The Korean Society For Biotechnology And Bioengineering
[ Research Paper ]
Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 33, No. 3, pp.168-174
ISSN: 1225-7117 (Print) 2288-8268 (Online)
Print publication date 30 Sep 2018
Received 21 Jul 2018 Revised 12 Sep 2018 Accepted 12 Sep 2018
DOI: https://doi.org/10.7841/ksbbj.2018.33.3.168

구리-L-리신 킬레이트의 Bacillus megaterium 내 축적

박재호 ; 박혜민 ; 윤현식*
인하대학교 생물공학과
Bioaccumulation of Copper-L-Lysine Chelate in Bacillus megaterium
Jae Ho Park ; Hye Min Park ; Hyun Shik Yun*
Department of Biological Engineering, Inha University, Incheon 402-751 Korea +82-32-860-7517 +82-32-872-4046 hyunshik@inha.ac.kr

Correspondence to: *Department of Biological Engineering, Inha University, Incheon 402-751, Korea Tel: +82-32-860-7517, Fax: +82-32-872-4046 e-mail: hyunshik@inha.ac.kr


© 2018 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering

Abstract

Copper is a bivalent mineral and nutritionally necessary for mammals. It has been used as an animal feed additive or growth factor for animals. However, large amount of copper contained in animal manure by oversupplying of copper have a negative impact on the soil environment. Chelates of copper and amino acids have the advantages of being better absorbed into the intestines than copper ions and less sensitive to photodegradation than amino acids. Bacillus spp., a spore-forming probiotic, have stability against heat and low pH and are used as animal growth factor or feed additives. In this study, copper-L-lysine chelate was accumulated in Bacillus megaterium ATCC 10778 to use as mineral-containing probiotics or feed additives. The highest chelation rate of copper sulfate and L-lysine was 62.53% after 1:1 reaction of copper sulfate to L-lysine for 25 minutes at 70oC. FB media was selected for bioaccumulation of copper-L-lysine chelate in flask culture. In the fermentor culture, 38,043 ppm of copper ion was accumulated in 6.50×108 CFU/mL of B. megaterium.

Keywords:

copper, chelate, L-Lysine, Bacillus megaterium, bioaccumulation

1. INTRODUCTION

미네랄 (mineral)은 인체 건강에 중요한 요소로 다양한 생물학적 기능을 가지며 그 대표적인 예로는 칼슘 (calcium, Ca), 아연 (zinc, Zn), 철 (iron, Fe) 및 구리 (copper, Cu)와 같은 2가 금속 (metal)이 있다 [1]. 특히 구리 이온 (ion)은 일부 중요한 단백질의 구조의 구성 성분으로 조효소의 역할을 하고 에너지 생성, 산소 전달, 항산화 방어 등 중요한 기능에 관여한다 [2,3]. 1928년에 포유류에 대한 구리의 영양적 필요성이 보고된 이후 [4], 구리는 동물 건강을 보장하는데 필수적이며 성장 인자로 사용되고 있다. 그러나 의도적인 동물의 성장을 위해 동물사료에 구리가 과공급되면 구리가 많이 농축된 동물의 분뇨에 의해 토양에 축적되어 식물이나 미생물에 독성 위험을 초래할 수 있다고 보고되었다 [5]. 오염된 토양에서 EDTA와 유기산의 킬레이트 (chelate)를 이용한 구리 및 중금속을 제거하는 연구가 보고되고 구리와 아미노산의 킬레이트를 통한 흡수로 생물학적 기능 향상 연구가 수행되어 왔다 [6-9]. 아미노산에는 총 20개의 종류가 있으며 보통 동물에서 합성할 수 없는 9개의 필수 아미노산을 공급하기 위해 인간은 식품으로 섭취하거나 동물은 사료 첨가제를 사용한다 [10]. 아미노산은 값이 저렴하고 풍부한 킬레이트 재료로 카르복실기 (carboxyl group)와 아미노기 (amino group)를 통해 금속 이온 농도를 조절하는 능력을 가지고 있다. 금속과 아미노산의 복합체는 유리 아미노산보다 광분해에 덜 민감하다 [11]. 또한 동물에서 사료 첨가제로 첨가된 구리-아미노산 복합체가 황산구리 (copper sulfate, CuSO4)보다 더 좋은 구리의 흡수를 보인 결과도 보고되었다 [12]. 특히 필수 아미노산인 L-리신 (L-lysine)과 구리의 킬레이트를 첨가하여 동물의 성장을 향상시킨 연구가 보고되었다 [13]. 최근에 구리와 L-리신의 킬레이트를 암탉에 첨가하여 달걀의 미네랄의 구성과 양질을 변화시킨 연구도 보고되었다 [14].

