양액 1 mL를 취한 뒤, 13,000 rpm에서 3분간 원심분리하여 얻어진 상등액을 본 실험에 사용하였다. 생리활성 실험에 사용된 시약들은 10배 농도로 제조하여 냉장보관하였고, 측정 시 적정 농도로 희석하여 사용하였다.

2.9. Tyrosinase 저해활성 측정

Tyrosinase 저해활성 측정은 Yagi 등 [16]의 방법으로 측정하였다. 기질로서는 L-tyrosine을 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 6.8)에 0.9 mg/mL의 농도로 완전히 녹인 후, 공극이 0.45 μm인 syringe filter로 여과하여 사용하였다. 시료 250 μL에 L-tyrosine 용액 200 μL를 혼합한 뒤, tyrosinase 50 μL를 첨가하여 37oC에서 10분간 반응시켰다. Buffer 500 μL를 첨가하여 총 부피를 1 mL로 맞춘 뒤, 475 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 시료액 대신에, 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 6.8)를 첨가하여 흡광도 값을 측정하였다.

Tyrosinase inhibitory activity (%) = [(C − T) / C] × 100

C : 시료 대신 buffer 첨가 시 475 nm에서의 흡광도

T : 시료 첨가시의 흡광도

2.10. ACE 저해활성 측정

ACE 저해활성은 변형된 Cushman과 Cheung [17]의 방법을 사용하여 측정하였다. ACE 조효소액은 0.3 M NaCl을 포함한 0.1 M sodium borate buffer (pH 8.3)에 rabbit lung acetone powder (Sigma, St. Louis, MO, USA)를 0.1 g/mL (w/v)의 농도로 4oC에서 24시간 동안 교반하여 추출한 후, 추출액을 30분간 원심분리 (4oC, 4,000×g)하여 얻어진 상등액을 사용하였다. 기질로서 Hip-His-Leu (hippuryl-histidyl-leucine)는 0.1 M sodium borate buffer 5 mL에 완전히 용해시킨 후, 0.45 μm filter로 여과시켜 사용하였다. ACE 저해활성은 시료 50 μL에 0.1 M sodium borate buffer (pH 8.3) 100 μL와 ACE 조효소액 50 μL를 가하여 37oC에서 10분간 예비반응시킨 후, 5 mg/mL Hip-His-Leu 용액 50 μL를 첨가하여, 37oC에서 30분간 반응시켰다. 1 N HCl 250 μL를 가하여 반응을 정지시키고, ethyl acetate 1 mL를 가하여 30초간 교반시킨 후, 15분 동안 원심분리 (4oC, 3,000×g)하여 상등액 800 μL를 취하였다. 이 상등액을 speed vac concentrator (EYELA, Tokyo, Japan)을 이용하여 완전히 건조시킨 후, 0.1 M sodium borate buffer (pH 8.3) 1 mL에 용해시켜 228 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 아래의 식을 이용하여 ACE 저해활성을 계산하였다.

ACE inhibitory activity (%) = [(C − T) / C] × 100

C : 시료 대신 증류수 첨가 시 228 nm에서의 흡광도

T : 시료 첨가시의 흡광도

2.11. 항산화능 측정

항산화능 측정은 Blois [18]의 방법을 일부 변형시켜 사용하였다. DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) (Sigma, USA)는 에탄올에 녹여 1 mM을 제조하였고, 측정 시 0.1 mM로 희석하여 사용하였다. 시료 50 μL에 DPPH 용액 1 mL와 Tris-HCl (pH 7.4) 450 μL를 잘 혼합하여 37oC에서 암실조건을 유지시킨 상태로 30분간 반응시킨 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.

DPPH radical scavenging capacity (%) = [(C − T) / C] × 100

C : 시료 대신 80% 에탄올 첨가 시 517 nm에서의 흡광도

T : 시료 첨가시의 흡광도

2.12. SOD-유사활성 측정

SOD (superoxide dismutase)-유사활성은 Marklund와 Marklund [19]의 방법으로 측정하였다. 시료 200 μL에 50 mM Tris-HCl buffer (10 mM EDTA 포함, pH 8.5) 3 mL와 10 mM HCl에 녹인 7.2 mM pyrogallol 200 μL를 혼합하여, 25oC의 암실조건에서 10분간 반응시킨 후, 1 N HCl 1 mL를 가하여 반응을 정지시켰으며, 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 시료액 대신에 증류수를 200 μL 첨가하여 동일조건으로 반응시킨 후, 흡광도를 측정하고 활성도를 산출하였다.

