The Korean Society For Biotechnology And Bioengineering
[ Research Paper ]
Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 36, No. 1, pp.76-85
ISSN: 1225-7117 (Print) 2288-8268 (Online)
Print publication date 31 Mar 2021
Received 15 Mar 2021 Revised 28 Mar 2021 Accepted 29 Mar 2021
DOI: https://doi.org/10.7841/ksbbj.2021.36.1.76

산업폐수로부터 분리한 1,4-Dioxane을 분해할 수 있는 새로운 세균인 Shinella granuli CK-4의 특성

최문섭1, 2 ; 최기승2 ; 오계헌1, *
1순천향대학교 자연과학대학 생명시스템학과
2(주) 씨디아이
Characterization of Shinella granuli CK-4, a Novel Bacterium Isolated from Industrial Wastewater Capable of Degrading 1,4-Dioxane
Moon-Seop Choi1, 2 ; Ki-Seung Choi2 ; Kye-Heon Oh1, *
1Department of Life Science and Biotechnology, Soonchunhyang University, Asan 31538, Korea
2CDI Co., Ltd, Gyeongi-do 38543, Korea

Correspondence to: Department of Life Science and Biotechnology, Soonchunhyang University, Asan 31538, Korea Tel: +82-41-530-1353, Fax: +82-41-530-1350 E-mail: kyeheon@sch.ac.kr

© 2021 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering

Abstract

We have characterized a novel bacterium, strain CK-4 isolated from industrial wastewater, which is capable of utilizing 1,4-dioxane as sole carbon source and energy. Complete depletion of 1 g/L 1,4-dioxane by CK-4 cultures growing on AMS media was achieved within 168 h. Both the Biolog system and phylogenetic analysis using 16S rRNA sequencing were utilized for identification, and the strain was designated as Shinella granuli CK-4, and registered in GenBank as [MN841914]. The mortality of CK-4 was not greatly affected by 1,4-dioxane concentrations below 10 g/L but was increased with increasing 1,4-dioxane concentrations. SDS-PAGE revealed that the amount of lipopolysaccharide in CK-4 increased or decreased according to the 1,4-dioxane concentration. The expression of 60-kDa GroEL stress shock protein (SSP) was increased in proportion to concentrations below 10 g/L 1,4-dioxane but was not expressed at concentrations above 15 g/L dioxane. On the other hand, 70-kDa DnaK SSP was not expressed at any 1,4-dioxane concentrations (0~20 g/mL) tested. SEM demonstrated that the surface of CK-4 cells exposed to 10 g/L dioxane was not significantly different from that of normal cells, whereas cells exposed to 20 g/L 1,4-dioxane showed the presence of perforations and irregular rod forms with wrinkled cell surfaces. These results provide clues to understanding the resistance of S. granuli CK-4 to 1,4-dioxane and the promotion of 1,4-dioxane degradation, which can be applied to the treatment of industrial wastewater with higher concentrations of 1,4-dioxane.

Keywords:

Shinella granuli CK-4, 1,4-Dioxane, biodegradation, industrial wastewater

1. INTRODUCTION

Shinella species는 비포자형성, 통성혐기성, 편모에 의한 운동성을 가지는 그람-음성 세균으로 활성슬러지, 동물성 플랑크톤의 내장, 토양 및 물과 같은 다양한 환경 시료에서 분리되었다 [1]. Kanamycin, ampicillin, spectinomycine 등의 항생제에 대한 내성뿐만 아니라, As(III), Cd(II), Cr(II), Co(II), Ni(II), Zn(II) 같은 중금속에도 저항성을 가지고 있는 것으로 알려져 있으며, 질소고정과 인산염 합성 등의 대사를 할 수 있는 것으로 보고된 바 있다 [2-5]. 최근 일부 연구에서 Shinella sp.를 3-methyl-sulfolane, chlorothalonil, pyridine 등의 화학물질 분해에 적용하려는 시도가 보고되었지만 [6-8], 현재까지 발표된 Shinella sp.에 관한 대부분의 연구는 분류학적인 측면에 국한되어왔다. S. granuli는 호기성 세균으로 상향류 혐기성 슬러지 블랭킷 반응조(upflow anaerobic sludge blanket reactor)에서 처음 분리되었으며, 4-40oC, 1-4 % NaCl 및 pH 6-10에서 생장할 수 있는 것으로 보고되었다. 그러나 다른 Shinella sp.과는 다르게 질소고정을 할 수 없으며, 전분, 셀룰로오스, 자일란, 단백질, 지질, 카제인 또는 젤라틴을 가수분해 할 수 없는 것으로 알려져 있다 [9].

1,4-Dioxane은 구조적으로 매우 안정한 고리형 에테르 화합물로서 분해가 어려워 자연환경에 노출되었을 경우, 토양에 장기간 잔류하거나 지표수 또는 지하수 등에 오염을 일으킬 수 있다 [10]. 미국 환경보호청의 음용수 관리지침에서 1,4-dioxane의 농도를 0.35 μg/L 이하로 규정하였으며, 미국지역의 지표수 또는 지하수 시료에서 약 0.1~50 μg/L의 1,4-dioxane이 검출되어 UCMR-3 (third unregulated contaminant monitoring rule) 목록에 등재된 오염 물질 중 하나이다 [11]. 국제 암 연구기관(International Agency for Research on Cancer, IARC)은 1,4-dioxane을 인간에 대한 발암가능성이 있는 물질인 Group 2B로 분류하고 있으며, 장기간 노출될 경우에 호흡기, 간 또는 신장 등의 손상을 일으키는 것으로 알려져 있다 [12].

현재 1,4-dioxane은 대부분 화학적 방법으로 처리하고 있으나, 산화제 또는 촉매 등을 사용하기 때문에 이 화합물을 제거하기 위해서 추가적인 작업이 요구되며, 이러한 작업은 2차 오염과 경제적으로 비용 부담을 발생시킬 수 있다. 반면에 1,4-dioxane의 생물학적 처리는 추가적인 작업 또는 2차 오염을 최소화 시켜 산업폐수를 효율적으로 처리하는 친환경적인 정화 기술로 주목을 받고 있다. Parales 등 [13] 은 토양으로부터 1,4-dioxane을 단일 탄소원으로 이용하는 Pseudonocardia sp.을 분리하였으며, Sun 등 [14]은 하수의 퇴적물로부터 분리한 Flavobacterium sp.이 tetrahydrofuran의 존재 하에서 1,4-dioxane이 분해되는 것을 확인하였다. Kim 등 [15]은 낙동강에서 채취한 물 시료에서 Mycobacterium sp PH-06을 분리하여 1,4-dioxane의 분해를 보고하였으며, Inoue 등 [16]은 석유화학 슬러지에서 1,4-dioxane을 분해하는 Rhodococcus sp.를 분리하였다. 또한 Yamamoto 등 [17]은 1,4-dioxane으로 오염된 지하수로부터 1,4-dioxane을 분해할 수 있는 Pseudonocardia sp.를 분리하였다. 그러나 이들 대부분의 연구는 1,4-dioxane의 분해 미생물의 확보 또는 생화학 측면에 주로 국한되어있으며, 일부 1,4-dioxane의 분해에 관한 연구는 1,4-dioxane의 농도가 3~1,000 mg/L로 낮을 뿐만 아니라 분해가 느려서 산업적으로 적용하기에 부적합한 것으로 알려져 있다.

