The Korean Society For Biotechnology And Bioengineering
[ Research Paper ]
Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 36, No. 2, pp.139-144
ISSN: 1225-7117 (Print) 2288-8268 (Online)
Print publication date 30 Jun 2021
Received 26 Apr 2021 Revised 25 Jun 2021 Accepted 27 Jun 2021
DOI: https://doi.org/10.7841/ksbbj.2021.36.2.139

Biorenovation 생물전환 기법을 이용한 브로콜리 추출물의 B16F10 melanoma 세포에 대한 미백효과

이경미1 ; 김정환1 ; 강경환2 ; 황준호2 ; 김승영1, *
1선문대학교 제약생명공학과
2(주)제주사랑농수산
Whitening Activities of Brassica oleracea sprout Biorenovated Extract in B16F10 Melanoma Cells
Kyung-Mi Lee1 ; Jung-Hwan Kim1 ; Kyeong-Hwan Kang2 ; Joon-Ho Hwang2 ; Seung-Young Kim1, *
1Department of Pharmaceutical Engineering & Biotechnology, Sunmoon University, Asan 31460, Korea
2Jeju Love Co., Ltd, Jeju 63358, Korea

Correspondence to: Department of Pharmaceutical Engineering & Biotechnology, Sunmoon University, Asan 31460, Korea Tel.: +82-41-530-2390, Fax: +82-41-530-2939 E-mail: sykim01@sunmoon.ac.kr

© 2021 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering

Abstract

Biorenovation is a method of structurally modifying natural components based on microbial enzymes to improve biological efficacy or reduce cytotoxicity. In this study, we investigated the cytotoxicity and anti-melanogenic activity of Brassica oleracea sprout extract (BO) and biorenovated BO (BOBR) in α-MSH stimulated B16F10 melanoma cells. BOBR reduced the cytotoxicity and strongly suppressed the melanin synthesis, tyrosinase activity and melanogensis-related protein expression compared to BO at 50 to 200 μg/mL. In addition, 200 μg/mL BOBR inhibited the melanogensis effect by α-MSH to the level of the non-treated control. These results indicate that BOBR could be a novel skin-lightening source for cosmetics and pharmaceutical ingredients.

Keywords:

Brassica oleracea sprout, biorenovation, B16F10 melanoma cell, tyrosinase, melanin

1. INTRODUCTION

자외선 및 α-melanocyte stimulating hormone (α-MSH) 등의 호르몬 자극은 피부 표피 기저층에 존재하는 멜라노사이트를 활성화하고 microphthalmia-associated transcription factor (MITF)를 자극하여 [1-2] tyrosinase를 함유하는 멜라노좀을 생성한다 [3]. Tyrosinase는 멜라닌 합성의 속도 결정 단계로 작용하는 효소로써 tyrosinase related protein-1 (TRP-1), tyrosinase related protein-2 (TRP-2)의 전사 활성을 조절하며, 아미노산의 일종인 tyrosine과 반응하여 DOPA와 DOPA-quinone으로 대사되어 5,6-dihydroxyl indole의 단일중합체인 흑갈색의 eumelanin을 형성한다 [4-6]. 합성된 멜라닌은 피부 표피 세포로 이동하여 피부색을 결정하고 자외선으로부터 피부를 보호하는 역할을 하지만 과발현 시, 색소침착과 노인성 흑자를 유발하고 활성 산소를 발생시켜 노화를 가속한다고 보고되고 있다 [7-8]. 따라서 현재 시판되고 있는 화장품은 피부 자극 감소 및 노화 지연을 위해서 arbutin, hydroquinone, azelaic acid 등의 성분을 함유하고 있으나 최근에 이러한 합성 화합물의 세포 독성과 접촉성 피부염 등이 보고되면서 지속적인 사용에 대한 안정성 문제가 대두되었다 [9]. 이에 부작용을 최소화하고 melanogenesis 관여인자를 효과적으로 억제할 수 있는 천연소재 탐색이 활발하게 이루어지고 있다 [10-11].

