The Korean Society For Biotechnology And Bioengineering
[ Research Paper ]
Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 33, No. 3, pp.183-191
ISSN: 1225-7117 (Print) 2288-8268 (Online)
Print publication date 30 Sep 2018
Received 29 Aug 2018 Revised 22 Sep 2018 Accepted 22 Sep 2018
DOI: https://doi.org/10.7841/ksbbj.2018.33.3.183

인간 결장직장암 세포주들에 미치는 복어 균질액의 성장억제 활성 연구

김정훈 ; 김정호*
서강대학교 생명과학과
Inhibitory Effect of Globefish Homogenate on the Growth of Human Colorectal Cancer Cell Lines
Junghoon Kim ; Jungho Kim*
Laboratory of Molecular and Cellular Biology, Department of Life Science, Sogang University, Seoul 04107 Korea +82-2-705-8461 +82-2-705-8412 jkim@sogang.ac.kr

Correspondence to: *Laboratory of Molecular and Cellular Biology, Department of Life Science, Sogang University, Seoul 04107, Korea Tel: +82-2-705-8461, Fax: +82-2-705-8412 e-mail: jkim@sogang.ac.kr


© 2018 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering

Abstract

Cancer is one of the most serious public health problems in Korea and worldwide, and has a major impact on society. Despite significant advances in traditional anti-cancer therapies, such as chemotherapy, radiotherapy, and surgery, it remains extremely difficult to cure and prevent cancer. Consequently, novel anti-cancer therapies must be developed. We previously reported that Globefish homogenate suppresses the growth of Caco-2 human colorectal cancer cells. To build upon this previous observation, we investigated the cytotoxic effects of Globefish homogenate on DLD-1, HCT116, and SW480 human colorectal cancer cells by counting cells and examining morphological changes underneath an inverted microscope. Treatment with Globefish homogenate markedly inhibited the growth of cultured DLD-1, HCT116, and SW 480 cells in a dose-dependent manner. The sensitivities of these cells to Globefish homogenate were determined by calculating the lethal concentrations. The 50% inhibitory concentrations of Globefish homogenate were 111, 95, and 121 μg/mL in DLD-1, HCT116, and SW480 cells, respectively. These results indicate that Globefish homogenate contains a bioactive material(s) that inhibits the growth of human colorectal cancer cells.

Keywords:

colorectal cancer, globefish homogenate, growth inhibition, DLD-1, HCT116, SW480

1. INTRODUCTION

암은 한국에서뿐만 아니라 세계적으로 공중보건을 위협하는 가장 심각한 질병 가운데 하나이다 [1,2]. 지금까지 화학 요법, 방사선 요법, 수술적인 방법 등 암 치료 기술에 획기적인 진전이 있었음에도 불구하고 암은 아직 완벽한 치료나 예방이 어려운 질병으로 남아 있다. 결장직장암 (colorectal cancer, CRC)은 세계적으로 암 사망률이 높은 암 가운데 하나로 그 발생빈도가 높다 [1,3,4]. 국내 신규 결장직장암 발병은 남성과 여성의 경우 전체 암 발생의 13.6%와 11.4%로 한국인에게서 주로 발생하는 10대 암 가운데 3위에 해당하는 것으로 보고되었다 [2]. 한국 남성과 여성의 결장직장암으로 인한 사망보고도 11.1%와 12.2%로 전체 10대 암 사망률 가운데 3위와 2위에 해당하는 수치다 [2].

대장은 다른 이름으로 큰창자 (large intestine)라고도 불리는 소화기관으로 소장 (작은창자, small intestine)이 끝나는 부분부터 항문까지 이르는 긴 튜브 형태를 하고 있다. 대장의 시작부위에는 충수 (appendix)와 맹장 (cecum)이 존재하고, 상행 결장 (ascending colon), 횡행 결장 (transverse colon), 하행 결장 (descending colon), S자 결장 (sigmoidal colon), 직장(rectum), 그리고 항문 (anus)으로 구성된다. 일반적으로 결장(상행 결장, 횡행 결장, 그리고 하행 결장)에서 발생하는 암을 결장암 (colon cancer)이라 한다. 반면 직장에서 발생하는 암은 직장암 (rectal cancer)이라고 부른다. 따라서 결장직장암은 결장과 직장에서 발생하는 암을 통칭해 부르는 암이다 [5]. 결장직장암 대부분은 양성종양 (benign tumor)이지만, 일부는 추가적인 돌연변이에 의해 악성종양 (malignant tumor)으로 발전해 사망에 이르게 된다 [3,5]. 그동안 항암요법을 활용한 결장직장암 치료에 많은 연구가 이루어졌음에도 불구하고 악성종양으로 발전하면 치료가 매우 어려워진다. 따라서 악성 결장직장암 치료를 위한 새로운 소스의 항암제 발굴이 절실하게 필요하다.

