The Korean Society For Biotechnology And Bioengineering
[ Research Paper ]
Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 36, No. 2, pp.145-153
ISSN: 1225-7117 (Print) 2288-8268 (Online)
Print publication date 30 Jun 2021
Received 08 Apr 2021 Revised 25 Jun 2021 Accepted 28 Jun 2021
DOI: https://doi.org/10.7841/ksbbj.2021.36.2.145

형질전환 벼 세포 배양에서 Sorbitol과 Hexokinase 저해제 조합 전략을 통한 Acid α-glucosidase 생산성 증대

정창현 ; 최홍열 ; 복다은 ; 양유정 ; 이현아 ; 이지아 ; 최은수 ; 김동일*
인하대학교 공과대학 생명공학과
Enhanced Production of Acid α-glucosidase by Combined Use of Sorbitol and Hexokinase Inhibitor in Transgenic Rice Cell Cultures
Chang-Hyun Jung ; Hong-Yeol Choi ; Da Eun Bok ; Yu Jeong Yang ; Hyeon Ah Lee ; Ji Ah Lee ; Eun Soo Choi ; Dong-Il Kim*
Department of Biological Engineering, Inha University, Incheon 22212, Korea

Correspondence to: Department of Biological Engineering, Inha University, Incheon 22212, Korea Tel: +82-32-860-7515, Fax: +82-32-872-4046 E-mail: kimdi@inha.ac.kr

© 2021 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering

Abstract

Acid α-glucosidase (GAA) was produced in transgenic rice cell suspension cultures. In order to solve the problems using RAmy3D promoter for the efficient expression of GAA under sugar starvation condition, sorbitol was used as an alternative carbon source. Cell viability could be prolonged up to 27 days when sorbitol was present. Protein expression could also be enhanced. In addition, N-acetyl glucosamine, a hexokinase inhibitor, was used as a regulator for the RAmy3D promoter to shorten the incubation time with improved GAA expression. When sorbitol and N-acetyl glucosamine were used together, production of GAA was higher than that with sorbitol only. In order to optimize the combination condition, various experimental sets were designed and 60% increased protein could be obtained. In conclusion, optimized utilization of sorbitol as an alternative carbon source with N-acetyl glucosamine in transgenic rice cell suspension cultures was found to be the best condition for the enhanced expression of GAA using RAmy3D promoter.

Keywords:

acid α-glucosidase, transgenic plant cell cultures, sorbitol, N-acetyl glucosamine

1. INTRODUCTION

리소좀은 60가지 이상의 가수분해 효소를 가지고 있는 세포 내 소기관이다. 리소좀 축적 질환 (lysosomal storage disease, LSD)은 리소좀 내 가수분해 효소의 결함으로 인하여 분해되지 못한 기질들이 축적되는 유전질환이다. 기질이 축적되면 세포의 기능에 문제가 유발되며, 뇌, 내장, 뼈 및 다양한 조직과 장기에도 심각한 장애를 유발한다. 그 결과 환자들은 막대한 비용을 치료비로 지출하고 있으며, 심한 경우 사망에 이르기도 한다 [1].

LSD는 현재 50가지 이상 발견되었으며 Gaucher 병, Fabry 병, Pompe 병 등이 대표적이다. LSD의 치료를 위해서는 외부에서 효소를 직접 투여하는 효소 대체 치료법 (enzyme replacement therapy, ERT)이 주로 사용되고 있다 [2]. Pompe 병은 acid α-glucosidase (GAA) 효소의 결함으로 인하여 조직에 글리코겐이 축적되는 질환이다. Pompe 병은 근육약화, 저혈압, 심근병증 등 호흡기, 심장계, 골격계 등 다양한 부분에 손상을 주며, 대부분은 심혈관계 질환으로 인하여 사망에 이른다 [3,4]. Pompe 병의 치료는 ERT를 통해서 이루어지며, 미국 Genzyme사에서 동물세포인 CHO 세포를 이용하여 생산한 Myozyme과 Lumizyme이 승인을 받아 현재 치료제로 사용되고 있다 [5].

재조합 단백질을 생산할 수 있는 방법으로는 동물세포나 미생물, 식물을 숙주로 이용하는 등 다양한 시스템이 존재한다. 그 중 식물을 이용한 재조합 단백질 생산은 오래전부터 연구가 진행되어 왔으며, 많은 장점들을 가지고 있다 [6]. 식물세포는 동물세포와 유사한 post-translational modification 과정의 수행이 가능하여 복잡한 구조의 재조합 당단백질을 생산하기 위한 세포주로 사용될 수 있으며, 최근 효소 치료제나 치료용 항체 등을 생산하는데 이용되고 있다. 식물유래 생물의약품 (plant-made pharmaceutical)이란 치료를 목적으로 형질전환 된 식물세포에서 생산되는 재조합 단백질을 말인하대학교 공과대학 생명공학과 한다. 식물유래 생물의약품은 의약품 생산비용의 절감을 가져올 수 있고 독성이 적으며, 적절한 단백질 접힘이 일어나기 때문에 당단백질이거나 구조가 복잡한 의약품의 생산이 가능하다.

