The Korean Society For Biotechnology And Bioengineering

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Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 33 , No. 2

[ Research Paper ]
Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 33, No. 1, pp.1-6
ISSN: 1225-7117 (Print) 2288-8268 (Online)
Print publication date 31 Mar 2018
Received 28 Sep 2017 Revised 06 Dec 2017 Accepted 22 Dec 2017
DOI: https://doi.org/10.7841/ksbbj.2018.33.1.1

재조합 대장균을 이용한 전달 단백질 rCRM197 생산
박재범1 ; 권덕호1 ; 박중희1 ; 김희연2 ; 이찬규2 ; 하석진1, *
1강원대학교 생물공학과
2(주)유바이오로직스

Production of Carrier Protein rCRM197 Using Recombinant E. coli
Jae-Bum Park1 ; Deok-Ho Kwon1 ; Joong-Hee Park1 ; Heeyoun Kim2 ; Chankyu Lee2 ; Suk-Jin Ha1, *
1Department of Bioengineering and Technology, Kangwon National University, Chuncheon 200-701, Korea, Tel: +82-33-250-6277~8, Fax: +82-33-243-6350 (sjha@kangwon.ac.kr)
2Eubiologics Co., LTD, Chuncheon 19860, Korea
Correspondence to : Department of Bioengineering and Technology, Kangwon National University, Chuncheon 200-701, Korea Tel: +82-33-250-6277~8, Fax: +82-33-243-6350 e-mail: sjha@kangwon.ac.kr


© 2017 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering
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Abstract

Cross reacting materials (CRM197) is a mutant protein from diphtheria toxin (DT) by a single amino acid substitution, glycine to glutamic acid at position 52 (G52E). In order to achieve high yields of CRM197, the fermentation process requires multiple lysogenic mutants of Corynebacterium diphtheriae and strictly controlled conditions of growth generally. Wild type CRM197 gene and codon optimized CRM197 gene were synthesized to produce recombinant CRM197 (rCRM197). Expression vectors were constructed using pQE30, pET-21a, pET-22b and pET-28a for efficient expression by E. coli. Expression conditions such as temperature, induction time, and IPTG concentration were optimized for soluble expression of rCRM197. In additions, large scale production of rCRM197 through the bioreactor, exhibited higher proportion of soluble expression than flask culture.


Keywords: cross reacting materials, E. coli, codon optimization, bioreactor

1. INTRODUCTION

디프테리아 독소는 Corynebacterium diphtheriaetox 유전자로 발현되는 54.8 kDa 크기의 단백질이다. 이 단백질은 이황화 결합으로 연결된 두 개의 단백질 절편으로 나뉘어 있으며, 그 중 A 절편은 eukaryotic elongation factor-2 (eEF-2)의 ADP-ribosylation 과정의 촉매 역할을 하여 단백질 합성을 저해한다고 보고된 바 있다 [1]. Cross-reactive materials 197 (CRM197)은 디프테리아 독소의 52번째 아미노산인 글라이신이 글루탐산으로 치환되어 독성이 제거된 단백질이며, 백신의 활성을 보조해주는 전달 단백질의 역할을 한다 [2]. 독성이 제거되었지만 디프테리아 독소가 지니고 있는 면역 자극제의 효능은 상실하지 않았으며, 이러한 특성을 이용한 conjugated 백신으로 널리 이용되고 있다 [3,4]. 또한 CRM197은 39개의 라이신 잔기를 지니며, 이러한 특성으로 인하여 polysaccharide에 대한 접합능력이 우수하며 이러한 능력은 glycoconjugated 백신을 생산할 시 유용하다고 알려져 있다 [5]. 몇몇의 암세포에서 높게 발현되는 HB-EGF에 binding하여 항암작용과 연관이 있으며, 암세포의 proliferation을 저해하는 항암 효능을 지니고 있다고 보고된 사례도 존재한다 [6,12].

