The Korean Society For Biotechnology And Bioengineering
[ Research Paper ]
Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 33, No. 3, pp.175-182
ISSN: 1225-7117 (Print) 2288-8268 (Online)
Print publication date 30 Sep 2018
Received 15 Jun 2018 Revised 12 Jul 2018 Accepted 25 Jul 2018
DOI: https://doi.org/10.7841/ksbbj.2018.33.3.175

미세조류 (Pseudokirchneriella subcapitata), 물벼룩 (Daphnia magna), 그리고 어류 (Danio rerio Embryo)를 이용한 유기인계농약 Carbophenothion의 위해성평가

구희영 ; 김성준*
전남대학교 환경에너지공학과
Risk Assessment of Carbophenothion, an Organophosphorus Pesticide, Using Pseudokirchneriella subcapitata, Daphnia magna, and Danio rerio Embryo
Hee-Yeong Gu ; Seong-Jun Kim*
Department of Environment and Energy Engineering, Chonnam National University, Gwangju 61186 Korea +82-62-530-1864 +82-62-530-1859 seongjun@jnu.ac.kr

Correspondence to: *Department of Environment and Energy Engineering, Chonnam National University, Gwangju 61186, Korea Tel: +82-62-530-1864, Fax: +82-62-530-1859 e-mail: seongjun@jnu.ac.kr


© 2018 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering

Abstract

In 2008, Carbophenothion had the 10th detection frequency in Korea; it is therefore necessary to evaluate the comprehensive risk factors. However, previous studies on the risk of Carbophenothion are limited to the assessment of a single species based on diverse evaluation methods from various research institutes. Therefore, in this study, acute toxicity tests were performed on three types of organisms representing the aquatic ecosystem according to the test guidelines of Organization for Economic Cooperation and Development to assess the overall risk of Carbophenothion. The organisms to be evaluated were selected among the test species recommended by the International Standard Test Methods, and the culture and test conditions were kept constant. In each test, the no observed effect concentration (NOEC), lowest observed effect concentration (LOEC), and 50% lethal/effect concentration (L/EC50) were calculated by the Probit Method and the Trimmed Spearman Karber Method. The growth inhibition of microalgae (Pseudokirchneriella subcapitata) was observed by the microscopic counting method and optical measured method; the 72 hr-EC50 was 0.29 mg/L and 0.21 mg/L, respectively. Observation of immobilized daphnia (Daphnia magna) revealed that the 48hr-EC50 was 2.1×10-10 mg/L. The 96 hr-LC50 of fish (Danio rerio embryo) was 42.8 mg/L, and the morphological abnormalities such as pigmentation (P), bent spine (BS), and bloody pericardial edema (BPE) were observed. Finally, the hazard quotient (HQ) was found to be 1.3, however, the considerable difference between the EC50 and LC50 of D. magna should be considered.

Keywords:

carbophenothion, risk assessment, Pseudokirchneriella subcapitata, Daphnia magna, Danio rerio embryo

1. INTRODUCTION

일부 농약은 대기 중으로 휘발되고 생물체에 의해 분해되어 신속하게 사라지기도 하지만 대부분은 잔류되어 비점오염원으로써 상당지역에 작용한다. 국내 22개 지역에서 유통되는 농산물의 잔류농약실태를 조사한 결과 3.20%의 농약이 검출되었고, 검출된 농산물의 잔류농약 농도는 전부 허용기준치 이하였다 [1]. 이에 근거하여 노출평가를 수행한 결과 인체에 대한 직접적인 위해는 거의 없는 것으로 확인되었다 [1]. 하지만 인간은 농작물뿐만 아니라 수서의 물고기 등 다양한 식자재를 섭취하기 때문에 잔류농약 노출의 추가적인 확률은 결코 배제할 수 없으며, 바디버든 (Body burden; 유해화학물질의 체내 축적)의 관점에서 먹이사슬의 하위단계로의 독성영향 평가가 요구된다.

특히 농업에 사용되는 제초제, 성장조절제, 보조제 등 다양한 농약 중에서도 살충제는 전체 농약 사용량의 일부분만을 차지하지만 유기염소계 살충제가 환경오염에 중대한 영향을 미치며 살충제 독성평가의 필요성이 대두되었다. 1970년대 이전에는 주로 DDT, Dieldrin, Endrin 등 유기염소계 살충제가 사용되었는데 이들은 큰 독성과 잔류성으로 환경과 생물체로의 독성농축 등의 문제를 낳았다. 이에 따라 우리나라를 포함한 대부분 국가에서 스톡홀름 협약으로 유기염소계 농약의 제조 및 사용을 규제하고 있다 [2]. 유기염소계 농약을 대신하여 살충효과가 우수하고 분해속도가 빠른 유기인계 농약이 세계적으로 유통되면서 현재 100가지 이상의 유기인계 농약이 시판되고 있고, 국내에서도 역시 대량 생산되며 가장 많이 사용되고 있다 [3,4].

