The Korean Society For Biotechnology And Bioengineering
[ Research Paper ]
Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 33, No. 3, pp.200-208
ISSN: 1225-7117 (Print) 2288-8268 (Online)
Print publication date 30 Sep 2018
Received 20 Aug 2018 Revised 09 Sep 2018 Accepted 21 Sep 2018
DOI: https://doi.org/10.7841/ksbbj.2018.33.3.200

국내산 솜대 줄기로부터 추출한 리그닌의 항산화 활성

양승화 ; 최문희 ; 신현재*
조선대학교 대학원 화학공학과
Antioxidant Activities of Lignin Extracted from Domestic Bamboo (Phyllostachys nigra var. Henonis) Stem
Seung-Hwa Yang ; Moon-Hee Choi ; Hyun-Jae Shin*
Department of Chemical Engineering, Graduate School of Chosun University, Gwangju 61452 Korea +82-62-230-7518 +82-62-230-7226 shinhj@chosun.ac.kr

Correspondence to: * Tel: +82-62-230-7518, Fax: +82-62-230-7226 e-mail: shinhj@chosun.ac.kr


© 2018 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering

Abstract

Several fractions of lignin were extracted from the stem of domestic bamboo (Phyllostachys nigra var. henosis) through steam explosion and organic solvent fractionation. A maximum yield of 21% and 47% lignin were attained from steam explosion (SL) and non-soluble fraction (SL-F3), respectively. Molecular weights (and poly diversity index) and chemical structure consisting in the lignin were estimated by GPC, FT-IR, and NMR spectrometry. Major carbon-hydrogen bonding has been assigned by HSQC analysis. Among the four fractions, SL-F1 showed the highest polyphenol contents and antioxidant activities (DPPH, ABTS, hydroxyl radical and Fe2+ chelating activities). All four fractions showed no cytotoxicity up to the concentration of 100 μg/mL by MTT assay. The lignin fractions would be a valuable asset for many applications including cosmetic products.

Keywords:

lignin, bamboo stem, steam explosion, solvent fractionation, antioxidant activity, cytotoxicity

1. INTRODUCTION

리그닌의 구조는 라디칼 공명 구조들이 서로 축합 결합하게 되면서 다양한 내부 결합이 일어나, 주로 β-O-4-aryl ether 결합으로 이루어져 있으며 그 외 다른 결합은 β-5-phenylcoumaran, 5-5-biphenyl, 4-O-5-diaryl ether, β-1-(1,2-diarylpropane) 및 β-β-resinol 결합 등이 있다 [1]. 주로 축합 결합으로 이루어져 있으며, 다양한 관능기를 포함하고 있다. 리그닌은 펄프 및 제지 산업의 펄프 제조공정 중에서 생산되거나, 다당류의 선택적 가수 분해 후 부산물로 생산된다. 리그닌이 추출되는 각 공정마다 사용되는 효소 및 용매들의 전처리 과정에서 화학적 변화를 겪게 되고 이때 추출된 각각의 리그닌들의 구조는 달라지게 된다. 리그닌이 추출되는 여러 공정에 따라 나눌 수 있는데 대표적으로 크라프트 리그닌 (kraft lignin), 설파이트 리그닌 (sulfite lignin), 유기용매 리그닌 (organosolv lignin), 증기 폭쇄 리그닌 (steam explosion lignin) 등이 있다. 이중 증기 폭쇄 리그닌은 바이오매스를 단시간에 고온, 고압 스팀을 사용해 펄프 섬유를 분리한 다음 알칼리 또는 유기용매로 리그닌을 추출한다. 추출된 리그닌은 저분자이고 유기용매에 용해성이 높으며, 페놀성 방향족이 3~12개 정도의 올리고머로 구성되어 있는 것으로 알려져 있다 [2]. 또한 리그닌의 다양한 관능기는 주로 페놀성 수산기들로 이루어져 있으며, 이는 리그닌에 항산화 단량체가 많이 존재한다는 것을 의미한다 [3]. 항산화 물질은 체내에서 reactive oxygen species (ROS) 또는 자유라디칼 (free radicals)로부터 발생하는 산화과정을 지연시키거나 방해한다 [4]. 지금까지 이루어진 리그닌 혹은 리그닌 분해물의 항산화 연구결과를 살펴보면 리그닌이 높은 폴리페놀 함량을 가지고 있고 여러 라디칼을 제거하는데 중요한 능력을 가지고 있다고 연구되고 있다 [5]. 또한 리그닌 이용해 산화를 방지하는 제품 개발에 대한 연구도 진행되고 있으며 [6], 다른 항산화제와 complex되어 높은 항산화 활성을 보이는 연구도 진행되고 있다 [7]. 리그닌은 주로 활엽수 (hardwood), 침엽수 (softwood), 잔디 (grasses)과 식물들에서 추출되어 이용되고 있다. 활엽수에서는 자작나무, 아카시아나무 등을 사용하며 침엽수에서는 소나무, 향나무 등을 잔디과 식물에서는 옥수수 줄기와 대나무 줄기 등을 대표적으로 사용하고 있다. 이중에 대나무는 왕대 (Phyllostachys bambusoides), 솜대 (Phyllostachys nigra var. Henonis) 및 맹종죽(Phyllostachys pubescens)이 사용되었고 항산화와 관련된 많은 연구가 진행되었다 (Table 1). 대나무의 부위 중에서는 대부분 잎 추출물에 대한 연구들이 많이 진행되어 왔으며 대나무 추출물들은 높은 항산화 활성을 가지고 있다 [8-16]. 그러나 대부분의 대나무종 연구는 중국 등 외래종에 국한되어 있었으며 국내산 대나무를 이용한 리그닌 분리와 항산화 활성과의 관계를 연구한 보고는 아직 없다. 따라서 본 연구는 국내산 솜대 줄기에서 추출된 증기폭쇄 리그닌의 유기용매 분획의 항산화 활성에 관한 연구로 유기용매 분획에 따라 리그닌의 구조적 차이와 항산화 활성의 차이에 관하여 연구하였다.