SOD like activity (%) = [(C-T)/C] × 100

C : 시료 대신 D.W 첨가 시 420 nm에서의 흡광도

T : 시료 첨가시의 흡광도

2.13. 아질산염 소거능 측정

아질산염 소거능은 Ito 등 [20]의 방법으로 측정하였다. 배지는 멸균된 sodium nitrite 용액 (1 mg/mL)과 10% 버섯추출물이 첨가된 MRS 액체배지를 1:9 비율로 혼합하여 사용하였다. 시료 100 μL와 0.02% sulfanilamide, 0.1% N-1-naphthylethylenediamine dihydrochloride, 35% HCl을 각각 1 mL씩 첨가하여 암실에서 10분간 반응시킨 뒤, 538 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 시료액 대신에, sodium nitrite가 1 mg/mL가 첨가된 MRS 액체배지를 사용하였다.

Depletion of sodium nitrite (%) = [(C − T) / C] × 100

C : 시료 미첨가 시 538 nm에서의 흡광도

T : 시료첨가시의 흡광도

2.14. 항균활성 측정

분리세균을 버섯추출물이 10% 첨가된 MRS 액체배지와 대조구에 각각 접종하여 배양기에서 48시간동안 배양한 후, 배양액을 4,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 회수된 상등액은 공극이 0.45 μm인 syringe filter로 여과시킨 후, 동결건조기에서 20배로 농축시켰다. 농축 배양상등액의 항균활성은 disc diffusion assay를 통하여 실시하였으며, 사용된 균주는 Bacillus cereus ATCC 14579, Enterobacter aerogenes ATCC 15038, Escherichia coli ATCC 25922, Listeria monocytogenes ATCC 19111, methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) CCARM 3141, Staphylococcus aureus ATCC 12600, Salmonella enteritidis ATCC 18076, Shigella sonnei ATCC 9290 등의 식중독을 유발하는 균주들이었다. L. monocytogenes 균주는 brain-heart infusion (BHI) (Difco Co., Detroit, MI, USA) 액체배지에 접종하였으며, 그 외 균주들은 Luria-Bertani (LB) (Difco Co., Detroit, MI, USA) 액체배지에 접종하여 사용하였다. 배양된 균주는 고체평판배지에 도말하고, paper disc를 올려놓은 후, 농축된 배양 상등액 20 μL를 흡수시켜 30oC에서 24시간 동안 배양하였다. 배양된 배지에 올려놓은 paper disc 주변의 투명대 형성유무를 확인하는 방식으로 조사하였다.


3. RESULTS AND DISCUSSION

3.1. 젖산균의 분리 및 배양

본 연구에 사용된 균주는 마트에서 구입한 유기농 표고버섯으로부터 농화배양기법을 이용하여 젖산균을 분리하였으며, 3회에 걸친 MRS 고체배지 상에서 도말평판법으로 분리한 4개 균주 가운데, 생육과정에서 산을 생산하여 배지의 색상변화가 가장 두드러진 1개 균주 PK-8을 선별하였다. 이 선별된 젖산균 PK-8은 버섯추출물이 10% 첨가된 MRS 액체배지와 대조구 배지에 젖산균을 각각 약 1.0×104 CFU/mL를 접종하여, MRS 액체배지에 접종하여 진탕배양기 (37oC, 160 rpm)에서 배양조건을 유지하면서 본 실험에 이용하였다.