유기인계 농약 중 Carbophenothion은 미국 환경보호국 (US EPA; Environmental Protection Agency)에서 독성이 강한 카테고리 I으로 분류하고 있다 [5]. 하지만 캄보디아와 같은 개발도상국에서는 금지 및 제한된 살충제를 여전히 쉽게 구입할 수 있고, 심지어 DDT와 같은 잔류성유기오염물질 (POPs; Persistant Organic Pollutants)의 살충제를 사용하기도 한다 [6,7]. 또한 농산물의 농약 잔류량을 분석한 국내연구에서는 미등록농약이 검출된 경우가 농약잔류허용기준을 초과한 경우보다 4.9배 높음을 확인하여 방제 후 농약 살포기를 세척하여도 어느 정도의 잔류농약이 비의도적으로 노출될 수 있음을 제시하였다 [8]. 실제로 Carbophenothion이 국내 아산만 해수 중에 검출된 유기인계 농약 29가지 중 검출 빈도 10위를 차지한 바 있기 때문에 [2], 수생생태계 건강 유지를 위해 Carbophenothion의 환경위해성평가가 필요하다.

기존에 수행된 수서 환경 중 Carbophenothion의 독성에 관한 연구들은 미세조류, 무척추동물, 그리고 어류 각각에 대한 평가로 국한되어 있을 뿐 아니라 각 시험의 가이드라인에 통일성이 없다는 점에서 수서 생태계로의 Carbophenothion의 환경위해성을 종합적으로 평가하기에는 부족하다. 따라서 본 연구에서는 이전에 보고된 종 수준의 시험 결과와 달리 수서 생태계 영양단계의 세 개체군 (tri-trophic)을 대상으로 Carbophenothion을 노출함으로써 그 독성영향을 종합적으로 평가하였다. 생태 독성평가 시험계는 일차생산자인 미세조류 (P. neriella subcapitata), 일차소비자인 무척추동물 (D. magna), 그리고 이차소비자인 어류 (D. rerio embryo)로 구성하였다. 각 생물은 OECD 등에서 독성평가의 표준시험생물로 지정되어있기 때문에 결과의 재현성이 높고 기타 독성자료들과 직접 비교가 가능하다는 장점이 있다 [9-11].

본 연구는 Carbophenothion의 유해성 확인, 용량-반응 평가, 노출 평가, 그리고 위해성 평가의 순서로 진행하였고, 최종적으로 유해지수 (HQ)를 제시함으로써 수생생태계에서의 위해성을 평가하였다. 이는 Carbophenothion의 수서 생태계에 대한 독성을 종합적으로 판단하기 위한 기초자료로써 충분히 활용될 것으로 예상된다.


2. MATERIALS AND METHOD

2.1. 유해성 확인

본 연구의 평가 대상인 살충제 Carbophenothion은 머캅탄 향을 가진 무색 또는 호박색의 액체로 분자식은 C11H16ClO2PS3 (Fig. 1), 분자량은 342.87 g/Mole이다. 사용한 시약의 순도는 96.1%로 Sigma-aldrich에서 구매하였으며 개봉 직후 시약 전량을 dimethyl sulfoxide (Junsei Chemical Co., Japan, 99.8%)에 녹인 0.2% stock solution 상태로 4oC 암실에 냉장 보관하였다 [5].

Fig. 1.

Chemical structure of Carbophenothion.

다양한 생물종에 대한 급성독성자료를 확인하고자 하였지만 Carbophenothion의 환경 중 유해성 정보가 불충분하여, QSAR (Quantitative Structure Activity Relationship) 프로그램으로 화학물질의 구조에 따른 수생생태계의 세 영양단계에 대한 급성독성을 예측하였다. 본 연구에서는 대표적인 QSAR 프로그램 중 EPA와 SRC (Syracuse Research Corporation)가 개발한 스크리닝 레벨의 EPI Suite (v4.1, US EPA)를 이용하였다.

2.2. 용량-반응 평가

각 생물의 배지 및 사육수 조제에는 Na2EDTA·2H2O (Junsei Chemical Co., Japan, Guaranteed Reagent)와 NaHCO3 (Samchun Pure Chemical Industries LTD, Korea, First grade)를 제외하고는 Extra Pure등급의 시약을 사용하였고, 모든 생물은 시험조건과 같은 환경에서 최소 한 달 계대배양하였기 때문에 환경부적응으로 인한 영향은 없다고 간주하였다. 또한 모든 생태 독성시험은 stock solution을 상온에 충분히 적응시킨 뒤에 실시하였다.

2.2.1. 조류 성장저해시험

본 연구에서는 P. subcapitata를 ㈜NLP (Natural & Live Plankton, Korea)에서 분양받아 온도 20±1oC, 광도 6800 lux, 광주기 (L:D) 24:0의 조건에서 배양하였다. 조류 성장저해시험은 OECD TG 201에 따른 환경조건에서 세포수와 Chlorophyll a 함량의 72시간 관찰로 이루어졌으며 [9], 결과처리에는 EPA Probit Method (v1.5, US EPA)을 이용하였고 LOEC와 EC50 및 95% 신뢰구간을 도출하였다.

혈구계수기에 커버글라스를 덮고 시료 주입 5분 정치 후 실체현미경 (Nikon, ECLIPSE E200, Japan)을 이용하여 400배율로 관찰하였다. 혈구계산판의 중구획을 2회씩 검경하였고 분취한 미세조류 (mL)와 세포 염색용 루골용액 (mL)을 1:1 비율로 충분히 섞은 것을 시료 용액으로 하였다. 본 연구에서는 수질오염공정시험기준 식물성플랑크톤-현미경계수법에 제시된 mL당 세포수 환산식에 농도와 단위를 보정하여 식1 로 변형하였고, 이에 따라 계산하였다 [12].

