The Korean Society For Biotechnology And Bioengineering
[ Research Paper ]
Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 33, No. 3, pp.209-213
ISSN: 1225-7117 (Print) 2288-8268 (Online)
Print publication date 30 Sep 2018
Received 24 Apr 2017 Revised 15 Dec 2017 Accepted 26 Apr 2018
DOI: https://doi.org/10.7841/ksbbj.2018.33.3.209

Ethyl Acetate를 유기탄소원으로 이용한 혼합영양배양에서의 Oscillatoria sp.의 성장특성 연구

고시원 ; 홍가이 ; 이태윤*
부경대학교 환경공학과
Cultivation of Oscillatoria sp. under Mixotrophic Conditions with Ethyl Acetate as Organic Carbon
Siyun Gao ; Kai Hong ; Tae-Yoon Lee*
Department of Environmental Engineering, Pukyong National University, Busan 680-737 Korea +82-51-629-6530 +82-51-629-6523 badger74w@pknu.ac.kr

Correspondence to: *Department of Environmental Engineering, Pukyong National University, Busan 680-737, Korea Tel: +82-51-629-6530, Fax: +82-51-629-6523 e-mail: badger74w@pknu.ac.kr


© 2018 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering

Abstract

The purpose of this study was to determine optimum value of aeration rate for the cultivation of Oscillatoria sp. and to find adequate acetate types and concentration as organic carbon source. The highest specific growth rate of 0.287 day-1 was obtained at the aeration of 0.55 vvm. Among four different acetate compounds, ammonium acetate and ethyl acetate were effective for Oscillatoria cultivation. For 30 mM ethyl acetate usage, the highest maximum specific growth rate (0.347 day-1), maximum biomass productivity (0.214 g L-1 d-1), and maximum concentration (2.05 g/L) were obtain. For the effective cultivation of Oscillatoria, aeration and dosage of more than 20 mM of ethyl acetate is recommended.

Keywords:

oscillatoria, mixotrophic cultivation, ethyl acetate, aeration, biomass

1. INTRODUCTION

식물성 플랑크톤에 의해 생산되는 유기물의 양은 연간 1×1011톤으로 추정되고 있다. 식물성 플랑크톤, 즉 미세조류는 많은 분야에 유용하게 이용이 되고 있는데, 대표적으로 어폐류 양식을 위한 먹이생물로 이용되거나 [1], 연료, 단백질 및 천연색소 등의 고부가가치 소재의 공급원으로 사용될 수 있어 이와 관련된 많은 연구가 진행되고 있다 [2,3].

이 중에서 미세조류 (microalgae)를 이용한 바이오디젤 생산연구가 많이 진행이 되고 있는데 이는 기존 재료를 이용한 바이오디젤 생산에 비해 많은 장점이 있기 때문이다 [4,5]. 예를 들면, 미세조류를 이용하여 생산된 바이오디젤의 에너지 근원은 태양에너지이므로 무한 공급이 가능하며, 연소 시 발생하는 CO2는 식물 또는 광합성 작용으로 회수되므로 탄소중립적이기 때문이다. 미세조류 배양을 통해 생산된 최종 산물인 바이오매스는 바이오연료 외에 동물 사료, 물고기 사료로 재사용함으로써 이산화탄소 저감과 대체연료 생산이라는 환경개선의 장점을 가지고 있다 [6-9]. 미세조류를 이용하여 바이오매스를 생산하는 것은 다음과 같은 장점이 있다. 미세조류는 과거 수십년 동안 많은 연구자들이 연구를 진행하였으며 30,000종 이상이 연구가 완료되어 성장환경만 조절한다면 쉽게 원하는 미세조류를 배양할 수가 있다 [10]. 미세조류의 지질/오일 함량은 20~50%로서 비교적 높은 편이며 증식속도 또한 다른 육상식물에 비해 빠른 것으로 보고되었다 [10]. 특히, 육상식물인 콩과 비교 시 동일 지질/오일을 생산하는 데 필요한 부지는 49~132배 정도 작은 것으로 알려져있다 [11].