3.2. 분리세균의 형태학적 관찰 및 생화학적 특성조사

분리균주인 PK-8은 그람염색을 하여 위상차 현미경으로 형태학적 분석을 실시하였으며, 그 결과 이 균주는 그람양성의 구균으로 관찰되었다. 또한 이 세균에 대하여 여러 가지 생리생화학적 특성조사를 실시하였다. 인돌 (indole) 생성시험에서는 음성반응으로 나타났다. Glucose 액체배지에서는 Durham 기체포집관에 기체가 형성되지 않았고, glucose를 발효하여 배지의 색상이 붉은색이 노란색으로 변하는 것을 확인하였다. MR-VP 시험에서는 methyl red를 첨가하였을 경우에 붉은색으로 변하여 MR 양성으로 나타났으며, α-naphthol과 KOH를 첨가한 결과, VP 음성으로 나타났다. 녹말배지와 젤라틴배지에서는 투명대가 형성되지 않았으며, Simmon's citrate 이용여부에서도 음성을 나타내었다. 또한 KIA 배지를 이용한 disulfhydrase에 의한 H2S의 형성시험과 리트머스 우유(litmus milk) 배지를 이용한 펩톤화 (peptonization) 실험과 catalase와 oxidase 실험에서 모두 음성으로 확인되었다 (Table 1).

Morphological and physiological characteristics of Lactococcus lactis PK-8

3.3. 젖산균의 BIOLOG 분석시험

BIOLOG 분석시스템을 사용하여 분리세균 PK-8의 다양한 탄소원의 이용여부를 조사를 실시하였다. 그람염색을 통하여 얻어진 결과를 바탕으로, 그람양성 세균에 사용되는 GP2 MicroplateTM를 사용하여 분석하였다. MicroLogTM database software를 통하여 얻어진 이 균주의 생화학적 특성들은 Table 2에 나타내었다.

Biochemical characteristics of Lactococcus lactis PK-8 using the BIOLOG analysis system

3.4. 16S rRNA 염기서열에 의한 동정 및 계통수 분석

분리세균인 PK-8의 동정은 16S rRNA 염기서열 분석을 통해 실시하였다. 그 결과 PK-8 균주는 Lactococcus lactis로 동정되었으며, 이 균주를 Lactococcus lactis PK-8로 명명하였다. 분리세균 PK-8의 계통수 (phylogenetic tree)를 작성하기 위하여 PCR을 통하여 16S rRNA 유전자를 증폭하고, 부분적인 염기서열을 결정하였다. 결정된 염기서열은 NCBI의 BLAST 분석프로그램을 이용하여 상동성을 비교한 결과, 이 균주는 Lactococcus lactis와 99%의 유전적 상동성을 보여주었다. PK-8와 Lactococcus lactis 종에 속하는 다른 균주들과의 유사성은 Fig. 1에 나타내었다.

Fig. 1.

Phylogenetic trees of the strain, Lactococcus lactis PK-8 (●) based on 16S rRNA gene sequences. The trees were constructed by the neighbor-joining method. Number at nodes are bootstrap percentage based on 1,000 resampled data sets. GenBank accession numbers are given in parentheses. Bar, 0.02 changes per nucleotide.

3.5. 젖산균의 생장에 따른 pH 변화

L. lactis PK-8을 10%의 버섯추출물이 첨가된 MRS 액체배지(pH 7.0)에 접종하고, 세균의 생장과 배양기간 중의 pH 변화를 6시간 간격으로 측정하였다. PK-8은 24시간까지 급격히 생장하였으며, 36시간부터는 완만한 생장률을 유지하였고, 배지의 pH는 배양 24시간이후 4.0 이하로 감소하였다. 10%의 버섯추출물이 첨가된 배지는 버섯추출물이 첨가되지 않은 배지보다 더욱 왕성한 생장률을 보였으며, 배지 내 pH 감소는 유사하게 감소되어, 배양 72시간이 경과한 후, pH는 두 조건 모두에서 약 3.6으로 측정되었다 (Fig. 2).

Fig. 2.

Bacterial growth (circle) and pH change (square) of Lactococcus lactis PK-8 cultured in MRS broth in the presence of 10% (●, ■) mushroom extracts and control (◯, □). Data shown represent the mean±SD based on triplicate studies.

