The Korean Society For Biotechnology And Bioengineering
[ Research Paper ]
Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 36, No. 1, pp.49-59
ISSN: 1225-7117 (Print) 2288-8268 (Online)
Print publication date 31 Mar 2021
Received 12 Nov 2020 Revised 04 Jan 2021 Accepted 06 Jan 2021
DOI: https://doi.org/10.7841/ksbbj.2021.36.1.49

CHO 세포 배양에서 UDP-N-acetylglucosamine의 합성 증진을 통한 albumin-erythropoietin의 시알산 증대

한혜진 ; 이지희 ; 차현명 ; 임진혁 ; 김동일*
인하대학교 공과대학 생물공학과
Enhanced Sialylation of Albumin-erythropoietin through Increased Synthesis of UDP-N-acetylglucosamine in CHO Cell Cultures
Hye-Jin Han ; Ji-Hee Lee ; Hyun-Myoung Cha ; Jin-Hyuk Lim ; Dong-Il Kim*
Department of Biological Engineering, Inha University, Incheon 22212, Korea

Correspondence to: Department of Biological Engineering, Inha University, Incheon 22212, Korea Tel: +82-32-860-7515, Fax: +82-32-872-4046 E-mail: kimdi@inha.ac.kr Contributed by footnote: These two authors contributed equally.


© 2021 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering

Abstract

Sialylation is a major factor to determine half-life of glycoproteins and sialic acid content of glycoprotein was effectively increased by supplementation of nucleotide sugar precursors during cell cultures. So it is necessary to investigate the effect on glycan may be different when two or more precursors are fed in combination. Albumin-erythropoietin (Alb-EPO) can form a tetra-antennary structure and up to 14 sialic acids can be attached depending on the antennary structure of glycan. It is possible to increase the sialic acid contents of Alb-EPO by promoting the formation of the antennary structure of glycans. In this study, uridine and N-acetylglucosamine (GlcNAc) were added to Chinese hamster ovary (CHO) cell cultures to enhance the synthesis of uridine diphosphate N-acetylglucosamine (UDP-GlcNAc). Also, manganese ion, which is a cofactor of glycosyltransferases or UDP-GlcNAc biosynthesis, was added in the form of MnCl2. By optimizing the feeding concentrations of uridine and GlcNAc with response surface methodology based on central composite design to reduce the negative impact on cell growth and productivity. Cell growth was observed similar and then productivity and sialic acid content of Alb-EPO were enhanced 1.21-fold and 1.69-fold higher than that of the control, respectively. These results suggest that the combined feeding of uridine, GlcNAc, and MnCl2 is an effective strategy to enhance the sialic acid content of glycoproteins in CHO cell cultures.

Keywords:

CHO cell culture, albumin-erythropoietin, sialylation, nucleotide sugar precursor, UDP-GlcNAc, MnCl2

1. INTRODUCTION

Chinese hamster ovary (CHO) 세포는 인간과 유사한 구조의 글리칸이 부가된 당단백질을 생산할 수 있어 단클론항체, erythropoietin (EPO) 등의 재조합단백질을 생산하는데 널리 사용되고 있다 [1,2]. 이 중 EPO는 주로 빈혈치료제로 사용되는 당단백질로, 전체 분자량의 약 40%를 글리칸이 차지하여 글리칸 구조가 변형되거나 제거되면 in vitro 또는 in vivo에서 EPO의 약동학적 특성이나 체내 반감기가 달라진다 [2-5]. 글리칸 말단의 시알산은 체내 반감기, 단백질의 활성, 효능 등에 영향을 주며, EPO의 경우 글리칸의 안테나 구조에 따라 시알산이 최대 14개까지 부가될 수 있다 [3-7]. 당단백질 말단의 시알산 부가는 galactose 잔기의 노출을 막아주어 간에 있는 asialoglycoprotein receptor와 당단백질이 결합하여 분해되는 것을 방지하고 재조합단백질의 체내 반감기를 증진시킨다 [8]. 특히 EPO는 체내 반감기가 4-13시간 정도로 짧아 EPO의 시알산 함량을 높이는 것은 EPO의 짧은 반감기 개선과 단백질 활성에 중요하다 [4,6,7,9,10]. 따라서, 글리칸 제어를 위해 glycosylation 관련 효소의 활성을 조절하거나glycosylation site의 수를 증가시키는 방법 등이 연구되었으며 글리칸 생합성에 영향을 주는 배지첨가물이 보고되었다 [9,11]. 특히 cytidine monophosphate N-acetylneuraminic acid (CMP-sialic acid), uridine diphosphate N-acetylglucosamine (UDP-GlcNAc), uridine diphosphate galactose (UDP-Gal) 등의 nucleotide sugar는 glycosyl donor로 사용되므로 글리칸 구조 형성을 촉진하기 위해 충분한 양의 nucleotide sugar가 필요하다 [12]. 따라서 nucleotide sugar의 전구체인 uridine, cytidine, glucosamine (GlcN), N-acetylmannosamine (ManNAc), N-acetylneuraminic acid 등을 배지에 첨가하여 세포 내 nucleotide sugar의 합성을 증가시킬 수 있다 [13-15] 또한 nucleotide sugar 생합성 및 glycosyltransferase의 cofactor로 사용되는 Mn2+과 Mg2+ 등을 배지에 첨가함으로써 시알산 함량을 조절할 수 있다 (Fig. 1) [11,13-16]. 하지만 세포주, 생산 단백질 및 첨가하는 nucleotide sugar precursor의 종류에 따라 상이한 결과가 나타나므로 이에 대한 추가적인 연구가 필요하다 [14,17]. 특히 EPO의 N-글리칸은 tri-또는 tetra-antennary 구조를 형성할 수 있어 배지에 nucleotide sugar precursor 첨가를 통해 글리칸의 안테나 구조 확장 및 시알산 함량을 극대화할 수 있다 [18,19].