기능성 소재 탐색을 위해서 최근 친환경 기술과의 접목을 통한 천연물의 약리 활성 증대 및 새로운 생리 활성 기작에 대한 연구개발이 이루어지고 있는 가운데 [12], 본 연구에서는 천연소재의 생리활성 증진을 위해 생물전환 기법 중 하나인 biorenovation 공법을 활용하였다. Biorenovation 공법이란 미생물의 대사작용을 이용한 친환경적인 생물전환 기술로서 천연물이 본래 갖고 있는 독성을 감소시키거나, 생리활성이 우수한 유도체 산물을 유도하여 항산화, 항염 및 미백 등의 생리활성을 증진한다고 보고되어있다 [13]. 따라서 biorenovation 공법을 브로콜리 (Brassica oleracea)새싹 추출물에 적용하여 소재의 가치 증진에 기여하고자 하였다.

브로콜리는 십자화 과에 속하는 짙은 녹색 채소로 '녹색 꽃 양배추'라고도 불리는 이탈리아 양배추에 대한 품종 개량종이며, 다양한 활성을 가진 sulforaphane, indole, β-carotene, rutin, ascorbic acid, quercetin 등을 다량 함유하여 예로부터 암, 위장 기능, 안과 질환 예방을 위해 사용되었으나 미백 활성은 미미하다고 보고되고 있다 [14-18]. 따라서 biorenovation 생물 전환 기법을 통해 기존 소재의 생리활성 증진을 유도하고 B16F10 melanoma 세포를 사용하여 미백 활성을 확인해봄으로써 미백 화장품 소재로서의 활용 가치를 탐색해보고자 한다.


2. MATERIALS AND METHODS

2.1. 재료 및 추출

본 연구에 사용된 브로콜리 새싹은 2017년 12월 20일에 제주특별자치도 제주시 구좌읍 행원로에서 채집되었으며, 열수 추출 후 동결 건조된 분말 상태의 시료를 ㈜제주사랑농수산으로부터 공급받았다. 이후 멸균수를 사용하여 100 mg/ml 농도의 stock을 제조하고 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM, Welgene, Gyeongsan, KOR)으로 희석하여 실험에 사용하였다.

2.2. 실험 재료 및 세포배양

Murine B16F10 melanoma cell을 ATCC사 (American Type Cell Culture, USA)로부터 분양 받아 100 units/mL Penicillin-Streptomycin과 10% Fetal Bovine Serum (FBS, Welgene, Gyeongsan, KOR)가 함유된 DMEM을 사용하였으며, 37oC, 5% CO2 조건에서 3일 간격으로 계대 배양하였다. Melanoma cell 자극에 사용한 α-MSH와 tyrosinase activity 측정에 사용한 L-3,4-dihydroxyphenylalanin (L-DOPA) 시약은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.

2.3. 미생물 배양 및 biorenovation 반응

Biorenovation 생물전환 반응에 사용한 미생물은 Bacillus amyloliquefaciens (KCTC 43033) 균주이며 미생물센터에서 분양 받았다. 이후 균주의 증식을 위해 Nutrient Broth (Beef extract 3.0 g/L, Peptone 5.0 g/L) 배지를 사용하여 30oC, 150 rpm 조건으로 16시간 동안 배양하고 4,500 rpm에서 15분 동안 원심 분리하였으며 수득한 pellet을 PG buffer (50 mM Phosphate buffer, 2% Glycerin)로 2회 세척하고 동일 buffer에 균 pellet을 현탁하여 대조군 (BA)으로 사용하였다. 균 pellet을 현탁한 PG buffer에 브로콜리 열수 추출물 (BO) 100 mg을 첨가하여 30oC, 150 rpm 조건에서 72시간 동안 생물전환 (BOBR) 하였다. 이후 원심 분리를 통해 얻은 상등액을 감압 농축하고 –110oC에서 동결 건조하여 분말화하였다.