C. diphtheriae 균주를 이용한 CRM197의 대량 생산은 특정한 배양 조건과 phage stability를 위한 조건들 때문에 생산단가가 높아진다는 단점을 지니고 있다 [13]. 따라서 이러한 문제를 결하기 위해 Escherichia coli, Bacillus subtilis 와 같은 균주들의 heterologous system을 이용하는 방법에 대한 연구가 진행되는 추세이다 [14,15]. 이들 연구에서는 각각의 균주에 적합한 발현 조건 및 codon 최적화 등을 이용하여 연구를 진행하였으며, 특히 E. coli를 이용한 발현 연구의 경우 다량으로 생성되는 insoluble 형태의 재조합 CRM197 (rCRM197)의 비율을 줄이기 위해 chaperone을 함께 발현시켜 150.69±8.95 μg/mL 농도의 soluble 형태 rCRM197을 발현시킨 연구 사례가 보고된 바 있다 [16].

본 연구에서는 E. coli JM109 균주와 E. coli BL21 (DE3) 균주를 이용하여 rCRM197을 생산할 수 있는 재조합 균주를 개발하였으며, 이들의 발현 조건 중 온도, 시간 그리고 IPTG 농도를 조절하여 soluble 형태의 rCRM197을 과량 생산할 수 있는 조건을 탐색하였다.


2. MATERIALS AND METHOD
2.1. rCRM197 대량생산을 위한 코돈 최적화 및 유전자 합성

디프테리아 독소는 C. diphtheriae 균주의 tox 유전자에 의해 발현되며, rCRM197은 tox 유전자 중 52번째 아미노산인 글루탐산을 글라이신으로 치환하는 코돈으로 변경하여 생산할 수 있다. 따라서, tox 유전자를 대장균에 적합한 코돈으로 바꾸어 주는 코돈 최적화 과정과 52번째 아미노산인 글라이신을 글루탐산으로 치환하는 과정을 동시에 진행하였다. 최적화에 사용한 프로그램은 Integrated DNA Technologies, Inc.의 홈페이지에서 제공하는 Codon Optimization Tool을 이용하여 진행하였으며, 아미노산의 서열을 기반으로 하여 대장균에 적합한 코돈으로 전체 염기 서열의 최적화를 진행하였다. 코돈 최적화된 염기서열을 지닌 유전자를 확보하기 위해 마크로젠 (Seoul, Korea)에 의뢰하여 유전자 합성을 진행하였다 (Table 1).

Table 1. 
The nucleotide compositions and GC contents from wild type or codon optimized type rCRM197 gene
Gene type A T G C GC contents
wild type rCRM197 494 442 382 293 41.9%
codon optimized type rCRM197 461 393 399 358 47.0%

2.2. 발현벡터 개발 및 재조합 균주 개량

벡터 제작을 위하여 대장균 TOP10 (Invitrogen, CA, USA) 균주를 호스트 균주로 이용하였다. Luria-Bertani (LB) broth (Difco Laboratories, MI, USA)는 대장균 배양을 위해 사용하였으며 이때 필요에 따라 엠피실린 (Thermo Fisher Scientific, USA)을 사용하였다. 엠피실린 저항성 마커를 지니고 있는 다양한 종류의 발현벡터 (pQE30, pET-21a, pET-22b 또는 pET-28a)를 사용하였으며, 각각의 발현벡터에 적합한 E. coli JM 109 또는 E. coli BL21 (DE3) 계열의 호스트 균주를 이용하여 rCRM197 발현 실험을 진행하였다. 벡터 제작을 위한 제한효소와 ligase 효소 등은 모두 Enzynomics (Daejeon, Korea)의 제품을 이용하였다. IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)는 바이오세상 (Biosesang, Korea)에서 구매하였으며, SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulfate poly acrylamide gel electrophoresis)에 사용된 각종 시약들은 Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories. Inc, USA)에서 구매하였다. Wild type 및 codon optimized type의 rCRM197 생산을 위해 PCR을 이용하여 유전자를 증폭한 후 발현벡터 제작을 진행하였다.