미세조류 배양에 있어서 가장 큰 문제는 경제성이 떨어진다는 것인데 이를 해결하기 위한 방법 중 하나는 미세조류의 고농도 대량배양을 통해 수확비용을 줄이는 것이다 [12]. 고농도 배양을 위해서는 독립영양 (autotrophy)와 종속영양 (heterotrophy) 방식을 결합한 혼합영양 (mixotrophy) 방식이 많이 사용되고 있다. 혼합영양 배양방식은 이산화탄소와 유기탄소를 탄소원과 에너지원으로 사용하여 바이오매스를 생산하는 방법이며, 이산화탄소는 대기 중의 공기를 주입하여 공급하고 유기탄소원의 경우 glucose, xylose, rhamnose, fructose, sucrose, galactose, acetate 등이 다양한 미세조류 배양에 효과적이라는 것이 확인되었다 [12,13]. 이 중 acetate를 이용한 미세조류 배양 및 수소생산 연구가 최근 활발히 진행이 되고 있으며 다른 유기탄소원에 비해 저렴하고 미세조류 배양에 더욱 효과적인 것으로 보고되었다 [13].

따라서 본 연구에서는 Oscillatoria sp.를 이용하여 혼합영양 배양방식에서 최적의 배양조건을 찾아내고자 하였다. 먼저 최적의 공기공급 속도를 찾아내고 다양한 종류의 acetate 화합물을 유기탄소원으로 하여 배양한 후 최적의 acetate 화합물을 찾아내고자 한다. 최적의 화합물이 선정이 되면 다양한 농도로 배양하여 최적 농도를 찾아내고자 하였다. 이후 공기와 최적의 유기탄소를 동시에 주입하여 배양하여 최적의 배양조건을 도출하고자 한다.


2. MATERIALS AND METHOD

2.1. 사용 균주 및 배지

본 연구에 사용된 미세조류는 Oscillatoria sp. (LIMS-PS-0030)으로 한국해양미세조류은행 (KMMCC, Korea)로부터 분양받았다. 사용된 배지는 Table 1에 나타낸 바와 같은 성분의 JM배지 (Jaworski's Medium)를 조제하여 121oC에서 15분간 멸균하여 사용하였다.

The composition Jaworski's medium (Unit: mg/L deionized water)

Fig. 1.

Schematic diagram of the photobioreactor for the experiments on Anabena growth for batch and semicontinuous microalgal culture. The airstreams was adjusted by a gas flow meter. External illumination of light was provided by a continuous LED light.

2.2. 실험 장치

Oscillatoria의 성장실험은 공기 공급 속도에 따른 성장 속도를 비교하기 위해서 에어 펌프를 이용하여 공기의 공급 속도를 0.0, 0.11, 0.55, 그리고 1.2 vvm의 범위로 달리하였다. 광원으로는 660 nm 파장으로 발광하는 적색 LED를 사용하였는데 이는 Lee 등 [14]의 연구에서 녹색계통 미세조류의 배양효과가 적색 LED를 사용하였을 때 가장 우수하다고 보고하였기 때문이다. 반응기는 가로 60 cm, 세로 60 cm, 높이 30 cm의 크기로 반응시스템을 제작하였으며, LED 램프는 S-tech LED사로부터 bar 형식의 LED램프를 구입하여 실험하였다. 광원은 반응기의 상부에 설치하여 위에서 아래로 광을 공급하였다. 광량 및 조도는 58 μmol/m2/s, 3,540 Lux로 하였으며, 조도계 (I-346 Illuminometer, Sekonic Co., Philippines)와 광량계 (MQ-306, Apogee Instruments Inc., Logan, UT)를 사용하여 측정하였다.

2.3. 미세조류 배양 방법 및 농도 측정

Oscillatoria의 성장특성 연구는 100 혹은 500 mL 용량의 코니칼 비이커를 사용하여 희석한 초기배양액을 주입하여 계획한 초기농도로 맞춘 후 파라필름을 이용해 비커의 입구를 막은 후 미세 구멍을 뚫어 주었다. 공기 공급 속도 따른 성장속도를 비교하기 위하여 반응기의 바닥 부분에 산기석 (porous stone)을 고정시켜 에어펌프를 조정하여 공급 속도를 조절하였다. 아세테이트 주입 실험의 경우에는 100 mL 비이커에 20 mM의 Acetic acid, ethyl acetate, butyl acetate, ammonium acetate를 넣은 후 JM 배지로 채운 후 배양 실험을 실시하였다. 온도조절은 실험실에 설치된 온도 조절장치를 이용하여 반응기의 온도를 21~23oC로 일정하게 유지하였다. 배양액의 온도는 수은온도계를 이용하여 측정하였다.