천연물 (natural products)은 다양한 질병 치료에 사용되어 왔고, 지금도 암치료를 위한 중요한 연구분야로 자리 잡고 있다 [6]. 특히 강황에 주로 들어있는 성분인 커큐민 (curcumin) [7], 포도에 있는 레스베라트롤 (resveratrol) [8,9], 각종 과일과 채소류에 함유된 플라보노이드 성분인 아피게닌 (apigenin) [10], 양파, 시금치, 파슬리 등에 있는 케르세틴 (quercetin) [11], 콩과류에 많은 제니스테인 (genistein) [12], 토마토에 있는 리코펜 (lycopene) [13], 서양고추냉이 (horseradish), 무 (radish), 양파, 겨자류 등에 많은 이소티오시아네이트 (isothiocyanate) [14]와 같은 피토케미칼 (phytochemical)을 이용한 항암연구가 활발하게 진행되었는데 이들은 암의 개시 (initiation), 발달 (development), 그리고 진행 (progression)을 억제하면서 항암 활성을 나타내는 것이 보고되었다 [6]. 복어는 전 세계에 100여 종이 존재하고, 국내에도 30 여종이 보고된 참복과에 속하는 어류이다 [15,16]. 아시아권에서는 주로 우리나라 중남부와 일본 중부 이남에 존재한다고 보고되었다 [15]. 복어의 특징 가운데 한가지는 독성물질을 갖고 있다는 것인데, 복어의 껍질, 내장, 근육, 간, 그리고 알에 신경독소(neurotoxin)인 테트로도톡신 (tetrodotoxin, TTX)이라는 독이 존재한다 [17,18]. 그러나 양식 복어에는 자연산 복어와 달리 독이 없거나 거의 존재하지 않는다 [19,20]. 복어의 독은 복어 스스로가 만드는 것이 아니고 서식지 조건에 의해 생기는데 자연산 복어의 경우 먹이나 세균, 플랑크톤으로부터 테트로 도톡신을 얻지만, 양식 복어는 이와 같은 환경에서 성장하지 않기 때문에 해당하는 독성물질이 없을 것으로 추정하고 있다 [21,22].

이전 논문을 통해 우리는 대표적인 인간 직장결장암 세포주 가운데 하나인 Caco-2 세포의 성장이 황복어 균질액 처리에 의해 억제됨을 보고하였다 [23]. 본 본문에서는 황복어 균질액에 의한 암세포 성장억제 효과가 Caco-2 세포주에 특이적으로 한정된 것인지 여부를 조사하기 위해 다른 종류의 인간 직장결장암 세포주인 DLD-1, HCT116, SW480 세포를 가지고 세포 독성 효과를 조사하였다. 성장곡선과 세포의 형태학적인 변화를 조사한 결과 황복어 균질액 처리가 DLD-1, HCT116, 그리고 SW480 인간 직장결장암 세포에서 용량 의존적인 형태로 현저한 성장 억제효과가 있음을 발견했다. 이러한 결과는 황복어 균질액에 인간 결장직장암 세포의 성장에 억제작용을 하는 생리활성물질이 존재하고 다양한 종류의 결장직장암 세포에서 활성을 갖는다는 것을 의미한다.


2. MATERIALS AND METHODS

2.1. 실험재료 및 시약

Sodium chloride, potassium chloride, sodium phosphate dibasic, sodium phosphate monobasic, formaldehyde, methanol은 Sigma-Aldrich (USA)에서, Crystal Violet은 AlhaChem (UK)에서 구입해 사용하였다.

2.2. 황복어 균질액 제조

본 연구재료로 사용한 황복어 (Yellow puffer, Takifugu obscurus)는 충청남도 예산군 대흥면에 위치한 예당수산에서 양식한 것으로 살아있는 3년산을 선별해 사용하였다. 실험에 사용한 황복어 균질액은 이전에 발표한 방법을 이용해 제조하였다 [23]. 이 과정을 간략하게 요약하면 다음과 같다. 황복어를 적당한 크기로 절단한 후 무게 1 g당 1 mL의 1X PBS (phosphate buffered saline, pH 7.4; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4)를 넣고 분쇄기 (Blender)를 이용해 잘게 절단하였다. 절단한 황복어를 50 mL conical tube (SPL, Korea)로 옮기고 Hand Held Homogenizer (Thermo Fisher Scientific, USA)를 사용해 균질액을 제작하였다. 황복어 균질액에 존재하는 잔해 (debris)는 원심분리 과정을 통해 제거하였고, 상층액은 Miracloth (Merck, USA)를 사용해 1차 여과하였다. 1차 여과한 황복어 균질액은 주사기 필터 (Syringe filter, 0.45 mm, Sartorius, Germany)로 2차 여과하여 멸균상태로 만들고, 그 분액 (aliquot)을 -80oC에 보관한 후 필요한 시기에 녹여 사용하였다.

2.3. DLD-1, HCT116, SW480 인간 결장직장암 세포주 배양 및 성장곡선 작성

DLD-1, HCT116, SW480 인간 결장직장암 세포주에 대한 배양배지는 10% FBS (Fetal Bovine Serum, Invitrogen, USA), 1x 페니실린/스트렙토마이신 (Gibco, USA)을 첨가한 Eagle’s Minimum Essential medium (EMEM; Hyclone, USA)을 사용하였다. 세포는 5% CO2가 공급된 37oC humidified 배양기 (ThermoFisher Scientific, USA)에서 배양하였다. 대조군은 동일 부피의 1X PBS를 첨가해 실험을 수행하였다.