본 연구에서는 산업 폐수로부터 1,4-dioxane을 생분해할 수 있는 새로운 Shinella granuli CK-4를 분리하여, 1,4-dioxane의 분해와 여러 가지 특성을 조사하였다. CK-4 균주에서 고농도의 1,4-dioxane 노출에 따른 lipopolysaccharide (LPS)의 변화 패턴과 스트레스 충격단백질 발현을 확인하였으며, 1,4-dioxane에 노출된 CK-4 세포의 형태학적 변화를 주사전자현미경으로 관찰하였다.


2. MATERIALS AND METHODS

2.1. 1,4-Dioxane 분해세균의 분리

울산 지역의 S공단에서 채취한 폐수 표본으로부터 1,4-dioxane의 분해능을 가지는 세균을 농화배양과 순수배양 기법을 통하여 분리하였다. 사용한 배지는 AMS (ammonium mineral salt)이며, 증류수 1 L당 0.66 g (NH4)2SO4, 1.0 g MgSO4·7H2O, 0.015 g CaCl2·2H20, 1.0 mL AMS trace elements (증류수 1 L당 0.5 g FeSO4·7H20, 0.4 g ZnSO4·7H20, 0.02 g MnSO4·H20, 0.015 g H3BO3, 0.01 g NiCl2·6H20, 0.25 g EDTA, 0.05 g CoCl2·6H20, 0.005 g CuCl2·2H20), 1 mL AMS stock A (증류수 1 L당 5.0 g Fe-Na EDTA, 2.0 g NaMoO4·2H2O), 20.0mL 1.0 M phosphate buffer (증류수 1 L당 113.0 g K2HPO4, 47.0 g KH2PO4)을 포함하는 기본 배지에 탄소원으로 1,4-dioxane이 첨가된 배지를 사용하였다. 준비된 배지는 고압멸균(121oC, 15분)한 후, pH 8.0으로 조절하였다. 배양액의 5% (v/v)를 신선한 AMS 배지에 계대 배양(30oC, 160 rpm)하며, 1,4-dioxane 분해능이 탁월한 세균 CK-4를 분리하였다.

2.2. 1,4-Dioxane 분해능 측정

1,4-Dioxane 농도를 측정하기 위하여 UV/Visible Detector 2489, Isocratic HPLC Pump 1515와 Autosampler 2707이 부착 된 Waters 사 (Milford, MA, USA)의 HPLC system을 사용하였으며, 컬럼은 Agilent 사 (Santa Clara, CA, USA)의 Eclipse XDB-C18 (4.6 × 250 mm, 5 μm)을 이용하였다. HPLC 작동조건으로 유속은 1 mL/min, UV 파장은 200 nm로 설정하였으며, mobile phase은 12% acetonitrile을 0.45 μm membrane filter에 여과하고, 초음파 분쇄기를 이용하여 용액 내의 기포를 제거한 후 사용하였다. 표준물질은 분석용 고순도 1,4-dioxane (Sigma Co., St. Louis, MO, USA)을 사용하였으며, 분석 시료는 배양액을 13,000 rpm에서 10분간 원심분리 후, 상등액을 0.45 μm syringe filter로 여과하여 분석하였다.

2.3. 분리 균주의 형태학적 관찰 및 생화학적 특성조사 및 동정

분리된 세균을 고체 Luria-Bertani (LB) 배지에 도말하여 단일 집락의 형태를 관찰하였으며, 그람염색과 위상차현미경을 사용하여 분리세균 CK-4의 형태학적 특성을 관찰하였다. 분리균주의 생리화학적 특성을 조사하기 위하여, indole 생성유무, glucose의 이용여부, methyl red (MR) 및 voges proskauer (VP) 시험, Klingler iron agar (KIA) 시험, litmus milk 시험, 녹말과 gelatin 및 citrate의 이용 여부 확인시험을 실시하였다 [18]. 다양한 탄소원 이용 능력을 확인하기 위해 BIOLOGTM 분석시스템을 이용하여 실시하였다. CK-4의 단일집락을 5% 혈액이 첨가된 BIOLOG universal growth(BUG) 고체 평판배지에 도말하여 37oC에서 24시간 동안 배양하였다. 배양된 균주는 생리식염수에 현탁시키고, 혼탁도를 35% (±3%)로 조절하여 GN2 MicroplateTM (BIOLOG, Hayward, USA)에 200 μL씩 접종한 후, 48시간 동안 배양하였다. 배양된 Microplate는 BIOLOG automated Micro-Station instrument를 사용하여 탄소원의 이용여부를 조사하였다.

2.4. 16S rRNA 염기서열 분석에 의한 계통수 분석

CK-4의 16S rRNA 부분 염기서열 분석과 이를 기초로 한 유전학적 계통수(phylogenetic tree)를 작성하기 위해 중합효소 연쇄반응(PCR)을 통해 16S rRNA 유전자를 증폭시켰다. Genomic DNA는 G-spinTM Genomic DNA Extraction Kit(Intron Biotechnology Inc., Korea)을 이용하여 추출하였으며, primer는 27F (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3‘)와 1492R(5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3')을 사용하였다. PCR은 genomic DNA를 주형으로 하여, PCR premix (GenDEPOT, Korea)를 사용하여 진행하였으며, 수행조건은 변성(denaturation) (94oC, 1분), 냉각(annealing) (60oC, 1분), 신장(elongation) (70oC, 1분)의 단계를 33회 반복한 후, 70oC에서 15분간 유지하였다. PCR을 통하여 증폭된 DNA 단편은 전기영동을 이용하여 확인하였고 agarose extraction kit (Intron, Korea)를 사용하여 gel로부터 분리, 정제하였다. 염기서열은 ABI373 Automated sequencer (Foster City, CA, USA)를 이용하여 분석하였으며, 분석된 16S rRNA 염기서열은 Clustal X software (http://www.clustal.org) 및 Molecular Evolutionary Genetic Analysis 4 (MEGA4; The Biodesign Institute, Tempe, AZ, USA) 소프트웨어를 사용하여 동정하였으며, 계통수를 작성하였다.

