The Korean Society For Biotechnology And Bioengineering
[ Research Paper ]
Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 36, No. 1, pp.30-35
ISSN: 1225-7117 (Print) 2288-8268 (Online)
Print publication date 31 Mar 2021
Received 12 Dec 2020 Revised 04 Jan 2021 Accepted 06 Jan 2021
DOI: https://doi.org/10.7841/ksbbj.2021.36.1.30

Biorenovation 공법을 활용한 광나무 추출물의 미백 효과

심지한 ; 이경미 ; 박태진 ; 강민성 ; 홍혜현 ; 김승영*
선문대학교 제약생명공학과
Biorenovation-Assisted Modifiction of Ligustrum japonicum Extract for Skin-Whitening Effect
Ji Han Sim ; Kyung-Mi Lee ; Taejin Park ; Min Sung Kang ; Hyehyun Hong ; Seung-Young Kim*
Department of Pharmaceutical Engineering & Biotechnology, Sunmoon University, Asan 31460, Korea

Correspondence to: Department of Pharmaceutical Engineering & Biotechnology, Sunmoon University, Asan 31460, Korea Tel.: +82-41-530-2390, Fax: +82-41-530-2939 E-mail: sykim01@sunmoon.ac.kr

© 2021 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering

Abstract

Biorenovation is a microbial enzyme-based structural modification of component compounds in natural products and synthetic compounds including plant crude-extracts with the potential benefits of reduced cytotoxicities and improved biological activities compared with its reaction substrates. In this study, we examined the whitening effect of Ligustrum japonicum (LJ) and LJ biorenovation extract (LJBR) in α-MSH-stimulated B16F10 melanoma cells. In the non-toxic concentrations of 25, 50, and 100 μg/ml, the inhibitory effect of LJ and LJBR on melanin synthesis and tyrosinase activity was observed. LJBR exhibited a stronger inhibitory effect on melanin synthesis and tyrosinase activity relative to its reaction substrate LJ. In addition, the protein expression level of MITF, TRP-1, TRP-2, and tyrosinase, which are known to play a critical role in melanin synthesis, was measured. As expected, a greater inhibitory effect on melanogenesis was observed in LJBR than in untreated group. These findings strongly suggest that biorenovation can assist the generation of a novel skin-lightening material.

Keywords:

Ligustrum japonicum, Biorenovation, tyrosinase, B16F10 melanoma cell, melanin

1. INTRODUCTION

멜라닌은 다양한 형태 및 과정으로 피부에 흡수되어 피부 기저층에 존재하며, 자외선 및 외부 손상으로부터 피부를 보호하는 역할을 한다 [1]. 특히 자외선은 피부 면역계의 구성 요소를 활성화하여 염증 매개체를 방출하는 각질형성 세포(keratinocyte) 및 기타 세포의 직접 활성화 등 많은 기전을 통해 염증 반응을 유발할 수 있다 [2,3]. 자외선으로 유도된 DNA 손상은 p53이 POMC (pro-opiomelanocortin) 유전자의 프로모터에 대한 결합을 활성화하여 α-MSH (melanocyte-stimulating hormones)를 생성하며, 생성된 α-MSH는 멜라닌 세포로 신호를 보내는 역할을 하는 MC1R (melanocortin 1receptor)와 결합하여 cAMP (cyclic adenosine monophosphosphate)생산을 자극하고, 증가된 cAMP는 PKA (protein kinase A)를 활성화하여 cAMP 반응 요소인 CREB (cAMP response element-binding protein) 단백질을 인산화한다 [4]. CREB는 MITF (microphthalmia-associated transcription factor)의 발현을 포함하여 다양한 유전자의 발현을 조절하는 전사 인자이다. MITF는 멜라닌 생성 효소인 TRP (tyrosinase-related protein)-1, 2, 및 tyrosinase의 발현을 조절한다 [5-9]. 그 중 tyrosinase 효소로부터 시작되는 멜라닌 생성은 tyrosinase 효소가 DOPA (3, 4-dihydroxy phenylalanine)를 거쳐 DOPA-quinone으로 변환되며, 이것이 효소반응과 자동 산화 반응으로 DOPA-chrome을 거쳐 멜라닌이 형성된다 [10-12]. 이러한 멜라닌 합성 과정을 억제하는 연구들이 진행되어 미백 효능으로 잘 알려진 arbutin, kojic acid, hydroquinone 등이 미백용 화장품 원료로 사용되고 있지만, 피부에 대한 안전성, 부작용의 원인으로 천연물 개발에 대한 필요성이 끊임없이 제기되고 있다 [13-15].