Antioxidant activities of bamboo species and part


2. MATERIALS AND METHOD

2.1. 리그닌 추출 및 분획제조 (fraction)

건조된 솜대 줄기 1 kg을 24시간 동안 10 L의 증류수에 침지하였다. 침지된 솜대 줄기를 한국에너지기술연구원의 steam explosion 장치 (SPE-STE-40K)를 이용하여 210oC, 2 MPa 에서 5분 동안 유지 후 폭쇄하였다 [17]. 증기 폭쇄된 폭쇄물은 수거하여 증류수로 세척하고 그늘에서 건조하였다. 건조된 증기 폭쇄물 20 g을 0.6% aqueous NaOH 400 mL에 넣어 80oC에서 3시간동안 300 rpm으로 alkaline delignification을 진행하였다 [18]. 추출된 리그닌은 필터 후 황산을 이용해 pH 5.5로 중화시켰으며, 중화액은 12,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 증기 폭쇄 리그닌을 얻었다 [17]. 추출된 증기 폭쇄 리그닌은 Li et al.의 방법을 변형하여 methanol, acetone 용매를 사용해 순차적으로 분획을 나누었다 [19]. 5 g의 리그닌을 100 mL의 methanol에 용해시키고 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 교반 후 용액은 감압 여과기를 이용하여 여과하였으며 여과액은 감압농축기를 사용하여 농축하였다. 필터에 남아있는 고체잔여물은 40oC 오븐에서 건조시킨 후 acetone에 용해시켜 이 공정을 순차적으로 반복하였다. 추출된 리그닌들을 다음과 같이 명명하였다. 증기 폭쇄 후 추출된 리그닌은 SL, methanol에 추출된 리그닌은 SL-F1, acetone에 추출된 리그닌은 SL-F2, 유기용매에 용해되지 않은 남은 리그닌은 SL-F3로 명명하였다 (Fig. 1).

Fig. 1.

Schematic diagram of sequential solvent fractionation of steam explosion lignin.

2.2. FT-IR 분석

추출 후 건조된 리그닌 시료 SL, SL-F1, SL-F2, SL-F3를 다른 전처리 없이 리그닌 펠렛을 제조하여 기본장치를 사용해 (MIRacle, PIKE) 분석을 진행하였다. Fourier transform infrared (FT-IR) 스펙트럼을 IRAffinity-1S 분광 광도계 (SHIMADZU, Japan)로 4000 내지 400 cm-1 범위의 파장 및 4 cm-1의 분해능을 측정하였다 [20].

2.3. Molecular weight 분석

리그닌 시료는 수 평균 (Mn) 및 중량 평균 분자량 (Mw)은 굴절 검출기 (RI-detector)가 장착된 EcoSEC HLC-8320 GPC 시스템 (Tosoh, Japan)을 사용하여 gel-permeation chromatography (GPC)에 의해 측정하였다. 35oC에서 2x TSKgel Super-multiporeHZ-M (4.5×150 mm) 컬럼을 사용하고 tetrahydrofuran (THF)을 0.35 mL/min의 유속으로 이동상으로 사용했다. 각각의 리그닌 시료 50 mg을 1 mL의 THF에 용해시켜 0.45 μm 필터로 여과 후 3 mg/mL의 농도로 희석하여 사용하였다. 희석된 리그닌 시료 용액을 30 μL 분량을 GPC 용으로 주입하였다. 시스템은 580과 1,074,000 Da. 사이의 폴리스티렌 표준을 사용하여 보정되었다 [21].