2.5. CK-4의 1,4-dioxane 농도에 대한 사멸률 조사

CK-4의 1,4-dioxane 농도에 따른 사멸률을 알아보기 위하여 CK-4를 LB 액체배지에 배양한 후, 분광광도계를 이용하여 600 nm에서 O.D.값이 1.0일 때, 배양액을 원심분리용 튜브에 넣고 13,000 rpm에서 5분간 원심 분리하였다. 얻어진 균체를 10 mM phosphate buffer (pH 7.0)로 3회 세척하여 0, 5, 10, 15, 20 g/L의 1,4-dioxane을 포함하는 액체배지에 약 2.5×107 CFU/ml의 균체를 각각 접종하였으며, 24시간 간격으로 LB 고체 평판배지에 도말하여 형성되는 집락을 계수하면서 1,4-dioxane의 농도와 노출시간에 따른 CK-4 균주의 사멸률을 분석하였다.

2.6. CK-4의 LPS 추출

1,4-Dioxane의 농도에 따른 CK-4의 LPS 변화를 관찰하기 위하여 0, 5, 10, 15, 20 g/L의 1,4-dioxane에 24시간 동안 노출시킨 후, 원심분리를 통하여 균체를 회수하였다. 획득한 균체는 PBS로 3회 세척한 후, phenol-water 추출법 [19]에 근거한 LPS Extraction kit (Intron Co., Korea)를 사용하여 CK-4의 LPS를 추출하였다. 추출한 LPS는 Fomsgaard의 방법 [20]에 따라 SDS-PAGE 및 변형된 silver staining을 통하여 확인하였다. SDS-PAGE의 separating gel은 12% acrylamide gel을 사용하였으며, stacking gel은 5% acrylamide gel을 사용하였다 [21].

2.7. CK-4의 단백질 획득 및 정량

CK-4를 1,4-dioxane에 노출시킨 후, 원심분리하여 얻어진 균체를 10 mM PBS로 3회 세척하여 시료를 준비하였다. 이후, PRO-PREPTM Protein extraction solution (Intron Co., Korea)에 균체를 현탁하여 4oC에서 30분간 반응시켜 단백질을 추출하였다. 현탁된 세포는 30분간 원심분리(4oC, 13,000 rpm)한 후 상등액을 취하여 SMARTTM BCA Protein assay kit (Intron Co., Korea)을 통해 단백질을 정량하였다.

2.8. SDS-PAGE 및 Western blotting 분석

CK-4가 1,4-dioxane에 노출이 되었을 때 스트레스 충격단백질(stress shock proteins, SSPs)의 변화를 조사하기 위하여SDS-PAGE와 Western blot을 실시하였다. SDS-PAGE는 Bollag등 [21]의 방법에 따라 수행하였으며, separating gel은 12% acrylamide gel, 그리고 stacking gel은 4% acrylamide gel을 각각 사용하였다. 전기영동한 후, gel은 2.5% Coomassie brilliant blue staining solution (Bio-Rad Co., Hercules, CA, USA) 1시간 동안 염색하였고, destaining solution (30% methanol, 7% acetic acid)로 1시간 동안 탈색하였다. 1,4-Dioxane에 의한 스트레스 충격단백질을 분석하기 위하여, Sambrook 등 [22]의 방법에 따라 Western blot을 실시하였다. 1차 항체는 anti-DnaK와 anti-GroEL (Abcam, Cambridge, UK)을 사용하였으며, 2차 항체는 anti-mouse IgG HRP conjugate (Abcam, Cambridge, UK)를 사용하였다. 항원-항체 반응을 검출하기 위해 ECL kit (Intron Co., Korea)를 사용하였으며, ImageJ 프로그램(LOCI, University of Wisconsin, USA)을 이용하여 정량하였다.

2.9. 주사전자현미경을 이용한 세포 외부 형태 관찰

CK-4의 세포 외부형태를 주사전자현미경으로 관찰하기 위하여 CK-4를 LB 액체배지와 1,4-dioxane이 첨가된 AMS 액체배지에 24시간 동안 배양시킨 후, 원심 분리하여 얻어진 균체를 PBS로 3회 세척하여 준비하였다. 원심 분리하여 균체를 회수하고 여과지에 부착하여 2.5% glutaraldehyde (Sigma, St. Louis, MO, USA)와 1% osmium tetroxide (Sigma Co., St. Louis, MO, USA)로 각각 2시간 처리하여 고정(fixation)을 진행하였다. 다양한 농도의 ethanol (50, 60, 70, 80, 90, 95%)을 준비하여, 저농도부터 점차 농도를 높여가면서 농도별로 10분씩 연속적으로 탈수시켰다. 마지막으로 absolute ethanol에 30분씩 2회 탈수하고, hexamethyldisilazane (HEMS, Fort Washington, PA, USA)에 20분간 반응시켜 공기 중에서 건조시켰다. 건조된 membrane filter를 slide glass 상에 부착시키고, sputter coater (IB-3, Giko Engineering Co., Japan)를 사용하여, 2 mA로 3분간 gold coating하여 주사전자현미경 (LEO 1455VP, ZEISS, Germany)으로 관찰하였다.


3. RESULTS AND DISCUSSION

3.1. 1,4-Dioxane 분해세균의 분리 및 배양

울산 지역의 S공단에서 채취한 폐수 표본으로부터 농화 배양기법으로 1,4-dioxane을 분해하는 3가지의 단일 세균을 분리하였다. 분리된 세균들은 1 g/L의 1,4-dioxane을 포함하는 액체배지로 옮겨 30oC에서 분당 160회로 회전하는 진탕배양기에서 배양하며 생장과 1,4-dioxane 분해를 조사하였으며, 배지 내의 잔존 1,4-dioxane의 양을 HPLC로 측정하여 1,4-dioxane의 분해능이 가장 우수한 CK-4를 확보하였다. 확보된 CK-4 균주는 연속적인 실험을 위하여 1,4-dioxane을 포함하는 AMS 배지에 계대 배양하면서 여러 가지 실험에 이용하였다.