생균제 (probiotics)는 건강을 목적으로 숙주 (host)에게 적절한 양을 투여하는 살아있는 미생물이다 [15]. 생균제가 숙주에게 주는 이익에는 장내 미생물 항상성 조절, 소화 장벽기능의 안정화, 흡수 및 영양을 유도하는 효소의 활성 등이 있다 [16-18]. 생균제는 비독성과 비병원성, 유전적 안정성, 위액과 담즙에 대한 내성 그리고 저장 및 배달의 용이성 등이 필요하다 [19]. 50년 전부터 생균제로 사용되어 온 Bacillus spp.는 gram-positive이며 포자 (spore)를 형성하는 호기성 박테리아로 일반적으로 토양, 물 및 공기에서 서식한다. 포자는 열과 낮은 pH에 안정성을 가지고 있어서 비포자 균주의 대표인 Lactobacillus spp.와 다르게 Bacillus spp.는 상온에서 건조 보관이 용이하며, 위장과 같은 환경에서 생존하기에 유리하다 [20-24]. 일부 Bacillus spp.가 식중독의 매개체로도 알려져 있지만 Bacillus subtilis, B. coagulans, B. megaterium 등의 안전성이 보장된 종은 생균제나 성장 인자로서 동물 사료 첨가제로 사용될 수 있다 [19].

본 연구에서는 기존 보고된 토양 오염의 직접적인 해결 [9] 대신 토양 오염의 가능성을 줄이고자 구리와 아미노산과의 킬레이트를 Bacillus에 축적시켜 동물의 사료에 이용 가능한 생균제를 제작하는 연구를 수행하였다. 동물에 필요한 미네랄을 함유한 생균제의 생산을 목적으로 2가 금속 미네랄인 구리와 필수 아미노산인 L-리신의 킬레이트를 효율적으로 합성하고 구리-L-리신 킬레이트를 B. megaterium ATCC 10778 내에 고농도로 축적시키는 연구를 수행하였다.


2. MATERIALS AND METHODS

2.1. 구리-L-리신 킬레이트 (copper-L-lysine chelate) 합성

구리-L-리신 킬레이트 합성은 회분식으로 진행하였다. 80oC로 가열한 30 mL의 증류수에 24.97 g의 황산구리 (Samchun Pure Chemical Co., Korea)를 넣고 황산구리가 완전히 용해된 후에는 80oC의 반응 온도를 유지하며 18.50 g의 L-리신 (Sigma Chemical Co., USA)을 넣어 연속 교반을 하며 반응시켰다. 반응이 진행되면서 반응물의 수용액이 초기 파란색에서 녹색으로 변하면 VO-10X vacuum oven (Jeio Tech Co., Korea)에서 온도는 70oC, 압력은 -400 mmHg으로 4일간 감압 건조하여 녹색 결정 형태의 화합물을 얻었다.

2.2. 적외 분광법 (Infrared Spectroscopy) 분석

구리-L-리신 킬레이트 정성 분광 분석을 위한 고체 시료는 다음과 같이 준비하였다. 건조된 녹색 결정을 고운 가루 형태로 만들어 브롬화칼륨 (KBr)과 균일하게 혼합하고 매트릭스 (matrix)에서 고압으로 압축하여 펠렛 (pellet)을 얻었다. 적외선 분광 분석 장치에 브롬화칼륨 펠렛을 넣고 스펙트럼 피크 (spectrum peak)를 분석하였다. 분석기기는 FT-IR (Spectrum 2000 Explorer Perkin Elmer Co., USA)을 이용하였다. 황산구리와 L-리신을 분석하였고 황산구리와 구리-L-리신 킬레이트의 스펙트럼 (spectrum)을 비교 분석하였다.