2.4. Crystal Violet 콜로니 염색

각각의 1×104 DLD-1, HCT116, SW480 세포를 8일 간 배양한 후 배지를 제거하고 실온에서 Crystal Violet Fixing/Staining 용액 [0.05% (w/v) Crystal Violet, 1% Formaldehyde, 1% methanol, 1X PBS]으로 20분 동안 염색하였다. 대조군은 동일 부피의 1X PBS를 첨가해 실험을 수행하였다.

2.5. 50% 성장억제 농도 (IC50, 50% inhibitory concentration, half maximum inhibitory concentration) 측정

2 mL의 세포 배양액을 첨가한 12-well 세포배양 플레이트에 1×104 DLD-1, HCT116, SW480 세포를 각각 깔고 황복어 균질액을 0%, 0.001% (0.27 μg/mL), 0.01% (2.7 μg/mL), 0.1% (27 μg/mL), 그리고 1% (270 μg/mL)가 되게 첨가하였다. 각각의 DLD-1, HCT116, SW480 결장직장암 세포를 37oC 5% CO2 배양기에서 8일 간 배양하고 세포수를 측정하였다. IC50 값은 SoftMax Pro software (Molecular Devices, USA)를 사용해 측정하였다.


3. RESULTS AND DISCUSSION

3.1. 황복어 균질액이 DLD-1. HCT116, 그리고 SW480 인간 결장직장암 세포주 콜로니 형성에 미치는 영향

이전 연구에서 본 연구팀은 황복어 균질액이 대표적인 인간 결장직장암 세포주인 Caco-2세포의 성장을 억제함을 보고하였다 [23]. 이번 논문에서는 황복어 균질액에 의한 결장직장암 세포 성장억제 효과가 Caco-2 세포주에만 국한된 결과가 아님을 조사하기 위해 다양한 종류의 결장직장암 세포주를 이용해 황복어 균질액 효과를 분석하였다. 실험에 사용할 균질액은 이전에 발표한 문헌의 조건과 동일하게 살아있는 3년산 황복어를 사용해 제작하였다 [23]. 황복어를 적당한 크기로 절단한 후 절단체 1g당 1 mL의 PBS를 첨가한 후 분쇄기와 Homogenizer를 사용해 황복어 균질액을 제작하였다. 이 균질액에 존재하는 잔해는 원심분리로 제거한 후 상층액을 0.45 μm 필터를 사용해 멸균하였다. 여기에서 만들어진 여과액(filtrate)에 대해 분액을 만든 후 후속적인 실험에 사용하였다.

황복어 균질액이 다양한 종류의 결장직장암 세포주의 성장에 영향을 미치는지를 조사하기 위해 추가로 DLD-1, HCT116, 그리고 SW480을 선택해 실험을 수행하였다. 1×104 DLD-1 세포를 12-well 세포배양 플레이트에 깔고 2 mL의 배양액을 첨가한 후 콜로니 형성 실험 (colony formation assay)을 수행하였다 (Fig. 1). HCT116 세포와 SW480 세포도 동일한 수로 깐 후 같은 조건에서 실험을 수행하였다. DLD-1, HCT116, 그리고 SW480 세포에 각각 1% (v/v)의 황복어 균질액을 처리하고 5% CO2가 공급된 37oC 배양기에서 키웠다. 콜로니 형성은 세포 배양을 시작하고 4일과 8일 후에 DLD-1, HCT116, 그리고 SW480 세포를 methylene blue로 염색해 관찰하였다.

Fig. 1.

Effects of Globefish homogenate on colony formation by human colorectal cancer cell lines. DLD-1, HCT116, and SW480 colorectal cancer cells were seeded into 12-well plates at a density of 1×104 cells per well. After treatment with Globefish homogenate for 4 or 8 days, cell colonies were visualized by staining with 0.05% Crystal Violet. Representative images from the colony-forming assay are shown. Three independent experiments yielded similar results.

그림에서 보는 바와 같이 1% 황복어 균질액을 처리하지 않은 대조군 결장직장암 세포주들의 콜로니는 배양 8일 후에 methylene blue 염색과정을 통해 명확히 관찰할 수 있었다 (Fig. 1 Day 8 Control panels). 그러나 흥미롭게도 황복어 균질액을 1% 농도로 처리한 DLD-1, HCT116, 그리고 SW480 결장직장암 세포주들은 배양을 시작한지 8일 이후에도 콜로니를 거의 형성하지 못함을 관찰할 수 있었다 [Fig. 1 Day 8 Homogenate(1%) panels]. 이 결과는 황복어 균질액이 Caco-2 세포만의 성장을 억제하는 것이 아니라 DLD-1, HCT116, 그리고 SW480과 같은 다양한 종류의 결장직장암 세포주의 성장도 억제할 수 있는 능력이 있음을 의미한다.

3.2. 황복어 균질액이 DLD-1 결장직장암 세포주 성장에 미치는 영향

황복어 균질액에 의한 DLD-1 결장직장암 세포주 콜로니 형성 억제 효과가 세포 성장을 억제함으로 인해 일어나는 현상인지를 조사하기 위해 DLD-1 세포에 황복어 균질액을 처리한 후 세포 성장 형태를 조사하였다. 12-well 세포배양 플레이트에 1×104 DLD-1 세포를 깔고 2 mL의 배양액을 첨가한 후 1% (vol/vol) 황복어 균질액을 처리하였다.