2.4. NMR Spectroscopy 분석

추출된 리그닌 fraction 시료를 70 mg을 0.5 mL DMSO-d6에 용해시켜 분석하였다. FT-NMR Spectrometer 400 MHz (AVANCE III HD 400) 분광기로 25oC에서 1H-, 13C-, 2D HSQCNMR 분석을 진행하였다 [22].

2.5. Total Polyphenol Contents (Ph-OH Group Contents)

총 페놀 함량은 변형된 Folin-Ciocalteu 방법으로 진행하였다. 리그닌 시료 0.5 mL를 0.5 mL의 0.2 M Folin-Ciocalteu 시약과 0.5 mL의 2% 탄산나트륨 (w/v)과 혼합하였다. 실온에서 30분간 반응시킨 후, 반응 혼합물의 흡광도를 SCINCO UV-Vis 분광 광도계 s-3100 (Seoul, Korea)을 사용하여 750 nm에서 측정하였다 [23]. 추출물의 최종 농도는 1 mg/mL로 하였으며, 총 페놀 함량은 검정 곡선에 기초하여 다음 식을 사용하여 μg/mg p-coumaric acid 당량으로 표현하였다:

y = 2.9533x + 0.1146, R2 = 0.9883

x는 흡광도, y는 p-coumaric acid 당량 (μg/mg).

2.6. 리그닌 (Lignin)의 항산화 활성측정

2.6.1. DPPH free radical scavenging activity

리그닌 시료 200 μL에 1 mM DPPH 시약을 800 μL를 혼합하고, 혼합물을 어두운 곳에서 15분 동안 반응시켰다. 그 후 흡광도를 SCINCO UV-Vis spectrophotometer s-3100 (Seoul, Korea)을 이용하여 517 nm에서 측정하였다 [12].

2.6.2. ABTS radical scavenging activity

7 mM ABTS 용액을 2.45 mM 칼륨과 황산염과 반응시키고 혼합물을 실온에서 12시간동안 어두운 곳에 반응시켜 ABTS 라디칼 양이온을 생성시켰다. ABTS 라디칼 양이온이 생성된 용액을 흡광도 값이 0.80±0.02이 되도록 PBS (pH 7.4)로 희석한다. 10~1,000 μg/mL 농도의 리그닌 시료 200 μL에 ABTS 라디칼 희석 용액을 1,000 μL를 혼합하였다. 혼합물을 암실에서 15분 동안 반응 후 흡광도를 SCINCO UV-Vis spectro-photometers-3100 (Seoul, Korea)을 이용하여 720 nm에서 측정하였다 [24].

2.6.3. Hydroxy radical scavenging activity

리그닌 시료 0.5 mL를 1 mL의 9 mM FeSO4, 1 mL의 9 mM 살리실산 및 0.5 mL의 0.3% H2O2와 혼합하였다. 혼합물을 실온에서 30분동안 반응시킨 후 흡광도를 SCINCO UV-Vis spectrophotometers-3100 (Seoul, Korea)을 이용하여 510 nm에서 측정하였다 [25].

2.6.4. Ferrous metal ions chelating activity

철 이온의 킬레이트 실험은 Dinis et al.의 방법을 변형하여 진행하였다. 리그닌 시료 0.4 mL에 0.05 mL의 2 mM FeCl2를 혼합한 후 5 mM ferrozine 0.2 mL를 넣은 후 ethanol로 총 부피 2 mL를 맞추었다. 혼합물을 실온에서 10분 동안 반응시킨 후 흡광도를 SCINCO UV-Vis spectrophotometer s-3100 (Seoul, Korea)을 이용하여 562 nm에서 측정하였다 [26].

2.7. 세포배양 (B16F10 melanoma cell line)

B16F10 cell line을 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco BRL, USA), 0.2% sodium bicarbontate를 첨가한 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM; Sigma, USA)를 배지를 사용하여, 37oC 온도에서 4% CO2 상태로 배양하였다. 세포가 바닥면적의 90% 정도까지 자란 상태에서 계대배양하여 실험을 진행하였다.