2.4. Biorenovation 전환물의 HPLC 분석

HPLC 분석 기기는 LC-2030C PLUS UV (Shimadzu, Kyoto, JPN)를 이용하였으며, column은 Sigma-Aldrich 사의 Shimpack GIS C18 column (5 μm ODS, 250 × 4.6 mm id)을 사용하여 254 nm의 파장에서 검출하였다. 분석조건으로 column 온도는 40oC, 유속은 1.0 mL/min으로 설정하였으며 이동상은 0.1% trifluoroacetic acid (TFA, SAMCHUN, KOR)를 함유한 H2O (Solvent A)와 acetonitrile (Solvent B, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)를 사용하여 0 min에서 30 min까지 solvent B를 10%에서 100%로 증가시키는 조건으로 각 시료를 비교분석하였다.

2.5. 세포 생존율 측정

생물전환에 사용된 B. amyloliquefaciens 추출물 (BA), BO 그리고 BOBR의 B16F10 melanoma cell에 대한 세포생존율을 확인하기 위하여 24 well plate에 B16F10 cell을 1.0 × 104 cells/well로 분주한 후 37oC, 5% CO2 조건의 incubator에서 24시간 전 배양하고 α-MSH (200 nM)와 각 시료를 농도별로 (50, 100, 200 μg/mL) 동시 처리하여 72시간 배양하였다. 이후 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)시약을 첨가하여 37°C, 5% CO2 조건에서 3시간 동안 반응시킨 다음 상등액을 제거하고 dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 첨가하여 formazan 결정을 용해하였다. Microplate reader를 사용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였고 무 처리군 (control)의 세포 생존율과 비교하여 시료 (BO, BOBR) 처리군의 세포생존율을 분석하였다.

2.6 Melanin contents 측정

BO와 BOBR의 멜라닌 합성 억제 효능을 비교하기 위해 B16F10 melanoma 세포를 37°C, 5% CO₂ incubator에서 4.0 × 102 cells/well로 24시간 전 배양한 후 α-MSH (200 nM)와 BO 및 BOBR을 50, 100, 200 μg/mL 농도로 동시 처리하여 72시간 배양하였다. 이후 세포를 PBS (Phosphate buffered saline, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)로 세척하고 trypsin-EDTA (Gibco, Grand Island, NY, USA)를 처리하여 회수하였으며 1% protease inhibitor (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 함유한 radioimmunoprecipitation assay buffer (RIPA buffer, Biosesang, Seongnam, Korea)를 첨가한 뒤 micro high speed centrifuge (13,000 rpm, 30min)를 사용하여 원심 분리하였다. 상등액을 분리하고 얻은 pellet에 10% DMSO가 함유된 1 N NaOH (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)로 용해하고 90oC heating block에서 1시간 동안 반응시킨 후 Microplate reader를 사용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였고, α-MSH 처리군에 대하여 통계처리를 시행하여 시료 (BO, BOBR) 처리 시 melanin contents 억제활성을 분석하였다.

2.7. Tyrosinase activity 측정

B16F10 melanoma cell을 6 well plate에 4.0 × 104 cells/well의 농도로 분주하여 37oC, 5% CO2 조건에서 24시간 전 배양한 후 각각의 시료 (BO, BOBR)와 α-MSH (200 nM)을 동시 처리하고 72시간 배양하여 BO와 BOBR 처리군의 tyrosinase activity를 비교하였다. 이후 상기와 동일한 방법으로 lysis 하여 세포를 수득하고 13,000 rpm에서 30분간 원심 분리한 상등액을 BCA protein assay kit (Thermo Scientific, USA)를 사용하여 정량하였다. 정량한 단백질에 100 mM sodium phosphate buffer (pH 6.8)를 용매로 제조한 2 mg/mL L-DOPA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 첨가하여 2시간 동안 37oC shaking incubator에서 반응시킨 후 형성된 DOPA chrome의 양을 490 nm에서 측정하여 상대적인 tyrosinase 활성을 측정하였다. 측정된 결과값은 α-MSH 처리군의 흡광도 값과 비교하여 분석하였다.