미세조류의 성장은 UV 흡광광도계 (UV-vis Spectrophotometer SP 3000, Optima, Tokyo)를 이용하여 약 2 mL의 샘플을 취한 후 660 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 관찰하였다. 미세조류 바이오매스양 (g/L)과 흡광도의 관계는 흡광도 측정 후 샘플을 원심분리기에 넣어 고액분리하고 냉동건조한 후 측정된 바이오매스량을 이용하여 구하였다.

2.4. 미세조류 비증식속도와 최대 바이오매스 생산성 계산

주어진 배양 조건에서의 Oscillatoria의 비증식속도 (specific growth rate)는 다음의 식으로 계산하였다.

μmax=InN2-InN1 / t2-t1(1) 

여기서, μmax는 비증식속도 (day-1), N1 및 N2는 대수증가 단계에서의 초기(t=0) 및 일정 배양 시간 후의 Oscillatoria의 최대 농도 (g/L), 그리고 t는 배양 시간 (day)을 나타낸다.

최대바이오매스 생산성 (maximum biomass productivity)는 다음의 식으로 계산하였다.

Pmax=Xt-X0 / tx-t0(2) 

여기서, Pmax는 최대 바이오매스 생산성 (g/L/day), Xt는 최종 배양시간 (tx)에 측정된 바이오매스의 농도를 의미한다.


3. RESULTS AND DISCUSSION

각 실험조건에서의 성장특성, 즉 비성장속도, 최대바이오매스 생산성 및 최대농도는 Table 2에 요약되어있다. 먼저 Oscillatoria의 초기 농도에 따른 성장특성을 보기 위해 초기 농도를 0.42 g/L, 0.50 g/L, 0.92 g/L로 조절하여 JM 배지에서 배양하였으며, Oscillatoria의 증식 곡선은 Fig. 2에 나타내었다.

Test conditions and results of specific growth rate (μmax), maximum biomass productivity (Pmax), and maximum cell concentrations (Cmax)

Fig. 2.

Growth curves of Oscillatoria for the experiments on different initial concentrations of Oscillatoria in batch culturing tests.

최대 비성장속도 (day-1)는 초기 농도가 0.42와 0.50 g/L일 때 각각 0.114와 0.115로 거의 유사한 값을 나타내었으나 초기 농도가 0.91 g/L로 증가하였을 때는 0.084로 감소하는 것을 알 수 있었다. 최대바이오매스 생산성의 경우 초기농도가 증가함에 따라 0.037, 0.040, 0.045 g L-1 d-1로 조금씩 증가하였다. 최대농도 또한 초기 농도에 비례하여 증가하는 것을 확인하였다 [14].

공기주입속도에 따른 Oscillatoria의 성장곡선은 Fig. 3에 나타내었다. 최대 비성장속도 (day-1)는 공기를 주입하지 않았을 때 0.022 day-1, 0.11 vvm일 때 0.124 day-1, 0.55 vvm일 때 0.287 day-1, 1.2 vvm일 때 0.282 day-1이었다. Pmax와 최대농도의 경우도 vvm이 증가할수록 큰 값을 나타내었지만, 0.55 vvm과 1.2 vvm의 경우 μmax, Pmax와 최대농도는 거의 유사한 값을 나타내었으므로 Oscillatoria의 성장에 동일한 효과를 가진다고 볼 수 있다.

Fig. 3.

Growth curves of Oscillatoria for the experiments on different aerations (vvms) for batch culture tests.

Oscillatoria의 배양에 가장 효과적인 acetate를 선정하기 위해 4개의 100 mL 코니컬 플라스크에 각 20 mM의 acetic acid, ethyl acetate, butyl acetate, 그리고 ammonium cetate를 첨가한 후 JM 배지를 채운 후 배양을 하였다. 배양곡선은 Fig. 4에 표시하였다.