세포 성장 변화를 관찰하기 위해 황복어 균질액을 처리한 DLD-1 세포와 균질액을 처리하지 않은 세포를 현미경을 이용해 하루 간격으로 비교 관찰하였다 (Fig. 2A). 황복어 균질액을 처리하지 않은 DLD-1 세포주는 10% FBS를 첨가한 EMEM에서 배양한 결과 패치 형태를 이루면서 빠른 속도로 성장하였다 (Fig. 2A top panels; Control). 그러나 1% 황복어 균질액을 처리한 DLD-1 세포는 거의 성장하지 못함을 관찰하였다 [Fig. 2A bottom panels; Homogenate (1%)].

Fig. 2.

Inhibition of DLD-1 cell growth by Globefish homogenate. (A) Time-dependent effects of Globefish homogenate on the growth and morphology of DLD-1 cells. DLD-1 human colorectal cancer cells were seeded into 12-well plates at a density of 1×104 cells per well and grown in Eagle’s Minimum Essential Medium lacking (Control, top panels) or containing (Homogenate, bottom panels) 1% Globefish homogenate. DLD-1 cells were monitored daily using an inverted phase-contrast microscope (Eclipse TE300, Nikon). Three independent experiments yielded similar results. (B) Quantitative determination of the number of Globefish homogenate-treated DLD-1 cells. DLD-1 cells were seeded into a 12-well plate at a density of 1×104 cells per well, treated with 1% (v/v) Globefish homogenate, and then cultured for 8 days. Cell numbers were counted every 2 days. Experiments were performed in triplicate. Three independent experiments yielded similar results.

이 결과를 좀 더 구체화하기 위해 DLD-1 결장직장암 세포주에 대한 성장곡선을 측정하였다. DLD-1 결장직장암 세포에 황복어 균질액을 1% 농도로 처리하고 이틀 간격으로 세포수를 계산해 세포 성장 곡선을 작성하였다 (Fig. 2B). 그림에서 보는 바와 같이 배양시간이 경과할수록 대조군 DLD-1 인간 결장직장암 세포주는 기하급수적으로 증가함을 알 수 있다. 그러나 흥미롭게도 1%의 황복어 균질액을 처리한 DLD-1 세포주의 경우 대조군과 다르게 시간이 경과하여도 세포 성장이 거의 일어나지 못함을 알 수 있다. 이는 1%의 황복어 균질액이 대표적인 인간 결장직장암 세포주인 Caco-2 세포의 성장뿐만 아니라 [23] 다른 종류의 인간 결장직장암 세포주인 DLD-1 세포의 성장도 억제할 수 있음을 의미한다.

3.3. 황복어 균질액이 HCT116 결장직장암 세포주 성장에 미치는 영향

황복어 균질액에 의한 효과를 조금 더 확장하기 위해 이번에는 또 다른 결장직장암 세포주인 HCT116 세포를 가지고 수행하였다. DLD-1 결장직장암 세포주에서 나타났던 콜로니 형성 억제 효과가 HCT116 세포주에서도 나타나는지를 조사하기 위해 동일한 조건으로 황복어 균질액을 처리한 후 HCT116 세포의 성장 형태를 조사하였다.

HCT116 결장직장암 세포주의 성장 변화를 관찰하기 위해 황복어 균질액을 처리한 HCT116 세포와 균질액을 처리하지 않은 HCT116 세포를 현미경을 이용해 하루 간격으로 비교 관찰하였다 (Fig. 3A). 그림에서 보는 바와 같이 황복어 균질액을 처리하지 않은 HCT116 세포주는 10% FBS를 첨가한 EMEM에서 배양한 결과 패치 형태를 이루면서 빠른 속도로 성장하였다 (Fig. 3A top panels; Control). 그러나 1% 황복어 균질액을 처리한 HCT116 세포는 DLD-1 세포와 유사하게 거의 성장하지 못함을 관찰하였다 [Fig. 3A bottom panels; Homogenate(1%)].

Fig. 3.

Inhibition of HCT116 cell growth by Globefish homogenate. (A) Time-dependent effects of Globefish homogenate on the growth and morphology of HCT116 cells. HCT116 human colorectal cancer cells were plated into 12-well plates at a density of 1×104 cells per well and grown in Eagle’s Minimum Essential Medium lacking (Control, top panels) or containing (Homogenate, bottom panels) 1% Globefish homogenate. HCT116 cells were monitored daily using an inverted phase-contrast microscope (Eclipse TE300, Nikon). Three independent experiments yielded similar results. (B) Quantitative determination of the number of Globefish homogenate-treated HCT116 cells. HCT116 cells were seeded into a 12-well plate at a density of 1×104 cells per well, treated with 1% (v/v) Globefish homogenate, and then cultured for 8 days. Cell numbers were counted every 2 days. Experiments were performed in triplicate. Three independent experiments yielded similar results.

이 결과도 좀 더 구체화하기 위해 HCT116 결장직장암 세포주에 대한 성장곡선을 측정하였다. DLD-1 세포주를 이용해 수행했던 실험과 동일하게 HCT116 결장직장암 세포에서도 황복어 균질액을 1% 농도로 처리하고 이틀 간격으로 세포수를 계산해 세포 성장 곡선을 작성하였다 (Fig. 3B). 그림에서 보는 바와 같이 배양시간이 경과할수록 대조군 HCT116 인간 결장직장암 세포주는 기하급수적으로 증가함을 알 수 있다. 그러나 흥미롭게도 1%의 황복어 균질액을 처리한 HCT116 세포주의 경우 DLD-1 결장직장암 세포주가 보였던 결과와 유사하게 대조군과 다르게 시간이 경과하여도 세포 성장이 거의 일어나지 못함을 알 수 있다. 이는 1%의 황복어 균질액에 HCT116 세포의 성장을 억제할 수 있는 물질이 존재함을 의미한다.