2.8. 세포독성 평가 (MTT assay)

B16F10 cell suspension을 12 well 에 1×105 cells/cm 농도로 200 μL씩 분주하여 배양기에서 24시간동안 안정화를 시킨 후 시료를 농도별로 처리한 후 24시간동안 배양하였다. Vistica의 방법 [27]에 따라 2.0 mg/mL MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 용액을 well 당 200 μL씩 넣어 1시간 동안 배양기에 방치한다. 이후 상등액을 제거하고 DMSO를 well 당 200 μL씩 가하고 1분간 shaking하여 formazan 을 완전히 용해시킨 후 ELISA Bio-Tek instrument Inc. (Winooski, VT, USA)을 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다 [28].

2.9. 통계처리

모든 결과 값은 세 번 반복실험 후 통계처리하였으며, 실험에 의해 얻어진 값들의 평균으로 나타내었다. 대조군과 실험군 사이의 통계학적 유의성 검증은 SPSS 23 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하여 t-test를 실시하였으며, p<0.05 이하 경우 유의하다고 판정하였다.


3. RESULTS AND DISCUSSION

3.1. 리그닌 분획의 추출 수율

본 연구에서는 솜대 줄기에서 증기 폭쇄 리그닌 (SL)을 추출한 후 유기용매에 용해시켜 분획을 나누었다. 솜대 줄기에서 추출된 SL의 수율은 21.16%로 확인되었다 (Table 2). SL을 유기용매에 용해하여 분획을 나눈 결과 methanol에 용해된 SL-F1은 37.05%, acetone 에 용해된 SL-F2는 1.79%, 나머지 분획물인 SL-F3는 47.44%로 확인되었다. 기존에 유기용매에 용해하여 분획을 진행한 연구에서는 증기 폭쇄 리그닌인 아닌 알칼리 리그닌, 유기용매 리그닌, 마쇄 리그닌으로 연구되어 왔다. 유기용매 리그닌으로 분획을 진행한 선행연구에서는 ethyl acetate에 용해된 리그닌의 수율이 가장 높은 것으로 확인되었다 [19]. 이는 추출방법에 따라 리그닌의 구조가 달라지면서 용해되는 단량체들의 종류가 다른 것으로 보인다.

Yield of steam explosion lignin (SL) and steam explosion lignin fractions 1-3 (SL-F1, SL-F2, SL-F3)

3.2. 구조 분석

본 실험에서는 대나무 줄기 유래 증기 폭쇄 리그닌 샘플인 SL과 유기용매에 용해시킨 분획물인 SL-F1, SL-F2, SL-F3의 FT-IR 스펙트럼은 Fig. 2에 나타내었다. 4가지 리그닌 모두 3100~3580 cm-1에서 방향족 및 지방족의 -OH 그룹을 확인하였고, 2942, 2835 cm-1에서 메틸 (methyl, -CH3) 및 메틸렌(methylene, -CH2-) 그룹에서 -CH를 확인하였다. 또한 1589, 1513, 1421 cm-1 (aromatic skeletal vibrations) 및 1456 cm-1 (-CH deformation vibration)에서 리그닌의 주요 구조를 확인하였다. 1113 cm-1은 GS 리그닌의 신호로 SL 에서 가장 크게 확인되었고, 1154 cm-1는 coumarate (p-CE)의 존재를 확인해주는데 SL에서는 정확하게 확인이 되지 않았으나, SL-F1, SL-F2, SL-F3에서는 확인이 되었다. 유기용매에 용해됨에 따라 리그닌이 일부 정제되어 확인되지 않았던 밴드가 확인된 것 보인다. 1703 cm-1는 케톤 (ketone, >C=O)과 카르복실산 (carboxylic acid, -COOH)의 카보닐 (carbonyl, C=O) 신축운동 (stretching vibration)에 해당하는 것으로 SL에서는 전혀 확인되지 않다가 SL-F3 로 갈수록 더욱 선명하게 확인되었다. 1326, 1216, 843 cm-1에서 syringyl 단위가 공통적으로 확인되었다.

Fig. 2.

FT-IR spectra of steam explosion lignin (SL) and steam explosion lignin fraction 1-3 (SL-F1, SL-F2, SL-F3).

솜대 줄기에서 추출된 리그닌 (SL, SL-F1, SL-F2, SL-F3)의 중량 평균 분자량 (Mw), 수 평균 분자량 (Mn)과 분자량 분산도 (poly diversity index, PDI=Mw/Mn)는 GPC 분석으로 확인하였다 (Table 3). SL, SL-F1, SL-F2와 SL-F3의 Mn은 각각 394 g/mol, 35 g/mol, 37 g/mol, 31 g/mol이었고, Mw는 각각 288 g/mol, 103 g/mol, 112 g/mol, 53 g/mol이었다. 유기용매 분획물 리그닌은 낮은 분자량을 가진 것으로 확인되었고 기존의 기존의 증기 폭쇄 리그닌인 SL보다 더 낮은 분자량으로 확인되었다. 또한, PDI의 결과, SL은 좁은 분자 분포를 나타내지만, SL-F1, SL-F2, SL-F3은 넓은 분자 분포를 나타내었다. 이는 분획물에 추출된 단량체들의 크기가 달라 넓은 분포를 가진것으로 보인다.