3.6. 유기산의 HPLC 정량분석

버섯추출물이 첨가된 MRS 배지에 PK-8를 접종하여 배양으로 부터 매 24시간마다 시료를 취하여 유기산 (젖산과 아세트산)의 양을 측정하였다. 젖산과 아세트산이 1:1로 혼합된 표준품과 채취한 시료는 HPLC에 의해 분석되었으며, 그 결과 HPLC chromatogram 상에 7.90분과 9.00분에서 피크 (peak)가 생성되었으며, 이들 피크는 각각 젖산과 아세트산으로 확인되었다. PK-8 균주에서 얻은 시료를 분석한 결과, 젖산과 아세트산은 배양 96시간까지 지속적으로 증가하였으며, 젖산과 아세트산의 최대생성량은 버섯추출물이 첨가된 경우에 402.1 mM과 103.4 mM, 그리고 첨가되지 않은 경우에 각각 353.4 mM과 80.4 mM 이었다 (Fig. 3). 이전에 연구된 김치와 묵은지에서 각각 분리된 Lactobacillus plantarum YK-9와 Lactobacillus sakei JK-17의 젖산과 아세트산의 생성량에 관한 보고 [15,21]에서, 이들 균주는 젖산과 아세트산을 각각 588 mM와 255 mM, 그리고 510 mM와 207 mM 정도를 생성하는 것으로 보고하였는데, 이들 결과는 본 연구에서 사용된 버섯에서 분리된 L. lactis PK-8에서의 생성량보다 크게 높았다. LactobacillusLactococcus는 동형발효 (homofermentation)를 하는 젖산균이라 할지라도 균주의 종류에 따라 차이가 있으며, 김치나 묵은지와 같은 거친 환경에서 분리된 젖산균과 자연버섯으로부터 분리된 젖산균과는 물질대사에서 차이가 있는 것으로 사료된다. 그러나 PK-8에서 버섯추출물이 첨가된 배양에서 생성된 젖산과 아세트산의 양은 미첨가된 배양에서의 생성량과 비교하여 다소 증가되는 것으로 확인되었다.

Fig. 3.

Production of lactic acid (closed) and acetic acid (open) by Lactococcus lactis PK-8 cultured in MRS broth in the presence of 10% mushroom extracts (square) and control (circle). Data shown represent the mean±SD based on triplicate studies.

3.7. Tyrosinase 저해활성 측정

Tyrosinase 저해활성 측정은 PK-8 균주를 10%의 버섯추출물이 첨가된 MRS 액체배지와 첨가되지 않은 MRS 액체배지에서 72시간동안 배양하면서 6시간 간격으로 측정하였다. PK-8 배양액에 버섯추출물이 첨가되지 않았을 때의 최대 활성도는 16.3%였으나, 버섯추출물 첨가하였을 때의 최대 활성도는 약 18.0%로서 다소 상승한 것으로 나타났다 (Fig. 4). Kim과 Lee의 연구 [22]에서 Lactobacillus rhamnosus 또는 Lactobacillus paracasei 단일배양의 세포파쇄액으로부터 tyrosinase 저해활성을 측정하여 11.2-19.9%였으며, 이 두 가지 균주의 동시배양 (co-culture)에서 얻어진 세포파쇄액의 tyrosinase 저해활성은 약 20.7%로 증가하였다고 보고하였다. 버섯추출물이 포함된 PK-8 배양액의 tyrosinase 저해활성은 이전에 보고된 결과의 최대치와 비교하여 거의 유사하거나 다소 높은 활성을 보여주었는데, 본 연구에서 분석된 배양상등액이 세포파쇄액이 아닌 것을 고려하였을 때 차이가 있을 것으로 사료된다.

Fig. 4.

Tyrosinase inhibitory activity of Lactococcus lactis PK-8 cultured in MRS broth in the presence of 10% mushroom extracts (●) and control (◯). Data shown represent the mean±SD based on triplicate studies.

3.8. ACE 저해활성 측정

PK-8의 ACE 저해활성을 측정하기 위하여, 10%의 버섯추출물이 첨가된 배지에 각각 접종하고 72시간 동안 6시간 간격으로 측정하였다. PK-8 배양은 버섯추출물을 첨가되지 않은 경우, 72시간에서 46.6%의 활성을 보였으나, 10%의 버섯추출물이 첨가된 경우, 보다 빠른 12시간에서 최대활성도인 64.0%으로 측정되었고, 약 17.4% 증가된 활성을 보여주었다 (Fig. 5). Han 등 [23]은 발효소세지 제조를 위해 분리한 Lactobacillus plantarum L167에서 ACE 저해활성이 58.7%임을 보고하였다. 또한 Harun-ur-Rashid 등 [24]은 전통발효유에서 Lactobacillus 종과 Leuconostoc 종의 젖산균을 분리하여 ACE 저해활성이 약 30-50%였다는 것을 보고하였다. 이들 결과는 버섯추출물이 첨가되지 않은 PK-8 배양액에서의 ACE 저해활성과 비교하여 커다란 차이가 없었으나, 버섯추출물이 첨가된 PK-8 배양에서의 ACE 저해활성은 증가하는 것으로 나타났다.