2.8. Western Blot analysis

BO, BOBR 처리 시 melanogenesis 관여인자의 발현 변화를 비교하기 위하여 B16F10 melanoma cell을 37oC, 5% CO2 인큐베이터에서 4.0 × 104 cells/well로 48시간 전 배양하고 α-MSH 와 시료를 동시 처리하여 48시간 동안 배양하였다. 100 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 200mM Na3VO4 및 protease inhibitor를 함유한 RIPA buffer로 단백질을 lysis하고 13,000 rpm에서 30분간 원심 분리한 상등액을 BCA protein assay kit (Thermo Scientific, USA)를 이용하여 계산하였다. 정량한 단백질은 10% SDS-PAGE에 전기영동하고 poly-vinylidene difluoride (PVDF) membrane (Bio-rad, USA)에 전이하여 5% skim milk (BD, Franklin Lakes, USA)가 함유된 TBST (Tris-buffered saline containing 0.1%, Tween 20)에 넣고 상온에서 1시간 30분 blocking 하였다. Blocking 된 membrane은 TBST를 사용하여 10분 간격으로 4회 세척하고 1차 항체 (MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase, 1 : 1000, Santa cruz Biotechnology, USA)를 처리하여 4oC에서 overnight하여 반응시켰다. 반응이 끝난 후 TBST로 4회 세척하고 HRP (horseradish peroxidase)가 결합된 anti-mouse IgG (1 : 1,000, Cell signaling, USA) 2차 항체와 상온에서 2시간 반응시킨 뒤 TBST로 4회 세척하였다. 이후 ECL kit (Bio-rad, USA)를 사용하여 imaging densitometer (model GS-700, Bio-rad, USA)를 통해 측정하였으며 imageJ program (NIH, Bethesda, MD, USA)을 이용하여 β-actin 대비 MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase 단백질 발현량의 면적을 수치화한 후 그래프로 나타내고 α-MSH 처리군에 대하여 비교분석하였다.

2.9. 통계처리

모든 결과값은 최소한 3번 이상의 독립적인 실험을 통해 평균±표준편차로 나타내었고 대조군과 실험군 사이의 통계학적 유의성 검증을 위해 student-t test를 시행하였다. 또한 유의성 검정은 *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 수준에서 실시하였다.


3. RESULTS AND DISCUSSION

3.1. Biorenovation 전환물의 HPLC 분석

Biorenovation 기법은 천연물의 생리활성 증대를 유도하는 생물전환 기법으로 본 연구에서는 브로콜리 새싹 추출물에 적용하였으며, bioroenovation 생물전환 기법에 의해 전환된 브로콜리 새싹 추출물 (BOBR)과 브로콜리 새싹 추출물 (BO), 기질을 넣지 않고 동일하게 biorenovation 생물전환한 반응물의 상등액 (BA, 대조군)을 HPLC를 통해 분석하였다. 그 결과 BO의 retention time 11min에서 검출되는 피크가 생물전환 후 (BOBR) 감소하였고 BOBR의 retention time 5-10.9, 16-18 및 23 min에서 기존 peak로 부터의 함량 변화와 신규 peak 생성을 확인하였다 (Fig. 1). 이는 기질 (BO) 환경에서, 미생물의 물질대사에 의해 기존 성분이 전환되고 미지의 물질이 생성되어 신규 peak로 나타난 것으로 사료된다 [17]. 이러한 생물전환 과정에서 생긴 유도체 및 미지의 물질이 생리학적 활성 변화를 유도하는지 알아보기 위해 B16F10 cell를 사용하여 미백 활성 실험을 진행하였다.

Fig. 1.

HPLC analysis of Brassica oleracea extract (BO), Brassica oleracea biorenovated extract (BOBR) and Bacillus amyloliquefaciens (BA). The chromatogram showed BO, BOBR, and BA.