Fig. 1.

Primary metabolic interconversions implicated in nucleotide-sugar biosynthesis and transport pathway in mammalian cells [11, 13-16]. (UTP, Uridine triphosphate; GlcN, Glucosamine; GlcNAc, N-acetyl glucosamine; GlcNAc-6P, GlcNAc 6-phosphate; GlcNAc-1P, GlcNAc 1-phosphate; UDP-GlcNAc, Uridine diphosphate-GlcNAc; Glc, Glucose; Glc-1P, Glc 1-phosphate; UDP-Glc, Uridine diphosphate-Glc; GlcN-6P, GlcN 6-phosphate; Gal, Galactose; UDP-Gal, Uridine diphosphate-Gal; ManNAc, N-acetyl mannosamine; ManNAc-6P, ManNAc 6-phosphate; Neu5Ac-9P, N-acetyl neuraminic acid 9-phosphate; Neu5Ac, N-acetylneuraminic acid; CMP-Neu5Ac, Cytidine-5'-monophospho-Neu5Ac; CMAS, CMP-Neu5Ac synthetase; GnTs, N-acetylglucosaminyltransferase; GT, Galactosyltransferase; ST, Sialyltransferase)

본 연구에서는 albumin-erythropoietin (Alb-EPO)을 생산하는 CHO 세포 배양에서 uridine, GlcNAc과 Mn2+을 함께 첨가하여 UDP-GlcNAc 합성 및 글리칸 안테나 구조 증가를 통해 Alb-EPO의 시알산 함량을 증대시키고자 하였다. 중심합성 설계 (central composite design; CCD)를 기반으로 반응표면 분석 (response surface methodology)을 이용하여 uridine과 GlcNAc의 첨가 농도 최적화하여 첨가물이 세포 성장 및 단백질 생산성에 미치는 부정적인 영향은 최소화하면서도 시 알산 함량은 최대화하고자 하였다.


2. MATERIALS AND METHODS

2.1. 세포 배양

본 연구에서는 Alb-EPO를 생산하는 형질전환된 CHO 세포주를 사용하였다 [20]. 세포 배양은 ProCHO5 (12-766Q, Lonza, Verviers, Belgium) 배지에서 4 mM의 L-glutamine (G7513-100 mL, Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA)을 첨가하여 20 mL의 working volume으로 진행하였다. 125-mL Erlenmeyer flask (CC-431143, Corning Glass Works, Corning, NY, USA)에 3×105 cells/mL로 접종하였으며, 37oC, 5% CO2를 공급하는 humidified CO2 incubator (Sanyo, Osaka, Japan)에서 100 rpm을 유지하였다.

2.2. Nucleotide sugar precursor 첨가

Nucleotide sugar precursor로 uridine (U3003, Sigma-Aldrich)과 GlcNAc (A3286, Sigma-Aldrich)을 사용하며 nucleotide sugar 합성과 glycosylation 과정의 cofactor인 Mn2+를 MnCl2 (M5005, Sigma-Aldrich)의 형태로 세포 배양에 이용하였다. Uridine은 2-10 mM, GlcNAc은 5-15 mM의 범위로, MnCl2는 2 μM의 농도로 첨가하였다. 실험군은 Minitab (Minitab LLC, State College, PA, USA) 프로그램을 이용하여 CCD로 설계하였다 (Table 1).

CCD matrix of 2 independent variables

2.3. Nucleotide sugar precursor의 농도 최적화를 위한 중심합성설계

CHO 세포 성장, Alb-EPO의 생산성 및 시알산 함량을 바탕으로 uridine 및 GlcNAc의 최적 첨가 농도를 결정하기 위하여 uridine은 2-10 mM, GlcNAc은 5-15 mM 농도로, 중심점은 2개로 설정하였다. Minitab (Minitab LLC) 을 이용하여 중심합성설계를 이용하여 실험을 설계하고, 설계된 조건에 따라 배양을 진행하였다 (Table 2).

Experimental data on CHO cell culture according to CCD matrix

2.4. 세포수 및 생존도 측정

배양 중 CHO 세포를 trypan blue (15250-061, Thermo scientific, Waltham, MA, USA)로 염색하고 hemocytometer (Marienfeld Superior, Lauda-Königshofen, Germany)를 이용하여 세포 수를 측정하였다. Integral viable cell density (IVCD)는 다음과 같이 계산하였다. 이 때, VCD는 viable cell density (cells/mL), t는 time (day)를 의미한다.

IVCDcells·day/mL=(VCD + VCD)2×t2-t1

2.5. Alb-EPO 정량분석

Alb-EPO 정량분석을 위해 sandwich enzyme-linked immunosorbent assay를 수행하였다. 1, 2차 항체는 각각 goat anti-human albumin antibody (ab19180, Abcam, Cambridge, UK)와 peroxidase-labeled goat anti-human albumin antibody (ab19183, Abcam)를 이용하였다. 표준물질은 human serum albumin(ab205808, Abcam), 기질은 ABTS peroxidase substrate (50-66-18, KPL, Gaithersburg, MD, USA)를 사용였고 Multiskan GO microplate spectrophotometer (Thermo Scientific)로 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.