Fig. 5.

ACE inhibitory activity of Lactococcus lactis PK-8 cultured in MRS broth in the presence of 10% mushroom extracts (●) and control (◯). Data shown represent the mean±SD based on triplicate studies.

3.9. 항산화능 측정

항산화능 (antioxidant capacity)의 측정은 DPPH 자유 라디칼 소거능을 이용하여 측정하였다. 분리균주 PK-8의 버섯추출물 첨가 유무에 따른 항산화능의 차이를 비교하기 위하여 10%의 버섯추출물이 첨가된 MRS 액체배지와 대조구의 MRS 액체배지를 준비하여 각각의 균주를 접종하였다. 버섯추출물이 대조구 배지에서 PK-8은 약 44.3%로 측정되었으나, 버섯추출물이 첨가된 배지에서는 PK-8이 71.0%로 현저히 상승된 결과를 보여주었다 (Fig. 6). 젖산균의 DPPH 라디칼 소거능에 대한 연구는 비교적 많이 보고되었다. 생막걸리와 요구르트에서 분리한 젖산균들에 대한 항산화능 측정에서 10-32%로 보고되었다 [25,26]. 이들 결과와 비교했을 때, 버섯추출물 첨가된 PK-8 배양액에서 측정된 71%의 결과는 생막걸리와 요구르트 등에서 분리한 젖산균에서보다 탁월한 항산화능을 보이는 것으로 나타났다.

Fig. 6.

Antioxidant capacity of Lactococcus lactis PK-8 cultured in MRS broth in in the presence of 10% mushroom extracts (●) and control (◯). Data shown represent the mean±SD based on triplicate studies.

3.10. SOD-유사활성 측정

두 분리균주 PK-8의 버섯추출물에 대한 SOD-유사활성의 상승효과를 알아보기 위하여 각각의 균주를 버섯추출물이 10% 첨가된 배지와 대조구 배지에 각각 접종하고 72시간 동안 배양하며 6시간마다 활성도를 측정하였다. PK-8 균주에서 버섯추출물이 첨가되지 않았을 때, 최대활성도는 41.3% 정도로 나타났으며, 버섯추출물이 첨가된 경우에 PK-8 균주는 약 48.3%의 활성을 보였다 (Fig. 7). Lin과 Yen의 연구 [27]에서 무기물 첨가에 따른 젖산균의 SOD-유사활성이 8-10%로 나타났고, 특정 젖산균에서는 무기물이 첨가되었을 때 SOD-유사활성은 상승하였다고 보고하였다. PK-8 배양은 버섯추출물이 첨가된 경우에, SOD-유사활성은 이미 발표된 결과들과 비교하여 높은 활성을 보였는데, 이는 버섯이 함유하는 여러가지 무기질이나 생장요소들에 기인하는 것으로 사료된다.

Fig. 7.

SOD-like activity of Lactococcus lactis PK-8 cultured in MRS broth in the presence of 10% mushroom extracts (●) and control (◯). Data shown represent the mean±SD based on triplicate studies.

3.11. 아질산염 소거능 측정

PK-8의 아질산염 소거능은 배지에 1 mg/mL의 농도로 첨가된 아질산염의 제거율을 통하여 측정하였다. 또한 버섯추출물이 첨가된 배지와 첨가되지 않은 배지의 소거능을 비교하였다. PK-8 균주는 대조구 배지에서 72시간동안 지속적으로 아질산염의 제거율을 보였으며, 72시간이 지난 후 최종 소거능은 약 68.3%로 측정되었다. 반면에 10% 버섯추출물 첨가 배지에서는 36시간까지 급격한 소거능을 보였으며, 이후 완만하게 상승하여 72시간에서 약 84.8%로 나타났다. 그 결과 10% 버섯추출물이 첨가된 배지가 16.5%정도의 상승된 효과를 보여주었다 (Fig. 8). 아질산염은 여러 가지 식품에 함유되어 있는데, 특히 식품에서 발색, 보존, 풍미 등의 목적으로 인공첨가제가 포함되어진다. 그러나 아질산염은 아민류 (amines)와 반응하여 발암물질인 니트로스아민 (nitrosamine)을 생성하는데 [13], 젖산균은 체내에서 아질산염의 소거와 항돌연변이 등의 생리활성이 있는 것으로 알려져 있다 [28]. 향후 젖산균 증식에서 버섯추출물 첨가에 의한 아질산염 소거능 향상이 발암 억제에 기여하는지에 대한 구체적인 연구가 수행되어야 할 것으로 생각된다.