광나무는 물푸레나무과 쥐똥나무에 속하는 식물로서, 전남, 경남의 해안, 제주, 섬지방, 일본과 대만 등지에서 분포하는 상록활엽교목으로, 정목 또는 여정목이라고도 부르며, 열매를 여정실이라고 한다 [16]. 또한, 잎에는 syringin, 과피와 과육에 ursolic acid, oleanolic acid, acetyloeanolic acid 등의 성분이 함유되어 있다고 알려져 있다. 광나무 잎은 성질이 평하고 독이 없으며, 시력을 좋게 하고 통증완화, 구내염, 치주염, 급성세균성 이질, 악성종양, 화상 등에 효과가 있다고 보고되어 있다 [17-18]. 그러나 광나무의 미백 효과에 대한 연구는 아직 알려지지 않았다.

이에 본 연구에서는 광나무의 미백 소재로서 활성을 확인하기 위해 biorenovation 기법을 적용하였다. Biorenovation 생물전환 기법은 미생물이 가지고 있는 효소적 기능을 이용하여 소재의 독성을 줄이거나 생리활성을 증가 시키는 기술이다 [19-20]. Biorenovation 생물 전환 기법에 Bacillus amyloliquefaciens (KCTC 43033)균을 이용하여 광나무 추출물을 생물 전환하였고 B16F10 melanoma 세포를 이용하여 세포 생존율, melanin 합성 저해, tyrosinase 활성 저해, 멜라닌 합성에 관여하는 TRP-1, TRP-2, MITF, tyrosinase의 단백질 발현량을 확인하여 생물 전환된 광나무 추출물이 가지는 멜라닌 생성 저해 활성을 미백 화장품 소재에 적용하고자 한다.


2. MATERIALS AND METHODS

2.1 재료 및 추출

본 연구에 사용된 광나무 (Ligustrum japonicum)는 2018년도 제주특별자치도 제주시 한림읍에서 채취한 원물을 제주자원식물연구소에서 제공받아 실험을 진행하였다. 건조된 광나무 원물 300 g을 분쇄한 후 70% Ethanol 1 L를 첨가하여 60oC에서 3시간 동안 가열하였다. 이후 3회에 걸쳐 추출을 진행하였다. 추출된 추출액을 filter paper로 여과하였고, 여과 후 얻은 추출액을 감압 농축한 뒤, −110oC에서 동결건조하여 본 실험의 시료로 사용하였다.

2.2. 실험재료 및 세포배양

본 실험에서 사용된 α-멜라닌세포 자극 호르몬 (α-MSH, α-melanocyte-stimulating hormone)과 L-3,4-dihydroxyphenylalanin (L-DOPA)는 Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. B16F10 melanoma 세포는 ATCC사(American Type Cell Culture, USA)에서 분양을 받았으며 10% Fetal Bovine Serum (FBS, Gibco BRL Co., Grand Island, NY, USA), 1% penicillin/streptomycin을 함유한 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, Gibco BRL Co. Grand Island, NY, USA) 배지를 사용하여 37oC, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였으며 3일에 한 번씩 계대배양을 하였다.

2.3. 미생물 배양 및 Biorenovation 반응

미생물센터에서 분양받은 Bacillus amyloliquefaciens(BA, KCTC 43033) 균주를 이용하여 biorenovation 반응에 사용하였으며, 균주의 증식에 필요한 Nutrient Broth (Beef extract3.0 g/L, Peptone 5.0 g/L) 배지를 이용하여 배양하였다. 이 균주를 30oC, 200 rpm에서 18시간 동안 배양 후 5,000 rpm에서 15분 동안 원심 분리하여 얻어진 pellet을 PG buffer (50 mM Phosphate buffer, 2% Glycerin)로 2회 세척하였다. Pellet에 100 ml PG buffer를 현탁하여 BA를 대조군으로 설정하였고 여기에 광나무 추출물 (LJ) 100mg을 첨가한 것을 30oC, 200 rpm에서 72시간 반응시켜 생물전환 하였다 (LJBR). 이후 원심분리를 통해 상등액을 감압 농축하였고 –110oC에서 동결건조하여 사용하였다.