2.6. Nucleotide sugar 분석

세포 pellet에 MeOH (34860, Sigma-Aldrich), 정제수를 첨가하여 초음파 분쇄한 후 chloroform (650498, Sigma-Aldrich)과 정제수를 각각 첨가하고 원심분리하여 세포 내 nucleotide sugar를 추출하였다. HPLC system (Younglin, Anyang, Korea)와 Inertsil ODS-4 HP column (5020-04046, GL Science, Tokyo, Japan)로 분석하였다. Buffer A (100 mM potassium phosphate (Sigma-Aldrich) buffer + 8mM tetrabutylammonium hydrogensulphate (ion-pair reagent; I0368, TCI Chemical, Tokyo, Japan), pH 6.4)를 100%로 35분, 이후 40분 동안 buffer A를 100%에서 23%로, buffer B (70% buffer A + 30% acetonitrile(ACN; 1012-2304, Daejung Chemicals & Metals Co., Siheung, Korea))를 0%에서 77%로 흘려주고 0.8 mL/min, 40oC로 유지하며 UV detector를 통해 254 nm 파장에서 분석하였다. 표준 물질로는 UDP-GlcNAc (G1514, Sigma-Aldrich), UDP-Gal (U4500, Sigma-Aldrich), CMP-sialic acid (233264, Sigma-Aldrich)를 같은 농도로 혼합하여 사용하였다.

2.7. Alb-EPO의 시알산 함량 분석

배양 6일차에 배양액을 회수한 후 Hitrap Blue HP (17-0412-01, GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) column과 ÄKTA FPLC (GE Healthcare)를 사용하여 affinity chromatography 방법으로 정하였다. 정제된 Alb-EPO을 정량하고 100 mM HCl (320331, Sigma-Aldrich)을 첨가한 후 80oC에서 1시간 동안 반응시켰다. Sialic acid fluorescence labeling kit (4400, Takara, Tokyo, Japan)를 이용하여 분리된 시알산에 1,2-diamino-4,5-methyleneoxybenzene (DMB)으로 형광 표지를 하였다. Zorbax ODS column (883952-702, Agilent, Santa Clara, CA, USA)을 이용하여 40oC, 1 mL/min 유속을 유지하며 HPLC 분석을 수행하였다. Buffer A (9% ACN (Sigma-Aldrich), 7% MeOH (Sigma-Aldrich), 84% 정제수)를 100%로 30분간 흘려준 뒤 buffer A를 100%에서 0%로, buffer B (93% ACN (Sigma-Aldrich), 7% MeOH (Sigma-Aldrich))를 0%에서 100%의 농도 구배로 10분간 흘려주었다. DMB가 표지된 시알산은 fluorescence detector (Agilent, Santa Clara, CA, USA)를 이용하여 excitation/emission = 373 nm/448 nm의 파장에서 검출하였다.

2.8. 통계 처리

모든 실험은 2회 반복을 수행하였으며, 그 결과는 평균 ± 표준편차 (standard deviation, SD)로 나타내었다. Student’s t-test(SigmaPlot for windows version 10.0, Systat Software Inc., San Jose, CA, USA)를 사용하여 대조군과 실험군 사이의 차이에 대해 통계적 유의성을 평가하였다. p < 0.05, < 0.01 및 < 0.001은 각각 *, *****로 표시하였다.


3. RESULTS AND DISCUSSION

3.1. Nucleotide sugar precursor 첨가에 의한 culture performance및 Alb-EPO의 시알산 함량 변화

Uridine과 GlcNAc, MnCl2의 첨가가 CHO 세포 성장에 미치는 영향을 확인하기 위해 중심합성설계로 설계된 실험군의 IVCD를 비교하였다. 2번 (uridine: 2 mM, GlcNAc 5 mM, MnCl2: 2 μM)와 4번 (uridine: 0.34mM, GlcNAc: 10 mM, 2 μM)를 제외한 모든 실험군에서 IVCD는 대조군보다 감소하였다(Fig. 2, Table 2). GlcNAc와 uridine의 첨가 농도가 증가할수록 IVCD는 감소하는 경향을 보였는데, GlcNAc과 uridine의 첨가 농도가 증가함에 따라 UDP-GlcNAc의 합성이 증가하며, 이 과정에서 세포 내에서 에너지로 사용되는 adenosine triphosphate 함량이 감소하여 나타난 결과로 사료된다 [15,18,19,21]. Uridine을 6 mM 이상 첨가하고 GlcNAc을 10 mM 이상 첨가한 5번, 6번, 7번, 9번, 10번 실험군과 uridine을 10 mM, GlcNAc을 5 mM 첨가한 3번 실험군에서 Alb-EPO의 생산성은 감소하였다 (Fig. 3, Table 2). 반면, uridine의 첨가 농도가 낮은 2번 (uridine: 2 mM, GlcNAc: 5 mM, MnCl2: 2 μM), 4번 (uridine: 0.34 mM, GlcNAc: 10mM, MnCl2: 2 μM), 8번 (uridine: 2 mM, GlcNAc: 15 mM, MnCl2: 2 μM) 실험군의 Alb-EPO 생산성은 대조군과 유사하였다 (Fig. 3, Table 2). 하지만 MnCl2의 첨가에 의한 변화는 크게 관찰되지 않았다(Table 2). 시알산 상대정량 결과 uridine과 GlcNAc의 첨가는 대조군 대비 Alb-EPO의 시알산 함량이 증대시켰으나, uridine의 첨가 농도가 높은 경우 시알산 함량이 대조군과 유사하거나 (7번 실험군, uridine: 11.66 mM, GlcNAc: 10 mM) 감소하였다 (3번 실험군, uridine: 10 mM, GlcNAc: 5 mM) (Fig. 4). MnCl2를 함께 첨가하였을 때 시알산 함량이 더욱 증대되는 경향이 나타났으며, 특히 4번 조건 (0.34 mM uridine, 10 mM GlcNAc)에서는 MnCl2의 첨가로 인하여 시알산 함량이 U+G 대조군에 비해 최대 100%, U+G+M 대조군에 비해 76% 증가하였다 (Fig. 4). 이 결과를 통해 세포 내 UDP-GlcNAc의 precursor인 uridine과 GlcNAc의 농도가 높아질수록 Alb-EPO의 시알산 함량이 증가함을 확인하였고, MnCl2가 함께 첨가되었을 때 시알산 함량이 극대화되었다.