3.4. 황복어 균질액이 SW480 결장직장암 세포주 성장에 미치는 영향

DLD-1과 HCT116 결장직장암 세포주에서 나타났던 콜로니 형성 억제 효과가 또 다른 인간 결장직장암 세포주인 SW480 세포에서도 나타나는지를 조사하기 위해 동일한 조건으로 황복어 균질액을 처리한 후 SW480 세포의 성장 형태를 조사하였다.

DLD-1과 HCT116 세포에서 나타난 현상과 비교하기 위해 동일한 조건으로 HCT116 대 SW480 세포에 황복어 균질액을 처리한 후 균질액을 처리하지 않은 SW480 세포를 대조군으로 사용해 하루 간격으로 세포 성장을 비교 관찰하였다 (Fig. 4A). 그림에서 보는 바와 같이 황복어 균질액을 처리하지 않은 SW480 세포주는 패치 형태의 성장 패턴을 보이면서 빠른 속도로 성장함을 알 수 있다 (Fig. 4A top panels; Control). 그러나 1% 황복어 균질액을 처리한 SW480 세포는 DLD-1 세포나 HCT116 세포가 보였던 것과 유사하게 거의 성장하지 못함을 관찰할 수 있었다 [Fig. 4A bottom panels; Homogenate(1%)].

Fig. 4.

Inhibition of SW480 cell growth by Globefish homogenate. (A) Time-dependent effects of Globefish homogenate on the growth and morphology of SW480 cells. SW480 human colorectal cancer cells were plated into 12-well plates at a density of 1×104 cells per well and grown in Eagle’s Minimum Essential Medium lacking (Control, top panels) or containing (Homogenate, bottom panels) 1% Globefish homogenate. SW480 cells were monitored daily using an inverted phase-contrast microscope (Eclipse TE300, Nikon). Three independent experiments yielded similar results. (B) Quantitative determination of the number of Globefish homogenate-treated SW480 cells. SW480 cells were seeded into a 12-well plate at a density of 1×104 cells per well, treated with 1% (v/v) Globefish homogenate, and then cultured for 8 days. Cell numbers were counted every 2 days. Experiments were performed in triplicate. Three independent experiments yielded similar results.

다음으로 SW480 결장직장암 세포주에 대한 성장곡선을 측정하였다. DLD-1 세포주나 HCT116 세포주를 이용해 수행했던 실험과 동일하게 SW480 결장직장암 세포에서도 황복어 균질액을 1% 농도로 처리하고 이틀 간격으로 세포수를 계산해 세포 성장 곡선을 작성하였다 (Fig. 4B). 그림에서 보는 바와 같이 배양시간이 경과할수록 대조군 SW480 인간 결장직장암 세포주는 기하급수적으로 증가함을 알 수 있다. 그러나 흥미롭게도 1%의 황복어 균질액을 처리한 SW480 세포주의 경우 대조군과 달리 시간이 경과하여도 세포 성장이 거의 일어나지 못함을 알 수 있다. 이는 1%의 황복어 균질액이 DLD-1 세포주나 HCT116 세포주가 보였던 결과와 유사하게 SW480 결장직장암 세포의 성장을 억제함을 의미한다.

3.5. 황복어 균질액에 대한 DLD-1 결장직장암 세포주의 IC50 측정

황복어 균질액에 대한 DLD-1 결장직장암 세포주의 IC50을 측정하기 위해 DLD-1 세포주에 다양한 농도의 황복어 균질액을 처리하고 농도별로 세포주 성장에 얼마나 영향을 미치는지를 조사하였다. 0.001%, 0.01%, 0.1%, 1% (v/v) 농도로 황복어 균질액을 DLD-1 결장직장암 세포주에 처리하고 8일 간 배양하였다. 그림에서 보는 바와 같이, 8일 후 세포를 위상차 현미경 (phase contrast microscope)으로 관찰한 결과, 황복어 균질액 처리 농도가 증가할수록 DLD-1 결장직장암 세포주의 성장이 더 크게 억제됨을 알 수 있다 (Fig. 5A).

Fig. 5.

Dose-dependent inhibition of DLD-1 cell proliferation by Globefish homogenate. (A) Morphology of DLD-1 colorectal cancer cells exposed to Globefish homogenate. DLD-1 cells were incubated with different concentrations of Globefish homogenate and monitored for 8 days under an inverted phase-contrast microscope (IX71; Olympus). Three independent experiments yielded similar results. (B) Globefish homogenate inhibits growth of DLD-1 colorectal cancer cells. DLD-1 cells were exposed to increasing concentrations of Globefish homogenate, and growth inhibition was measured by cell counting. The relative cell number was calculated as the percentage of the control value upon treatment with a given concentration of Globefish homogenate. Data are expressed as the mean±SEM of three independent experiments. The IC50 value of Globefish homogenate was calculated from sigmoidal dose-response curves using SoftMax Pro software (Molecular Devices). Three independent experiments yielded similar results.