2.4. Biorenovation 전환물의 HPLC 분석

Shimadzu SpectroMonitor 3200 digital UV/Vis detector (Phenomenex 4 μm Hydro-RP 80 Å, 250 × 4.6 mm)를 이용하여 시료의 HPLC 비교 분석을 진행하였으며, 정제수 (0.1% TFA (Trifluoroacetic acid))와 Acetonitrile를 이동상으로 사용하였다. 이동상의 조성은 A : H2O 99.9 : TFA (Trifluoroacetic acid) 0.1, B: Acetonitrile이며 A: 90%, B: 10%로 시작하여 30min에 A: 0%, B: 100%의 조건으로 분석하였다. 또한 최대 흡수 파장인 UV 254 nm, Ethanol에 녹인 시료 10 μl, 용매의 유속 1.0 mL/min, column 온도 40oC, Gradient 조건으로 분석하였다.

2.5. 세포 생존율 측정

B16F10 melanoma 세포에 대한 광나무 추출물 (LJ)과 생물 전환된 광나무 추출물 (LJBR), biorenovation에 사용된 균주인 B. amyloliquefaciens 추출물 (BA)의 세포 독성은 MTT assay를 통해 측정하였다. B16F10 melanoma 세포를 24 well plate에 1.0 × 104 cells/well로 분주하여 37oC, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 배양한 후 α-MSH (200 nM)와 각 시료를 25, 50, 100 μg/mL의 농도로 처리하여 72시간 배양하였다. 이후 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium-bromide, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 용액을 첨가하여 37oC, 5% CO2 인큐베이터에서 4시간 동안 반응시킨 후 상등액을 제거하고 형성된 pellet을 DMSO (dimethyl sulfoxide)를 첨가하여 용해시킨 후 96 well plate에 담아 570 nm 파장에서 spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finland)를 이용하여 흡광도를 측정하였다.

2.6. B16F10 melanoma 세포의 Melanin contents 측정

LJ와 LJBR의 멜라닌 합성 억제 효능을 확인하기 위해 B16F10 melanoma 세포를 6 well plate에 4.0 × 104 cells/well로 분주하여 37oC, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 배양하였고, α-MSH (200 nM)와 LJ와 LJBR을 세포 독성이 없는 농도로 함께 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 이후 PBS (phosphate buffered saline, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)로 세포를 세척하고 trypsin-EDTA (Gibco, Grand Island, NY, USA)를 처리하여 세포를 회수하여 1%의 protease inhibitor (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)가 함유된 RIPA buffer (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 넣어 세포를 lysis한 후 13,000 rpm에서 40분간 원심 분리하여 pellet과 상등액을 분리하였다. 분리한 pellet에 1 N NaOH (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 넣어 90oC에 1시간 동안 가열 후 spectrophotometer를 이용하여 405 nm 파장으로 흡광도를 측정하였다.

2.7. B16F10 melanoma 세포의 Tyrosinase activity 측정

Tyrosinase는 멜라닌 합성에서 가장 중요한 역할을 하는 효소로 melanosome에서 tyrosine을 산화시켜 L-DOPA로 전환하며, 전환된 L-DOPA를 DOPA quinone으로 전환하는 일련의 과정에서 촉매작용을 통해 멜라닌 합성에 관여하게 된다 [22]. 이 tyrosinase의 활성을 측정하기 위해 B16F10 melanoma 세포를 6 well plate에 4.0 × 104 cells/well로 분주하여 37oC, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 배양하였고, α-MSH (200 nM)와 시료를 농도별 (25, 50, 100 μg/mL)로 함께 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 이후 trypsin-EDTA를 3분간 처리하여 세포를 회수하고 RIPA buffer (1% protease inhibitor)를 넣어 lysis 한 후 13,000 rpm에서 40분간 원심 분리하여 pellet과 상등액을 분리하였다. 분리한 상등액은 BCA protein assay kit (Thermo Scientific, USA)를 이용하여 정량하였고, 0.1 M sodiumphosphate buffer (Samchum Chemical Co., Seoul, Korea)와 L-DOPA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 2 mg/mL로 만들어, 정량한 단백질과 함께 96 well plate에 첨가하여 2시간 동안 37oC에서 반응시켰다. 반응 후 spectrophotometer를 이용하여 490 nm에서 tyrosinase 활성도를 측정하였다.