3.2. 세포 생존율 측정

세포 생존율 측정을 위해 사용한 MTT는 미토콘드리아의 탈수소효소에 의하여 tetrazolium의 ring 구조가 끊어져 청자색을 띄는 비수용성의 MTT formazan으로 환원되며, formazan 환원 정도를 측정하여 살아있는 세포를 정량적으로 평가할 수 있다 [19]. 따라서 시료의 세포 독성 유무를 확인하기 위하여 α-MSH로 자극된 B16F10 cell에 BA, BO, BOBR을 각각 50, 100, 200 μg/mL 농도로 처리하여 세포 생존율을 측정한 결과, 최대농도 처리군에서 94.7 ± 7.0%, 81.3 ± 1.0% 그리고 101.3 ± 5.3%의 세포 생존율을 확인하였다 (Fig. 2). 기존 추출물 (BO)은 생물 전환 후 (BOBR) 세포 독성이 감소하였으며 BA는 melanoma cell에 대하여 유의미한 독성을 나타내지 않았다. 이러한 세포 생존율 차이는 기존 추출물 (BO)이 갖는 세포 독성이 생물전환 과정에서 경감된 것으로 사료되며, 이후 실험은 단백질 정량 후 진행하여 B16F10 cell에 대한 BO와 BOBR의 세포 생존율 차이가 미백활성 비교에 영향을 미치지 않도록 하였다.

Fig. 2.

Cell viability of BO, BOBR and BA on B16F10 melanoma cell by the MTT assay. After B16F10 cells (1 × 104 cells/well) were started in medium for 24 h the cells were treated α-MSH (200 nM) with various concentrations of BO and BOBR extract (50, 100, and 200 μg/mL) for 72h. Each values represents as percentages compared to the respective values obtained for the control. The values represent mean ± SD. *p < 0.05. **p < 0.01. BO: Brassica oleracea extract, BOBR: biorenovated Brassica oleracea extract, BA: Bacillus amyloliquefaciens.

3.3. Melanin contents 측정

B16 melanoma cell에 대한 α-MSH 자극은 세포막 수용체와 상호작용하여 멜라닌 세포의 발현을 유도하고 색소 증가에 관여하는 것으로 보고되고 있다 [20]. BO, BOBR 추출물이 멜라닌 세포에 미치는 영향을 알아보기 위해 α-MSH로 자극된 melanoma cell에 각각의 추출물을 처리하여 melanin contents를 비교하였다. 그 결과 α-MSH 단독 처리군과 비교하여 BO 처리군은 최대 농도인 200 μg/mL에서 5.6 ± 2.1%의 미미한 멜라닌 합성 억제를 보인 반면 같은 농도의 BOBR 처리군에서는 무 처리군 (control)보다 낮은 멜라닌 생성량을 나타냈다 (Fig. 3). BO 처리군에서 나타난 멜라닌 합성량 감소는 시료 (BO)가 가지는 미백활성이 아닌 적은 멜라닌 형성 세포 수에 비례하여 상대적으로 생성되는 멜라닌 양이 적기 때문에 나타난 결과로 사료되며 [21], 생물전환 기법에 의해 전환된 BOBR 처리군의 멜라닌 합성 저해 활성은 eumelanin을 조절하는 단백질과 효소의 발현을 저해하여 나타난 것으로 사료된다. 이후 BOBR의 미백 소재로서의 가치를 판단하고자 melanogenesis 활성을 조절하는 신호 전달 경로 및 단백질 억제 효능을 측정하였다.

Fig. 3.

Inhibitory effects of BO and BOBR extract on melanin synthesis of α-MSH stimulated B16F10 melanoma cells. B16F10 cells (4 × 104 cells/well) were started in medium for 24h. After the cells were stimulated with α-MSH (200 nM) and treated with 50, 100, and 200 μg/mL of BO and BOBR extract for 96 hours. The picture showed melanin content was measured by absorbance at 405 nm. The values represent mean ± SD. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. BO: Brassica oleracea extract, BOBR: biorenovated Brassica oleracea extract.

3.4. Tyrosinase activity 측정

Tyrosinase은 멜라닌 합성의 초기 단계에 관여하는 주요 효소로 L-DOPA를 기질로 사용하여 dopachrome 생성량 측정을 통해 상대적인 tyrosinase 활성 측정이 가능하다 [22]. 따라서 BO, BOBR 처리 시 tyrosinase 활성 억제를 알아보기 위해 dopachrome 생성량을 측정한 결과, BO 처리군은 α-MSH 자극으로 증가된 tyrosinase를 억제하지 못하였으나 BOBR 처리군에서는 농도 의존적인 저해 활성을 보이며 200 μg/mL에서는 무 처리군과 유사한 수준의 tyrosinase activity를 나타내었다 (Fig. 4). 이러한 결과는 BO 내 존재하는 다양한 성분이 biorenovation 생물전환 기법에 의해 전환되어 melanogenesis 활성 조절에 영향을 주었으며, tyrosinase의 활성을 억제하였다고 사료된다. 이후 BO와 BOBR의 멜라닌 합성 관여 인자의 발현 억제 활성을 알아보기 위해 추가적인 실험을 진행하였다.