Fig. 2.

Effects of supplementing uridine, GlcNAc, and MnCl2 on IVCD. The error bar represents standard deviation (SD) of two independent experiments (n=2). (U, uridine; G, N-acetylglucosamine (GlcNAc); M, MnCl2)

Fig. 3.

Effects of supplementing uridine, GlcNAc, and MnCl2 on Alb-EPO titer. The parameters represent the mean ± standard deviation from two independent experiments (n=2). (U, uridine; G, N-acetylglucosamine (GlcNAc); M, MnCl2)

Fig. 4.

Variation of sialic acid content of Alb-EPO by addition of uridine, GlcNAc, and MnCl2. The sialic acid content of Alb-EPO in each group was normalized to those of control. The error bar represents standard deviation (SD) of two independent experiments (n=2). (U, uridine; G, N-acetylglucosamine (GlcNAc); M, MnCl2)

3.2. 반응표면분석을 통한 첨가 농도 최적화

실험한 결과를 토대로 Minitab 프로그램을 이용하여 반응표면분석을 진행하였다. IVCD와 Alb-EPO 생산성 및 시알산함량을 변수로 지정하여 분석한 결과, 각각의 완전 2차 다항식 모델 (second-order full quadratic model)을 얻을 수 있었다(Table 3). 분산분석 (analysis of variance, ANOVA) 결과 모델의 R2 값이 1에 가깝고 lack of fit의 값이 0.05보다 큰 수치로 확인되어, 주영향 요인이 아닌 것으로 분석되었다 (Table 4, Table 5). 또한, 모델의 Probability > F (Prob > F) 값이 0.05 미만으로, 2차 모델이 통계적으로 유의하고 신뢰도가 높음을 증명하였다 (Table 4, Table 5). Table 4Table 5에 따르면, MnCl2의 첨가 유무에 관계없이 uridine과 GlcNAc 모두가 IVCD와 Alb-EPO 생산성에 대한 주영향 요인 (p < 0.05)이며, Alb-EPO 글리칸의 시알산 함량은 uridine만이 주영향 요인으로 확인되었다.

Second-order polynimial model obtained from experimental data

ANOVA for response surface model under U+G conditions

ANOVA for response surface model under U+G+M conditions

Uridine과 GlcNAc의 상호작용 규명 및 최적 첨가 농도 결정을 위해 U+G 조건과 U+G+M 조건에 대한 3차원 반응 표면 플롯을 사용하였다. 3차원 표면 플롯에서 IVCD와 Alb-EPO의 생산성은 uridine 또는 GlcNAc의 첨가 농도가 증가할수록 감소하였으며 (Fig. 5), 이는 Fig. 2의 결과와 비슷하다. 또한, Alb-EPO의 시알산 함량은 MnCl2의 첨가에 따라 경향성이 크게 변화하였다. 이를 통해 MnCl2가 함께 첨가되었을 때, uridine과 GlcNAc이 저농도로 첨가된 조건에서도 높은 효율로 Alb-EPO의 sialylation이 유도되는 것을 확인하였다. 따라서 U+G 조건과 U+G+M 조건에서 IVCD와 Alb-EPO의 생산성 및 시알산 함량을 최대화를 목표로 설정하여 uridine과 GlcNAc의 첨가 농도를 최적화 및 실험 예측값을 얻었다(Table 6).

Fig. 5.

Response surface plots to determine optimal concentration of uridine and GlcNAc. (U, uridine; G, GlcNAc; M, MnCl2)

Optimum levels of additives and predicted values

3.3. 최적 첨가 농도에서의 세포 성장 및 Alb-EPO의 생산성 변화

반응표면분석을 통해 얻은 최적 농도로 uridine과 GlcNAc을 첨가하고 U+G+M 실험군에는 MnCl2를 추가로 처리하여 세포 배양을 진행하였다. 그 결과, U+G 조건의 VCD는 대조군과 거의 유사하였지만, U+G+M 조건의 peak VCD가 38.3 × 105 cells/mL로, 대조군의 42.7 × 105 cells/mL보다 10% 감소하였다 (Fig. 6(a)). 또한, IVCD는 U+G 조건에서 145.5 × 105 cells·day/mL, U+G+M 조건에서 134.1 × 105 cells·day/mL으로 대조군 대비 각각 4%, 12% 감소하였으나 (Fig. 6(b)), viability는 모든 조건에서 대조군과 유사하였다 (Fig. 6(c)). 따라서 uridine과 GlcNAc 첨가 농도의 최적화를 통해 세포 성장 및 viability에 주는 부정적인 영향을 최소화하였다.