 1.  / mL=CV×N×a×b

C = 계수된 개체수의 합

V = 검경한 구획의 부피 (mm3)

N = 검경한 시야의 횟수

a = 단위 보정 계수 1000 (mm3/mL)

b = 시료 희석 배수

1984년에 수행된 엽록소 추출에 사용되는 다양한 용매의 비교 연구는 Chlorophyll-a에 대해 계산된 비흡수계수가 90% 아세톤에서 가장 높다는 것을 보여주었다 [13]. 따라서 본 연구에서는 Chlorophyll-a를 90% 아세톤으로 추출한 후 Parsons and Strickland (1972)의 방법에 따라 단위 부피당 pigment 농도 (mg/m3)로 환산하였다 [14]. 유리섬유여과지 (47 mm Whatman GF/C)에 감압여과하여 90% 아세톤으로 엽록소를 추출하였다. 해당 시료는 4oC 암실에 24시간 보관 후 3000 rpm, 10분의 조건에서 2회 원심분리하였고, UV/VIS Spectrophotometer (Optizen 3220UV, Korea)를 이용하여 665 nm, 645 nm, 630 nm에서 상등액의 흡광도를 측정하였다.

2.2.2. 물벼룩 급성독성시험

국내 GLP (Good Laboratory Practice)기관인 KTR (Korea Testing and Research Institute, Korea)에서 D. magna를 분양받아 온도 20±1oC, pH 7.3, 광도 720 lux의 조건에서 배양하였다. 사육수로 M4 배지를 선택하여 3일 간격으로 배양액 전량을 교체하였고 주 먹이 Chlorella는 1일 1회, 보조 먹이 YCT (Yeast, Chlorophyll, Trout chow)는 주 1회 급여하였다. 물벼룩 급성 독성시험은 OECD TG 202에 준하는 환경조건에서 48시간 동안의 유영저해 관찰로 이루어졌다 [10]. 시험결과는 EPA Trimmed Spearman-Karber Method (v1.5, US EPA)로 통계하여 NOEC, LOEC, EC50 그리고 95% 신뢰구간을 제시하였다.

모든 샘플에 대한 노출 개체는 성체로 성숙한 이후 3번째 산란 시 태어난 어린 개체 10마리로 구성하였고 처리 농도당 3개의 반복구를 두었으며 시험 동안 별도의 폭기나 먹이는 제공하지 않았다. 상층부 1/3-2/3 지점에서 상하 움직임을 보이는 물벼룩을 건강한 물벼룩으로, 시험용기를 움직이고 15초 경과 후 일부 기관은 움직임이 있더라도 유영하지 않는 것은 유영저해로, 아무런 움직임도 없는 개체는 치사로 판단하였다. 모든 시험은 배양조건과 같이 지수식으로 진행되었고, 대조군 및 처리군에서 용존산소가 3 mg/L 이상을 유지할 수 있도록 시험개시 전에 시험용액을 충분히 폭기하였으며 대조군의 물벼룩이 불안정하다고 판단되는 경우에는 재시험하였다.

2.2.3. 어류 급성독성시험

어류 급성독성시험은 장기 및 유전질환이 인간과 유사한 D. rerio를 대상으로 수행하였으며 제브라피쉬소재은행 (Korea)에서 분양받아 개체번식으로 세대를 연장하여 사용하였다. 배양 및 시험 환경은 온도 26±1oC, pH 7.5±0.5, 광도 240 lux, 광주기 (L:D) 16:8로 항상 일정하게 유지하였고, 양질의 천연수를 구하기에 어려움이 있어 증류수에 sea salt 0.16 g/L와 sodium bicarbonate 0.065 g/L를 용해한 후 12% sodium phosphate monobasic anhydrous 용액으로 pH를 조정하여 사육수로 사용하였다. 윤리적 관점에서 치어를 대신하여 생물 발생단계 이전의 배아를 이용한 급성 독성평가법이 개발됨에 따라 OECD TG 236에 준하여 어류의 초기생장 단계에 미치는 영향을 평가하였다 [11]. 결과처리에는 EPA Trimmed Spearman-Karber Method (v1.5, US EPA)을 이용하였으며 NOEC, LOEC, LC50 및 95% 신뢰구간을 제시하였다.

독성물질 노출 직후부터 96시간 후까지 24시간마다 실체현미경 (Nikon, ECLIPSE E200, Japan)으로 4배 확대하여 농도변화에 따른 치사뿐 아니라 형태학적 이상 현상까지도 관찰하였다. 색소침착 (P), 척추 굽음 (BS), 피가 심한 심낭부종 (BPE)과 같은 형태학적 이상 판단에는 주관적 기준 수립의 어려움을 겪어 수차례 예비실험을 진행함으로써 시험의 재현성과 신뢰성을 높였다.

2.3. 노출 평가

아산만 해역의 유기인계 농약 분포특성에 관한 연구에서 Carbophenothion의 최대 검출 농도와 검출빈도를 확인할 수 있었다 [15]. 하지만 최고검출농도로 일반화하는 것은 무리라고 판단되어 희석배수를 적용하여 예측환경농도 (PEC; Predicted Environment Concentration)를 산정하였다.