2.3. 구리 이온의 양 분석

구리-L-리신 킬레이트의 정량 분석을 위해 Copper Electrode 720 A+ (Thermo Orion Co., USA)을 이용하여 반응 전과 후의 구리 이온의 양을 측정하였다. 구리-L-리신 킬레이트의 합성수율은 합성 전과 후의 구리 이온의 양을 비교하여 분석하였다. 반응 시간에 따른 영향을 알아보기 위하여 5분에서 30분까지 5분 간격으로 반응시켰다. 몰 비율에 따른 반응을 알아보기 위하여 황산구리 1.0 몰 (mole) 당 0.5, 1.0 및 1.5 몰의 L-리신을 반응시켰다. 반응 온도에 따른 영향을 알아보기 위하여 70oC에서 90oC까지 5oC 간격으로 반응시켰다. 각 실험에서 황산구리의 반응 전과 후의 구리 이온의 양을 비교하여 반응 비율을 확인하였다.

2.4. 균주 및 배양

본 연구에서는 Bacillus megaterium ATCC 10778을 사용하였고 배지는 LB 배지 (media, BD Biosciences, USA), Soybean 배지 [25] 및 FB 배지 [26]를 사용하였다. 배지 50 mL를 250 mL 플라스크 (flask)에 넣고 200 rpm으로 37oC에서 24시간 동안 배양하였다. 5 L의 KF-5L 발효기 (fermentor, KoBioTech, Korea)에 2.5 L의 FB 배지를 넣고 1 vvm, 20-30% DO (dissolved oxygen) 및 300 rpm 조건에서 24시간 동안 배양하였다.

2.5. 세포 내에 축적된 구리 이온의 양 분석

세포 내에 구리 이온의 양을 분석하기 위하여 배양액을 10분 동안 10,000 rpm에서 원심 분리하여 상등액을 제거하였다. 상등액을 제거하고 남은 샘플 (sample)을 증류수로 3회 세척하고 동결 건조기로 건조하였다. 건조된 세포 2 mg을 1 mL의 질산 (HNO3)으로 처리한 후 60oC의 오븐 (oven)에서 반응시켜 완전히 용해시킨 후 흡광도를 측정하였다 [25]. 흡광도는 구리 측정 램프 CuHK (Narva, Germany)를 사용해서 AAS (Atomic Absorption Spectrophotometer) 5EA (Analytik Jena AG, Germany)에서 측정하였다.

2.6. 주사전자 현미경 (Scanning Electron Microscope, SEM) 분석

Field Emission Scanning Electron Microscope S-4300 (Hitach Co., Japan)로 B. megaterium ATCC 10778의 구리-L-리신 킬레이트 흡착을 분석하였다. 분석을 위해 샘플은 고정, 탈수, 건조, 부착 및 증착 (coating)의 과정으로 처리하였다. 원심 분리하여 세포를 회수하고 배지 성분을 제거하기 위하여 세포를 15분 동안 pH 7.2의 0.1 M의 phosphate buffer로 3회 세척하였다. 세척한 샘플은 원형 유지를 위하여 에탄올 농도 50, 70, 80 및 95%에서 10분 동안 1회, 100%에서 10분 동안 2회 처리하여 탈수하고 상온에서 건조하였다. 건조된 샘플은 홀더에 부착하고 Ion Coating System E1030 (Hitach Co., Japan)으로 증착하여 분석하였다.

2.7. 투과전자 현미경 (Transmission Electron Microscope, TEM) 관찰

Transmission Electron Microscope H-7100 (Hitach Co., Japan)으로 B. megaterium ATCC 10778 내부의 축적된 구리-L-리신킬레이트를 분석하였다. 분석을 위해 샘플은 고정, 세척, 고정, 탈수, 부착, 포매 (embedding) 및 절편 제작 등의 과정으로 처리하였다. 원심 분리하여 세포를 회수하고 4%의 PFA (paraformaldehyde)와 1%의 GA (glutaraldehyde) 혼합 용액에서 2시간 동안 고정하였다. 고정된 샘플을 0.1 M의 phosphate buffer로 10분 동안 3회 세척하고 1%의 사산화오스뮴 (OsO4)으로 다시 고정하였다. 고정된 샘플은 원형 유지를 위하여 에탄올 농도 70, 80, 90 및 95%에서 10분 동안 처리 후 에탄올 농도 100%에서 1시간 동안 2회 처리하여 탈수하였다. 탈수 후 15분 동안 프로필렌옥사이드 (propylene oxide)로 세척을 하고 Epon (EMS 812)에 포매 후 분석하였다.