3.2. CK-4의 생장과 1,4-dioxane 분해

1,4-Dioxane을 포함하는 AMS 배지 내에서 CK-4에 의한 1,4-dioxane의 분해와 이 세균의 생장, 그리고 pH 변화를 관찰하였다 (Fig. 1). 배지 내의 1,4-dioxane 초기 농도는 0.5 g/L와 1.0 g/L 이었으며, 접종한 후, CK-4는 급격히 생장하였으며, 84시간에 최대 생장을 보여주었다. 그 후에는 감소하기 시작하여 배양기간 동안 일정한 생장을 유지하였다. CK-4 균주의 생장이 진행되는 동안, 초기 pH 8.0은 서서히 감소하여 60시간이 경과한 후, 1,4-dioxane의 배양액은 각각 7.3과 7.1로 측정되었다. 이전 연구에서 산업폐수로부터 농화를 통해 확보된 미생물컨소시엄 CDIK-3에 의한 1,4-dioxane의 생분해에 미치는 pH의 영향에서 8에서 최적의 분해능을 보여주었다 [23]. CK-4 균주는 이 컨소시엄 CDIK-3로부터 분리된 균주로서 본 실험을 위한 초기 pH를 8로 설정하였다. 일부 1,4-dioxane의 생분해 연구에서 분해과정 중에 몇 가지 종류의 유기산 (예, glycolic acid, oxalic acid, glyoxylic acid 등)이 생성된다고 보고된 바 있다 [24,25]. 이러한 연구와 비교해 볼때, 본 연구에서 pH의 감소는 CK-4 균주가 1,4-dioxane을 분해하는 과정에서 생성되는 대사산물에 의한 것으로 생각된다. CK-4가 접종된 후, 0.5 g/L의 1,4-dioxane은 약 6.94 mg/L/h분해율로 72시간 이내, 그리고 1.0 g/L의 1,4-dioxane은 약 9.25mg/L/h의 분해율로 108시간 이내에 각각 완전 분해되었다.

Fig. 1.

Growth of S. granuli CK-4 (A) and the degradation of 1,4-dioxane (B) in the presence of different concentrations of 1,4-dioxane- 0.5 g/L (□,■), 1.0 g/L (○,●). Error bars indicate the standard deviations of three replicates.

Kim 등 [15]은 분리한 Mycobacterium sp. PH-06이 15일 이내에 900 mg/L의 1,4-dioxane, 그리고 Pugazhendi 등 [24]Rhodanobacter sp. AYS5이 10일 이내에 950 mg/L의 1,4-dioxane을 분해를 보고하였다. Nakamiya 등 [26]Cordyceps sp.을 이용한 연구에서 3 mg/L의 1,4-dioxane을 3일 이내 분해하였으며, Inoue 등 [16]Rhodococcus sp. JCM 14343이 20 mg/L의 1,4-dioxane을 30시간 이내 제거를 보고한 바 있다. 또한 Kelley 등 [27]이 분리한 Amycolata sp. CB1190은 100 mg/L의 1,4-dioxane을 120일 동안 약 65%를 제거하였으며, Chen 등 [28]Xanthobacter sp. DT8을 이용하여 100mg/L의 1.4-dioxane을 50시간 이내 분해한다고 보고한 바 있다. 이러한 연구를 비교하여 볼 때, 본 연구에서 사용된 CK-4 균주는 0.5 g/L의 1,4-dioxane을 72시간 이내, 그리고 1.0 g/L의 1,4-dioxane을 108시간 이내에 완전히 분해함으로서, 지금까지 발표된 1,4-dioxane 생분해와 관련한 연구들과 비교하여 볼 때, 그 분해능이 매우 탁월한 것으로 판단된다.

1.0 g/L의 1,4-dioxane를 포함하는 배지에서의 잔존 1,4-dioxane을 HPLC로 분석하였다. 접종 직후부터 24시간마다 시료를 채취하여 분석한 HPLC chromatogram 상에서 retention time 4.00분에 1,4-dioxane이 확인되었으며, 1,4-dioxane 이외의 별도의 중간대사산물은 확인되지 않았다 (Fig. 2).

Fig. 2.

HPLC chromatograms of culture samples initially (A), and after 24 h (B), 48 h (C), 72 h (D), 96 h (E), 120 h (F) of incubation, respectively. Initial concentration of 1,4-dioxane was 1.0 g/L.

3.3. 1,4-dioxane 분해세균의 특성조사 및 동정

1,4-Dioxane 분해세균인 CK-4에 대한 형태학적 및 생화학적 특성조사와 동정을 실시하였다. CK-4의 집락은 연노랑의 불투명한 크림색으로 관찰되었으며, 위상차현미경을 통해서 CK-4 형태는 간균으로 확인되었다. 그람염색 결과는 음성으로 판명되었으며, 여러 가지 생리학적 실험을 실시하여 그 결과를 Table 1에 요약하였다. 또한 CK-4의 다양한 탄소원의 이용 여부는 GN2 MicroplateTM를 이용하였으며, 이를 BIOLOG database software 분석시스템을 통해 분석하였다 (Table 2). 그 분석 결과, CK-4는 Shinella granulli로 동정되었으며, 본 연구에서는 Shinella granulli CK-4로 명명되었다.

Morphological and physiological characteristics of the isolate, CK-4

Biochemical characteristics of the isolate, CK-4 using the BIOLOG analysis system

3.4. 분해 세균의 계통수 분석

CK-4 균주의 계통학적 분류를 확인하기 위해, 16S rRNA 증폭 및 부분적인 염기서열을 분석하였다. 1401 bp의 16S rRNA 부분 염기서열의 분석되었으며, 그 결과는 GenBank에 [MN841914]로 등록하였다. CK-4 균주는 Rhizobiaceae 과(科)로 분류되며, Shinella granuli와 99%의 유전적 상동성을 나타내었다. National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 Basic Logical Alignment Search Tool (BLAST)을 통하여 상동성을 확인한 결과, Shinella granuli strain Ch06과 99%로 가장 높은 상동성을 나타내었으며, Shinella curvata strain C3 (98%), Shinella zoogloeoides strain NBRC 102405 (98%), Shinella yambaruensis strain MS4 (98%), Shinella fusca DC-196 (97%) 등과 높은 상동성을 가지는 것으로 조사되었다. CK-4와 밀접하게 관련된 다른 균주들과의 유전적 유사성을 16S rRNA 염기서열 결과에 기초하여 계통수(phylogenetic tree)를 작성하였다 (Fig. 3).

Fig. 3.

Phylogenetic tree of the isolate, S. granuli CK-4 (●) based on 16S rRNA gene sequences. The tree was constructed by the neighbor-joining method. Number at nodes are bootstrap percentage based on 1000 resampled data sets. Bar, 0.005 substitutions per nucleotide position.

3.5. CK-4의 1,4-dioxane 농도에 대한 사멸률 조사

다양한 농도 (0~20 g/L)의 1,4-dioxane 농도와 배양시간에 따른 CK-4 세포의 사멸률을 조사하였다 (Fig. 4). 약 2.5 × 107 CFU/ml의 초기 균체를 접종한 후 168시간의 관찰 기간 동안, 1,4-dioxane의 농도가 높아질수록 CK-4 세포의 사멸률은 증가하였다. 5 g/L과 10 g/L의 1,4-dioxane에 노출된 균주는 168시간 배양 후, 약 107CFU/ml와 106CFU/ml로 각각 측정되었으며, 노출되지 않은 균주과 비교하여 근소한 사멸률의 차이를 보여주었다. 15 g/L의 1,4-dioxane은 배양 초기의 48시간 동안 102 CFU/ml가 급격하게 감소되었으나, 이후 감소폭이 줄어들면서 최종적으로 168시간 동안 50% 이상 생존하였다. 본 연구에서 사용된 1,4-dioxane의 최고 농도인 20 g/L에서 72시간 노출된 후 CK-4의 집락은 완전히 사멸되었다. 본 연구에서 CK-4 사멸률에 적용된 1,4-dioxane의 최고 농도인 20 g/L는 기존의 발표논문들에서 제시된 1,4-dioxane의 생분해에서 언급된 농도와 비교하여 월등하게 높은 것으로 확인되었으며, CK-4 균주인 S. granuli는 1,4-dioxane의 생분해와 관련하여 알려진 바가 없다. 다만 Sun 등 [29]S. zoogloeoides BC026을 이용한 pyridine의 생분해 관련 연구에서 2 g/L 이하의 농도에서 균주의 생장과 pyridine 분해를 보고한 바 있다.