이를 정량화해 IC50을 측정하기 위해 농도별 황복어 균질액 처리한 DLD-1 세포수를 측정해 그래프를 그렸다. 황복어 균질액을 처리하지 않은 DLD-1 결장직장암 세포주의 세포수를 100%로 환산한 후 이를 기준점으로 다양한 농도의 황복어 균질액을 처리하고 배양한 DLD-1 세포주의 세포수를 전환해 그래프를 그렸다. 또한 황복어 균질액의 질량을 측정해 %에 대한 단위를 그램으로 환산해 X축에 표시하였다. 황복어 균질액에 대한 DLD-1 세포에서의 IC50은 도출된 수식 (R2=0.997)을 활용해 계산하였다. 그 결과 DLD-1 인간 결장직장암 세포주에서 황복어 균질액에 대한 IC50은 111 μg/mL로 측정되었다 (Fig. 5B).

3.6. 황복어 균질액에 대한 HCT116 결장직장암 세포주의 IC50 측정

이번에는 황복어 균질액에 대한 HCT116 결장직장암 세포주의 IC50을 측정하기 위해 HCT116 세포주에 다양한 농도의 황복어 균질액을 처리하고 농도별로 세포주 성장에 얼마나 영향을 미치는지를 조사하였다. 0.001%, 0.01%, 0.1%, 1% (v/v) 농도로 황복어 균질액을 HCT116 세포주에 처리하고 8일 간 배양하였다. 그림에서 보는 바와 같이, 8일 후 세포를 위상차 현미경으로 관찰한 결과, 황복어 균질액 처리 농도가 증가할수록 HCT116 결장직장암 세포주의 성장이 더 크게 억제됨을 알 수 있다 (Fig. 6A).

Fig. 6.

Dose-dependent inhibition of HCT116 cell proliferation by Globefish homogenate. (A) Morphology of HCT116 colorectal cancer cells exposed to Globefish homogenate. HCT116 cells were incubated with different concentrations of Globefish homogenate and monitored for 8 days under an inverted phase-contrast microscope (IX71; Olympus). Three independent experiments yielded similar results. (B) Globefish homogenate inhibits growth of HCT116 colorectal cancer cells. HCT116 cells were exposed to increasing concentrations of Globefish homogenate, and growth inhibition was measured by cell counting. The relative cell number was calculated as the percentage of the control value upon treatment with a given concentration of Globefish homogenate. Data are expressed as the mean±SEM of three independent experiments. The IC50 value of Globefish homogenate was calculated from sigmoidal dose-response curves using SoftMax Pro software (Molecular Devices). Three independent experiments yielded similar results.

이를 정량화해 IC50을 측정하기 위해 농도별 황복어 균질액 처리한 HCT116 세포수를 측정해 그래프를 그렸다. 황복어 균질액을 처리하지 않은 HCT116 결장직장암 세포주의 세포수를 100%로 환산한 후 이를 기준점으로 다양한 농도의 황복어 균질액을 처리하고 배양한 HCT116 세포주의 세포수를 전환해 그래프를 그렸다. 또한 황복어 균질액의 질량을 측정해 %에 대한 단위를 그램으로 환산해 X축에 표시하였다. 황복어 균질액에 대한 HCT116 세포에서의 IC50은 도출된 수식 (R2=1.000)을 활용해 계산하였다. 그 결과 HCT116 인간 결장직장암 세포주에서 황복어 균질액에 대한 IC50은 95 μg/mL로 측정되었다 (Fig. 6B).

3.7. 황복어 균질액에 대한 SW480 결장직장암 세포주의 IC50 측정

황복어 균질액에 대한 SW480 결장직장암 세포주의 IC50을 측정하기 위해 SW480 세포주에 다양한 농도의 황복어 균질액을 처리하고 농도별로 세포주 성장에 얼마나 영향을 미치는지를 조사하였다. 0.001%, 0.01%, 0.1%, 1% (v/v) 농도로 황복어 균질액을 SW480 결장직장암 세포주에 처리하고 8일간 배양하였다. 그림에서 보는 바와 같이, 8일 후 세포를 위상차현미경으로 관찰한 결과, 황복어 균질액 처리 농도가 증가할수록 SW480 결장직장암 세포주의 성장이 더 크게 억제됨을 알 수 있다 (Fig. 7A).

Fig. 7.

Dose-dependent inhibition of SW480 cell proliferation by Globefish homogenate. (A) Morphology of SW480 colorectal cancer cells exposed to Globefish homogenate. SW480 cells were incubated with different concentrations of Globefish homogenate and monitored for 8 days under an inverted phase-contrast microscope (IX71; Olympus). Three independent experiments yielded similar results. (B) Globefish homogenate inhibits growth of SW480 colorectal cancer cells. SW480 cells were exposed to increasing concentrations of Globefish homogenate, and growth inhibition was measured by cell counting. The relative cell number was calculated as the percentage of the control value upon treatment with a given concentration of Globefish homogenate. Data are expressed as the mean±SEM of three independent experiments. The IC50 value of Globefish homogenate was calculated from sigmoidal dose-response curves using SoftMax Pro software (Molecular Devices). Three independent experiments yielded similar results.