3. RESULTS AND DISCUSSION

3.1. 적외 분광법 분석

본 실험에서는 구리-L-리신 킬레이트의 결합을 확인하기 위하여 FT-IR로 분석하였고 반응 전 황산구리와 L-리신을 킬레이트 반응 후의 구리-L-리신 킬레이트 물질과 스펙트럼을 비교하였다. 황산구리, L-리신 및 구리-L-리신 킬레이트의 스펙트럼은 Fig. 1에 나타내었다. 검은색 선으로 표시된 구리-L-리신 킬레이트의 스펙트럼을 보면 1600-1680 cm-1의 파수 (wave number)에서 나타나는 피크 (peak)를 통해 C=C 공유결합을 구성하고 있는 배위 결합이 이루어 진 것을 확인하였다. 그리고 3300-3600 cm-1의 파수에서 나타나는 피크를 통해 금속 이온과 배위자 사이에 일어나는 결합인 O-H 결합으로 이온 사이의 결합이 이루어진 것을 확인하였다 (Fig. 1).

Fig. 1.

FT-IR spectra of copper sulfate, L-lysine, and copper-L-lysine chelate. Blue line is L-lysine, red line is copper sulfate, and black line is copper-L-lysine chelate. Wavenumbers of carbon double bond (C=C) are 1600-1680 cm-1 and wavenumbers of hydroxy bond (O-H) are 3300-3600 cm-1.

3.2. 황산구리와 L-리신의 킬레이트 합성

황산구리와 L-리신의 반응 시간별 구리-L-리신 킬레이트의 합성율을 알아보기 위하여 80oC의 증류수에 황산구리를 넣고 L-리신을 첨가하여 반응을 시켰다. 킬레이트 반응 전의 전체 부피와 비교하여 반응이 완료된 후 반응 시간 동안 증발된 증류수의 양을 보충하고 구리 이온의 양을 측정하여 전체 반응 양을 확인하였다. 5분 간격으로 킬레이트 총 반응 시간인 30분까지 구리 이온의 양을 측정하였다. 황산구리와 L-리신의 반응은 25분 후에 완료되었다 (Table 1). 황산구리와 L-리신의 몰 비율에 따른 반응율을 알아보기 위하여 L-리신의 몰비율에 변화를 주어 합성율을 측정하였다. 1.0몰 황산구리에 L-리신을 1.5몰까지 0.5몰 간격으로 반응시켰으며 L-리신의 반응 몰 비율에 따른 구리 이온의 양을 측정한 결과로 (Table 1) 황산구리와 L-리신의 몰 비율이 1:1에서 가장 많은 반응을 하였다. 킬레이트 반응 온도 변화에 따른 반응 수율을 알아보기 위하여 증류수에 황산구리만 녹인 구리 이온의 양을 기준으로 황산구리와 L-리신의 몰 비율 1:1에서 반응시켰다. 온도는 70oC에서 90oC까지 5oC 간격으로 반응시킨 결과 황산구리가 완전히 용해되는 온도 70oC 이상에서 반응 비율이 일정하였다 (Table 1). 킬레이트 반응 전 구리 이온의 양을 100% 기준으로 황산구리와 L-리신의 반응율은 62.53%이었다.

Changes in copper ion concentration with reaction time, molar ratio, and temperature

3.3. Bacillus megaterium에 구리-L-리신 킬레이트 축적의 관찰

B. megaterium ATCC 10778에 구리-L-리신 킬레이트의 흡착을 알아보기 위하여 배지에 구리-L-리신 킬레이트를 첨가하지 않은 대조군과 구리-L-리신 킬레이트를 첨가한 실험군을 주사전자 현미경으로 비교 분석하였다 (Fig. 2). 대조군에는 표면이 매끄러운 반면에 실험군은 막 (membrane) 표면에 돌기 형태의 흡착된 물질을 확인하였다. 구리-L-리신 킬레이트가 돌기 형태의 흡착 물질인지 확인하고 세포 내부에 축적을 확인하기 위하여 B. megaterium ATCC 10778에 구리-L-리신킬레이트를 첨가하지 않은 대조군과 구리-L-리신 킬레이트를 첨가한 실험군을 투과전자 현미경으로 세포의 내부를 분석하였다 (Fig. 3). 대조군과 비교하여 실험군에서 검은색 입자 (particle)가 세포의 표면과 내부에서도 존재하고 있음을 확인하였다. 세포의 내부의 입자와 막 외부의 돌기 부분은 세포를 질산에 녹인 후 AAS로 구리 이온의 고유 파장 분석을 통하여 구리-L-리신 킬레이트로 확인되었다.