Fig. 4.

Mortality rate of S. granuli CK-4 cells after 1,4-dioxane shock. The cells were maintained at the concentrations of 0 g/L (●), 5 g/L (■), 10 g/L (▲), 15 g/L (◆), or 20 g/L (▼) 1,4-dioxane, respectively. At intervals, the numbers of colonies (CFU/mL) were measured. Data shown represent the mean± based on triplicate studies.

3.6. LPS의 silver stained SDS-PAGE

1,4-Dioxane에 노출된 CK-4 균주의 LPS 변화를 SDS-PAGE 와 silver staining을 이용하여 관찰하였다 (Fig. 5). 1,4-Dioxane에 노출되지 않은 균주에서 LPS의 SDS-PAGE 패턴 비교을 하였을 때, 1,4-dioxane의 노출농도가 증가함에 따라 CK-4의 LPS에서 약 75-kDa과 17-kDa 사이에 존재하는 밴드들의 발현량 변화가 관찰되었다. 약 75-kDa, 20-kDa, 17-kDa의 밴드들은 1,4-dioxane의 농도에 따라 증가하였으나, 약 24-kDa의 밴드는 감소하는 것을 보여주었다. LPS는 그람-음성세균의 외막을 구성하고 있는 성분으로서 중심 다당류, O-다당류 그리고 지질 A가 서로 결합되어 복합체를 형성하고 있으며, 외부 물질의 유입을 막아 세포를 보호하는 역할을 한다 [30]. 1,4-Dioxane 노출에 따른 Shinella sp.의 LPS 발현기작에 관한 연구는 보고된 바 없으나, Qing 등 [31]은 1,4-dioxane에 노출된 쥐의 장내 미생물[Porphyromonadaceae과(科)와 Helicobacteraceae과]에서 LPS의 양이 증가할 수 있음을 제시하였으며, Bos 등 [30]N. meningitidis H44/76의 LPS가 막 투과성 및 유기용매 저항성에 관여하는 것으로 보고하였다. 이들 연구와 비교하였을 때, 본 연구에서 CK-4는 1,4-dioxane의 농도에 따라 LPS 발현이 증가하여 1,4-dioxane에 대한 저항성이 향상됨으로 인해 높은 농도의 1,4-dioxane에서도 생존할 수 있을 것으로 사료된다.

Fig. 5.

Silver-stained SDS-PAGE gel profiles of LPS extracted from untreated S. granuli CK-4 cells, cells treated with different concentrations of 1,4-dioxane for 24 h.

3.7. SDS-PAGE와 Western blotting 분석

CK-4 세포를 다양한 농도 (0~20 g/L)의 1,4-dioxane에 노출시킨 후, 세포 내에서 발현되는 스트레스 충격단백질인 DnaK와 GroEL의 발현을 조사하였다 (Fig. 6). 그 결과, 1,4-dioxane의 농도가 10 g/L까지 증가함에 따라 CK-4 세포에서 발현되는 GroEL의 양은 점차 증가하는 것을 보여주었으며, 그 발현량은 노출되지 않은 균주와 비교하여 5 g/L와 10 g/L에서 각각 약 2배와 4배 정도로 증가하였으나, 15 g/L 이상에서는 발현되지 않았다. 흥미로운 결과는 분석에 적용된 모든 1,4-dioxane 농도에서 전혀 DnaK가 발현되지 않았다는 것이다. Mogk 등 [32]B. subtilis를 이용한 열 충격에 의한 CIRCE 레귤론(regulon) 조절 기작 연구에서 GroEL이 dnaK 오페론에 영향을 미치며, 과발현된 GroEL은 dnaK 오페론의 발현을 저해시킨다는 것을 보고하였다 [30]. 이러한 보고를 비추어 볼 때, 1,4-dioxane에 노출된 CK-4에서도 GroEL의 발현이 증가함에 따라 dnaK 오페론이 억제되어 DnaK의 발현이 저해되는 것으로 생각된다. 본 연구에서 1,4-dioxane 노출에 대한 S. granuli의 스트레스 충격단백질로서 DnaK의 미발현과 GroEL의 발현이 처음으로 확인되었다.

Fig. 6.

Induction of stress shock proteins in S. granuli CK-4 treated with different 1,4-dioxane concentrations for 24 h. The SSPs were analyzed SDS-PAGE (A), Western blot with anti-DnaK monoclonal antibodies (B), and Western blot with anti-GroEL monoclonal antibodies (C), respectively.

난분해성의 탄화수소 화합물들은 미생물에 의해 생산된 monooxygenase에 의해 생분해를 일으킬 수 있다. 실제로1,4-dioxane의 생분해는 monooxygenase가 관여하는 것으로 알려져 있다 [33]. Steffan 등 [10]은 1,4-dioxane을 분해할 수있는 Pseudonocardia sp., Rhodococcus sp., Xanthobacter sp. 등의 세균에서 monooxygenase의 발현을 확인하였으며, 이monooxygenase가 정상적인 접힘(folding)을 위해 GroEL이 필요함을 보고한 바 있다. GroEL은 세포가 열악한 환경에 노출되었을 때, 세포의 생존을 위하여 효소를 비롯한 여러 단백질이 정상적인 기능을 하도록 만드는 단백질로 알려져 있다 [34]. 이들 결과와 비교하여 CK-4의 GroEL 발현 기작은 1,4-dioxane 농도에 따라 구분되는 것으로 판단된다. 적정 농도의 1,4-dioxane에 노출된 경우, 1,4-dioxane을 탄소원 및 에너지원으로 이용하기 위해 monooxygenase의 발현이 증가하게 되며, 동시에 monooxygenase의 정상적인 접힘을 유도하는 GroEL의 발현도 증가하는 것으로 사료된다. 반면에 적정 농도를 초과하는 1,4-dioxane에서는 기질이 아닌 스트레스원으로 작용하게 되며, 생존을 위한 여러 단백질의 정상적인 접힘을 유도하기 위해 스트레스 충격단백질로서 GroEL의 발현양이 증가하는 것으로 판단된다. 현재까지 S. granuli에서 이러한 현상에 대하여 알려진 것이 없으며, 향후 보다 체계적인 분자생물학적 연구를 통해 입증할 필요가 있다고 사료된다.