Weight average (Mw), number average (Mn) molecular weight and poly dispersity index (PDI = Mw/Mn) of SL, SL-F1, SL-F2 and SL-F3

SL, SL-F1, SL-F2와 SL-F3는 1H-, 13C-, 2D HSQC를 통해 분석하였다. 리그닌들의 NMR 분석 결과 기본적으로 알려진 리그닌의 특성 및 구조를 확인하였으며 분석 결과는 Table 4Fig. 3에 나타내었다. 2D HSQC 결과 SL과 SL 분획물이 구조적으로 많은 차이를 보이는 것을 확인하였다. 특히 SL-F3의 경우 p-coumarat, phenylcoumaran 구조외에 다른 분획물들과 동일한 구조는 확인되지 않았으며, 케톤과 carbon 체인 구조만 확인이 되었다. SL-F2는 SL-F1과 비슷하지만 다른 구조를 가진 것으로 확인되었다. SL-F1은 C=C 결합 및 카르복실기의 C-O 결합이 다른 리그닌들에 비해 많은 것으로 확인되었다. 또한 높은 methoxy 결합도 확인되었는데 이는 SL-F1의 높은 항산화 활성 결과와 일치하는 것을 알 수 있다. 본 실험을 통해 리그닌의 구조 분석 결과 각각의 유기용매에 용해된 리그닌을 이루는 단량체의 종류가 다른 것으로 확인되었다. 각각의 리그닌 분획에 이루어진 단량체의 종류가 달라 각 분획별로 구조적 특성 및 항산화 활성이 다른 것으로 확인되었다.

Assignments of 2D HSQC spectra results of steam explosion lignin (SL) and steam explosion lignin fractions 1-3 (SL-F1, SL-F2, SL-F3)

Fig. 3.

1H-, 13C-NMR spectra of steam explosion lignin (SL), steam explosion lignin fraction 1 (SL-F1), steam explosion lignin fraction 2 (SL-F2) and steam explosion lignin fraction 3 (SL-F3). (A) 1H- NMR spectra, (B) 13C NMR spectra.