Fig. 4.

Growth curves of Oscillatoria for the experiments on different types of acetate compounds (20 mM of acetate was used for each test).

각각 20 mM의 acetic acid와 butyl acetate를 포함한 실험의 경우 Oscillatoria는 성장하지 않는 것으로 밝혀졌으며, ethyl acetate와 ammonium acetate를 첨가한 경우 JM 배지만 포함한 control에 비해 성장속도가 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 20 mM의 ethyl acetate를 포함한 배양실험에서의 μmax, Pmax와 최대농도는 0.314 day-1, 0.096 g L-1 d-1 1.14 g/L였다. 본 실험을 통해 ethyl acetate가 가장 효과적인 유기탄소원인 것으로 파악되었다.

Oscillatoria의 최적배양을 위한 최적의 ethyl acetate 농도를 구하기 위하여 5개의 100 mL 코니컬 플라스크에 5, 10, 20, 30, 40 mM의 ethyl acetate를 첨가한 후 JM 배지를 추가하여 배양을 하였다. 다양한 ethyl acetate 농도에 따른 Oscillatoria의 배양곡선은 Fig. 5에 표시하였다.

Fig. 5.

Growth curves of Oscillatoria for the experiments on different concentrations of ethyl acetate.

μmax의 경우 모든 실험의 경우에 0.302-0.347 (day-1) 범위의 값을 보여주었으며, Pmax의 경우에는 첨가한 acetate의 농도가 증가할수록 0.136에서 0.214 g L-1 d-1로 지속적으로 증가하였다. 최대 농도의 경우도 acetate의 농도에 비례하여 증가하는 것을 확인하였다.

acetate 첨가와 aeration의 혼합효과를 보기 위해 2개의 500 mL 코니컬 플라스크를 준비하여 각각 20 mM의 ethyl acetate를 JM 배지에 넣은 후 첫 번째 플라스크에는 공기주입을 하지 않고 두 번째 플라스크에 0.53 vvm의 속도로 공기를 주입하였다. 실험결과는 Fig. 6에 나타내었다.

Fig. 6.

Growth curves of Oscillatoria for the experiments conducted with ethyl acetate with aeration or without aeration.

aeration 없이 20 mM의 ethyl acetate를 첨가한 실험의 경우 umax는 0.240 day-1, Pmax는 0.171 g L-1 d-1, 그리고 최대농도는 1.13 g/L의 값을 나타내었다. 이 값들은 앞의 20 mM의 ethyl acetate를 첨가한 실험과 비교하였을 때 모두 감소하였다는 것을 알 수 있었다. 이는 앞 실험의 경우 100 mL 용량의 플라스크를 사용하였지만 본 실험은 500 mL 용량의 플라스크를 사용하여 배양 시 광공급조건 및 대기 중의 이산화탄소 공급조건 등이 변하여 성장특성에 영향을 준 것으로 판단된다. 이에 반해 0.53 vvm의 공기공급 조건에서는 Oscillatoria의 성장이 급격히 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이 조건에서의 umax는 0.311 day-1, Pmax는 0.245 g L-1 d-1, 그리고 최대농도는 2.19 g/L의 값을 나타내었다.