2.8. Western Blot analysis

멜라닌 합성의 중요한 단백질인 MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase의 발현량을 측정하기 위해 B16F10 melanoma 세포를 6 well plate에 4.0 × 104 cells/well로 분주하여 37oC, 5% CO2 인큐베이터에서 48시간 배양한 후 α-MSH (200 nM)와 LJ와 LJBR을 농도별 (25, 50, 100 μg/mL)로 함께 처리하여 48시간 동안 배양하였다. 이후 배양된 세포를 PBS를 이용해 세척하고 RIPA buffer (1% protease inhibitor)를 첨가하여 lysis한 후, 13,000 rpm에서 40분간 원심 분리하여 pellet과 상등액을 분리하였다. 분리한 상등액은 BCA protein assay kit를 이용하여 정량하였고, 정량한 상등액을 10% SDS-PAGE에 전기영동한 후 poly-vinylidene difluoride (PVDF) membrane (Milipore, Burlington, MA, USA)으로 단백질을 전이시켰다. 그 후 0.05% Tween 20/Tris-buffered saline (0.05% T/ TBS)에 5% skim milk를 포함한 용액을 membrane에 넣어 상온에서 2시간 동안 blocking 한 후, 1차 antibody인 MITF (1 : 500, Santa cruz Biotechnology, USA), TRP-1, TRP-2, tyrosinase (1: 1,000, Santa cruz Biotechnology, USA)를 사용하여 저온(4oC)에서 18시간 반응시켰고, 0.05% T/TBS로 10분간 4회 세척 후 Horseradish peroxidase (HRP)가 결합된 2차 andtibody인 anti-mouse IgG (Cell signaling, USA)을 0.05% T/TBS와 1 : 10,000으로 희석하여 상온에서 2시간 동안 부착시킨 뒤 0.05% T/TBS로 4회 세척하였다. 단백질은 Enhanced chemiluminescence kit (Bio-rad, USA)를 사용하여 Imaging densitometer (model GS-700, Bio-rad, USA)를 통해 결과를측정하였다. 또한, MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase 단백질 발현량을 imageJ program (NIH, Bethesda, MD, USA)을 이용하여 면적을 수치화한 뒤 그래프로 나타내었다.

2.9. 통계처리

모든 결과값은 3번의 독립적인 실험을 통해 평균과 표준편차로 나타내었고, 대조군과 실험군 사이의 통계학적 유의성 검정은 t-test를 사용하면서 ANOVA 검정을 적용하였으며, 유의성 검정은 *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 수준에서 실시하였다.


3. RESULTS AND DISCUSSION

3.1. Biorenovation 전환물의 HPLC 분석

Biorenovation 기법을 이용하여 천연물을 생물 전환한 최근연구 (Park et al. 2020)에서 Colocasia esculenta (토란 뿌리추출물)을 Biorenovation 기법으로 생물 전환한 후 신규 피크 생성 및 기존 추출물보다 우수한 항염활성이 보고되었다 [23]. 본 연구에서도 B. amyloliquefaciens (KCTC 43033) 균주를 이용하여 LJ를 biorenovation 기법으로 전환하고 HPLC로 분석한 결과 LJBR 14-17.5min에서 LJ에 존재하지 않는 신규 peak 생성이 확인되었다 (Fig. 1). 이는 LJ에 존재하는 미지의 화합물이 미생물과의 대사작용을 통해 새로운 화합물로 전환되었을 가능성을 시사한다.

Fig. 1.

HPLC Chromatogram of Ligustrum japonicum extract (LJ), Ligustrum japonicum Biorenovate Extract (LJBR) andBacillus amyloliquefaciens (BA). The chromatogram of (a) showed Ligustrum japonicum Extract (LJ). The chromatogram of (b)showed Ligustrum japonicum Biorenovate Extract (LJBR). The chromatogram of (c) showed Bacillus amyloliquefaciens (BA).

3.2. 세포 생존율 비교 측정

BA, LJ, LJBR이 B16F10 melanoma cell 생존률에 미치는 영향을 알아보기 위하여 MTT 분석법을 이용하여 세포 독성을 측정하였다. Biorenovation 생물 전환 기법에 사용된 BA 및 LJ와 LJBR을 25, 50, 100 μg/mL 농도로 처리한 결과 측정 농도에서 BA, LJ, LJBR 모두 약 98% 이상의 세포 생존율을 보였다 (Fig. 2). 따라서 세포 독성을 보이지 않는 25, 50, 100 μg/mL의 농도로 추후 실험을 진행하였다.

Fig. 2.