3.3. 항산화 활성

리그닌 분획물의 총 폴리페놀 함량 (TPC)은 417.86~567.46 COUE μg/mg 범위였다 (Table 5). MeOH 용매에 용해된 리그닌 분획인 SL-F2는 상당히 높은 TPC 함량을 가졌다. 유기용매에 용해되지 않은 분획물인 SL-F3는 가장 낮은 함량을 나타내었다. 증기 폭쇄 후 유기용매에 요해한 분획물들이 기존의 Barapatre et al.이 진행한 유기용매 분획들의 총 폴리페놀 함량보다 높은 것으로 확인되었다 [29]. DPPH 항산화 활성 측정결과 추출된 SL, SL-F1, SL-F2와 SL-F3의 IC50은 각각 439.06 μg/mL, 359.37 μg/mL, 391.09 μg/mL, 566.89 μg/mL이었다 (Table 5, Fig. 4). SL-F1이 다른 리그닌 시료에 비해 낮은 농도에서 DPPH free radical 소거 활성 (IC50)을 나타내었다. ABTS 항산화 활성에서 추출된 SL, SL-F1, SL-F2와 SL-F3의 IC50은 각각 161.27 μg/mL, 107.51 μg/mL, 153.57 μg/mL, 202.98 μg/mL로 확인되었다 (Table 5, Fig. 5). DPPH free radical 소거활성 결과와 마찬가지로 SL-F1이 다른 리그닌 시료에 비해 낮은 농도에서 IC50를 나타내었다. Aadil et al.의 연구에서 유기용매 리그닌의 분획 중 에탄올과 아세톤 분획이 높은 ABTS 라디칼 소거능을 나타낸다고 확인되었다 [30]. 이와 같이 용매와 용매의 극성이 항산화 활성을 가지는 화합물의 특정 그룹을 추출하여 항산화 활성을 높이는 것으로 보인다 [6]. Hydroxy radical 소거능의 IC50는 각각 330.93 μg/mL, 233.18 μg/mL, 272.25 μg/mL, 421.31 μg/mL로 확인되었다 (Table 5, Fig. 6). 리그닌의 높은 라디칼 소거능은 다량의 자유 페놀 성하이드록실기 및 저분자량을 갖는 화합물의 존재와 관련이 있다고 보고된 연구와 일치한다 [31]. 리그닌 분획물의 철 이온에 대한 킬레이트 활성은 모든 시료가 동일하게 100 μg/mL의 농도에서 측정하였다. 각 분획물들의 철 이온에 대한 킬레이트 활성은 각각 63.75%, 70.14%, 62.20%, 51.61% 로 확인되었다 (Table 5). 기존의 Barapatre et al.의 연구에서 극성 용매로 추출한 리그닌 분획물은 높은 킬레이트 능력을 보였다 [6]. 특히 철 이온과 결합한 카테콜레이트 (catecholate) 및 갈레이트 (gallate) 화합물은 pH 5~6에서 철 이온과 리간드 결합을 한다고 알려져있다. 철 이온의 킬레이트는 폴리페놀의 구조, -OH의 수와 위치 및 pH에 의해 강하게 영향을 받는다고 연구되어 있다 [32]. 증기 폭쇄 리그닌 추출시 pH 5.5는 리그닌이 가지는 단량체들이 철 이온과 리간드 결합을 이루는데 영향을 미친 것으로 생각된다. 본 실험에서 확인된 리그닌의 항산화 활성은 SL-F1, SL-F2, SL, SL-F3 순서로 확인되었으며, 높은 TPC 함량을 가진 SL-F1이 DPPH, ABTS, Hydroxy radical, 철 이온 킬레이트에서도 높은 활성을 나타내는 것을 확인하였다. 이와 같은 결과는 리그닌은 구조적인 차이에 따라 항산화 활성이 달라지며, 용해되는 유기용매의 종류에 따라 달라지는 것도 확인하였다. 리그닌의 메톡시 그룹은 항산화 활성에 큰 영향을 미치는 것으로 알려져있다 [33]. 리그닌의 메톡시 그룹은 형성된 라디칼은 안정화시켜 항산화 활성을 높이는 것으로 확인되었다 [34]. SL-F1 의 구조를 확인하였을 때 다른 분획물보다 메톡시 그룹의 함량이 많은 것을 확인할 수가 있다. 이는 SL-F1의 항산화 활성이 높은 이유이며, 기존의 연구와 유사한 연구결과를 가진다.

Antioxidant activity results and total polyphenol contents of steam explosion lignin (SL) and steam explosion lignin fractions 1-3 (SL-F1, SL-F2, SL-F3)

Fig. 4.

DPPH free radical scavenging activity results of steam explosion lignin (SL) and steam explosion lignin fraction 1-3 (SL-F1, SL-F2, SL-F3).

Fig. 5.

ABTS scavenging activity results of steam explosion lignin (SL), steam explosion lignin fraction 1 (SL-F1), steam explosion lignin fraction 2 (SL-F2) and steam explosion lignin fraction 3 (SL-F3).

Fig. 6.

Hydroxyl radical activity results of steam explosion lignin (SL), steam explosion lignin fraction 1 (SL-F1), steam explosion lignin fraction 2 (SL-F2) and steam explosion lignin fraction 3 (SL-F3).

3.4. 세포독성 측정결과

대나무 줄기 유래 리그닌의 세포 독성을 측정하기 위해 B16 F10 melanoma를 사용하여 25 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL 농도범위에서 세포 독성을 측정하였다. 실험한 농도 전체에서 24시간이 지난 후 세포독성은 나타나지 않았다 (Fig. 7). 이와 같은 결과는 선행연구에서 왕대 대나무 줄기 추출물의 독성을 실험하였을 때 100 μg/mL 이하 농도에서 독성이 나타나지 않았던 연구와 일치한다 [17]. 또한 측백나무에서 추출한 리그닌의 세포독성을 평가하였을 때 25 μg/mL 이하의 농도 범위에서 독성을 나타내지 않았다고 보고 되었는데 본 실험결과와 유사함을 확인하였다 [35,36]. 따라서 본 실험에서 사용한 대나무 유래 리그닌 분획물은 세포독성이 확인되지 않아 화장품 및 식품 산업에 적용할 수 있으리라 생각된다.

Fig. 7.

Cytotoxicity result (MTT assay) of steam explosion lignin (SL) and steam explosion lignin fraction 1-3 (SL-F1, SL-F2, SLF3).


4. CONCLUSION

본 연구의 결과 다음과 같은 결론을 얻을 수 있었다.