2.4. 위해성 평가

본 연구에서는 시험생물 종 이용이 제한적이었기 때문에, 도출 가능한 생태 독성자료 중 가장 낮은 독성값을 평가계수 (AF; Assessment Factor)로 나누어 안전수준을 결정하는 방법을 이용하여 생태위해성을 평가하였다 [16,17]. 가장 민감한종의 EC50에 AF 100을 적용하여 PNEC를 계산하였고, HQ는 PEC와 PNEC의 비로 산정하여 그 값이 1.0보다 클 경우에 Carbophenothion의 노출로 인한 위해 가능성이 있다고 간주하였다.


3. RESULTS AND DISCUSSION

3.1. 유해성 확인

기존연구에서 밝힌 Carbophenothion의 미세조류 (Skeletonema costatum)에 대한 반수영향농도 (96 hr-EC50)는 약 0.11 mg/L, 무척추동물 (D. magna)에 대한 반수치사농도 (48 hr-LC50)는 약 0.08 mg/L, 그리고 어류 (Lepomis macrochirusLctalurus puntatus)에 대한 반수치사농도 (96 hr-LC50)는 각각 0.013 mg/L와 6.00 mg/L로 확인되었다 [18,19]. 특히, 다른 종에 대한 독성을 비교할 수 있는 어류에 대한 평가결과는 종내 특이성이 충분히 더 크게 작용할 가능성도 있음을 보여주고 있다. 본 연구에서는 문헌에 제시된 두 종과 다른 D. rerio를 이용하였으면서도, 심지어 배아단계의 개체를 대상으로 시험하였기 때문에 본 연구에서 도출한 LC50은 참고문헌에 제시된 값과 크게 상이할 것으로 예상된다. 또한 세 영양단계에 대한 급성독성평가의 종말점이 상이함에도 불구하고 각 독성값에는 유의한 차이가 있다는 점에서, 종간특이성 또한 무시할 수 없다고 판단할 수 있다. 생물을 대상으로 수행하는 독성평가인만큼 사육 및 시험 조건이 중요하게 작용할 것으로 사료되는데, 조사한 문헌은 다양한 시기에 서로 다른 연구자에 의한 시험결과이기 때문에 해당 자료에만 근거하기에는 부족하다고 판단된다.

따라서 추가적으로 EPI Suite로 Carbophenothion의 독성을 예측한 결과 조류에 대한 96 hr-EC50은 0.18 mg/L, 물벼룩에 대한 48 hr-LC50은 0.66×10-3 mg/L, 그리고 어류에 대한 96 hr-LC50은 0.04 mg/L이었다. 예측값은 본 연구 및 기존연구에서 직접 구한 실험값과 분명한 차이를 보이는데, 독성평가에 있어서 시험생물 종의 특이성은 무시할 수 없음에도 불구하고 해당 프로그램에서 영향을 예측한 생물 종이 명확하게 제시되지 않았던 까닭으로 사료된다. 또한 상이한 노출 시간, 연구자들간의 치사 및 영향에 대한 불명확한 판단 기준, 시험대상 생물의 발달단계 등도 간과할 수 없다.

Carbophenothion은 평균적으로 갑각류에 보통 독성, 어류에 고독성을 띄지만, 이의 비교적 큰 물-옥탄올분배계수 (Log-Kow = 5.33)가 토양이나 고형매질에 더 빠르게 흡착할 수 있도록 하기 때문에 [20], 부유 입자에 흡착되면 더욱 강한 영향을 초래할 수도 있다. 따라서 기존 문헌뿐 아니라 본 연구결과와 QSAR프로그램을 통한 예측값 모두 실질적인 유해성을 확인하기에는 부족함이 있을 것으로 사료되지만, 추후 해당연구가 QSAR 프로그램의 기초자료로 활용되어 구체적인 환경에서의 독성을 예측한다면 그 결과의 신뢰도는 향상될 것으로 기대된다.

3.2. 용량-반응 평가

3.2.1. 조류 성장저해시험

대조군, 0.007, 0.27 및 11 mg/L로 농도설정 시험을 진행한 결과 중간농도에서 80.5 (±6)%의 성장저해율을 보였으며 최저농도에서는 25%의 저해가 관찰되었다. 따라서 본시험에서는 공비를 3으로 하고 예비시험의 최저 및 중간농도를 포함하는 범위인 0.01, 0.03, 0.09, 0.28, 0.83 mg/L와 비투여대조군 및 용매대조군에서 관찰하였으며 배양조건과 동일한 환경에서 시험을 수행하였다. 각각에 대하여 3개의 반복구를 두었고 모든 플라스크의 생물량은 24시간마다 측정하였으며 처리농도별 수율은 대조군과 비교하여 상대적 성장저해율로 나타내었다. 또한 시험 종료 후에는 시험의 유효성을 확인하기 위해 OECD 가이드라인에 근거하여 24시간 단위의 평균 특이 성장률을 제시하였다.