Fig. 8.

Depletion of sodium nitrite of Lactococcus lactis PK-8 cultured in MRS broth in the presence of 10% mushroom extracts (●) and control (◯). Data shown represent the mean±SD based on triplicate studies.

3.12. 항균활성 측정

L. lactis PK-8의 항균력을 조사하기 위하여 disc diffusion 방법을 이용하여 측정하였다. 각각 10% 버섯추출물이 첨가된 배지와 대조구 배지에서 배양한 분리균주의 농축 배양상등액을 그람양성 세균인 Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA)와 그람음성 세균인 Enterobacter aerogenes, Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Shigella sonnei 등 8가지 세균에 노출시키고, 24시간 배양한 후, disc 주변에 형성되는 투명대를 통하여 항균활성을 확인하였다. 분리균주 PK-8는 모든 균주들에 대하여 투명대를 형성함으로써 항균활성을 가지는 것으로 관찰되었다 (Fig. 9). 특히 E. aerogenes에 대하여 투명대가 가장 크게 형성되었으며, L. monocytogenes에 대한 항균력은 다른 균주들에 비하여 투명대의 크기가 작게 형성되어 비교적 낮은 항균활성을 보였다. 이에 따라 이들 균주는 버섯추출물이 첨가된 경우에 조사된 세균들에 대하여 더 높은 항균활성을 가지는 것으로 나타났다. 젖산균의 항균활성에 대한 많은 연구가 보고되었으며, 항균활성인자로는 유기산, 과산화수소, 이산화탄소, 디아세틸 (diacetyl), 아세트알데히드 (acetaldehyde), 박테리오신 (bacteriocin) 등이 알려져 있다. 특히 Baek 등 [29]은 신생아의 분변에서 분리한 Lactococcus lactis HK-9이 그람양성 세균에서만 항균력을 가진다는 것을 확인하였으며, 항균활성물질은 약 4 kDa의 분자량을 가지는 박테리오신 (bacteriocin)이라고 보고하였다.

Fig. 9.

Antibacterial activity by 20-fold concentrated culture supernatant from PK-8 cultured in MRS broth in the presence of 10% (right) mushroom extracts and control (left). Paper discs soaked with the supernatant were placed onto lawn plates of Bacillus cereus (A), Enterobacter aerogenes (B), Escherichia coli (C), Listeria monocytogenes (D), MRSA (E), Staphylococcus aureus (F), Salmonella enteritidis (G), Shigella sonnei (H), respectively. All strains grew on nutrient agar plates, whereas Listeria monocytogenes grew on BHI agar plate.

본 연구에서 얻어진 10% 표고버섯추출물이 첨가된 L. lactis PK-8 배양에서의 생리활성과 버섯추출물이 첨가되지 않은 배양에서의 생리활성의 결과를 비교하여 요약하였다 (Table 3). 버섯추출물만을 대상으로 tyrosinase 저해활성 (0.4%), ACE 저해활성 (0.0%), 항산화능 (1.2%), SOD-유사활성 (0.0%) 등을 측정한 결과는 이들 활성이 거의 없는 것으로 나타났다. 별도로 수행된 젖산균에 느타리버섯의 추출물을 첨가한 생리활성 증진에 관한 연구에서도 유사한 결과가 얻어졌다 (데이터 미제시). 이는 버섯추출물에 포함된 비타민, 무기질, 생장인자 등의 다양한 물질들이 여러 가지 생리활성의 증진에 기여하는 것으로 사료된다.