Fig. 6.

Comparison of cell culture performance: (a) VCD, (b) IVCD, (c) viability and (d) Alb-EPO titer within all conditions. The error bar represents standard deviation (SD) of two independent experiments (n=2). (U, uridine; G, N-acetylglucosamine. (GlcNAc); M, MnCl2

배양 8일차에 Alb-EPO 생산량은 U+G 조건에서 39.5 mg/L로 대조군 대비 9% 감소하였으나, U+G+M 조건에서는 52.5 mg/L로 대조군에 비해 21% 증가하였다 (Fig. 6(d)). 이는 MnCl2는 단백질의 생합성에 관련 있는 trace element이기 때문에 Alb-EPO의 생산성이 증가한 것으로 사료된다 [22,23]. 반응표면분석을 통하여 최적화된 농도의 uridine과 GlcNAc이 배양에 첨가되었을 때 세포 성장 및 Alb-EPO의 생산 저해가 완화되었고, MnCl2 첨가로 대조군 대비 생산성이 증가되었다.

3.4. 세포 내 nucleotide sugar pool 변화

세포 배양시 uridine이나 GlcNAc과 같은 nucleotide sugar precursor를 첨가하면 세포 내 nucleotide sugar pool이 증가할 수 있고, 이를 통해 목적 단백질의 글리칸 구조가 변할 수 있다 [15,16]. Complex type 글리칸의 안테나 구조를 형성하는데 이용되는 GlcNAc과 galactose, 시알산의 전구체인 UDP-GlcNAc, UDP-Gal, CMP-sialic acid의 세포 내 pool을 분석하였다. 세포 내 UDP-GlcNAc 농도는 U+G 조건에서 배양 3일차까지 대조군과 비슷하였으나 6일차에는 대조군 대비 388% 만큼 증가하였다. 또한, U+G+M 조건에서 UDP-GlcNAc 함량은 배양 3일차에 대조군에 비해 418%, 6일차에는 519%만큼 증대되었다 (Fig. 7(a)). 이를 통해, uridine과 GlcNAc의 첨가로 인해 세포 내 UDP-GlcNAc의 합성이 증가했으며 배양 3일차에 U+G+M 조건에서 UDP-GlcNAc 함량이 가장 높았던 것으로 보아 MnCl2가 UDP-GlcNAc 합성을 촉진하는 역할을 한 것으로 사료된다. 반면, UDP-Gal 농도는 U+G 조건과 U+G+M 조건에서 모두 대조군과 비슷하였는데 (Fig. 7(b)). 이는 GlcNAc이나 uridine의 경우 세포 내 UDP-Gal 합성과는 관련이 적기 때문인 것으로 보인다 (Fig. 1). 또한, 배양 3일차에 U+G 조건과 U+G+M 조건에서 CMP-sialic acid 함량이 대조군보다 낮았지만 6일차에는 대조군보다 각각 16%, 20% 증가하였다 (Fig. 7(c)). 이는 세포 내에서합성된 UDP-GlcNAc의 함량이 증가하고 UDP-GlcNAc 2-epimerase의 반응에 의해 CMP-sialic acid의 전구체인 ManNAc으로 전환될 수 있기 때문인 것으로 사료된다 [24-26]. 따라서 uridine과 GlcNAc, MnCl2를 함께 처리하는 것은 CHO 세포 내 UDP-GlcNAc과 CMP-sialic acid의 pool을 증대하여 결과적으로 Alb-EPO의 글리칸에 영향을 주었다.

Fig. 7.

The content of (a) UDP-GlcNAc, (b) UDP-Gal and (c) CMP-sialic acid on day 3 and day 6 in the condition of U+G and U+G+M according to the feeding uridine, GlcNAc, and MnCl2. The error bar represents standard deviation (SD) of two independent experiments. (n=2). (U, uridine; G, N-acetylglucosamine (GlcNAc); M, MnCl2)