관찰 및 측정은 3일 전배양한 지수성장기의 조류를 대상으로 하였고 시험 동안 관찰한 모든 시료에서 조류 이외의 미생물 증식은 육안으로 확인되지 않았다. 또한 비투여대조군과 용매대조군 사이에서는 생물량 변화가 크게 관찰되지 않아 용매에 의한 영향은 없는 것으로 간주하였다 (data not shown). OECD 가이드라인은 시험의 타당성을 위해 구간별 평균 특이성장률의 평균 변동계수가 35%를 초과하지 않고 시험 기간 72시간 이내에 대조군의 생물량이 16배 이상 증가하여야 한다고 규정하고 있는데 [9], 시험 개시 직후의 대조 시료 내 생물량은 Chlorophyll-a 측정이 불가능한 정도였기 때문에 본 연구의 현미경 계수 결과만을 이용하여 계산하였다. 24시간 단위의 대조군 생물량은 약 3×104, 13×104, 47×104, 그리고 97×104 cells/mL로 72시간 동안 약 29배 증가함을 확인할 수 있었다. 또한 대조군 반복구의 구간별 특이성장률을 계산한 결과 μ0-24는 0.058 day-1, μ24-48는 0.053 day-1, 그리고 μ48-72는 0.030 day-1로 이들의 평균변동계수는 26%에 그쳤기 때문에 본 시험의 유효성을 제시할 수 있다.

현미경 계수와 Chlorophyll-a 측정의 결과는 상이한 실험방법을 통해 확인한 미세조류양을 각각의 환산 식에 계산하여 나타내었다. 본 연구에서는 상이한 평가방법에 대한 별도의 보정 없이 기존 연구에서 제시한 환산 식에 적용한 결과 그대로를 비교하였기 때문에 100% 일치하지는 않았지만, 시험방법과는 무관하게 전반적으로 Carbophenothion 처리 농도가 높아짐에 따라 생물량은 감소하는 경향을 보였다 (Fig. 2).

Fig. 2.

Dose response curve of Carbophenothion against P. subcapitata at 72 hr.

현미경 계수의 경우, 시료를 챔버에 채우고 별도의 정체시간 없이 관찰한다면 충분히 침전되지 않은 개체가 계수 결과에 제외되어 오차 유발 요인이 될 수 있다고 사료되었기 때문에 5분간 정체 후 세포를 계수하였다. 하지만 현미경 계수 결과를 Chlorophyll-a 측정법과 비교하였을 때, 미세조류를 루골용액으로 염색하여 탈색의 영향이 없는 세포만을 계수하였음에도 불구하고 흡광법으로 측정한 결과보다 더 많은 세포가 계수되었다. 이는 5분의 정체시간이 적정량의 미세조류가 가라앉는데 필요한 시간보다 길게 설정되어 과하게 침체된 세포까지 계수된 까닭으로 예상된다.

최종적으로 시험 종료 시 생물량에서 시험 개시기 생물량을 뺀 값을 수율로 나타내었고, 수율에 대한 50% 영향농도를 EC50으로 하였다. 처리농도 0, 0.01, 0.03, 0.09, 0.28, 0.83 mg/L에 따른 시험 종료 시 생물량을 현미경으로 계수한 결과는 97×104, 96×104, 77×104, 69×104, 56×104, 31×104 cells/mL였고 흡광도 측정으로 계산한 결과는 각각 30.77, 30.72, 26.94, 20.62, 15.34, 4.89 mg/L였다. 따라서 현미경 계수 결과로 구한 72 hr-EC50과 95% 신뢰구간은 0.29 mg/L와 0.14-1.08 mg/L, 엽록소 농도로부터 계산한 72 hr-EC50과 95% 신뢰구간은 0.21 mg/L와 0.17-0.26 mg/L였으며 이때 LOEC는 0.01 mg/L였다. 동일 생물 종에 대한 Carbophenothion의 독성자료를 참고하여 시험의 재현성을 확인하고 싶었으나 해당 연구는 기존에 진행된 바 없어 해산 규조류에 대한 독성평가 연구를 참고하였다. 참고문헌에서는 S. costatum에 대한 Carbophenothion의 EC50을 0.11 mg/L로 밝혔지만 [18], 이는 시험생물뿐만 아니라 배양 조건, 노출 시간, 평가 및 통계처리 방법 등이 본 연구와 달라 면밀히 비교하기에는 어려울 것으로 사료된다. 하지만 본 연구에서 평가한 두 가지 방법에 따른 독성 값에는 유의한 차이가 없음에 따라 추후 기타 담수조류에 대한 Carbophenothion의 독성 연구의 기초자료로 충분히 활용될 것으로 기대된다.

3.2.2. 물벼룩 급성독성시험

본 시험을 수행하기에 앞서 MSDS (Material Safety Data Sheets)에서 D. magna에 대한 Carbophenothion의 48 hr-LC50을 0.08 mg/L로 확인하였고 이에 따라 Carbophenothion을 0.014, 0.07, 0.34 및 1.7 mg/L로 처리하여 반복 시험하였다. 시험결과를 EPA Probit Method (v1.5, US EPA)로 통계하자 48 hr-LC50은 0.05 mg/L로 나타났으며 이는 참고문헌의 독성 값과 약간의 차이가 있음을 알 수 있었다. 하지만 이때 95% 신뢰구간이 0.08 mg/L을 포함하는 0.01-0.1 mg/L로 확인되었기에 두 결과값의 오차는 연구자의 유영저해 판단 및 통계 방법으로부터 생긴 것으로 예상하였다. 이때 최저농도인 0.014 mg/L에서도 심각한 유영저해가 관찰되어 본 연구에서는 EC50을 추가로 구하였다.