Comparison of physiological activities of PK-8 cultured in MRS broth in the presence of 10% mushroom extracts and control

프로바이오틱스 (probiotics)으로서 젖산균은 건강상의 다양한 효과가 입증되어 많은 관심이 집중되어 있는 미생물이다. 또한 의약, 식품, 환경 등의 여러 산업분야에서도 널리 사용되는 유익한 세균이다. 특히 젖산균이 가지는 다양한 생리활성의 증진 및 불활성화 방지는 매우 중요한 사항으로서, 다른 종류의 젖산균들과의 혼합, 프리바이오틱 (prebiotics)의 처리, 캡슐화 등을 포함한 연구가 진행되어오고 있다. 본 연구에서 얻어진 결과를 바탕으로 표고버섯에서 분리한 Lactococcus lactis PK-8는 다양한 생리활성 기능을 가지고 있는 것으로 확인되었으며, 버섯추출물이 첨가된 상태에서 배양할 경우에 생리활성 기능이 전반적으로 향상되는 것으로 입증되었다. 향후 이 균주를 이용하여 다양한 종류의 버섯을 대상으로 생리활성 증진과 버섯추출물의 작용기작에 대한 구체적인 연구를 수행하여 궁극적으로 국민건강 증진에 기여하는 방향으로 진행되어야 할 것이다.


4. CONCLUSION

본 연구는 표고버섯에서 분리한 Lactococcus lactis PK-8의 다양한 생리활성을 조사하고, 표고버섯추출물을 첨가하였을 때 이들 생리활성 증진에 미치는 영향을 알아보기 위하여 수행되었다. 먼저 분리세균인 PK-8의 생리생화학적 특성조사를 진행하였다. 분리균주는 16S rRNA 염기서열분석을 통하여 균주를 동정하였고, 그 결과 Lactococcus lactis PK-8로 명명하였으며, 유전적 계통수를 작성하였다. 10% 표고버섯추출물이 첨가된 L. lactis PK-8 배양에서 tyrosinase 억제활성, ACE 억제활성, 항산화활성, SOD 유사활성, 아질산염 소거능, 항균활성 등의 다양한 생리활성을 측정하였으며, 버섯추출물이 첨가되지 않은 PK-8 배양의 결과와 비교하였다. 그 결과 본 연구에서 측정된 모든 생리활성은 10% 버섯추출물이 첨가된 배양에서 첨가되지 않은 배양과 비교하여 볼 때 상당히 높은 것으로 측정되었다. 결론적으로 Lactococcus lactis PK-8 배양액에서의 모든 생리활성은 표고버섯추출물의 첨가를 통해 증진되는 것으로 나타났다.

Acknowledgments

본 연구는 순천향대학교 학술연구비의 일부지원으로 수행되었음.

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Fig. 1.

Fig. 1.
Phylogenetic trees of the strain, Lactococcus lactis PK-8 (●) based on 16S rRNA gene sequences. The trees were constructed by the neighbor-joining method. Number at nodes are bootstrap percentage based on 1,000 resampled data sets. GenBank accession numbers are given in parentheses. Bar, 0.02 changes per nucleotide.

Fig. 2.

Fig. 2.
Bacterial growth (circle) and pH change (square) of Lactococcus lactis PK-8 cultured in MRS broth in the presence of 10% (●, ■) mushroom extracts and control (◯, □). Data shown represent the mean±SD based on triplicate studies.

Fig. 3.

Fig. 3.
Production of lactic acid (closed) and acetic acid (open) by Lactococcus lactis PK-8 cultured in MRS broth in the presence of 10% mushroom extracts (square) and control (circle). Data shown represent the mean±SD based on triplicate studies.

Fig. 4.

Fig. 4.
Tyrosinase inhibitory activity of Lactococcus lactis PK-8 cultured in MRS broth in the presence of 10% mushroom extracts (●) and control (◯). Data shown represent the mean±SD based on triplicate studies.

Fig. 5.

Fig. 5.
ACE inhibitory activity of Lactococcus lactis PK-8 cultured in MRS broth in the presence of 10% mushroom extracts (●) and control (◯). Data shown represent the mean±SD based on triplicate studies.

Fig. 6.

Fig. 6.
Antioxidant capacity of Lactococcus lactis PK-8 cultured in MRS broth in in the presence of 10% mushroom extracts (●) and control (◯). Data shown represent the mean±SD based on triplicate studies.

Fig. 7.