Fig. 2.

Scanning Electron Microscopy of Bacillus megaterium. Magnification is at ×20 K. (a) copper-L-lysine chelate was not added in the media and (b) copper-L-lysine chelate was added in the media. There is adsorbed material on cell surface (red arrow).

Fig. 3.

Transmission Electron Microscopy of Bacillus megaterium. Magnification is at ×30 K. (a) copper-L-lysine chelate was not added in the media and (b) copper-L-lysine chelate was added in the media. Black particles appear to be present on the cell surface (red arrow) and inside the cell (blue arrow).

3.4. Bacillus megaterium 내의 구리-L-리신 킬레이트 축적에 미치는 배지의 영향

다양한 배지에서 구리-L-리신 킬레이트를 넣어 B. megaterium ATCC 10778의 킬레이트 축적 실험을 하였다. 24시간 동안 배양한 후 세포는 10분 간 10,000 rpm으로 3회 세척하여 세포표면에 흡착된 구리 이온을 제거하고 동결건조하여 AAS로 분석하였다. LB 배지를 사용한 배양에서는 17 mg의 구리-L-리신 킬레이트를 첨가했을 때 가장 높은 구리 이온 축적량은 2,308 ppm이었다 (Table 2). 구리-L-리신 킬레이트 17 mg 이상에서는 축적량이 감소되었으며, 높은 농도의 구리-L-리신킬레이트는 세포 성장 제한으로 균체량이 감소하였다. Soybean 배지의 플라스크 배양 최적화를 위해 다양한 농도의 구리-L-리신 킬레이트를 넣어 축적된 구리 이온을 분석하였다. 구리-L-리신 킬레이트 30 mg에서 5,238 ppm로 최대 축적량을 확인하였다 (Table 2). FB 배지의 플라스크 배양에서는 세포의 성장 속도가 증가되었고 구리-L-리신 킬레이트를 35 mg 첨가하였을 때 최대 구리 이온 축적량은 7,626 ppm이었다 (Table 2). 그러나 구리-L-리신 킬레이트를 40 mg 첨가하였을 때는 세포가 성장을 못하였으며 구리-L-리신 킬레이트를 35 mg 첨가하였을 때는 균체량이 감소하였다 (data not shown). 플라스크 배양 결과를 기반으로 발효기에서 FB 배지로 배양을 하였다. FB 배지의 플라스크 배양에서 구리-L-리신 킬레이트를 35 mg 첨가하였을 때 구리 이온의 최대 축적량을 보였지만 낮은 균체량을 보였기 때문에 발효기를 사용한 배양에서는 그 절반 농도인 구리-L-리신 킬레이트를 0.35 g/L로 첨가한 후 pH에 의한 영향을 확인하였다. 배양은 각각 pH 6, 7 및 8로 하여 2.5 L 배지에 24시간 동안 배양하였다. 3시간 배양에서 구리 이온의 축적량과 균체량이 최대가 되는 것을 확인하였으며, 구리 이온의 축적량과 균체량은 pH 8에서는 각각 25,102 ppm과 1.10×108 CFU/mL, pH 7에서는 각각 29,814 ppm과 4.25×108 CFU/mL 그리고 pH 6에서는 각각 38,043 ppm과 6.50×108 CFU/mL로 pH가 낮을수록 구리 이온 축적량과 균체량이 증가하였다 (Fig. 4). 동물의 생균제로 판매되는 Bacillus 생균제의 균체량은 약 1.00×109-1.00×1010 CFU/g으로 알려져 있다 [20]. 이 수치는 본 연구에서 B. megaterium ATCC 10778의 균체량인 6.50×108 CFU/mL와 비교하면 상용화된 제품의 균체량에 비해 약 65% 정도 수준이지만 생산량을 늘릴 수 있을 것이다.