Fig. 4.

Inhibitory effects of BO and BOBR extract on tyrosinase activity in α-MSH stimulated B16F10 melanoma cells. B16F10 cells (4 × 104 cells/well) were started in medium for 24 h. After the cells were stimulated with α-MSH (200 nM) and treated with 50, 100, and 200 μg/mL of BO and BOBR extract for 72 hours. Tyrosinase activity was measured by absorbance at 490 nm. The values represent mean ± SD. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. BO: Brassica oleracea extract, BOBR: biorenovated Brassica oleracea extract.

3.5 Melanogenesis 관여인자 발현 측정

Melanoma 세포는 α-MSH 자극을 받으면 MITF 전사가 활성화되고 단계적으로 TRP-1, TRP-2가 발현되어 멜라닌 생성을 유도하는 것으로 알려져 있다 [23]. B16F10 세포에 α-MSH를 처리하여 멜라닌의 합성을 유도하고 BO 및 BOBR을 농도별 (50, 100, 200 μg/mL)로 첨가하여 melanogenesis의 활성을 조절하는 단백질을 측정하였다. 그 결과, BO 처리군은 α-MSH 자극에 의해 증가된 멜라닌 합성 관여 인자들의 발현을 저해하지 않았으나, BOBR 처리군은 TRP-1, TRP-2, tyrosinase 및 MITF의 발현을 농도 의존적으로 저해하였다. 특히 BOBR은 200 μg/mL 농도에서의 MITF와 tyrosinase은 α-MSH 무 처리군과 유사한 수준의 단백질 발현량을 나타내며 우수한 MITF 전사 억제 활성을 나타내었다 (Fig. 5). 이 결과는 BOBR이 MITF 전사인자의 발현을 효과적으로 억제하여 하위 인자인 TRP-1, TRP-2 및 tyrosinase 발현까지 저해한 것으로 사료된다.

Fig. 5.

Western blot analysis of the expression of MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase in α-MSH stimulated B16F10 melanoma cells. Protein expression levels of TRP-1 (a), TRP-2 (b), tyrosinase (c), MITF (d) in α-MSH simulated B16F10 melanoma Cells. After B16F10 cells (4 × 104 cells/well) were started in medium for 72h, the cells were stimulated with α-MSH (200 nM) and treated with 50, 100, and 200 μg/mL of BO and BOBR extract for 24 hours. Western blot analysis of cell lysates was performed using indicated antibodies. Proteins were visualized using an ECL detection system and β-actin expression was used as a control for normalization of target proteins. The values represent mean ± SD. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. BO: Brassica oleracea extract, BOBR: biorenovated Brassica oleracea extract.