Fig. 7.
SOD-like activity of Lactococcus lactis PK-8 cultured in MRS broth in the presence of 10% mushroom extracts (●) and control (◯). Data shown represent the mean±SD based on triplicate studies.

Fig. 8.

Fig. 8.
Depletion of sodium nitrite of Lactococcus lactis PK-8 cultured in MRS broth in the presence of 10% mushroom extracts (●) and control (◯). Data shown represent the mean±SD based on triplicate studies.

Fig. 9.

Fig. 9.
Antibacterial activity by 20-fold concentrated culture supernatant from PK-8 cultured in MRS broth in the presence of 10% (right) mushroom extracts and control (left). Paper discs soaked with the supernatant were placed onto lawn plates of Bacillus cereus (A), Enterobacter aerogenes (B), Escherichia coli (C), Listeria monocytogenes (D), MRSA (E), Staphylococcus aureus (F), Salmonella enteritidis (G), Shigella sonnei (H), respectively. All strains grew on nutrient agar plates, whereas Listeria monocytogenes grew on BHI agar plate.

Table 1.

Morphological and physiological characteristics of Lactococcus lactis PK-8

Morphological characteristics
Cell shape Cocci
Gram Staining Positive
Physiological characteristics
Indole production
Glucose +
Methyl red +
Voges-Proskauer
Starch hydrolysis
Gelatin hydrolysis
Simmon's citrate
H2S (KIA)
Litmus milk (peptonization)
Catalase
Oxidase

Table 2.

Biochemical characteristics of Lactococcus lactis PK-8 using the BIOLOG analysis system

Physiological & biochemical tests
+: Positive reaction, −: Negative reaction.
Water α-Methyl D-galactoside + L-Malic acid
α-Cyclodextrin β-Methyl D-galactoside + Methyl pyruvate
β-Cyclodextrin 3-Methylglucose + Mono-methyl succinate
Dextrin + α-Methyl D-glucoside Propionic acid
Glycogen β-Methyl D-glucoside Pyruvic acid
Inulin α-Methyl D-mannoside Succinamic acid
Mannan Palatinose Succinic acid
Tween 40 D-Psicose + N-Acetyl-L- glutamic acid
Tween 80 D-Raffinose + Alaninamide
N-Acetyl-D- glucosamine + L-Rhamnose D-Alanine
N-Acethyl-D- mannosamine D-Ribose + L-Alanine
Amygdain D-Salicin + L-Alanylglycine
L-Arabinose + Sedoheptulosan L-Asparagine
D-Arabitol D-Sorbitol + L-Glutamic acid
Arbutin + Stachyose Glycyl-L-glutamic acid
Cellobiose + Sucrose L-Pyroglutamic acid
D-Fructose + D-Tagatose + L-Serine
L-Fucose + D-Trehalose + Putrescine
D-Galactose Turanose + 2,3-Butanediol
D-Galacturonic acid Xylitol Glycerol +
Gentiobiose + D-Xylose + Adenosine +
D-Gluconic acid + Acetic acid + 2-Deoxy adenosine +
α-D-Glucose + α-Hydroxy butyric acid Inosine
m-Inositol β-Hydroxy butyric acid Thymidine +
α-D-Lactose + γ-Hydroxy butyric acid + Uridine
Lactulose + β-Hydroxy phenyl acetic acid Adenosine-5'- monophosphate
Maltose + α-Keto glutaric acid Thymidine-5'- monophosphate
Maltotriose α-Keto valeric acid + Uridine-5'- monophosphate
D-Mannitol + Lactamide Fructose-6-phosphate +
D-Mannose + D-Lactic acid methylester Glucose-1-phosphate
D-Melezitose + L-Lactic acid Glucose-6-phosphate
D-Melibiose D-Malic acid D-L-α-Glycerol phosphate

Table 3.

Comparison of physiological activities of PK-8 cultured in MRS broth in the presence of 10% mushroom extracts and control

Activities With ME Control
†ME: mushroom extracts (10%).
Tyrosinase inhibitory activity (%) 18.0 16.3
ACE inhibitory activity (%) 64.0 46.6
Antioxidant activity (%) 71.0 44.3
SOD-like activity (%) 48.3 41.3
Depletion of sodium nitrite (%) 84.8 68.3
Antibacterial activity ++ +