2012년에는 이스라엘의 Protalix 사가 당근 세포를 이용하여 Gaucher 병 치료제인 Elelyso를 생산하여 미국 FDA의 허가를 받아 판매 중에 있다 [7]. Elelyso의 허가 및 사용은 식물 유래 생물의약품의 상업화 가능성을 보여주었다 [8]. 또한 2014년에는 에볼라 치료제로 담배세포를 이용한 ZMapp이 생산되어 긴급 사용되기도 하였다 [9].

대표적으로 많이 이용되는 형질전환 식물세포로는 벼 세포를 들 수 있다. 벼의 α-amylase 3D (RAmy3D) 프로모터는 벼 자체에서 발현되는 프로모터이고 일반적으로 당이 고갈된 환경에서 강하게 발현되는 유도형 프로모터로 원하는 시기에 배지교환을 통하여 높은 수율로 단백질을 생산할 수 있다는 장점을 가지고 있다. 그러나 당이 고갈된 환경에서 단백질이 발현되기 때문에 필연적으로 세포가 사멸하게 되고, 이는 단백질의 생산량을 감소시킬 뿐만 아니라 세포 사멸로 인해 분비되는 단백질 분해효소들에 의하여 목적 단백질의 품질에도 부정적인 영향을 미칠 수 있다 [10]. 따라서 RAmy3D 프로모터를 발현시키면서 세포 생존도를 유지하여 세포 사멸을 지연시킬 수 있는 당이 아닌 대체 탄소원의 사용에 대한 연구가 필요하다 [11].

식물세포배양에서 가장 흔히 사용하는 탄소원은 sucrose이며, 이는 분해효소에 의해 glucose와 fructose로 분리되어 소비된다. 세포주의 특성에 따라 ribose, xylose, maltose와 같은 다른 당들도 이용이 가능하다 [12]. 또한 sorbitol이나 mannitol과 같은 당알코올 역시 탄소원으로 고려될 수 있으며, 당과 당알코올은 각각 서로 다른 수용체에 의하여 세포 내로 전달되어 TCA 회로로 들어가 ATP를 생산할 수 있다 [13]. 최근에는 대체 탄소원으로서 TCA 회로상의 중간물질들을 첨가하는 연구도 이루어진 바 있다 [14].

Hexokinase는 glucose를 인산화시키는 효소로 해당과정에서 첫 번째로 작용하는 효소이다. 또한 RAmy3D 프로모터는 hexokinase에 의하여 조절된다고 알려져 있다. 이처럼 hexokinase는 식물에서 당을 인지하고, 당의 조절과 관련된 발현을 매개한다. 식물에서 탄소원은 세포의 생장과 유전자 발현에 큰 영향을 미치기 때문에 당을 인지하는 것 역시 매우 중요한 기작이다. 따라서 hexokinase 저해제의 첨가를 통하여 당을 인지하는 과정을 조절할 수 있으며, 더 나아가 RAmy3D 프로모터의 발현을 유도할 수 있다. 이러한 hexokinase 저해제로는 6-deoxyglucose, glucosamine, N-acetyl glucosamine 등이 알려져 있다 [15].

본 연구에서는 형질전환 벼 세포를 이용한 GAA의 생산에서 RAmy3D 프로모터의 당 고갈 환경에서 제기되는 문제점들을 해결하기 위하여, 대체 탄소원인 sorbitol 첨가를 통해 세포 사멸을 지연시키고 GAA의 생산량을 증대시키고자 하였다. 또한 hexokinase 저해제로 N-acetyl glucosamine을 첨가하여 단백질 생산량을 높이고자 하였다. 또한 sorbitol과 N-acetyl glucosamine을 적절한 농도로 조합한 최적의 조건을 확립하여 궁극적으로는 GAA의 생산성을 극대화하고자 하였다.