3.8. S. granuli CK-4의 세포 외부형태 변화

사멸률 실험과 관련하여 아치사(sublethal) 농도의 1,4-dioxane에 노출되었을 때 일어나는 S. granuli CK-4 세포의 외부형태 변화를 주사전자현미경(SEM)으로 관찰하였다. 1,4-Dioxane에 노출되지 않은 S. granuli CK-4의 세포의 모양은 매끄러운 표면을 가진 막대형으로 확인되었으며 (Fig. 7A), 10 g/L의 1,4-dioxane에 노출된 CK-4 균주에서도 노출되지 않은 균주와 거의 차이가 없이 동일한 형태가 관찰되었다 (Fig. 7B). 그러나 20 g/L의 1,4-dioxane에 노출된 균주에서는 표면이 거칠고 불규칙적이며, 주름진 표면, 쭈그러진 형태, 구멍 생성 등의 세포 외부형태에서 구조적 변화가 발생하였다 (Fig. 7C). 본 연구에서 얻어진 여러 1,4-dioxane 농도에 노출된 CK-4의 사멸률이나 세포반응의 연구 결과는, 주사전자현미경 사진에서 보여주는 바와 같이, 20 g/L에 노출된 CK-4 세포의 형태변화에 의한 기능 저하 및 사멸에 대한 궁극적인 이해에 도움이 될 수 있는 것으로 생각된다.

Fig. 7.

Scanning electron micrographs of S. granuli CK-4 treated with 1,4-dioxane (a) untreated cells; (b) cells treated with 10 g/L 1,4-dioxane for 24 h; (c) cells treated with 20 g/L 1,4-dioxane for 24 h.

다양한 산업에서 널리 사용되는 1,4-dioxane은 환경오염원으로서 많은 주목을 받아왔다. 최근 국내에서 낙동강 유역, 상수원 등에서 1,4-dioxane이 검출되어 사회적으로 이슈가 되고 있으며, 1,4-dioxane을 효율적으로 제거할 수 있는 균주를 이용한 미생물학적 처리에 대한 연구의 필요성이 대두되고 있다. 본 연구를 통하여 확보된 1,4-dioxane을 분해하는 S. granuli CK-4 균주는 탄소 및 에너지원으로서 고농도의 1,4-dioxane을 짧은 배양기간 중에 완전하게 분해하며, 1,4-dioxane에 대한 적응 및 저항성도 매우 높은 것으로 확인되었다. 이는 지금까지 보고된 1,4-dioxane 분해와 관련한 연구들과 비교하여 볼 때, 그 분해능이 탁월한 것으로 입증되었으며, 이러한 결과는 CK-4 균주에 대한 학술적 및 산업적 의미가 매우 크다는 것을 시사한다. 향후 CK-4에서 1,4-dioxane의 분해 경로를 규명하기 위한 효소의 특성을 분자유전학적 접근과 1,4-dioxane에 의해 유도되는 스트레스 충격단백질의 정확한 발현기작에 대하여 연구가 진행되어야 할 것이다.


4. CONCLUSION

1,4-Dioxane을 유일한 탄소원 및 에너지원으로 이용할 수 있는 세균인 CK-4 균주를 산업폐수로부터 분리하여 특성조사를 실시하였다. AMS 배지에서 생장하는 CK-4 배양에 의해서 1 g/L의 1,4-dioxane은 108 시간 이내에 완전히 분해되었다. 이 균주는 BIOLOG 시스템과 16S rRNA 염기서열을 이용한 계통유전학적 분석으로 동정하여, Shinella granuli CK-4로 명명하고, GenBank [MN841914]로 등록하였다. CK-4의 사멸률은 10 g/L 1,4-dioxane 이하에서 크게 영향을 받지 않았으나, 1,4-dioxane 농도가 증가할수록 증가하였다. SDS-PAGE를 은으로 염색하여 관찰한 결과, CK-4의 lipopolysaccharide의 양은 1,4-dioxane 농도에 따라 증가하거나 감소하는 것으로 나타났다. 스트레스 충격단백질인 60-kDa GroEL의 발현은 10 g/L 1,4-dioxane 이하의 농도에서 비례하여 증가하였으나, 15 g/L dioxane 이상에서는 발현되지 않았다. 반면에 70-kDa DnaK는 동일한 조건에서 실험된 1,4-dioxane의 모든 농도 (0~20 g/mL)에서 발현되지 않았다. SEM 분석 결과, 10 g/L dioxane에 노출된 CK-4 세포의 표면은 정상 세포와 크게 다르지 않았으나, 20 g/L 1,4-dioxane에 노출된 이들 세포는 세포에 주름이 있는 표면을 가진 천공과 불규칙한 막대형을 보여주었다. 이러한 결과는 S. granuli CK-4의1,4-dioxane에 대한 내성을 이해하고, 1,4-dioxane의 분해를 촉진하는 단서를 제공하며, 1,4-dioxane의 농도가 높은 산업폐수의 처리에 적용될 수 있다.

Acknowledgments

본 연구는 순천향대학교 학술연구비지원사업의 일부지원으로 수행되었음.