대조군, 5.5×10-10, 27.4×10-10 및 137×10-10 mg/L에서 농도설정 시험을 수행한 결과 최저농도에서 60%, 중간농도에서 100%의 치사가 관찰되었다. 따라서 본 시험에서는 예비시험의 최저농도를 포함하는 범위에서 공비를 2로 하여 비투여대조군과 용매대조군 및 0.86×10-10, 1.7×10-10, 3.4×10-10, 6.9×10-10, 13.7×10-10 mg/L에서의 영향을 관찰하였다. D. magna에 대한 DMSO의 급성 및 만성에 관한 연구 (2003)에서는 NOEC를 6.8 mg/L로 제시하였고 [21], 본 시험의 용매대조군에서도 DMSO의 독성 영향은 나타나지 않았으며 (data not shown) 이때 비투여대조군에서 비커 표면에 뜨는 등의 불안정한 상태도 발견되지 않았다.

Fig. 3에 나타난 것과 같이 24시간 경과 시에는 1.7×10-10 mg/L 이하의 농도에서 아무런 영향도 발견되지 않았던 반면, 48시간 경과 시 1.7×10-10 mg/L에서는 6마리의 유영저해가 관찰되었고 3.4×10-10 mg/L에서는 전체 치사하였다. 따라서 NOEC와 LOEC는 0.86×10-10 mg/L 와 1.7×10-10 mg/L로 판단하였으며 48 hr-EC50은 2.1×10-10 mg/L, 95% 신뢰구간은 1.9×10-10-2.3×10-10 mg/L로 확인되었다.

Fig. 3.

Survival rates at 24 hr and 48 hr of D. magna exposed at different concentrations of Carbophenothion. *bars from left to right represent the survival rates of D. magna exposed at control concentration, 0.86×10-10, 1.7×10-10, 3.4×10-10, 6.9×10-10, and 13.7×10-10 mg/L of Carbophenothion, respectively.

3.2.3. 어류 급성독성시험

본 평가에 앞서 Carbophenothion의 급성 독성평가를 수행했던 기존 연구를 통해 L. macrochirusL. puntatus에 대한 LC50이 각각 0.013 mg/L와 6.00 mg/L임을 확인하였고 [19], 이를 토대로 Carbophenothion을 0.007, 0.25, 그리고 8.9 mg/L로 처리하여 예비시험을 수행하였지만 D. rerio embryo는 8.9 mg/L의 Carbophenothion에서 아무런 영향을 보이지 않았다. 두 가지 수명단계의 D. rerio에 대해 2-phenoxyethanol의 독성을 평가한 문헌에서 언급한 배아보다 부화 후로부터 2-3개월 지난 어린 개체에서 통계적으로 높은 민감성을 보였다는 연구결과와 마찬가지로 [22], Carbophenothion의 독성 또한 배아보다 치어에서 더욱 크게 발현될 가능성이 충분하다고 판단하였다. 따라서 예비시험의 최고농도보다 약 13배 높은 115 mg/L이하 5개 농도에서의 영향을 관찰하였다.

비투여대조군, 용매대조군, 그리고 처리군에는 3개의 반복구를 두어 각각 24개의 수정란을 노출했고 처리군의 공비는 3.2로 설정하여 1.1, 3.5, 11.2, 36 및 115 mg/L에서 평가하였다. OECD 가이드라인은 각각의 개체특이성을 고려하여 대조군의 부화한 수정란의 생존율이 최소 90%를 초과하도록 규정하는데 [11], 본 시험에서는 해당 기준을 만족하였음을 Table 1에 나타내었다. 이때 최고농도인 115 mg/L에 노출된 개체는 24시간이 경과하였을 때 전체 응고되었기 때문에 부화를 관찰할 수 없었다. 해당농도에서는 Carbophenothion이 사육수와 반응하여 시료의 탁도가 높아지고 타이어 타는 냄새가 나기도 했는데 그만큼 독성이 강하게 작용한 것으로 사료된다. 이전 농도인 36 mg/L에서는 96시간 경과 후 처음으로 7마리의 치사가 나타났고 생존율은 65%로 확인되었다. 하지만 11.2 mg/L에서 치사가 관찰되지 않았더라도 형태학적 이상 현상이 나타났기 때문에 본 연구에서는 D. rerio embryo의 NOEC와 LOEC를 3.5 mg/L와 11.2 mg/L로 판단하였다. 96 hr-LC50은 42.8 mg/L로 확인되었고 95% 신뢰구간에서 최저 값은 33.4 mg/L, 최고값은 54.86 mg/L이었으며 이때 별도로 처리한 용매대조군과 비투여대조군에서는 유의한 차이가 발견되지 않았다 (data not shown).