Effects of LJ, LJBR and BA on the cell viability in B16F10 melanoma cell by the MTT assay. The cytotoxicity was assayed of cells stimulated with α-MSH (200 nM) in the presence of sample (25, 50, and 100 μg/mL) for 72 h. Result is expressed as percentages compared to the respective values obtained for the control.

3.3 Melanin 합성 저해 비교

멜라닌은 세포 내 소기관인 리보솜에서 tyrosinase에 의해 생성되는 흑갈색 고분자로 단계적 효소반응에 의해 형성되는 최종산물로 알려져있다 [24]. LJ와 LJBR 처리 시 멜라닌 생성에 미치는 영향을 확인한 결과 α-MSH 단독 처리 군과 비교하여 LJ 처리군은 약 18%, 18%, 19%로 미미한 멜라닌 합성 저해를 보인 반면 LJBR 처리군은 21%, 25%, 29%의 멜라닌 합성 저해를 나타내었다 (Fig. 3). 이 결과는 biorenovation 기법으로 생물 전환된 LJBR이 기존의 LJ 보다 멜라닌 합성에 대한 우수한 저해 효과를 갖는다는 것을 나타낸다.

Fig. 3.

Effects of LJ and LJBR on cellular melanin synthesis in B16F10 melanoma cells. Cells were treated with 200 nM α-MSH in presence or absence of sample at the indicated concentrations for 72 h. Melanin content was measured by absorbance at 405 nm. Data represent the means ± SD with four separate experiments. **p < 0.01

3.4. Tyrosinase 억제 활성 비교

Tyrosinase은 멜라닌 색소를 형성하는 효소로 tyrosine이 DOPA를 거쳐 DOPA-quinone으로 전환되는 단계적 반응에 작용함으로써 멜라닌 합성에 관여한다고 보고된다 [25-26]. LJ와 LJBR이 멜라닌 합성 초기단계에 작용하는 Tyrosinase에 미치는 영향을 확인한 결과 α-MSH(200 nM) 단독 처리군과 비교하여 LJ 처리군은 최고농도인 100 μg/mL에서 tyrosinase 활성이 22% 억제된 반면 LJBR 처리군에서는 25, 50, 100 μg/mL 농도에서 14%, 49%, 58% 활성 억제를 보였다(Fig. 4). 이 결과는 생물 전환 후 tyrosinase 효소에 직간접적으로 관여하는 화합물이 생성되어 tyrosinase 효소를 억제했을 가능성을 보여준다.

Fig. 4.

Effects of LJ and LJBR on tyrosinase activity in B16F10 melanoma cells. Cells were treated with 200 nM α-MSH in presence or absence of sample at the indicated concentrations for 72 h. Tyrosinase activity was measured by absorbance at 490 nm. Data represent the means ± SD with four separate experiments. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001.

3.5. 멜라닌 합성 관련인자들의 발현 억제 비교

B16F10 melanoma 세포에 α-MSH를 처리 시 cAMP 신호가 증폭되어 MITF의 발현을 유도하고 MITF는 TRP-1, 2와 tyrosinase의 발현을 자극하여 세포의 멜라닌 생성을 조절하는 것으로 알려져있다 [27-28]. α-MSH의 의해 자극된 세포에 LJ와 LJBR 처리 시 멜라닌 합성에 관여하는지 알아보기 위해 western blot를 진행하였다. 실험 결과 LJ 처리 시 멜라닌 합성 관련 인자인 TRP-1, TRP-2, MITF 및 tyrosinase의 발현은 농도 의존적인 저해 활성을 보이지 않았다. 반면에 LJBR 처리군은 LJ처리군 보다 우수하고 농도 의존적인 미백활성을 나타내었으며 특히 TRP-1 과 tyrosinase 발현은 LJBR 100 μg/mL 농도에서 각각 89%, 90% 감소하여 무처리군 보다도 우수한 미백 활성을 나타내었다 (Fig. 5). 이는 LJ가 천연소재인 특성상 소재 내 여러 성분이 다발적으로 작용하여 관련 인자들의 발현이 일관되게 나타나지 않은 것으로 판단되며 LJBR은 biorenovation 과정에서 특정 화합물의 구조가 변화되어 특이적으로 작용되었기에 보다 우수한 미백활성을 나타낸 것으로 사료된다.

Fig. 5.