2.3. rCRM197발현 조건 최적화

rCRM197의 발현을 위해 코돈 최적화된 유전자가 삽입된 다양한 종류의 발현벡터와 E. coli JM109 또는 E. coli BL21 (DE3) 균주를 이용하여 재조합 균주를 개발하였으며 이들을 이용하여 rCRM197의 발현을 확인하였다 (Table 2). 발현 확인을 위해 LB 배지의 엠피실린 농도를 0.1 mg/mL로 조절한 후 rCRM197 발현 벡터가 도입된 재조합 대장균을 각각 접종하여, 37oC에서 배양하였으며, rCRM197 발현을 유도하기 위하여 흡광도 (600 nm) 값이 0.4~0.5이 되었을 때 단백질 발현 유도물질인 IPTG를 최종농도가 0.1, 0.2, 0.4 또는 1.0 mM 되도록 첨가하여 비교하였다. 발현 온도 조건은 20, 30 또는 37oC 조건에서 100 rpm 조건으로 교반하며 rCRM197의 발현을 유도하였다.

Table 2. 
Plasmids and strains used in this study
Type Name Note
Vector pQE30 Ampr, T5 promoter, intracellular expression
pET-21a Ampr, T7 promoter, intracellular expression
pET-22b Ampr, T7 promoter, periplasmic space expression
pET-28a Kanr, T7 promoter, intracellular expression
pQE30_rCRM_opti pQE30, codon optimized type rCRM197 gene
pET-21a_rCRM_opti pET-21a, codon optimized type rCRM197 gene
pET-22b_rCRM_opti pET-22b, codon optimized type rCRM197 gene
pET-28a_rCRM_opti pET-28a, codon optimized type rCRM197 gene
Strain Top10 cloning host, E. coli
JM109 expression host, E. coli
BL21 (DE3) expression host, E. coli
JC1 E. coli JM109 with pQE30_rCRM_opti
BC1 E. coli BL21 with pET-21a_rCRM_opti,
BC2 E. coli BL21 with pET-22b_rCRM_opti,
BC3 E. coli BL21 with pET-28a_rCRM_opti,

2.4. 발효기를 이용한 발현조건 최적화

대장균을 이용한 rCRM197의 발현 최적화를 위해 발효기를 이용한 발현조건 최적화 실험을 수행하였다. 총 부피 1.5 L의 발효기 (KF-601, 코바이오텍, 인천)에 최종 농도가 0.1 mg/mL이 되도록 엠피실린을 첨가한 LB배지 1 L를 이용하여 발현 실험을 진행하였다. 균주는 가장 발현률이 우수하게 나타난 E. coli BC1균주를 이용하였으며, 최적화를 위해 IPTG농도를 0.2 mM 또는 0.4 mM로 조정하고 20oC 또는 15oC 온도 조건에서 발현조건 최적화 실험을 진행하였다.

2.5. SDS-PAGE를 이용한 발현 확인

rCRM197 유전자가 삽입된 재조합 대장균들의 발현 유무를 비교하기 위하여 각각 SDS-PAGE를 수행하였다. 분석에 사용된 시료는 10,000 g, 4oC 조건에서 30분간 원심분리를 진행하여 불용성 단백질과 수용성 단백질을 분리하였으며, 불용성 단백질의 경우 멸균 증류수로 3회 세척 후 실험에 사용하였다. SDS-PAGE의 stacking gel은 5% polyacrylamide를 그리고 separating gel은 12% polyacrylamide를 각각 이용하였으며 전기영동 조건은 stacking gel의 경우 60 V와 500 mA로 20분동안 그리고 separating gel의 경우 110 V와 500 mA로 1시간 30분 동안 전기영동을 진행하였다. 그 후 Coomassie staining solution (Coomassie brilliant blue R-250 3 mM, Sigma aldrich, Korea)를 이용하여 1시간 동안 염색을 진행하였으며, 증류수로 세척해 준 후 destaining solution을 첨가하여 탈색을 진행하였다. 탈색된 SDS-PAGE gel의 각각의 band는 ImageJ를 이용하여 수치화하였으며, 발현된 전체 rCRM197 대비 soluble 형태와 insoluble 형태의 비율을 relative percentage (%)로 계산하였다 [17].