3.5. 최적 첨가 농도에서의 Alb-EPO의 시알산 함량 변화

시알산 상대정량을 통해 uridine과 GlcNAc, MnCl2의 첨가를 통한 세포 내 nucleotide sugar pool의 변화가 Alb-EPO의 시 알산 함량에 미치는 영향을 확인하였다. 그 결과, Alb-EPO의 시알산 함량이 U+G 조건에서 대조군에 비해 48%, U+G+M 조건에서는 69%만큼 증가하였다 (Fig. 8). Uridine과 GlcNAc의 첨가로 세포 내 UDP-GlcNAc의 합성이 증가하였다. 또한 UDP-GlcNAc 합성을 촉진하고 glycosyltransferase의 cofactor로 작용하는 manganese 함께 첨가하여 글리칸의 안테나 구조 형성을 촉진시켜 시알산이 부가될 수 있는 자리를 증진시킨 것으로 생각할 수 있다 (Fig. 1, Fig. 7, Fig. 8) [21,27,28]. 이와 함께 증가된 UDP-GlcNAc pool로 인해 세포 내 ManNAc 합성이 증가하며 결과적으로 시알산 생합성에 필요한 nucleotide sugar인 CMP-sialic acid pool이 증가하여 시 알산 형성을 극대화하였다 (Fig. 1, Fig. 7, Fig. 8). Wong 등의 연구에 따르면, CHO 세포배양 중 galactose, GlcN, ManNAc등의 nucleotide sugar precursor를 배지에 첨가할 경우 세포내 nucleotide sugar pool이 증가하지만 IFN-γ의 시알산 증가에는 시너지 효과는 없었으며, glycosyltransferase 또는 다른 글리칸 기질의 부족으로 시알산을 증진시키는데 제한이 있음을 확인하였다 [29]. 또한 Ehret 등의 연구에 따르면 GlcNAc에 galactose를 전달하는 β-1,4-galactosyltransferase의 조효소인 manganese와 uridine, galactose를 혼합하여 첨가하였고, 글리칸의 site occupancy를 증가시켜 galactosylation과 sialylation을 각각 41%, 19% 증가시켰다 [28]. 그러므로 본 연구에서는 글리칸의 안테나 구조 확장에 필요한 UDP-GlcNAc의 세포 내 합성을 증진시키기 위하여 기질로 사용되는 uridine과 GlcNAc을 CHO 세포 배양 시 첨가하였으며, 추가로 UDP-GlcNAc 합성 및 여러 glycosyltransferase의 cofactor로 알려진 MnCl2를 함께 첨가하여 Alb-EPO의 시알산 함량을 극대화하였다. 따라서 본 연구를 통해 glycosyltransferase의 cofactor인 MnCl2와 글리칸 생합성의 기질로 사용되는nucleotide sugar precursor를 조합하여 CHO 세포 배양에 사용하였을 때 당단백질의 시알산 함량 극대화하는데 시너지 효과가 있음을 확인하였으며 당단백질의 시알산 함량을 효과적으로 증대시킬 수 있는 전략임을 확인하였다.

Fig. 8.

Relative quantitative analysis of sialic acid content of Alb-EPO at optimal concentration. The sialic acid content of Alb-EPO in each group was normalized to those of control (0 mM uridine, 0 mM N-acetylglucosamine (GlcNAc), 0 μM MnCl2). The error bar represents standard deviation (SD) of two independent experiments. (n=2). (U, uridine; G, GlcNAc; M, MnCl2)


4. CONCLUSION

본 연구에서는 nucleotide sugar precursor인 uridine과 GlcNAc의 첨가 농도를 최적화하여 uridine과 GlcNAc로 인한 세포 성장과 단백질 생산 저하를 최소화하는 반면, glycosylation이나 nucleotide sugar 합성 등에 cofactor로 작용하는 MnCl2를 추가로 혼합하여 Alb-EPO 글리칸 말단의 시알산 함량을 극대화하고자 하였다.

중심합성설계를 바탕으로 설계한 실험군에서 uridine과 GlcNAc의 첨가 농도가 증가할수록 세포 성장과 Alb-EPO의 생산이 저해되었고, MnCl2를 함께 첨가하였을 때 Alb-EPO의 시알산 함량은 대조군 대비 최대 100% 증가하였다. 이를통해 uridine과 GlcNAc, MnCl2를 조합하여 첨가하는 것은 Alb-EPO의 시알산 함량을 증대하기에 효과적인 전략임을 확인하였으며 반응표면분석을 통해 uridine과 GlcNAc의 첨가 농도를 최적화하였다. 최적 농도의 uridine과 GlcNAc을 CHO 세포 배양에 첨가하였을 때, 세포 성장이 대조군과 비슷하였고, MnCl2가 함께 첨가되었을 때, Alb-EPO 생산성이 21% 증가하였다. 세포 내 nucleotide sugar pool은 배양 6일차에 UDP-GlcNAc 농도가 대조군에 비해 388% (U+G), 519% (U+G+M) 증가하였으며, CMP-sialic acid의 함량이 대조군보다 20% 증가하였다. 이러한 결과로 Alb-EPO의 시알산 함량은 최대 69% (U+G+M) 증가하였다.

이를 통해 CHO 세포 배양 시 글리칸 생합성의 기질인 uridine과 GlcNAc, nucleotide sugar의 합성 및 glycosyltransferase의 cofactor로 사용되는 MnCl2를 사용하는 전략은 당단백질의 시알산 함량을 극대화하는 시너지 효과를 확인하였으며, 세포 배양 과정에서 글리칸을 효율적으로 조절하여 당단백질의 반감기를 개선할 수 있는 방법으로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

Acknowledgments

이 논문은 2019년도 정부 (미래창조과학부)의 재원으로 한국연구재단 바이오·의료기술개발사업 (No. 2019R1F1A1061676) 으로 수행 되었으며 이에 감사드립니다.

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Fig. 1.