증기 폭쇄 리그닌을 methanol, acetone의 유기용매에 용해한 분획물들 수득하였고 각각의 수율은 methanol (SL-F1), acetone (SL-F2), non-soluble (SL-F3)의 경우에 각각 37.05%, 1.79%, 47.44%였다.

증기 폭쇄 리그닌을 융기용매에 용해시켜 얻은 SL-F1, SL-F2, SL-F3는 FT-IR, GPC, NMR 분석을 통해 SL-F1은 C=C 결합 및 카르복실기의 C-O 결합과 높은 methoxy 결합도 확인되었고, SL-F2는 SL-F1과 유사하지만 페놀그룹과 메톡시그룹의 함량이 낮은 것으로 확인되었다. SL-F3는 p-coumarat, phenylcoumaran 구조와 케톤, carbon 체인 구조만 확인이 되었으며, 공통적으로 저분자인 것을 확인하였다.

각각의 분획물들을 TPC, DPPH, ABTS, Hydroxyl rdiacal, 철 이온 킬레이트 활성을 통해 항산화활성을 확인한 결과, 분획물 중 SL-F1의 항산화 활성이 가장 높았으며, 이는 SL-F1을 이루고 있는 단량체의 종류가 페놀성 화합물이 많은 것으로 확인되었다. 또한 SL-F1에 메톡시 그룹이 많아 항산화 활성이 높은 것으로 확인되었다.

추출된 리그닌들은 MTT assay를 통해 100 μg/mL 이하의 농도에서 독성을 나타내지 않는 것으로 확인되었으며, 이는 리그닌 분획물을 항산화제로써 화장품 및 식품에 사용 가능성을 확인하였다.

Acknowledgments

본 연구는 산림청 (한국임업진흥원) 산림과학기술 연구개발사업 (2016015B10-1819-AB02)의 지원에 의하여 수행되었습니다.

References

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Fig. 1.

Fig. 1.
Schematic diagram of sequential solvent fractionation of steam explosion lignin.

Fig. 2.

Fig. 2.
FT-IR spectra of steam explosion lignin (SL) and steam explosion lignin fraction 1-3 (SL-F1, SL-F2, SL-F3).

Fig. 3.

Fig. 3.
1H-, 13C-NMR spectra of steam explosion lignin (SL), steam explosion lignin fraction 1 (SL-F1), steam explosion lignin fraction 2 (SL-F2) and steam explosion lignin fraction 3 (SL-F3). (A) 1H- NMR spectra, (B) 13C NMR spectra.

Fig. 4.

Fig. 4.
DPPH free radical scavenging activity results of steam explosion lignin (SL) and steam explosion lignin fraction 1-3 (SL-F1, SL-F2, SL-F3).

Fig. 5.

Fig. 5.
ABTS scavenging activity results of steam explosion lignin (SL), steam explosion lignin fraction 1 (SL-F1), steam explosion lignin fraction 2 (SL-F2) and steam explosion lignin fraction 3 (SL-F3).

Fig. 6.

Fig. 6.
Hydroxyl radical activity results of steam explosion lignin (SL), steam explosion lignin fraction 1 (SL-F1), steam explosion lignin fraction 2 (SL-F2) and steam explosion lignin fraction 3 (SL-F3).

Fig. 7.

Fig. 7.
Cytotoxicity result (MTT assay) of steam explosion lignin (SL) and steam explosion lignin fraction 1-3 (SL-F1, SL-F2, SLF3).

Table 1.

Antioxidant activities of bamboo species and part

Species Part Extraction methods Antioxidant assay References
P. nigra var. Henonis Stem Steam explosion-alkaline treate 359.37-566.89 μg/mL (DPPH)
414.61-2258.18 μg/mL (ABTS)
509.17-1395.93 μg/mL (Hydroxyl radical)
51.61-70.14 % (Fe2+ chelate)
This study
S. coreana Nakai Leaves Water, 70% EtOH, MeOH 604-797 μg/mL (DPPH)
117-166 μg/mL (ABTS)
Choi et al. (2018)
P. nigra var. Henonis Stem Water, 50-100% EtOH 565.63-1064.48 μg/mL (DPPH)
414.61-2258.18 μg/mL (ABTS)
509.17-1395.93 μg/mL (Hydroxyl radical)
Choi et al. (2018)
P. bambusoides, P. pubescens,
P. nigra var. henonis, S. coreana
Stem, leaves Water, 94% EtOH,
supercritical fluid
300-600 μg/mL (DPPH) Choi et.al (2012)
P. sieb. et Zucc Leaves Water 1.53-3.86 mM (DPPH)
478.4-988.4 μM (FRAP)
28-100 μg/mL (ABTS)
Wu et al. (2012)
P. pubescens, P. nigra Shoots MeOH 3.4-3.6mg/mL (DPPH) Park et al. (2010)
S. borealis Leaves 80% MeOH 9.5-161.5μM (DPPH) Park et al. (2007)
P. pubescens, P. bambusoides
S. et Z.
Stem, leaves MeOH 29.44-41.44% (DPPH)
0.041-0.083mg/mg (Reducing power)
Jun et al. (2004)
P. edulis Leaves 70% EtOH 6.9-16.0 μM (DPPH)
14.6-29.8μM (MTBA)
Mu et al. (2004)
P. bambusoides, P. pubescens,
P. nigra var. Henonis, S. borealis,
P. nigra Munro
Stem, leaves Water, 70% EtOH 0.425-0.735mM (TEAC)
58.03-91.27% (DPPH)
61.28-89.74% (Nitrite activity)
Lee et al. (2003)