REFERENCES

  • Ma, Y., Y. Wei, J. Qiu, R. Wen, J. Hong, and W. Liu (2014) Isolation, transposon mutagenesis, and characterization of the novel nicotine-degrading strain Shinella sp. HZN7. Appl. Microbiol. Biotechnol. 98: 2625-2636. [https://doi.org/10.1007/s00253-013-5207-0]
  • Lin, D. X., E. T. Wang, H. Tang, T. X. Han, Y. R. He, S. H. Guan, and W. X. Chen (2008) Shinella kummerowiae sp. nov., a symbiotic bacterium isolated from root nodules of the herbal legume Kummerowia stipulacea. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 58: 1409-1413. [https://doi.org/10.1099/ijs.0.65723-0]
  • Poehlein, A., H. Freese, R. Daniel, and D. D. Simeonova (2016) Genome sequence of Shinella sp. strain DD12, isolated from homogenized guts of starved Daphnia magna. Stand. Genomic Sci. 11: 1-8. [https://doi.org/10.1186/s40793-015-0129-3]
  • Bhakat, K., A. Chakraborty, and E. Islam (2019) Characterization of arsenic oxidation and uranium bioremediation potential of arsenic resistant bacteria isolated from uranium ore. Environ. Sci. Pollut. Res. 26: 12907-12919. [https://doi.org/10.1007/s11356-019-04827-6]
  • Grouzdev, D. S., T. L. Babich, D. S. Sokolova, T. P. Tourova, A. B. Poltaraus, and T. N. Nazina (2019) Draft genome sequence data and analysis of Shinella sp. strain JR1-6 isolated from nitrate-and radionuclide-contaminated groundwater in Russia. Data Brief. 25: 104319. [https://doi.org/10.1016/j.dib.2019.104319]
  • Liang, B., G. Wang, Y. Zhao, K. Chen, S. Li, and J. Jiang (2011) Facilitation of bacterial adaptation to chlorothalonil-contaminated sites by horizontal transfer of the chlorothalonil hydrolytic dehalogenase gene. Appl. Environ. Microbiol. 77: 4268-4272. [https://doi.org/10.1128/AEM.02457-10]
  • Matsui, T., N. Shinzato, H. Tamaki, M. Muramatsu, and S. Hanada (2009) Shinella yambaruensis sp. nov., a 3-methyl-sulfolane-assimilating bacterium isolated from soil. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 59: 536-539 [https://doi.org/10.1099/ijs.0.65510-0]
  • Bai, Y., Q. Sun, C. Zhao, D. Wen, and X. Tang (2009) Aerobic degradation of pyridine by a new bacterial strain, Shinella zoogloeoides BC026. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 36: 1391-1400. [https://doi.org/10.1007/s10295-009-0625-9]
  • An, D. S., W. T. Im, H. C. Yang, and S. T. Lee (2006) Shinella granuli gen. nov., sp. nov., and proposal of the reclassification of Zoogloea ramigera ATCC 19623 as Shinella zoogloeoides sp. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 56: 443-448. [https://doi.org/10.1099/ijs.0.63942-0]
  • Steffan, R. J., K. R. McClay, H. Masuda, and G. J. Zylstra (2007) ER-1422: Biodegradation of 1, 4-dioxane. Shaw Environmental Inc., Lawrenceville, NJ, USA.
  • Adamson, D. T., E. A. Piña, A. E. Cartwright, S. R. Rauch, R. Hunter Anderson, T. Mohr, and J. A. Connor (2017) 1,4-Dioxane drinking water occurrence data from the third unregulated contaminant monitoring rule. Sci. Total Environ. 596-597: 236-245. [https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2017.04.085]
  • National Toxicology Program (1978) Bioassay of 1,4-dioxane for possible carcinogenicity, Natl. Cancer Inst. Carcinog. Tech. Rep. Ser., 80: 1-123.
  • Parales, R. E., J. E. Adamus, N. White, and H. D. May (1994) Degradation of 1,4-dioxane by an actinomycete in pure culture. Appl. Environ. Microbiol. 60: 4527-4530. [https://doi.org/10.1128/AEM.60.12.4527-4530.1994]
  • Sun, B., K. Ko, and J. A. Ramsay (2011) Biodegradation of 1,4-dioxane by a Flavobacterium. Biodegradation 22: 651-659. [https://doi.org/10.1007/s10532-010-9438-9]
  • Kim, Y. M., J. R. Jeon, K. Murugesan, E. J. Kim, and Y. S. Chang (1994) Biodegradation of 1,4-dioxane and transformation of related cyclic compounds by a newly isolated Mycobacterium sp. PH-06. Biodegradation 20: 511-519. [https://doi.org/10.1007/s10532-008-9240-0]
  • Inoue, D., T. Tsunoda, N. Yamamoto, M. Ike, and K. Sei (2018) 1,4-Dioxane degradation characteristics of Rhodococcus aetherivorans JCM 14343. Biodegradation 29: 301-310. [https://doi.org/10.1007/s10532-018-9832-2]
  • Yamamoto, N., Y. Saito, D. Inoue, K. Sei, and M. Ike (2018) Characterization of newly isolated Pseudonocardia sp. N23 with high 1,4-dioxane-degrading ability. J. Biosci. Bioeng. 125: 552-558. [https://doi.org/10.1016/j.jbiosc.2017.12.005]
  • Benson, H. J. (1998) Microbiological Applications: Laboratory Manual in General Microbiology. 7th ed., McGraw-Hill, Inc., SF, USA.
  • Johnson, K. G, and M. B. Perry (1976) Improved techniques for the preparation of bacterial lipopolysaccharides. Can. J. Microbiol. 22: 29-34. [https://doi.org/10.1139/m76-004]
  • Fomsgaard, A., M. A. Freudenberg, and C. Galanos (1990) Modification of the silver staining technique to detect lipopolysaccharide in polyacrylamide gels. J. Clin. Microbiol. 28:2627-2631. [https://doi.org/10.1128/JCM.28.12.2627-2631.1990]
  • Bollag, D. M., M. D. Rozycki, and S. J. Edelstein (1996) Protein methods. 2nd ed. NY, Wiley-Liss, USA.
  • Sambrook, J., E. Fritsch, and T. Maniatis (1989) Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA.
  • Choi, M. S., K. S. Choi, and K. H. Oh. 2020. Effects of several physicochemical factors on the biodegradation of 1.4-dioxane by microbial consortium CDIK-3 enriched from industrial wastewater. J. KSEE 42: 381-392. [https://doi.org/10.4491/KSEE.2020.42.8.381]
  • Pugazhendi, A., J. Rajesh Banu, J. Dhavamani, and I. T. Yeom (2015) Biodegradation of 1,4-dioxane by Rhodanobacter AYS5 and the role of additional substrates. Ann. Microbiol. 65: 2201–2208. [https://doi.org/10.1007/s13213-015-1060-y]
  • Mahendra, S., C. J. Petzold, E. D. Keasling, and L. A. Cohen. 2007. Identification of the intermediates of in vivo oxidation of 1,4-dioxane by monooxygenase-containing bacteria. Environ. Sci. Technol. 41: 7330-7336. [https://doi.org/10.1021/es0705745]
  • Nakamiya, K., S. Hashimoto, H. Ito, J. S. Edmonds, and M. Morita (2005) Degradation of 1,4-dioxane and cyclic ethers by an isolated fungus. Appl. Environ. Microbiol. 71: 1254-1258. [https://doi.org/10.1128/AEM.71.3.1254-1258.2005]
  • Kelley, S. L., E. W. Aitchison, M. Deshpande, J. L. Schnoor, and P. J. J. Alvarez (2001) Biodegradation of 1,4-dioxane in planted and unplanted soil: Effect of bioaugmentation with Amycolata sp. CB1190. Water Res. 35: 3791-3800. [https://doi.org/10.1016/S0043-1354(01)00129-4]
  • Chen, D. Z., X. J. Jin, J. Chen, J. X. Ye, N. X. Jiang, and J. M. Chen (2016) Intermediates and substrate interaction of 1,4-dioxane degradation by the effective metabolizer Xanthobacter flavus DT8. Int. Biodeter. Biodegrad. 106: 133-140. [https://doi.org/10.1016/j.ibiod.2015.09.018]
  • Sun, Q. H., Y. H. Bai, C. Zhao, D. H. Wen, and X. Y. Tang (2008) Biodegradation of pyridine by Shinella zoogloeoides BC026, J. Environ. Sci. (China) 29: 2938-2943.
  • Bos, M. P., Tefsen, B., Geurtsen, J, and Tommassen, J. (2004) Identification of an outer membrane protein required for the transport of lipopolysaccharide to the bacterial cell surface. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101: 9417-9422. [https://doi.org/10.1073/pnas.0402340101]
  • Qing, Z., L. Jiang, J. Qiu, Y. Pan, V. S. Robert, P. Shi, A. M. Li, and X. Zhang (2020) Oral Exposure to 1,4-dioxane induces hepatic inflammation in mice: The potential promoting effect of the gut microbiome. Environ. Sci. Technol. 54: 10149-10158. [https://doi.org/10.1021/acs.est.0c01543]
  • Mogk, A., G. Homuth, C. Scholz, L. Kim, F. X. Schmid, and W. Schumann (1997) The GroE chaperonin machine is a major modulator of the CIRCE heat shock regulon of Bacillus subtilis. EMBO J. 16: 4579-4590. [https://doi.org/10.1093/emboj/16.15.4579]
  • Mahendra, S. and L. Alvarez-Cohen (2006) Kinetics of 1,4-dioxane biodegradation by monooxygenase-expressing bacteria. Environ. Sci. Technol. 40: 5435-5442. [https://doi.org/10.1021/es060714v]
  • Langer, T., C. Lu, H. Echols, J. Flanagan, M. K. Hayer, and F. U. Hartl (1992) Successive action of DnaK, DnaJ and GroEL along the pathway of chaperone-mediated protein folding. Nature 356: 683-689. [https://doi.org/10.1038/356683a0]