Fig. 1.
Primary metabolic interconversions implicated in nucleotide-sugar biosynthesis and transport pathway in mammalian cells [11, 13-16]. (UTP, Uridine triphosphate; GlcN, Glucosamine; GlcNAc, N-acetyl glucosamine; GlcNAc-6P, GlcNAc 6-phosphate; GlcNAc-1P, GlcNAc 1-phosphate; UDP-GlcNAc, Uridine diphosphate-GlcNAc; Glc, Glucose; Glc-1P, Glc 1-phosphate; UDP-Glc, Uridine diphosphate-Glc; GlcN-6P, GlcN 6-phosphate; Gal, Galactose; UDP-Gal, Uridine diphosphate-Gal; ManNAc, N-acetyl mannosamine; ManNAc-6P, ManNAc 6-phosphate; Neu5Ac-9P, N-acetyl neuraminic acid 9-phosphate; Neu5Ac, N-acetylneuraminic acid; CMP-Neu5Ac, Cytidine-5'-monophospho-Neu5Ac; CMAS, CMP-Neu5Ac synthetase; GnTs, N-acetylglucosaminyltransferase; GT, Galactosyltransferase; ST, Sialyltransferase)

Fig. 2.

Fig. 2.
Effects of supplementing uridine, GlcNAc, and MnCl2 on IVCD. The error bar represents standard deviation (SD) of two independent experiments (n=2). (U, uridine; G, N-acetylglucosamine (GlcNAc); M, MnCl2)

Fig. 3.

Fig. 3.
Effects of supplementing uridine, GlcNAc, and MnCl2 on Alb-EPO titer. The parameters represent the mean ± standard deviation from two independent experiments (n=2). (U, uridine; G, N-acetylglucosamine (GlcNAc); M, MnCl2)

Fig. 4.

Fig. 4.
Variation of sialic acid content of Alb-EPO by addition of uridine, GlcNAc, and MnCl2. The sialic acid content of Alb-EPO in each group was normalized to those of control. The error bar represents standard deviation (SD) of two independent experiments (n=2). (U, uridine; G, N-acetylglucosamine (GlcNAc); M, MnCl2)

Fig. 5.

Fig. 5.
Response surface plots to determine optimal concentration of uridine and GlcNAc. (U, uridine; G, GlcNAc; M, MnCl2)

Fig. 6.

Fig. 6.
Comparison of cell culture performance: (a) VCD, (b) IVCD, (c) viability and (d) Alb-EPO titer within all conditions. The error bar represents standard deviation (SD) of two independent experiments (n=2). (U, uridine; G, N-acetylglucosamine. (GlcNAc); M, MnCl2

Fig. 7.

Fig. 7.
The content of (a) UDP-GlcNAc, (b) UDP-Gal and (c) CMP-sialic acid on day 3 and day 6 in the condition of U+G and U+G+M according to the feeding uridine, GlcNAc, and MnCl2. The error bar represents standard deviation (SD) of two independent experiments. (n=2). (U, uridine; G, N-acetylglucosamine (GlcNAc); M, MnCl2)

Fig. 8.

Fig. 8.
Relative quantitative analysis of sialic acid content of Alb-EPO at optimal concentration. The sialic acid content of Alb-EPO in each group was normalized to those of control (0 mM uridine, 0 mM N-acetylglucosamine (GlcNAc), 0 μM MnCl2). The error bar represents standard deviation (SD) of two independent experiments. (n=2). (U, uridine; G, GlcNAc; M, MnCl2)

Table 1

CCD matrix of 2 independent variables

Run

Exprimental value
Uridine (mM) GlcNAc (mM) MnCl2 (μM)
U, Uridine; G, GlcNAc; M, MnCl2
U+G 1 6 2.93 -
2 2 5
3 10 5
4 0.34 10
5 6 10
6 6 10
7 11.66 10
8 2 15
9 10 15
10 6 17.07
U+G+M 1 6 2.93 2
2 2 5 2
3 10 5 2
4 0.34 10 2
5 6 10 2
6 6 10 2
7 11.66 10 2
8 2 15 2
9 10 15 2
10 6 17.07 2

Table 2

Experimental data on CHO cell culture according to CCD matrix

Experimental values U+G U+G+M
U, Uridine; G, GlcNAc; M, MnCl2
Run Uridine
(mM)
GlcNAc
(mM)
MnCl2
(μM)
IVCD
(105 cells
·day/mL)
Maximum titer
(mg/L)
Relative
amount of
sialic acids
IVCD
(105 cells
·day/mL)
Maximum titer
(mg/L)
Relative
amount of
sialic acids
1 6 2.93 2 120.25 ± 2.80 36.81 ± 3.90 1.31 ± 0.06 125.58 ± 1.50 37.64 ± 1.70 1.03 ± 0.11
2 2 5 2 145.91 ± 0.90 44.05 ± 2.00 1.71 ± 0.10 147.28 ± 1.90 47.25 ± 0.80 1.20 ± 0.08
3 10 5 2 94.46 ± 1.00 25.25 ± 0.50 0.71 ± 0.06 107.66 ± 3.50 31.68 ± 1.50 1.19 ± 0.05
4 0.34 10 2 140.43 ± 0.70 43.76 ± 0.30 1.40 ± 0.06 144.01 ± 2.30 46.72 ± 2.90 2.00 ± 0.01
5 6 10 2 119.34 ± 2.20 32.71 ± 3.80 1.23 ± 0.00 102.03 ± 0.80 35.37 ± 0.50 1.59 ± 0.04
6 6 10 2 120.13 ± 0.30 32.46 ± 1.20 1.23 ± 0.02 98.09 ± 0.20 36.06 ± 0.10 1.57 ± 0.05
7 11.66 10 2 84.73 ± 2.30 21.91 ± 2.80 0.97 ± 0.03 82.89 ± 0.90 34.76 ± 1.10 1.38 ± 0.04
8 2 15 2 124.98 ± 1.90 40.42 ± 0.40 1.03 ± 0.07 116.81 ± 0.70 40.46 ± 0.70 1.44 ± 0.07
9 10 15 2 80.70 ± 3.10 25.30 ± 0.80 1.47 ± 0.03 71.20 ± 0.10 31.65 ± 1.80 1.21 ± 0.04
10 6 17.07 2 90.64 ± 0.00 30.12 ± 0.20 1.39 ± 0.07 86.84 ± 2.10 31.53 ± 0.40 1.11 ± 0.04