2. MATERIALS AND METHODS

2.1. 세포주 및 배양조건

본 연구에서는 acid α-glucosidase (GAA)를 생산하는 형질전환 벼 세포를 사용하였으며, 당쇄를 제어하지 않은 벼 세포주 (Oryza sativa L. cv. Donjin, GAAWT)와 gnt1 유전자를 제거하여 당쇄를 제어하면서 mannose 함량을 증대시킨 변이주 벼 세포주 (Oryza sativa L. cv. Nipponbare, GAAgnt1)를 사용하였다. GAA 당단백질의 당쇄에 mannose가 많아지면 치료제로 사용할 경우 receptor와의 부착이 효율적이어서 uptake가 증대된다. 두 세포주 모두 RAmy3D 프로모터를 포함하며 당이 고갈된 환경에서 단백질을 발현하였다.

형질전환 벼 세포의 현탁배양을 위한 생장 배지로 N6 배지를 사용하였으며, 탄소원으로 30 g/L sucrose를 첨가하였다. 또 생장 조절제로 2.0 mg/L 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D)와 0.2 mg/L kinetin을 첨가하였고, pH는 5.8로 조절하였다. 배지는 500 mL Erlenmeyer flask에 분주 후 고압증기 멸균 후 사용하였고, 배양 조건은 암조건 하에 120 rpm, 28oC로 설정하였다. 단백질 생산을 유도하기 위해서는 100 mL Erlenmeyer flask에서 sucrose를 제외한 N6 배지를 사용하였고, 그 외 다른 조건은 동일하게 수행하였다.

2.2. 세포량 및 세포생존도 측정

세포량을 확인하기 위해서 세포의 건체량(dry cell weight, DCW)을 측정하였다. 배양한 현탁세포를 Buchner funnel에서 Whatman No.1 여과지를 사용하여 감압을 하면서 배지와 분리하였다. 분리된 세포는 증류수로 세척하고 수분을 제거한 후 60oC로 설정된 건조기에서 48시간 건조하고 DCW를 측정하였다.

세포 생존도는 TTC (2,3,5-triphenyltetrazolium chloride) 환원법으로 측정하였다. FCW 0.1 g의 세포를 회수하여 eppendorf 튜브에 담아 1.5% TTC 용액 (0.05 M potassium phosphate 용액, pH 9.0) 1.6 mL을 넣어서 20oC에서 24시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 TTC 용액을 제거하고 95% 에탄올 1 mL을 첨가하여 60oC에서 30분 동안 반응시켜 세포 내 red formazan을 추출하였다. 15,000 rpm으로 30분간 원심분리한 후, 상등액만을 회수하여 spectrophotometer를 이용하여 485 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. Blank로는 95% 에탄올을 사용하였다.

2.3. 단백질 분석

Acid a-glucosidase (GAA)의 정성 분석을 위해서는 SDS-PAGE를 이용하였다. 회수한 배양액을 8% acrylamide gel로 전기 영동하여 단백질 band를 확인하였고, marker로는 Seeblue Plus2 pre-stained standard (Invitrogen, USA)를 사용하였다.

단백질 정량분석을 위해서는 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)를 이용하였다. Indirect ELISA를 수행하기 위하여 capture antibody로 mouse polyclonal GAA antibody를 사용하였고, detection antibody로는 peroxidase-labeled goat anti-mouse IgG를 사용하였다. 기질로는 ultra-TMB peroxidase substrate (Thermo)를 이용하였으며, stop solution으로는 2 M sulfuric acid를 사용하였다. 흡광도는 450 nm에서 측정하였으며 표준물질로는 Myozyme을 사용하였다.

2.4. 탄소원 분석

탄소원의 정량 분석을 위해서는 high-performance liquid chromatography (HPLC) 방법을 사용하였다. YL9100S HPLC System (Young In Chromass, Korea)을 사용하였으며, Zorbox carbohydrate column (Agilent, USA)을 통하여 분석하였다. 분석은 75% acetonitrile을 이동상으로 하여 0.8 mL/min의 속도로 25oC 조건에서 수행하였다.


3. RESULTS AND DISCUSSION

3.1. 탄소원 비교 및 선정

탄소원은 in vitro 배양에서 세포 생장에 영향을 미치는 에너지원 중 하나이며, 당과 관련된 유전자를 발현하거나 유전자 발현을 억제하는데 영향을 주기 때문에 중요한 인자이다. 일반적으로 식물체는 autotroph이기 때문에 별도로 탄소원을 첨가해주지 않아도 스스로 생장을 할 수 있다. 하지만 식물체와 달리 배양 중인 식물세포는 heterotroph와 유사하기 때문에 필수적인 영양분을 외부에서 보충해주어야 하며, 그 중 탄소원은 에너지를 생성하는데 중요한 요소이다 [16].