3. 결과 및 고찰
3.1. 재조합 대장균에서 rCRM197의 효과적인 발현을 위한 코돈 최적화

디프테리아 독소의 경우, C. diphtheriae 균주의 tox 유전자에 의해 발현되며, 대장균에는 유전정보가 존재하지 않는다. 따라서 rCRM197의 발현을 위해 C. diphtheriae 균주의 tox 유전자를 분석하여 52번째 해당하는 아미노산이 글라이신으로 치환되도록 뉴클레오타이드를 변경하여 디프테리아 독소의 독성이 제거된 단백질인 rCRM197의 wild type 염기서열을 확정하였다 [18]. 그 후 아미노산 서열을 기반으로 대장균 발현에 적합한 염기서열로 전환하였으며, 그 결과 codon optimized type rCRM197염기서열을 확보할 수 있었다. 위 두 가지 방법을 이용하여 확보한 염기서열은 마크로젠 (Seoul, Korea)에 의뢰하여 유전자 합성을 진행하였으며 sequencing 과정을 통해 염기서열을 재 확인하였다. 두 유전자의 염기서열 상동성은 약 75.2%로 나타났으며, codon optimized type rCRM197 염기서열의 경우 wild type rCRM197 염기서열에 비해 아데닌 (A)과 티민 (T)의 비율은 각각 30.1%에서 28.6%로 그리고 27.4%에서 24.4%로 감소하였으며 구아닌 (G)과 시토신 (C)의 비율은 각각 23.7%에서 24.8%로 그리고 18.2%에서 22.2%로 증가한 것을 확인할 수 있었다 (Table 1). 결과적으로 CRM197의 유전자를 대장균 발현에 적합한 염기서열로 코돈 최적화를 수행하였으며 이를 통해 AT 비율은 58.1%에서 53.0%로 감소하였으며 GC 비율은 41.9%에서 47.0% 증가하였다.

3.2. 플라스크를 이용한 rCRM197 발현 비교

대장균을 이용한 rCRM197 단백질의 발현을 위해 다양한 종류의 발현 벡터 (pQE30, pET-21a, pET-22b 또는 pET-28a)와 E. coli JM109 또는 E. coli BL21 (DE3) 균주를 이용하여 wild type과 codon optimized type rCRM197 유전자가 삽입된 재조합 균주들을 개발하였으며, 개발한 재조합 균주들을 이용하여 플라스크 조건에서 단백질 발현 실험을 진행하였다 (Table 2). Wild type 유전자가 삽입된 균주들의 경우, codon optimized type 유전자가 삽입된 경우보다 rCRM197의 발현량이 현저하게 낮은 것을 확인할 수 있었으며, 몇몇의 경우에서는 벡터가 삽입되지 않은 대조구와 유사한 SDS-PAGE 유형이 나타난 경우도 확인되었다 (data not shown). 이러한 결과를 바탕으로 codon optimized type의 유전자를 이용하여 실험을 진행하였다. Codon optimized type rCRM197의 발현 유무를 확인하기 위해 pQE30_rCRM_opti벡터를 E. coli JM109에 삽입한 E. coli JC1균주를 이용하여 rCRM197을 발현시킨 결과, rCRM197의 발현은 관찰되지 않았다 (Fig. 1A). E. coli BL21 (DE3) 균주와 pET-28a_rCRM_opti 벡터를 이용하여 개발한 E. coli BC3 균주의 경우, rCRM197의 발현을 확인 할 수 있었으나, soluble한 형태로 발현된 rCRM197 단백질은 확인할 수 없었다 (Fig. 1D). 이에 반해, E. coli BL21 (DE3) 균주와 pET-21a_rCRM_opti 벡터를 이용하여 개발한 E. coli BC1 균주를 이용한 경우, rCRM197 단백질의 발현뿐만 아니라, soluble한 형태로 발현되는 것이 확인되었다 (Fig. 1B). 온도 및 IPTG 농도에 따른 E. coli BC1균주의 rCRM197 발현량을 확인하기 위하여 IPTG를 최종농도가 0.1, 0.2, 0.4 또는 1.0 mM이 되도록 첨가하여 비교한 결과, IPTG의 농도를 0.4 mM로 조절한 조건에서 soluble 형태의 rCRM197 발현량이 가장 우수한 걸 확인할 수 있었으며, 온도 조건을 20, 30 또는 37oC로 조절하여 발현을 유도한 결과 20 oC에서 soluble 형태의 rCRM197 발현량이 가장 우수한 걸 확인하였다. 최종적으로, E. coli BC1균주를 이용하여 20oC, 200 rpm 조건에서 IPTG의 농도를 0.4 mM로 조정하여 rCRM197을 발현시킬 경우 soluble 형태의 발현량이 다른 균주에 비해 눈에 띄게 높게 나타난 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 1B).