Hatching rates and survival rates of D. rerio embryos according to Carbophenothion concentrations

Carbophenothion의 농도가 높아짐에 따라 발현된 형태학적 이상 현상은 부화 전 수정란과 부화 후 개체로 구분하였고 각각은 0시간 및 96시간의 대조군과 비교하여 Fig. 4에 정리하였다. Fig. 4(c) 수정란의 응고는 대조군을 포함한 모든 처리농도에서 관찰되었으나 Fig. 4(a) 수정란의 색소침착과 Fig. 4(b) 수정란의 와해는 최고농도인 115 mg/L에서만 관찰되었다. 특히 농도 조제 직후 뿌옇게 반응했던 115 mg/L에 노출된 수정란 전체는 시간이 지남에 따라 시료의 탁도가 낮아지면서 수정란 표면에 색소가 침착된 것을 알 수 있었다. 또한 115 mg/L에 노출된 개체는 24시간 이내에 29%가 응고하였고 48시간 후에는 4%의 수정란 와해와 46%의 응고가 관찰되었다. 나머지 21%의 수정란은 72시간까지 색소가 침착된 채 부화하지 못하고 응고되었다. 부화한 개체의 치사 외 형태학적 이상 현상으로는 11.24 mg/L부터 난황이 검게 물드는 현상인 Fig. 4(d) 색소침착과 어류의 척추가 휘는 현상인 Fig. 4(e) 척추 굽음이 관찰되었고, 115 mg/L에서는 어류의 심장 막이 피와 함께 빨갛게 부풀어 오르는 현상인 Fig. 4(f) 피가 심한 심낭부종도 발견되었다. 색소침착 및 척추 굽음이 11.2 mg/L에서는 13%와 6% 확률로 나타났는데, 36 mg/L에서는 모두 100% 발현되었고 더불어 피가 심한 심낭부종도 85% 확률로 관찰되었음을 Fig. 5에 표현하였다. Table 1에 제시된 것과 같이, 극심한 형태학적 이상 현상과 이를 동반한 치사가 35% 관찰된 36 mg/L의 다음 농도인 115 mg/L에서는 부화도 하지 못한 채 전체 치사하였다.

Fig. 4.

Images of morphological abnormality of D. rerio embryo caused by Carbophenothion. *(a) Pigmentation of fertilized egg, (b) Collapse phenomenon of fertilized egg, (c) Coagulation, (d) Pigmentation, (e) Bent spine, (f) Bloody pericardial edema.

Fig. 5.

The ratio of morphological abnormality of D. rerio embryo in various concentrations of Carbophenothion at 96 hr.

3.3. 노출 평가

기존에 수행된 모니터링연구에 따르면, 아산만의 중장기적인 농사를 고려해 2004년 6월부터 2005년 8월까지 동일지점에서 한달에 한번씩 채수한 결과, 29가지 유기인계농약의 평균 검출빈도는 26.4%였다 [15]. 이중 Carbophenothion은 비교적 낮은 농도로 빈번하게 검출되는 특성을 보였으며, 그 최고 농도는 2.7×10-5 mg/L였다. Carbophenothion이 빈번하게 검출된 측에 속하더라도 총 78개 시료 중 13개의 시료에서만 검출되어 그 검출빈도가 16.7%에 그쳤기 때문에, 본 연구에서는 Carbophenothion의 최고검출농도에 불확실성계수를 고려하여 PEC를 산정하고자 하였다.

모니터링기간 14개월 중 가을과 겨울에는 살충제를 살포하지 않았을 것으로 판단하여 7개월 (약50%)의 검출농도는 0 mg/L로, 전체 연구기간 동안의 78개 시료에서 Carbophenothion이 최고농도로 검출된 시료 1개에 대해서는 최고농도값 (2.7×10-5 mg/L)으로 적용하였다. 참고문헌에서는 모니터링 대상인 29가지 유기인계 농약 중 대표물질 세가지에 대한 검출한계만을 제시하였기 때문에, Carbophenothion의 검출한계는 그 평균값인 1.1×10-6 mg/L로 예측하여, Carbophenothion이 검출된 13개 시료 중 최고농도로 검출된 시료 한 개를 제외한 나머지 12개 시료에 대해서는 최고검출농도와 예측검출한계농도의 평균값 (1.4×10-5 mg/L)으로 가정하였다. 마지막으로 전체 78개 시료 중 남은 33.3%는 분해 및 희석되어 극미량 존재할 것으로 예상하여 예측검출한계농도와 존재하지 않는 0 mg/L의 평균값 (5.5×10-7 mg/L)으로 적용하였고, 그 결과는 2.7×10-6 mg/L였다.

하지만 Carbophenothion이 최고농도로 검출된 시기는 4월로서 [15], 진드기가 활발히 번식하여 살충제를 가장 많이 살포하는 6-8월이 아니라는 점에서 가뭄과 장마철 강우에 의한 영향이 상당함을 예상할 수 있었다. 특히 아산만은 벼농사 및 밭농사가 많이 이루어져 주변 하천 수로를 따라 농약이 유입될 가능성이 큰 지역임에도 불구하고 [2], 국내 연평균 강수량이 비교적 낮다는 특징이 있기 때문에 보편적인 환경노출 농도를 예측한다면 훨씬 낮은 값의 계수를 적용해야 한다고 판단되었다. 또한 오늘날 Carbophenothion이 살포될 가능성은 당시보다 확실히 낮다는 것도 고려하여 희석배수를 106으로 가정하였고, 그 결과 PEC를 2.7×10-12 mg/L로 산정하였다.