형질전환 벼 세포배양에서 RAmy3D 프로모터를 통해 단백질을 생산하고자 할 때는 당이 존재할 경우 발현을 억제하게 되므로 생산에 부정적인 영향을 최소화 할 수 있는 탄소원을 선정하고자 하였다. 단백질 발현에 부정적인 영향을 주지 않아야 하는 생산 단계 조건을 기준으로 sucrose, fructose, mannitol, sorbitol을 첨가하여 비교 실험을 수행하였다. 각각 80 mM 농도로 첨가하였으며, 탄소원의 소비 경향과 세포의 생존도, 단백질 발현 등을 확인하여 비교하였다. 각각의 탄소원을 80 mM 농도로 첨가하여 세포를 배양한 후, 3일마다 소비 경향을 확인하였다. 그 결과 sucrose와 fructose는 처음 3일까지 급격하게 소모되었으며, 6일차에 완전히 소모되는 것을 확인하였다. Mannitol의 경우에는 두 세포주 모두에서 소비되지 않았고, 오히려 증가하는 결과를 나타냈다. Sorbitol은 sucrose와 fructose 보다 천천히 사용되었고, wild-type 세포주 (GAAWT)의 경우 21일차에 완전히 소모되었다. 반면에 당쇄 변이 세포주 (GAAgnt1)에서는 GAAWT 세포주와 다르게 15일만에 모두 소비되었으며, 세포주에 따라 다른 양상을 보였다 (Fig. 1). 이를 좀 더 구체적으로 확인하기 위해서 sorbitol을 40, 80, 120 mM로 다르게 처리하여 소비 경향을 확인한 결과 앞에서와 마찬가지로 GAAWT 세포주에서 느리게 사용되었으며, 세포주와 상관없이 농도가 높을수록 천천히 감소하였다. 또한 그래프의 기울기를 보아 같은 속도로 sorbitol을 소비함을 알 수 있었다 (Fig. 2).

Fig. 1.

Sugar uptake profiles with various carbon sources in cell cultures using GAAWT (wild-type cell line, A) and GAAgnt1 (glycoengineered cell line, B): ◆, sucrose; ○, fructose; △, sorbitol; ●, mannitol.

Fig. 2.

Time course profiles of sorbitol uptake in cell cultures using GAAWT (A) and GAAgnt1 (B): ◆, 40 mM; ○, 80 mM; ●, 120 mM.

형질전환 벼 세포 배양에서 각각의 탄소원을 80 mM로 첨가하였을 경우 세포 생존도에 어떠한 영향을 미치는지 확인하고자 3일부터 27일차까지 3일 간격으로 당이 없는 조건을 기준으로 비교하였다. 세포 건체량 (dry cell weight)은 GAAWT와 GAAgnt1 세포주 모두에서 sucrose를 첨가한 조건에서 가장 크게 증가하였으며, 그 후 급격하게 감소하였다. Fructose 첨가시 sucrose를 첨가한 조건보다는 낮았지만 역시 급격하게 증가 후 감소하는 경향을 보였다. Mannitol의 경우 당이 없는 조건보다 약간 높은 세포량을 보였지만 대체적으로 비슷하였다. Sorbitol의 경우 천천히 소비되면서 세포량이 눈에 띄게 증가하지는 않았고 생존도를 유지할 수 있는 탄소원으로 사용할 수 있음을 확인하였다 (Fig. 3).

Fig. 3.

Effects of various carbon sources on cell mass in cell cultures with GAAWT (A) and GAAgnt1 (B): ◇, sugar-free condition; ◆, sucrose; ○, fructose; △, sorbitol; ●, mannitol.

Sorbitol을 40, 80, 120 mM 농도로 첨가한 결과 40 mM에서는 세포량이 바로 감소하기 시작하였지만 당이 없는 조건에 비하여 천천히 감소하였다. 반면 80, 120 mM에서는 세포량이 약간 증가하였다가 서서히 감소하는 경향을 보였다. GAAWT와 GAAgnt1 세포주 모두 유사한 양상을 보였지만, GAAWT에서 더 천천히 감소하였다 (Fig. 4). Fig. 5에서 볼 수 있는 것과 같이 세포 생존도는 sucrose와 fructose를 첨가한 조건에서 급격하게 증가하였다가 빠르게 감소하였다. 반면에 mannitol의 경우 당이 없는 조건과 유사하였다. Sorbitol의 경우 오랫동안 생존도가 유지되었으며, 40 mM에서는 당이 없는 조건보다는 높은 생존도를 보였다. 80, 120 mM에서는 생존도가 증가하였다가 감소하는 경향을 보였으며, 농도가 높을수록 더 좋은 생존도를 보였다. 두 세포주를 비교하였을 경우, GAAWT에서 생존도가 더 오래 유지 되었고, sorbitol이 천천히 사용됨에 따라 생존도 역시 길게 유지되는 것으로 생각된다 (Fig. 6).