Fig. 1. 
The expression results of codon optimized type rCRM197 by recombinant E. coli JC1 (A), BC1 (B), BC2 (C) or BC3 (D) at 20oC and 0.4 mM IPTG for 16 h (1A and 1C, lane 1: codon optimized total protein and lane 2: codon optimized soluble protein. 1B and 1D, lane 1: codon optimized total protein, lane 2: codon optimized insoluble protein, lane 3: codon optimized soluble protein).

진핵 생물 유례의 단백질을 E. coli에서 발현할 경우 발생하는 문제 중 하나는 이황화 결합이 세포 내에서 잘 형성되지 않는다는 점이며, 이를 해결하기 위해 periplasmic localization과 같은 실험적 방법이 이용된다 [19,20]. Soluble 형태의 rCRM197 발현량을 증가시키기 위해 periplasmic localization이 가능한 pelB sequence를 지닌 pET-22b_rCRM_opti 벡터를 이용하여 발현 실험을 진행하였으나, 전체 발현량이 다른 두 pET 계열의 벡터에 비해 현저히 낮은 것을 관찰할 수 있었다. 특이한 점은 T5 promoter를 지닌 pQE30 벡터와 T7 promoter를 지닌 pET 계열 벡터 간의 발현량 차이가 눈에 보이게 나타났을 뿐만 아니라, 같은 T7 promoter를 지닌 pET-21a 또는 pET-28a 벡터와 pET-22b 벡터 간의 발현량 차이도 확인되었다는 점이다. 또한 발현량이 유사한 pET-21a 벡터와 pET-28a 벡터의 경우도 soluble 형태의 rCRM197발현량이 각기 다르다는 것을 확인할 수 있었다. 최종적으로 pET-21a 벡터가 삽입된 E. coli BC1 균주를 발현에 가장 적합한 균주로 선별한 후 발현 최적화 실험을 진행하였다.

3.3. 발효기를 이용한 rCRM197의 발현조건 최적화

대장균을 이용한 외래단백질 발현의 경우, 같은 균주를 이용한 단백질의 발현 패턴도 발현 조건에 따라 크게 다른 경우가 많이 존재하며, 대부분의 외래 단백질은 insoluble한 형태로 발현되는 양상을 보인다 [21]. 플라스크를 이용한 발현 실험에서도 이와 유사한 결과가 나타나는 것을 확인할 수 있었으며, 이러한 점을 보완하기 위해 rCRM197의 발현량이 가장 우수하게 나타난 E. coli BC1 균주를 이용하여 발효기를 이용한 rCRM197 발현조건 최적화 실험을 진행하였다. IPTG 농도를 조절하며 발효기를 이용하여 온도조건의 변화에 따른 soluble 형태 rCRM197의 발현량 차이를 확인해 본 결과, IPTG 농도를 0.2 mM로 조정하여 발현을 진행할 경우 전체 rCRM197의 발현량은 플라스크를 이용한 발현과 유사하게 나타났지만 soluble 형태의 rCRM197의 발현량이 증가된 것을 확인할 수 있었다. 이는 플라스크의 발현조건보다 발효기를 이용했을 때의 발현조건이 rCRM197 단백질의 발현에 더 적합하기 때문인 것으로 사료된다.