이를 정량화해 IC50을 측정하기 위해 농도별 황복어 균질액처리한 SW480 세포수를 측정해 그래프를 그렸다. 황복어 균질액을 처리하지 않은 SW480 결장직장암 세포주의 세포수를 100%로 환산한 후 이를 기준점으로 다양한 농도의 황복어 균질액을 처리하고 배양한 SW480 세포주의 세포수를 전환해 그래프를 그렸다. 또한 황복어 균질액의 질량을 측정해 %에 대한 단위를 그램으로 환산해 X축에 표시하였다. 황복어 균질액에 대한 SW480 세포에서의 IC50은 도출된 수식 (R2=0.998)을 활용해 계산하였다. 그 결과 HCT116 인간 결장직장암 세포주에서 황복어 균질액에 대한 IC50은 121 μg/mL로 측정되었다 (Fig. 7B).


4. CONCLUSION

본 연구팀은 이번 연구를 통해 황복어 균질액이 다양한 종류의 인간 결장직장암 세포들의 성장을 억제한다는 내용을 보고하였다. 황복어 균질액에 의한 암세포 성장 억제 효과가 이전 논문에서 발표했던 Caco-2 세포에 국한되지 않고 [23], 다른 종류의 인간 결장직장암 세포인 DLD-1, HCT116, SW480과 같은 암세포들에도 적용된다는 의미이다. 하지만 IC50 값을 비교했을 때 세포주 사이에 차이가 관찰되었다. 이번 논문에서 사용했던 DLD-1, HCT116, SW480 세포주들의 황복어 균질액에 대한 IC50 값은 각각 111 μg/mL (Fig. 7), 95 μg/mL (Fig. 8), 그리고 121 μg/mL (Fig. 9)로 나타났다. 반면 이전 논문을 통해 발표했던 Caco-2 세포주에서의 황복어 균질액에 대한 IC50 값은 37.5 μg/mL로 연구에 사용했던 인간 결장직장암 세포주 가운데 가장 민감도가 높게 측정되었다 [23]. 이러한 차이가 서로 다른 시간대에 진행되어 나타난 결과가 아님을 확인하기 위해 본 연구팀은 이번 연구에서 사용한 DLD-1, HCT116, SW480 세포주에 이전 연구에서 사용했던 Caco-2 세포주를 포함시켜 동일하게 실험을 진행한 결과에서도 유사한 결론에 도달할 수 있었다 (data not shown). 이러한 결과는 비록 황복어 균질액에 인간 결장직장암 세포주들의 성장을 억제할 수 있는 물질이 존재하고 있기는 하지만 세포주의 종류에 따라 억제 효과가 다소 차이가 있게 나타남을 의미한다. 따라서 이와 같은 효과가 유방암이나 난소암, 위암과 같이 한국인 사이에 자주 발생하는 다른 종류의 암에서 유래한 세포주에서도 유사하게 나타날 것인지에 대한 후속적인 연구가 이루어진다면 흥미로울 것으로 생각된다.

항암제를 천연물로부터 찾는 연구는 상당히 오랜 기간 진행되어 왔다. Taxol이라 알려진 파클리탁셀 (paclitaxel)을 비롯해 커큐민, 레스베라트롤, 아피게닌, 케르세틴, 제니스테인, 리코펜 등이 여기에 대한 대표적인 성과라고 할 수 있다 [6, 24]. 하지만 이러한 물질들은 모두 식물로부터 유래했다. 따라서 복어와 같은 어류에도 암세포의 살상을 유도하는 물질이 존재한다는 것은 학문적으로 매우 흥미로운 일이라 할 수 있다. 특히 Caco-2 인간 결장직장암 세포주를 포함해 DLD-1, HCT116, SW480 세포주에서 조사된 IC50 값은 실험에 사용했던 황복어 균질액이 단일물질이 아니고 여러 성분이 혼재된 혼합물임을 고려할 때 매우 고무적인 결과라고 할 수 있다. 이와 같은 이유로 황복어 균질액에 존재하는 물질들 가운데 어느 성분이 이런 기능을 하는지 순수 분리한 후 그 생화학적 특성을 규명하는 연구가 절실히 필요하다고 생각된다.

Acknowledgments

We thank Drs. Ji Ho Yun and Chu Won Nho (KIST Gangneung Institute, Korea) for providing the DLD-1, HTC116, and SW480 cells. This work was supported by the Priority Research Centers Program [grant number 2009-0093822] and the Bio & Medical Technology Development Program [grant number 2018M3A9 H1023139] through the NRF of Korea funded by the Ministry of Science and ICT.

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Fig. 1.

Fig. 1.
Effects of Globefish homogenate on colony formation by human colorectal cancer cell lines. DLD-1, HCT116, and SW480 colorectal cancer cells were seeded into 12-well plates at a density of 1×104 cells per well. After treatment with Globefish homogenate for 4 or 8 days, cell colonies were visualized by staining with 0.05% Crystal Violet. Representative images from the colony-forming assay are shown. Three independent experiments yielded similar results.

Fig. 2.