3.4. 위해성 평가

PNEC 산출 시 생태 독성자료로써 L/EC50과 같은 급성 독성치 또는 NOEC의 독성값을 이용하도록 규정하는데 [17], 타 연구결과와의 비교에 있어서 NOEC는 실험농도의 공비에 따른 편차가 큰 반면 EC50은 통계로 산정되기 때문에 비교적 정확할 것으로 판단되었다. 따라서 본 연구에서 대표 시험 종으로 선정한 3개 영양단계 각각에서의 L/EC50과 같은 급성 독성값과 Carbophenothion에 대한 민감도를 Table 2에 통합적으로 정리하여 PNEC를 산출하였다. 유독 큰 민감성을 보인 물벼룩의 EC50인 2.1×10-10 mg/L에 평가계수 (AF) 100을 적용한 결과 PNEC는 2.1×10-12 mg/L로 확인되었다. Carbophenothion이 살충제로 사용되는 만큼 물벼룩에는 예상보다 강하고 조류나 어류에는 비교적 약한 독성을 나타낸 것으로 보인다.

Toxicity values of Carbophenothion for three test organisms and sensitivity used to calculate PNEC

PNEC와 PEC를 이용하여 계산한 수계로의 HQ는 1.3이었기때문에 Carbophenothion이 수서 환경에 직접 노출되었을 때 수생생태계에 유해할 가능성이 있다고 간주될 수 있다. 하지만 해수 중 유기인계 농약의 농도는 만 입구에서 외만으로 갈수록 감소했던 점, 물벼룩에 대한 EC50값만 유독 낮았던 점등을 고려한다면 Carbophenothion의 독성은 살포지점에 한하여 곤충류에 대해서만 발현되고 빠르게 희석 및 분해될 것으로 사료된다.


4. CONCLUSION

본 연구에서는 수생생태계를 대표하는 세 개체군에 대한 Carbophenothion의 급성 독성시험을 수행하였고 종합적인 평가를 위해 HQ를 제시하였다. 직접적인 급성 독성시험을 통해 P. subcapitata의 72 hr-EC50은 0.21-0.29 mg/L, D. magna의 48 hr-L/EC50은 0.05 mg/L와 2.1×10-10 mg/L, 그리고 D. rerio embryo의 96 hr-LC50은 42.8 mg/L로 확인되었고 특히 D. magna에 대해서는 EC50과 LC50에 유의한 차이가 있음을 알 수 있었다. 따라서 본 연구에서는 PNEC를 D. magna에 대한 EC50에 근거하여 상당히 낮은 수준인 2.1×10-12 mg/L로 제시하였고, 기존 연구내용에 희석배수 106을 가정하여 PEC를 2.7×10-12 mg/L로 산정하였다. 결과적으로 HQ는 1.3으로 확인되었지만 물벼룩의 반수영향농도와 치사농도사이의 차이는 상당하며, 해당 물질이 희석되고 분해될 가능성이 높음과 해당 독성값도 언제까지나 통계에 의한 예측값임을 엄두할 필요가 있다고 생각된다. 그러므로 추후 만성 독성영향과 현상황에서의 노출 농도를 검토하여 보다 정밀한 위해 가능성을 예측할 것을 제안한다.

Acknowledgments

본 연구는 한국 환경부의 2017년 화학물질 유·위해성 정보관리 전문 인력 양성사업에 지원을 받아 수행하였기에 이에 깊은 감사를 드립니다.

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Fig. 1.

Fig. 1.
Chemical structure of Carbophenothion.

Fig. 2.

Fig. 2.
Dose response curve of Carbophenothion against P. subcapitata at 72 hr.

Fig. 3.

Fig. 3.
Survival rates at 24 hr and 48 hr of D. magna exposed at different concentrations of Carbophenothion. *bars from left to right represent the survival rates of D. magna exposed at control concentration, 0.86×10-10, 1.7×10-10, 3.4×10-10, 6.9×10-10, and 13.7×10-10 mg/L of Carbophenothion, respectively.

Fig. 4.

Fig. 4.
Images of morphological abnormality of D. rerio embryo caused by Carbophenothion. *(a) Pigmentation of fertilized egg, (b) Collapse phenomenon of fertilized egg, (c) Coagulation, (d) Pigmentation, (e) Bent spine, (f) Bloody pericardial edema.

Fig. 5.

Fig. 5.
The ratio of morphological abnormality of D. rerio embryo in various concentrations of Carbophenothion at 96 hr.

Table 1.

Hatching rates and survival rates of D. rerio embryos according to Carbophenothion concentrations

Concentrations (mg/L) Hatching rates (%) Survival rates of hatching individuals (%)
Control 75 100
1.1 83 100
3.5 83 100
11.2 67 100
36 83 65
115 0 0

Table 2.

Toxicity values of Carbophenothion for three test organisms and sensitivity used to calculate PNEC

Test organisms NOEC (mg/L) LOEC (mg/L) EC50 or LC50 (mg/L) Sensitivity
*NT: Not tested.
*The number of dots (●) represents the power of sensitivity by Carbophenothion (● = low sensitivity, ●● = medium sensitivity, ●●● = high sensitivity)
P. subcapitata NT 0.01 0.21-0.29 ●●
D. magna 0.86 × 10-10 1.7 × 10-10 2.1 × 10-10 ●●●
D. rerio embryo 3.5 11.2 42.8