Fig. 4.

Effects of sorbitol concentration on cell mass in cell cultures with GAAWT (A) and GAAgnt1 (B):◇, sugar-free condition; ◆, 40 mM; ○, 80 mM; ●, 120 mM.

Fig. 5.

Effects of various carbons sources on relative cell viability in cell cultures with GAAWT (A) and GAAgnt1 (B): ◇, sugar-free condition; ◆, sucrose; ○, fructose; △, sorbitol; ●, mannitol.

Fig. 6.

Effects of sorbitol concentration on relative cell viability in cell cultures with GAAWT (A) and GAAgnt1 (B): ◇, sugar-free condition; ◆, 40 mM; ○, 80 mM; ●, 120 mM.

서로 다른 탄소원의 첨가가 단백질 발현에 미치는 영향을 SDS-PAGE로 확인하였고 그 결과는 Fig. 7에 제시하였다. GAAWT 세포주에서는 3일차에 당이 없는 조건에서 희미하게 GAA가 발현되었지만 나머지 조건에서는 잘 나타나지 않았다. 15일차에는 80, 120 mM의 sorbitol을 처리한 조건에서만 GAA 밴드가 보이지 않았으며 나머지 조건에서는 비슷한 결과를 보였다. 27일차에는 모든 조건에서 GAA가 발현되지만 상대적으로 80, 120 mM의 sorbitol을 처리한 경우 희미하게 관찰되었다. GAAgnt1 세포주에서는 3일차에 모든 조건에서 GAA가 발현되었으며, sucrose와 fructose를 첨가한 조건에서는 다른 조건에 비하여 낮은 발현을 보였다. 15일차에서 sorbitol 80, 120 mM에서 발현 정도가 가장 낮았다. 27일차에 sorbitol을 80, 120 mM를 처리한 경우 다른 조건보다 높은 발현 결과를 보였다 (Fig. 8). 하지만 이 경우 단백질 발현에는 더 긴 시간이 걸렸다. Sorbitol 40 mM 처리시 세포량의 증가가 거의 없었음에도 불구하고 sucrose나 fructose를 첨가하여 세포량이 증가한 조건과 비슷한 단백질 발현을 보였다. 이는 세포당 단백질 발현량은 증가하였음을 의미한다. GAAWT 세포주에서는 sorbitol의 첨가가 세포의 생존도에는 긍정적인 영향을 미쳤으나 단백질 발현에는 뚜렷한 효과를 보이지 않았다. 반면에 GAAgnt1 세포주에서 sorbitol은 생존도뿐만 아니라 단백질 발현에도 긍정적인 영향을 미쳤다. 이를 통하여 두 세포주 간의 차이를 확인하였으며, GAAgnt1에서 sorbitol의 대체 탄소원으로서의 사용 가능성을 알 수 있었다.

Fig. 7.

SDS-PAGE analysis of GAA produced in cell cultures with GAAWT at day 3 (A) day 15 (B), and day 27 (C): lane M, SeeBlue Plus2 Pre-stained marker; 1, Myozyme (positive control); 2, control; 3, 80 mM sucrose; 4, 80 mM fructose; 5, 80 mM mannitol; 6, 40 mM sorbitol; 7, 80 mM sorbitol, 8, 120 mM sorbitol.

Fig. 8.

SDS-PAGE analysis of GAA produced in cell cultures with GAAgnt1 at day 3 (A) day 15 (B), and day 27 (C): lane M, SeeBlue Plus2 Pre-stained marker; 1, Myozyme (positive control); 2, control; 3, 80 mM sucrose; 4, 80mM fructose; 5, 80 mM mannitol; 6, 40 mM sorbitol; 7, 80 mM sorbitol; 8, 120 mM sorbitol.

당알코올은 일반적으로 식물세포배양에서 대사되지 않는 물질로 알려져 왔고, 그렇기 때문에 배양 중 탄소원으로 사용되기 보다는 삼투압 조절제로 많이 사용되었다. 하지만 일부 식물조직에서 mannitol을 사용하는 것이 발견되었고 [17], 당근세포나 담배세포의 현탁배양 중 mannitol이 천천히 대사됨도 확인된 바 있다 [18]. Sorbitol의 경우에는 다양한 종에서 흡수되어 대사가 이루어지는데, 일부 종에서는 sucrose 보다 더 좋은 생장을 보였다고 보고되었다 [13].