Fig. 2.
Inhibition of DLD-1 cell growth by Globefish homogenate. (A) Time-dependent effects of Globefish homogenate on the growth and morphology of DLD-1 cells. DLD-1 human colorectal cancer cells were seeded into 12-well plates at a density of 1×104 cells per well and grown in Eagle’s Minimum Essential Medium lacking (Control, top panels) or containing (Homogenate, bottom panels) 1% Globefish homogenate. DLD-1 cells were monitored daily using an inverted phase-contrast microscope (Eclipse TE300, Nikon). Three independent experiments yielded similar results. (B) Quantitative determination of the number of Globefish homogenate-treated DLD-1 cells. DLD-1 cells were seeded into a 12-well plate at a density of 1×104 cells per well, treated with 1% (v/v) Globefish homogenate, and then cultured for 8 days. Cell numbers were counted every 2 days. Experiments were performed in triplicate. Three independent experiments yielded similar results.

Fig. 3.

Fig. 3.
Inhibition of HCT116 cell growth by Globefish homogenate. (A) Time-dependent effects of Globefish homogenate on the growth and morphology of HCT116 cells. HCT116 human colorectal cancer cells were plated into 12-well plates at a density of 1×104 cells per well and grown in Eagle’s Minimum Essential Medium lacking (Control, top panels) or containing (Homogenate, bottom panels) 1% Globefish homogenate. HCT116 cells were monitored daily using an inverted phase-contrast microscope (Eclipse TE300, Nikon). Three independent experiments yielded similar results. (B) Quantitative determination of the number of Globefish homogenate-treated HCT116 cells. HCT116 cells were seeded into a 12-well plate at a density of 1×104 cells per well, treated with 1% (v/v) Globefish homogenate, and then cultured for 8 days. Cell numbers were counted every 2 days. Experiments were performed in triplicate. Three independent experiments yielded similar results.

Fig. 4.

Fig. 4.
Inhibition of SW480 cell growth by Globefish homogenate. (A) Time-dependent effects of Globefish homogenate on the growth and morphology of SW480 cells. SW480 human colorectal cancer cells were plated into 12-well plates at a density of 1×104 cells per well and grown in Eagle’s Minimum Essential Medium lacking (Control, top panels) or containing (Homogenate, bottom panels) 1% Globefish homogenate. SW480 cells were monitored daily using an inverted phase-contrast microscope (Eclipse TE300, Nikon). Three independent experiments yielded similar results. (B) Quantitative determination of the number of Globefish homogenate-treated SW480 cells. SW480 cells were seeded into a 12-well plate at a density of 1×104 cells per well, treated with 1% (v/v) Globefish homogenate, and then cultured for 8 days. Cell numbers were counted every 2 days. Experiments were performed in triplicate. Three independent experiments yielded similar results.

Fig. 5.

Fig. 5.
Dose-dependent inhibition of DLD-1 cell proliferation by Globefish homogenate. (A) Morphology of DLD-1 colorectal cancer cells exposed to Globefish homogenate. DLD-1 cells were incubated with different concentrations of Globefish homogenate and monitored for 8 days under an inverted phase-contrast microscope (IX71; Olympus). Three independent experiments yielded similar results. (B) Globefish homogenate inhibits growth of DLD-1 colorectal cancer cells. DLD-1 cells were exposed to increasing concentrations of Globefish homogenate, and growth inhibition was measured by cell counting. The relative cell number was calculated as the percentage of the control value upon treatment with a given concentration of Globefish homogenate. Data are expressed as the mean±SEM of three independent experiments. The IC50 value of Globefish homogenate was calculated from sigmoidal dose-response curves using SoftMax Pro software (Molecular Devices). Three independent experiments yielded similar results.

Fig. 6.

Fig. 6.
Dose-dependent inhibition of HCT116 cell proliferation by Globefish homogenate. (A) Morphology of HCT116 colorectal cancer cells exposed to Globefish homogenate. HCT116 cells were incubated with different concentrations of Globefish homogenate and monitored for 8 days under an inverted phase-contrast microscope (IX71; Olympus). Three independent experiments yielded similar results. (B) Globefish homogenate inhibits growth of HCT116 colorectal cancer cells. HCT116 cells were exposed to increasing concentrations of Globefish homogenate, and growth inhibition was measured by cell counting. The relative cell number was calculated as the percentage of the control value upon treatment with a given concentration of Globefish homogenate. Data are expressed as the mean±SEM of three independent experiments. The IC50 value of Globefish homogenate was calculated from sigmoidal dose-response curves using SoftMax Pro software (Molecular Devices). Three independent experiments yielded similar results.

Fig. 7.

Fig. 7.
Dose-dependent inhibition of SW480 cell proliferation by Globefish homogenate. (A) Morphology of SW480 colorectal cancer cells exposed to Globefish homogenate. SW480 cells were incubated with different concentrations of Globefish homogenate and monitored for 8 days under an inverted phase-contrast microscope (IX71; Olympus). Three independent experiments yielded similar results. (B) Globefish homogenate inhibits growth of SW480 colorectal cancer cells. SW480 cells were exposed to increasing concentrations of Globefish homogenate, and growth inhibition was measured by cell counting. The relative cell number was calculated as the percentage of the control value upon treatment with a given concentration of Globefish homogenate. Data are expressed as the mean±SEM of three independent experiments. The IC50 value of Globefish homogenate was calculated from sigmoidal dose-response curves using SoftMax Pro software (Molecular Devices). Three independent experiments yielded similar results.