Changes in copper ion accumulation of Bacillus megaterium grown on different media

Fig. 4.

Copper ion accumulation of Bacillus megaterium in fermentor culture of FB media at various pHs. : copper ion accumulation, : viable cell count, : OD600nm, and : DO (dissolved oxygen). (a) at pH 8, (b) at pH 7, and (c) at pH 6.


4. CONCLUSION

황산구리와 L-리신의 킬레이트 반응에서 25분 후에 반응이 완료되었고, 70oC에서 황산구리와 L-리신의 반응 몰 비율이 1:1일 때 최대 반응율이 62.53%이었다. B. megaterium ATCC 10778에 구리 이온의 축적량은 주사전자 현미경 (SEM), 투과전자 현미경 (TEM) 및 AAS 분석을 통해 세포 외부의 막에 돌기 형태에 구리-L-리신 킬레이트의 존재와 세포의 내부에도 구리-L-리신 킬레이트가 축적됨을 확인하였다. 구리-L-리신 킬레이트를 첨가한 B. megaterium ATCC 10778의 플라스크 배양에서는 LB 배지를 사용하였을 때 가장 낮은 구리 이온 축적량을 보였고 FB 배지에서 많은 양의 구리 이온이 축적되었다. 플라스크 배양에 사용한 배지 중에 가장 높은 구리 이온 축적량을 보인 FB 배지를 사용하여 발효기에서 배양을 하였고 pH 조건에 따른 영향도 살펴본 결과 pH 6일 때 pH 7과 pH 8에 비해 각각 15.8%, 34% 증가한 최대 구리 이온 축적량과 1.53배, 5.90배 증가한 최대 균체량을 확인할 수 있다. 본 연구 결과들은 황산구리와 L-리신의 킬레이트 반응을 통해 얻은 구리-L-리신 킬레이트를 B. megaterium ATCC 10778 내에 축적하여 미네랄이 함유된 생균제로 이용될 수 있는 가능성을 보여주었다.

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Fig. 1.

Fig. 1.
FT-IR spectra of copper sulfate, L-lysine, and copper-L-lysine chelate. Blue line is L-lysine, red line is copper sulfate, and black line is copper-L-lysine chelate. Wavenumbers of carbon double bond (C=C) are 1600-1680 cm-1 and wavenumbers of hydroxy bond (O-H) are 3300-3600 cm-1.

Fig. 2.

Fig. 2.
Scanning Electron Microscopy of Bacillus megaterium. Magnification is at ×20 K. (a) copper-L-lysine chelate was not added in the media and (b) copper-L-lysine chelate was added in the media. There is adsorbed material on cell surface (red arrow).

Fig. 3.

Fig. 3.
Transmission Electron Microscopy of Bacillus megaterium. Magnification is at ×30 K. (a) copper-L-lysine chelate was not added in the media and (b) copper-L-lysine chelate was added in the media. Black particles appear to be present on the cell surface (red arrow) and inside the cell (blue arrow).

Fig. 4.

Fig. 4.
Copper ion accumulation of Bacillus megaterium in fermentor culture of FB media at various pHs. : copper ion accumulation, : viable cell count, : OD600nm, and : DO (dissolved oxygen). (a) at pH 8, (b) at pH 7, and (c) at pH 6.

Table 1.

Changes in copper ion concentration with reaction time, molar ratio, and temperature

Variants Copper ion concentration (×103 ppm)
Time
(min)
0 175.67
5 129.67
10 122.33
15 110.00
20 90.87
25 82.17
30 84.33
L-Lysine
molar ratio
0.0 181.00
0.5 102.00
1.0 86.10
1.5 86.80
Temperature
(oC)
standard 183.89
70 68.89
75 69.44
80 75.56
85 71.94
90 70.00

Table 2.

Changes in copper ion accumulation of Bacillus megaterium grown on different media

Media Copper-L-lysine chelate (mg) Copper ion accumulation (ppm)
LB 15 1,606
16 1,793
17 2,308
18 2,253
19 1,975
Soy bean 10 3,405
20 4,231
30 5,238
40 4,629
50 4,289
FB 15 5,717
20 6,051
25 7,091
30 7,424
35 7,626