3.2. N-acetyl glucosamine첨가 및 조합을 통한 최적조건 선정

Sorbitol의 첨가로 세포 생존도 및 단백질 발현량을 증가시킬 수 있었지만 당을 첨가하지 않은 조건보다는 배양기간이 길어지는 결과를 보였다. 따라서 이를 보완하기 위하여 hexokinase 저해제로 N-acetyl glucosamine을 첨가하여 상승효과를 조사하고자 하였다.

일반적으로 hexokinase가 당을 인지하게 되면 당 고갈 신호가 전달되지 않으며, α-amylase를 발현하지 않는다. 반면에 당이 고갈된 조건에서는 hexokinase가 당을 인지하지 못하게 되며, calcineurin B-like protein (CBL) 과 Ca2+이 복합체를 형성하게 되고, 당이나 산소의 부족으로 발현되는 CIPK15로 신호를 전달하게 된다 [19]. CIPK15가 발현되면 다시 SnRK1A로 신호가 전달되며, sugar starvation inducible transcrip-tion factor 인 MYBS1를 활성화 시키고, 활성화된 MYBS1와 α-amylase mRNA의 상호작용으로 인하여 RAmy3D 프로모터를 통해 α-amylase와 코딩된 목적단백질을 발현하게 된다 [20].

Sorbitol과 N-acetyl glucosamine을 동시에 첨가하면 대체 탄소원으로 sorbitol의 첨가는 세포의 생존도를 더 오랫동안 유지시켜 주고, 단백질의 발현이 늦어지는 문제는 N-acetyl glucosamine을 처리하여 해결할 수 있으므로 이들의 조합을 통해 최적인 조건을 찾고자 하였다. 조합실험은 sorbitol 40 mM과 N-acetyl glucosamine 5 mM를 기준으로 하여 Table 1에 정리된 조건으로 수행하였다.

Central composition design for combination of sorbitol and N-acetyl glucosamine

먼저 N-acetyl glucosamine이 sorbitol을 소비하는데 미치는 영향을 확인하였다. 20mM sorbitol과 함께 N-acetyl glucosamine을 첨가하면 소비가 느려지기는 하지만 큰 영향은 없었으며 40 mM의 sorbitol 첨가시 N-acetyl glucosamine이 sorbitol 소비에 큰 영향을 주지는 않았다. 따라서 N-acetyl glucosamine이 sorbitol 소비에는 큰 영향을 미치지 않음을 알 수 있었다 (Fig. 9). Sorbitol과 N-acetyl glucosamine의 단일 첨가 및 동시 첨가가 미치는 영향을 확인한 결과 Fig. 10에 제시된 결과와 같이 N-acetyl glucosamine만을 처리하면 세포량과 생존도에 모두 부정적이었다. Sorbitol을 20 mM 첨가하면 세포량은 거의 일정했으며, 생존도는 더 오랫동안 유지되었다. N-acetyl glucosamine을 같이 첨가하였을 경우, 세포량과 생존도 모두 감소하였다. Sorbitol 40 mM에서는 20 mM과 비슷한 경향을 보였다. Sorbitol만 첨가하였을 경우 세포량이 약간 증가하지만 전체적으로 큰 변화 없이 일정하였고, 생존도는 높게 유지되었다.

Fig. 9.

Effects of N-acetyl glucosamine on sorbitol uptake with 20 mM sorbitol (A) and 40 mM sorbitol (B): ◇, 20 mM sorbitol; △, 20 mM sorbitol with 2.5 mM N-acetyl glucosamine; ◆, 20 mM sorbitol with 5 mM N-acetyl glucosamine ; ▽, 40 mM sorbitol; ○, 40 mM sorbitol with 2.5 mM N-acetyl glucosamine; ●, 40 mM sorbitol with 5 mM N-acetyl glucosamine.

Fig. 10.

Effects of N-acetyl glucosamine on dry cell weight (A) and relative cell viability (B); ◆, without sorbitol; ○, 2.5 mM N-acetyl glucosamine; ●, 5 mM N-acetyl glucosamine.