Table 2.

Yield of steam explosion lignin (SL) and steam explosion lignin fractions 1-3 (SL-F1, SL-F2, SL-F3)

Sample SL SL-F1 SL-F2 SL-F3
Yield (%) 21.16 37.05 1.79 47.44

Table 3.

Weight average (Mw), number average (Mn) molecular weight and poly dispersity index (PDI = Mw/Mn) of SL, SL-F1, SL-F2 and SL-F3

SL SL-F1 SL-F-2 SL-F3
Mw 394 35 37 31
Mn 288 103 112 53
PDI 1.368 2.921 2.989 1.707

Table 4.

Assignments of 2D HSQC spectra results of steam explosion lignin (SL) and steam explosion lignin fractions 1-3 (SL-F1, SL-F2, SL-F3)

Assignments δCH (ppm)
SL SL-F1 SL-F2 SL-F3
C-H in methoxyls 56.2/3.75 56.3/3.77 56.3/3.76 56.4/3.75
Cγ-Hγ in β-O-4’ substructures 60.2/3.70 60.5/3.65 60.5/3.64 -
Cγ-Hγ in cinnamyl alcohol acylated at the γ-OH 62.1/4.11 - - -
Cγ-Hγ in phenylcoumaran 67.6/4.48 - - -
Cα-Hα in β-O-4’ unit 72.6/4.88 72.8/4.90 72.7/4.88 72.7/4.90
Cβ-Hβ in β-O-4’ linked to G/H 84.3/4.32 - - -
Cα-Hα in tetrahydrofuran 82.2/4.87 82.0/4.78 - -
Cβ-Hβ in β-O-4’ linked to S 86.5/4.14 86.5/4.15 86.6/4.13 86.5/4.15
Cβ-Hβ in phenylcoumaran 87.5/5.49 87.7/5.46 87.6/5.44 -
C2,6-H2,6 in syringyl units 104.1/6.63 104.2/6.64 104.1/6.61 104.7/6.73
C2-H2 in guaiacyl units 110.9/6.90 110.9/6.94 - -
C2-H2 in ferulate 111.6/7.42 111.3/7.18 - -
C5-H5 in guaiacyl units 117.8/6.75 - - -
C8-H8 in p-coumarate 114.6/6.30 - 115.9/ 6.31, 6.28 -
C3,5-H3,5 in p-coumarate 116.1/6.80 116.2/6.78 116.2/6.79 116.3/6.80
C6-H6 in guaiacyl units 119.3/6.76 119.1/6.77 119.1/6.77 -
C6-H6 in ferulate 121.2/7.24 120.1/6.32, 6.27 - -
C2,6-H2,6 in H units 128.4/6.84 - - -
C3,5-H3,5 in H units 116.1/6.80 116.2/6.80 - -
C2,6-H2,6 in p-coumarate 129.3/7.37 129.8/ 7.42, 7.40 130.6/7.51 130.6/7.46
C7-H7 in p-coumarate 140.3/7.29 141.4/ 7.37, 7.35 144.7/ 7.52, 7.48 -

Table 5.

Antioxidant activity results and total polyphenol contents of steam explosion lignin (SL) and steam explosion lignin fractions 1-3 (SL-F1, SL-F2, SL-F3)

Sample IC50 (μg/mL) Fe2+ chelate (%) TPC (COUE μg/mg)
DPPH ABTS Hydroxyl radical
SL 439.06 161.27 330.93 63.75 556.23
SL-F1 359.37 107.51 233.18 70.14 567.30
SL-F2 391.09 153.57 272.25 62.20 527.57
SL-F3 566.89 202.98 421.31 51.61 417.86