Table 3

Second-order polynimial model obtained from experimental data

Supplement Dependent variable(Yn) Model equation
A: Uridine; B: GlcNAc; U, Uridine; G, GlcNAc; M, MnCl2
U+G IVCD(Y1) Y1 = 119.73 – 21.81A – 9.57B + 1.79AB – 2.95A2 – 6.52B2
Titer(Y2) Y2 = 32.59 – 8.10A – 1.63B + 0.92AB + 0.28A2 + 0.59B2
Relative amount of sialic acids(Y3) Y3 = 1.23 – 0.15A + 0.02B + 0.36AB – 0.03A2 + 0.05B2
U+G+M IVCD(Y1) Y1 = 100.06 – 21.46A – 15.21B – 1.5AB + 6.92A2 + 3.30B2
Titer(Y2) Y2 = 35.71 – 5.16A – 1.93B + 1.69AB + 2.54A2 – 0.54B2
Relative amount of sialic acids(Y3) Y3 = 1.58 – 0.16A + 0.02B – 0.01AB + 0.04A2 – 0.27B2

Table 4

ANOVA for response surface model under U+G conditions

Response Factor Sum of squeares Degree of
freedom
Mean square F-value p-value
(Prob>F)
R2
IVCD Model 4746.33 5 949.27 68.78 0.0006 0.9885
A:uridine 3806.09 1 3806.09 275.79 < 0.0001
B:GlcNAc 733.02 1 733.02 53.12 0.0019
AB 12.87 1 12.87 0.93 0.3889
A2 39.85 1 39.85 2.89 0.1645
B2 194.21 1 194.21 14.07 0.0199
Lack of fit 54.89 3 18.30 59.08 0.0953
Maximum titer Model 551.54 5 110.31 71.01 0.0005 0.9889
A:uridine 525.27 1 525.27 338.13 < 0.0001
B:GlcNAc 21.28 1 21.28 13.7 0.0208
AB 3.40 1 3.40 2.19 0.2132
A2 0.35 1 0.35 0.22 0.6616
B2 1.60 1 1.60 1.03 0.3678
Lack of fit 6.18 3 2.06 67.57 0.0891
Relative amount
of sialic acids
Model 0.72 5 0.14 172.21 < 0.0001 0.9954
A:uridine 0.17 1 0.17 201.79 0.0001
B:GlcNAc 0.00453 1 0.00453 5.40 0.0809
AB 0.52 1 0.52 623.09 < 0.0001
A2 0.00386 1 0.00386 4.60 0.0985
B2 0.011 1 0.011 13.70 0.0208
Lack of fit 0.00348 3 0.00112 149.02 0.0601

Table 5

ANOVA for response surface model under U+G+M conditions

Response Factor Sum of squeares Degree of freedom Mean square F-value p-value (Prob>F) R2
IVCD Model 5764.10 5 1152.82 164.60 0.0001 0.9952
A:uridine 3683.75 1 3683.75 525.95 < 0.0001
B:GlcNAc 1851.56 1 1851.56 264.36 < 0.0001
AB 9.00 1 9.00 1.28 0.3203
A2 219.17 1 219.17 31.29 0.0050
B2 49.85 1 49.85 7.12 0.0559
Lack of fit 20.27 3 6.76 0.87 0.6374
Maximum titer Model 298.76 5 59.75 31.37 0.0026 0.9751
A:uridine 213.14 1 213.14 111.92 0.0005
B:GlcNAc 29.88 1 29.88 15.69 0.0167
AB 11.45 1 11.45 6.01 0.0703
A2 29.45 1 29.45 15.46 0.0171
B2 1.33 1 1.33 0.70 0.4500
Lack of fit 7.38 3 2.46 10.25 0.2248
Relative amount
of sialic acids
Model 0.69 5 0.14 16.10 0.0093 0.9527
A:uridine 0.21 1 0.21 24.73 0.0076
B:GlcNAc 0.00359 1 0.00359 0.42 0.5533
AB 0.00008 1 0.00008 0.0095 0.9272
A2 0.00612 1 0.00612 0.71 0.4463
B2 0.34 1 0.34 39.90 0.0032
Lack of fit 0.00023 3 0.011 50.26 0.1032

Table 6

Optimum levels of additives and predicted values

Condition Factor Optimum
concentration
Predicted values
IVCD (105 cells·day/mL) Maximum titer (mg/L) Relative amount of sialic acids
U+G Uridine 2 mM 143.45 44.07 1.73
GlcNAc 5.05 mM
U+G+M Uridine 0.34 mM 141.83 47.23 1.84
GlcNAc 10.97 mM
MnCl2 0.002 mM