Effect of LJ and LJBR on the protein levels of TRP-1, TRP-2, MITF, and Tyrosinase in B16F10 melanoma cells. Protein expression levels of (a) TRP-1, (b) TRP-2, (c) MITF, (d) tyrosinase in α-MSH simulated B16F10 melanoma cells. B16F10 melanoma Cells (4.0 × 104 cells/well) were stimulated with α-MSH (200 nM) in the presence of LJ and LJBR (25, 50, 100 μg/ml) for 48 h. We use 10% SDS- PAGE gel and expressions of TRP-1, TRP-2, MITF, tyrosinase and β-actin were determined by western blotting. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001.


4. CONCLUSION

본 연구에서는 α-MSH로 자극된 B16F10 melanoma 세포에 대하여 광나무 추출물 (LJ)과 biorenovation 기법을 이용하여 생물전환한 추출물 (LJBR)의 미백 활성을 조사하였다. 세포독성을 보이지 않는 농도 내에서 LJ 처리군에 비해 LJBR 처리군이 멜라닌 합성과 그 관여인자 발현에 대하여 농도 의존적이고 보다 우수한 저해 활성을 나타내었으며 특히 100 μg/mL 농도에서 TRP-1과 tyrosinase 발현은 무 처리군과 유사한 수준으로 감소하였다. 따라서 biorenovation 기법을 이용한 생물 전환 과정에서 멜라닌 합성 및 관련인자 발현에 직간접적으로 관여하는 새로운 화합물이 생성됨으로써 생물 전환된 추출물(LJBR)이 기존 추출물 (LJ) 보다 우수한 미백 활성을 갖는다는 것을 확인하였다. 이 결과는 biorenovation 기법을 이용한 생물전환이 천연물의 생리활성 증대를 유도할 수있음을 시사한다. 본 연구에서는 식물 유래의 새로운 미백 소재 확인을 통해서 미백 효능을 가진 고부가가치 화장품 소재로의 활용 가능성을 제시하며 LJBR이 함유하고 있는 미백 효능을 가진 유효성분 분석에 관한 연구가 추후 수행되어야 할 것으로 사료된다.

Acknowledgments

본 연구는 산업통상자원부와 한국산업기술진흥원이 지원하 는 광역협력권산업육성사업으로 수행된 연구결과입니다(P0004692).

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Fig. 1.

Fig. 1.
HPLC Chromatogram of Ligustrum japonicum extract (LJ), Ligustrum japonicum Biorenovate Extract (LJBR) andBacillus amyloliquefaciens (BA). The chromatogram of (a) showed Ligustrum japonicum Extract (LJ). The chromatogram of (b)showed Ligustrum japonicum Biorenovate Extract (LJBR). The chromatogram of (c) showed Bacillus amyloliquefaciens (BA).

Fig. 2.

Fig. 2.
Effects of LJ, LJBR and BA on the cell viability in B16F10 melanoma cell by the MTT assay. The cytotoxicity was assayed of cells stimulated with α-MSH (200 nM) in the presence of sample (25, 50, and 100 μg/mL) for 72 h. Result is expressed as percentages compared to the respective values obtained for the control.

Fig. 3.

Fig. 3.
Effects of LJ and LJBR on cellular melanin synthesis in B16F10 melanoma cells. Cells were treated with 200 nM α-MSH in presence or absence of sample at the indicated concentrations for 72 h. Melanin content was measured by absorbance at 405 nm. Data represent the means ± SD with four separate experiments. **p < 0.01

Fig. 4.

Fig. 4.
Effects of LJ and LJBR on tyrosinase activity in B16F10 melanoma cells. Cells were treated with 200 nM α-MSH in presence or absence of sample at the indicated concentrations for 72 h. Tyrosinase activity was measured by absorbance at 490 nm. Data represent the means ± SD with four separate experiments. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001.

Fig. 5.

Fig. 5.
Effect of LJ and LJBR on the protein levels of TRP-1, TRP-2, MITF, and Tyrosinase in B16F10 melanoma cells. Protein expression levels of (a) TRP-1, (b) TRP-2, (c) MITF, (d) tyrosinase in α-MSH simulated B16F10 melanoma cells. B16F10 melanoma Cells (4.0 × 104 cells/well) were stimulated with α-MSH (200 nM) in the presence of LJ and LJBR (25, 50, 100 μg/ml) for 48 h. We use 10% SDS- PAGE gel and expressions of TRP-1, TRP-2, MITF, tyrosinase and β-actin were determined by western blotting. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001.