Sorbitol과 hexokinase 저해제의 동시 첨가가 단백질 발현에 미치는 영향은 SDS-PAGE와 ELISA를 통하여 정성 및 정량 분석하여 보았다. SDS-PAGE는 3일부터 12일차까지 3일 간격으로 수행하였다. 3일차에서는 아무것도 첨가하지 않은 조건에서 가장 높은 단백질 발현을 보였다. N-acetyl glucosamine을 처리하였을 경우 단백질 발현은 낮아졌다. 반면 sorbitol을 20 mM 첨가하면 약간의 발현을 보였으며, N-acetyl glucosamine을 같이 처리하면 더 발현 정도가 높아짐을 확인할 수 있었다. Sorbitol 40 mM에서는 발현이 거의 관찰되지 않았다 (Fig. 11(A)). 6일차에 아무것도 첨가하지 않은 경우 3일차와 비슷한 경향을 보였으며, sorbitol 20 mM에서도 3일차와 비슷한 경향을 보였다. Sorbitol과 N-acetyl glucosamine을 동시에 첨가하였을 경우, N-acetyl glucosamine의 농도가 높을 때 좀 더 많은 단백질을 확인할 수 있었다. Sorbitol 40mM에서는 역시 sorbitol을 단독으로 처리하는 경우보다 N-acetyl glucosamine을 같이 처리하였을 때 더 좋은 결과를 보였다 (Fig. 11(B)). 9일과 12일차에서는 모든 조건이 비슷한 경향을 보였으며, 9일차부터는 sorbitol과 N-acetyl glucosamine을 같이 처리할 때 단백질 발현이 높았다 (Fig. 11(C), Fig. 11(D)).

Fig. 11.

SDS-PAGE of GAA produced with various concentrations of sorbitol and N-acetyl glucosamine at day 3 (A) and day 6 (B), day 9 (C), and day 12 (D): lane M, SeeBlue Plus2 Pre-stained marker; 1, Myozyme (positive control); 2, W/O sorbitol; 3, 2.5 mM N-acetyl glucosamine; 4, 5 mM N-acetyl glucosamine; 5, 20 mM sorbitol; 6~8, 20 mM sorbitol and 2.5 mM N-acetyl glucosamine; 9, 20 mM sorbitol and 5 mM N-acetyl glucosamine, 10, 40 mM sorbitol; 11, 40 mM sorbitol and 2.5 mM N-acetyl glucosamine; 12, 40 mM sorbitol and 5 mM N-acetyl glucosamine.

좀 더 정확한 단백질 발현 확인을 위해서 ELISA를 사용하여 비교한 결과 SDS-PAGE에서와 유사하게 9일 이후에 sorbitol과 N-acetyl glucosamine을 같이 첨가한 조건에서 높은 단백질 발현을 나타내었다. 9일차에 sorbitol 20 mM과 N-acetyl glucosamine 5 mM을 동시 첨가한 경우 가장 단백질 발현이 높았으며 12일차를 기준으로 sorbitol 40 mM에 N-acetyl glucosamine 5 mM을 동시 첨가한 경우 가장 좋은 효과를 보였다 (Fig. 12). 따라서 sorbitol과 N-acetyl glucosamine을 함께 첨가하면 단백질 발현에는 긍정적인 효과를 보임을 알 수 있었다. 이상의 결과로부터 최적 조합의 sorbitol과 N-acetyl glucosamine 동시 첨가를 통하여 60% 향상된 GAA 단백질을 얻을 수 있었다.

Fig. 12.

Effects of combined supplementation of sorbitol and N-acetyl glucosamine on GAA production at day 3, 6, 9, and 12.


4. CONCLUSION

본 연구에서는 효소치료제인 GAA를 생산하기 위하여 RAmy3D 프로모터를 사용하였으며, 이는 당 고갈환경에서 높은 농도로 단백질을 생산할 수 있지만 당 고갈로 인하여 세포가 사멸된다. 이를 극복하고자 대체 탄소원을 첨가하여 단백질 생산량을 증대시키고자 하였다. Sorbitol은 세포에 의해 사용되었으며, 세포 생존도가 오래 유지되었다. 또한 세포량 증가 대비 더 많은 단백질이 발현되는 것을 알 수 있었다. 세포사멸로 인한 단백질 생산에 대한 부정적인 영향도 줄일 수 있었으며, 세포사멸의 저하로 인해 단백질 분해효소의 유출까지 줄여주는 긍정적인 영향을 미쳤다고 판단된다. Sorbitol과 함께 hexokinase 저해제인 N-acetyl glucosamine을 함께 첨가하면 단백질 발현에 긍정적인 영향을 줄 수 있음을 확인하였다. N-acetyl glucosamine의 첨가는 발현 시기가 늦춰지는 현상을 보완함을 알 수 있었으며, 최적화된 조합으로 sorbitol과 N-acetyl glucosamine을 동시에 첨가하면 60% 증가된 단백질량을 얻을 수 있었다.

Acknowledgments

이 성과는 정부(과학기술정보통신부)의 재원으로 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 연구 (No. 2019R1F1A1061676)이며 이에 감사드립니다.

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Fig. 1.

Fig. 1.
Sugar uptake profiles with various carbon sources in cell cultures using GAAWT (wild-type cell line, A) and GAAgnt1 (glycoengineered cell line, B): ◆, sucrose; ○, fructose; △, sorbitol; ●, mannitol.