온도조건에 따른 soluble 형태의 rCRM197의 발현을 비교했을 때 15oC 조건에서 soluble 형태의 rCRM197 발현 비율이 증가한 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 2). 특히, 12시간 동안 발현을 진행했을 경우 soluble 형태의 rCRM197 비율이 insoluble 형태보다 높게 나온 것을 확인할 수 있었다. 최종적으로 15oC 조건에서 IPTG 농도를 0.2 mM 또는 0.4 mM로 조정하여 IPTG의 농도에 따른 soluble 형태의 rCRM197의 발현 차이를 확인하였다. IPTG 0.4 mM을 첨가하여 발현할 경우, 0.2 mM을 첨가하여 발현을 진행할 때보다 이른 시간 (8 h)부터 soluble 형태의 rCRM197 비율이 높게 나타난 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 3). 따라서, 15oC 조건에서 0.4 mM의 IPTG를 첨가하여 발현을 진행할 경우, 짧은 발현시간으로도 높은 비율로 soluble 형태의 rCRM197 단백질을 발현할 수 있음을 확인할 수 있었으며, 추가적으로 이전 플라스크를 이용한 발현보다 발현조건이 훨씬 더 우수함도 확인할 수 있었다.


Fig. 2. 
The expression results of rCRM197 by recombinant E. coli BC1 using bioreactor with 0.2 mM IPTG for 8 h (A), 12 h (B) or 24 h (C) at 15oC (Lane 1: total protein, lane 2: insoluble protein and lane 3: soluble protein).


Fig. 3. 
Comparisons of soluble or insoluble form rCRM197 by recombinant E. coli BC1 with 0.2 mM IPTG (A) or 0.4 mM IPTG (B) using bioreactor at 15oC. SDS-PAGE results were analyzed and digitized by ImegeJ program. Relative percentages were calculated based on amounts of total proteins at 24 h (IS: Insoluble rCRM197 fraction, S: Soluble rCRM197 fraction).


4. CONCLUSION

본 연구에서는 대장균을 이용하여 면역 증강제로서 이용 가능성이 높은 CRM197 단백질을 대량생산 하기 위한 연구들을 수행하였다. 코돈 최적화 및 다양한 벡터와 균주들의 조합을 시도하여 rCRM197의 발현량이 우수한 균주와 벡터 조합 및 발현 조건을 확인하였다. 추가적으로, T5 promoter를 이용한 벡터보다 T7 promoter를 이용한 벡터로 발현을 진행할 경우 발현량이 더 증가하는 것을 확인 할 수 있었으며, 같은 T7 promoter를 이용하는 벡터들 간에도 발현량 및 발현 패턴의 차이를 확인하였다. 발현조건 최적화 연구를 위해 발효기를 이용하여 15oC, IPTG 0.4 mM의 조건에서 E. coli BC1 균주를 이용한 rCRM197 단백질 발현을 진행하였다. 발효기를 이용하여 단백질 발현을 수행한 결과 플라스크를 이용하여 같은 조건과 균주를 이용하여 발현했을 때보다 soluble 형태의 rCRM197 발현 비율이 약 28%에서 61%로 증가함을 확인할 수 있었다.


Acknowledgments

본 연구는 산업통상자원부와 한국산업기술진흥원이 지원하는 경제협력권산업육성사업으로 수행된 연구결과입니다.


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