Fig. 1.

Fig. 1.
Growth of S. granuli CK-4 (A) and the degradation of 1,4-dioxane (B) in the presence of different concentrations of 1,4-dioxane- 0.5 g/L (□,■), 1.0 g/L (○,●). Error bars indicate the standard deviations of three replicates.

Fig. 2.

Fig. 2.
HPLC chromatograms of culture samples initially (A), and after 24 h (B), 48 h (C), 72 h (D), 96 h (E), 120 h (F) of incubation, respectively. Initial concentration of 1,4-dioxane was 1.0 g/L.

Fig. 3.

Fig. 3.
Phylogenetic tree of the isolate, S. granuli CK-4 (●) based on 16S rRNA gene sequences. The tree was constructed by the neighbor-joining method. Number at nodes are bootstrap percentage based on 1000 resampled data sets. Bar, 0.005 substitutions per nucleotide position.

Fig. 4.

Fig. 4.
Mortality rate of S. granuli CK-4 cells after 1,4-dioxane shock. The cells were maintained at the concentrations of 0 g/L (●), 5 g/L (■), 10 g/L (▲), 15 g/L (◆), or 20 g/L (▼) 1,4-dioxane, respectively. At intervals, the numbers of colonies (CFU/mL) were measured. Data shown represent the mean± based on triplicate studies.

Fig. 5.

Fig. 5.
Silver-stained SDS-PAGE gel profiles of LPS extracted from untreated S. granuli CK-4 cells, cells treated with different concentrations of 1,4-dioxane for 24 h.

Fig. 6.

Fig. 6.
Induction of stress shock proteins in S. granuli CK-4 treated with different 1,4-dioxane concentrations for 24 h. The SSPs were analyzed SDS-PAGE (A), Western blot with anti-DnaK monoclonal antibodies (B), and Western blot with anti-GroEL monoclonal antibodies (C), respectively.

Fig. 7.

Fig. 7.
Scanning electron micrographs of S. granuli CK-4 treated with 1,4-dioxane (a) untreated cells; (b) cells treated with 10 g/L 1,4-dioxane for 24 h; (c) cells treated with 20 g/L 1,4-dioxane for 24 h.

Table 1.

Morphological and physiological characteristics of the isolate, CK-4

Morphological characteristics
Cell shape Rod
Gram stain Negative
Physiological characteristics
Glucose +
Indole production -
Methyl red -
Voges-Proskauer -
H2S (KIA) -
Gelatin hydrolysis +
Starch hydrolysis +
Litmus milk (peptonization) -
Simmon's citrate +

Table 2.

Biochemical characteristics of the isolate, CK-4 using the BIOLOG analysis system

Biochemical tests
+; positive reaction, −; negative reaction
Water p-Hydroxy Phenylacetic Acid +
α-Cyclodextrin Itaconic Acid
Dextrin + α-Keto Butyric Acid
Glycogen α-Keto Glutaric Acid +
Tween 40 α-Keto Valeric Acid
Tween 80 D,L-Lactic Acid +
N-Acetyl-D-galactosamine Malonic Acid
N-Acetyl-D-glucosamine + Propionic Acid +
Adonitol + Quinic Acid
L-Arabinose D-Saccharic Acid
D-Arabitol + Sebacic Acid
D-Cellobiose + Succinic Acid +
i-Erythritol + Bromo Succinic Acid +
D-Fructose + Succinamic Acid +
L-Fucose + Glucuronamide
D-Galactose + L-Alaninamide
Gentiobiose + D-Alanine
α-D-Glucose + L-Alanine +
m-Inositol + L-Alanyl-glycine +
α-D-Lactose L-Asparagine +
Lactulose L-Aspartic Acid +
Maltose + L-Glutamic Acid +
D-Mannitol + Glycyl-L-Aspartic Acid
D-Mannose + Glycyl-L-Glutamic Acid
D-Melibiose L-Histidine +
β-Methyl-D-Glucoside + Hydroxy-L-Proline +
D-Psicose + L-Leucine
D-Raffinose L-Ornithine +
L-Rhamnose + L-Phenylalanine +
D-Sorbitol + L-Proline +
Sucrose + L-Pyroglutamic Acid +
D-Trehalose + D-Serine
Turanose + L-Serine
Xylitol + L-Threonine
Methyl Pyruvate + D,L-Carnitine
Mono-Methyl-Succinate + γ-Amino Butyric Acid
Acetic Acid + Urocanic Acid +
Cis-Aconitic Acid + Inosine +
Citric Acid Uridine +
Formic Acid + Thymidine
D-Galactonic Acid Lactone + Phenyethylamine
D-Galacturonic Acid Putrescine
D-Gluconic Acid 2-Aminoethanol
D-Glucosaminic Acid 2,3-Butanediol
D-Glucuronic Acid Glycerol +
α-Hydroxy Butyric Acid D,L-α-Glycerol Phosphate
β-Hydroxy Butyric Acid + Glucose-1-Phosphate +
γ-Hydroxy Butyric Acid + Glucose-6-Phosphate +