Fig. 2.

Fig. 2.
Time course profiles of sorbitol uptake in cell cultures using GAAWT (A) and GAAgnt1 (B): ◆, 40 mM; ○, 80 mM; ●, 120 mM.

Fig. 3.

Fig. 3.
Effects of various carbon sources on cell mass in cell cultures with GAAWT (A) and GAAgnt1 (B): ◇, sugar-free condition; ◆, sucrose; ○, fructose; △, sorbitol; ●, mannitol.

Fig. 4.

Fig. 4.
Effects of sorbitol concentration on cell mass in cell cultures with GAAWT (A) and GAAgnt1 (B):◇, sugar-free condition; ◆, 40 mM; ○, 80 mM; ●, 120 mM.

Fig. 5.

Fig. 5.
Effects of various carbons sources on relative cell viability in cell cultures with GAAWT (A) and GAAgnt1 (B): ◇, sugar-free condition; ◆, sucrose; ○, fructose; △, sorbitol; ●, mannitol.

Fig. 6.

Fig. 6.
Effects of sorbitol concentration on relative cell viability in cell cultures with GAAWT (A) and GAAgnt1 (B): ◇, sugar-free condition; ◆, 40 mM; ○, 80 mM; ●, 120 mM.

Fig. 7.

Fig. 7.
SDS-PAGE analysis of GAA produced in cell cultures with GAAWT at day 3 (A) day 15 (B), and day 27 (C): lane M, SeeBlue Plus2 Pre-stained marker; 1, Myozyme (positive control); 2, control; 3, 80 mM sucrose; 4, 80 mM fructose; 5, 80 mM mannitol; 6, 40 mM sorbitol; 7, 80 mM sorbitol, 8, 120 mM sorbitol.

Fig. 8.

Fig. 8.
SDS-PAGE analysis of GAA produced in cell cultures with GAAgnt1 at day 3 (A) day 15 (B), and day 27 (C): lane M, SeeBlue Plus2 Pre-stained marker; 1, Myozyme (positive control); 2, control; 3, 80 mM sucrose; 4, 80mM fructose; 5, 80 mM mannitol; 6, 40 mM sorbitol; 7, 80 mM sorbitol; 8, 120 mM sorbitol.

Fig. 9.

Fig. 9.
Effects of N-acetyl glucosamine on sorbitol uptake with 20 mM sorbitol (A) and 40 mM sorbitol (B): ◇, 20 mM sorbitol; △, 20 mM sorbitol with 2.5 mM N-acetyl glucosamine; ◆, 20 mM sorbitol with 5 mM N-acetyl glucosamine ; ▽, 40 mM sorbitol; ○, 40 mM sorbitol with 2.5 mM N-acetyl glucosamine; ●, 40 mM sorbitol with 5 mM N-acetyl glucosamine.

Fig. 10.

Fig. 10.
Effects of N-acetyl glucosamine on dry cell weight (A) and relative cell viability (B); ◆, without sorbitol; ○, 2.5 mM N-acetyl glucosamine; ●, 5 mM N-acetyl glucosamine.

Fig. 11.

Fig. 11.
SDS-PAGE of GAA produced with various concentrations of sorbitol and N-acetyl glucosamine at day 3 (A) and day 6 (B), day 9 (C), and day 12 (D): lane M, SeeBlue Plus2 Pre-stained marker; 1, Myozyme (positive control); 2, W/O sorbitol; 3, 2.5 mM N-acetyl glucosamine; 4, 5 mM N-acetyl glucosamine; 5, 20 mM sorbitol; 6~8, 20 mM sorbitol and 2.5 mM N-acetyl glucosamine; 9, 20 mM sorbitol and 5 mM N-acetyl glucosamine, 10, 40 mM sorbitol; 11, 40 mM sorbitol and 2.5 mM N-acetyl glucosamine; 12, 40 mM sorbitol and 5 mM N-acetyl glucosamine.

Fig. 12.

Fig. 12.
Effects of combined supplementation of sorbitol and N-acetyl glucosamine on GAA production at day 3, 6, 9, and 12.

Table 1.

Central composition design for combination of sorbitol and N-acetyl glucosamine

Run# Pattern Sorbitol Hexokinase inhibitor
1 +- 40 0
2 00(CP) 20 2.5
3 0- 20 0
4 ++ 40 5
5 -+ 0 5
6 0+ 20 5
7 -- 0 0
8 00(CP) 20 2.5
9 -0 0 2.5
10 00(CP) 20 2.5
11 +0 40 2.5