4. CONCLUSION

본 연구에서는 biorenovation 공법을 사용하여 브로콜리 새싹 추출물을 생물전환하였으며, 이를 α-MSH로 자극된 B16F10 melanoma cell에 처리하여 멜라닌 합성량 및 관여 인자의 발현량을 확인하여 미백 소재로서의 활성을 입증하고자 하였다. HPLC 분석을 통해 기존 소재 (BO) 내 존재하는 성분들이 biorenovation 생물전환 기법에 의해 전환되어 신규 peak가 생성된 것을 확인하였으며 BO, BOBR을 50, 100, 200 μg/mL 농도로 처리하여 실험을 진행한 결과 생물전환 후 (BOBR) 기존 추출물 (BO)보다 세포 독성이 감소하였다. 또한 BOBR 처리군에서 농도 의존적인 melanogenesis 저해활성을 확인하였고 200 μg/mL 농도에서 멜라닌 생성량, tyrosinase 및 MITF 발현은 α-MSH를 처리하지 않은 무 처리군과 유사한 수준으로 저해되었다. 이는 biorenovation 생물전환 과정에서 기존 소재 (BO) 내 성분에 대한 구조변화가 유도됨으로써 [13], 생성된 대사물질이 독성 감소에 영향을 미친 것으로 사료된다. 또한 생물전환 과정에서 변환된 성분이 melanogenesis를 조절하여 MITF, tyrosinase 및 TRP-1, TRP-2를 효과적으로 저해하였고 MITF의 발현 및 관련된 하위인자인 TRP-1, TRP-2 및 tyrosinase의 발현이 저해되었다. 이는 MAPK 신호전달 과정을 통해 이루어졌을 가능성을 시사한다 [24]. 이러한 결과를 통해 biorenovation 생물전환 기법은 천연물의 생리활성을 증대할 수 있는 친환경 기술임을 입증하였으며, 생물전환된 브로콜리 새싹 추출물의 미백 화장품 및 기능성 식품 소재로서의 이용 가능성을 시사한다. 또한, biorenovation 생물전환 기법에 의하여 미백 활성이 증가된 성분에 관한 연구가 추가로 진행되어야 할 것으로 판단된다.

Acknowledgments

본 연구는 중소벤처기업부와 한국산업기술진흥원의 “지역특화산업육성+(R&D) 지역스타기업육성사업”의 지원을 받아 수행된 연구결과입니다(S2899599).

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Fig. 1.

Fig. 1.
HPLC analysis of Brassica oleracea extract (BO), Brassica oleracea biorenovated extract (BOBR) and Bacillus amyloliquefaciens (BA). The chromatogram showed BO, BOBR, and BA.

Fig. 2.

Fig. 2.
Cell viability of BO, BOBR and BA on B16F10 melanoma cell by the MTT assay. After B16F10 cells (1 × 104 cells/well) were started in medium for 24 h the cells were treated α-MSH (200 nM) with various concentrations of BO and BOBR extract (50, 100, and 200 μg/mL) for 72h. Each values represents as percentages compared to the respective values obtained for the control. The values represent mean ± SD. *p < 0.05. **p < 0.01. BO: Brassica oleracea extract, BOBR: biorenovated Brassica oleracea extract, BA: Bacillus amyloliquefaciens.

Fig. 3.

Fig. 3.
Inhibitory effects of BO and BOBR extract on melanin synthesis of α-MSH stimulated B16F10 melanoma cells. B16F10 cells (4 × 104 cells/well) were started in medium for 24h. After the cells were stimulated with α-MSH (200 nM) and treated with 50, 100, and 200 μg/mL of BO and BOBR extract for 96 hours. The picture showed melanin content was measured by absorbance at 405 nm. The values represent mean ± SD. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. BO: Brassica oleracea extract, BOBR: biorenovated Brassica oleracea extract.

Fig. 4.

Fig. 4.
Inhibitory effects of BO and BOBR extract on tyrosinase activity in α-MSH stimulated B16F10 melanoma cells. B16F10 cells (4 × 104 cells/well) were started in medium for 24 h. After the cells were stimulated with α-MSH (200 nM) and treated with 50, 100, and 200 μg/mL of BO and BOBR extract for 72 hours. Tyrosinase activity was measured by absorbance at 490 nm. The values represent mean ± SD. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. BO: Brassica oleracea extract, BOBR: biorenovated Brassica oleracea extract.

Fig. 5.

Fig. 5.
Western blot analysis of the expression of MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase in α-MSH stimulated B16F10 melanoma cells. Protein expression levels of TRP-1 (a), TRP-2 (b), tyrosinase (c), MITF (d) in α-MSH simulated B16F10 melanoma Cells. After B16F10 cells (4 × 104 cells/well) were started in medium for 72h, the cells were stimulated with α-MSH (200 nM) and treated with 50, 100, and 200 μg/mL of BO and BOBR extract for 24 hours. Western blot analysis of cell lysates was performed using indicated antibodies. Proteins were visualized using an ECL detection system and β-actin expression was used as a control for normalization of target proteins. The values represent mean ± SD. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. BO: Brassica oleracea extract, BOBR: biorenovated Brassica oleracea extract.