4. CONCLUSION

본 연구에서는 Oscillatoria의 혼합영양배양에서의 효과적 배양조건 중 초기농도, 공기주입속도, 유기탄소원의 종류 및 농도를 선정하고자 하였다. 초기농도를 달리한 경우에는 초기 농도가 낮을수록 비성장속도는 증가하였지만 이에 반해 최대바이오매스 생산성은 오히려 감소한다는 것을 알 수 있었다. 공기를 주입하지 않은 경우와 다양한 공기 공급 속도 (0.11 vvm, 0.55 vvm, 1.2 vvm)의 조건에서 비성장속도는 0.55 vvm의 공급 속도 (0.287 day-1)에서 가장 높았다. 1.2 vvm의 경우 최대바이오매스 생산성과 최대농도에서 조금 높은 값을 나타내었으나 경제성을 고려할 때 0.55 vvm의 공기공급 조건이 최적조건이라 할 수 있다. 4가지 종류의 acetate 화합물에 대한 배양실험에서 acetic acid와 butyl acetate의 경우에는 배양에 효과가 없었으며, ammonium acetate와 ethyl acetate의 경우 Oscillatoria의 배양에 효과가 있음을 알 수 있었다. 이중 ethyl acetate 첨가의 경우 umax는 0.314 day-1, Pmax는 0.096 g L-1 d-1, 그리고 최대농도는 1.14 g/L으로 사용한 화합물 중 가장 효과가 좋았다. ethyl acetate의 농도가 5 mM에서 40 mM로 증가함에 따라 성장 또한 촉진됨을 확인할 수 있었다. 20 mM의 ethyl acetate를 함유한 반응조에 0.54 vvm의 공기를 공급하여 주었을 때 공기 공급이 없는 조건보다 Oscillatoria의 성장이 촉진되는 것을 확인하였다. 따라서 혼합영양배양 조건에서의 Oscillatoria의 효과적인 배양을 위해서는 0.54 vvm의 공기공급과 더불어 20 mM 이상의 ethyl acetate를 첨가하면 기존의 방법에 비해 훨씬 경제적으로 배양을 할 수 있을 것으로 판단된다.

Acknowledgments

이 연구는 한국연구재단 중견연구자 지원사업 및 지역대학 우수과학자지원사업 (C-D-2018-0411)으로 수행된 연구입니 다.

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Fig. 1.

Fig. 1.
Schematic diagram of the photobioreactor for the experiments on Anabena growth for batch and semicontinuous microalgal culture. The airstreams was adjusted by a gas flow meter. External illumination of light was provided by a continuous LED light.

Fig. 2.

Fig. 2.
Growth curves of Oscillatoria for the experiments on different initial concentrations of Oscillatoria in batch culturing tests.

Fig. 3.

Fig. 3.
Growth curves of Oscillatoria for the experiments on different aerations (vvms) for batch culture tests.

Fig. 4.

Fig. 4.
Growth curves of Oscillatoria for the experiments on different types of acetate compounds (20 mM of acetate was used for each test).

Fig. 5.

Fig. 5.
Growth curves of Oscillatoria for the experiments on different concentrations of ethyl acetate.

Fig. 6.

Fig. 6.
Growth curves of Oscillatoria for the experiments conducted with ethyl acetate with aeration or without aeration.

Table 1.

The composition Jaworski's medium (Unit: mg/L deionized water)

Components Contents
Ca(NO3)2·4H2O 20
KH2PO4 12.4
MgSO4 · 7H2O 50
NaHCO3 15.9
Na2HPO4 · 12H2O 36
NaNO3 80
EDTA FeNa 2.25
EDTANa2 2.25
H3BO3 2.48
MnCl2 ·4H2O 1.39
(NH4)6Mo7O24 · 4H2O 1.00
Cyanobalamin 0.04
Thiamine HCl 0.04
Biotin 0.04

Table 2.

Test conditions and results of specific growth rate (μmax), maximum biomass productivity (Pmax), and maximum cell concentrations (Cmax)

Test condition μmax (day-1) Pmax (g L-1d-1) Cmax (g L-1)
Initial Con. (g/L) 0.42 0.114 0.037 0.91
0.50 0.115 0.040 1.02
0.91 0.084 0.045 1.49
Aeration (vvm) 0 0.022 0.020 0.45
0.11 0.124 0.102 2.19
0.55 0.287 0.152 3.25
1.2 0.282 0.160 3.43
Acetate Compounds (20 mM) Acetic acid dead dead dead
Ethyl acetate 0.314 0.096 1.14
Butyl acetate dead dead dead
Ammonium acetate 0.279 0.061 0.65
Ethyl acetate 5 mM 0.302 0.136 1.32
10 mM 0.313 0.156 1.45
20 mM 0.337 0.205 1.95
30 mM 0.347 0.214 2.05
40 mM 0.340 0.206 1.99
Ethyl acetate (20 mM) Aeration (0.54 vvm) 0.311 0.245 2.19
Ethyl acetate (20 mM) No aeration 0.240 0.171 1.13