The Korean Society For Biotechnology And Bioengineering

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Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 33 , No. 2

[ Research Paper ]
Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 33, No. 1, pp.7-13
ISSN: 1225-7117 (Print) 2288-8268 (Online)
Print publication date 31 Mar 2018
Received 14 Sep 2017 Revised 20 Dec 2017 Accepted 28 Dec 2017
DOI: https://doi.org/10.7841/ksbbj.2018.33.1.7

피브로인 미세구 첨가에 의한 3T3 섬유아 세포의 이동 촉진
권세창 ; 전현상 ; 류다영 ; 김지영 ; 허원*
강원대학교 공과대학 생물공학과

Fibroin Microsphere-induced 3T3 Cell Migration
Se Chang Kwon ; Hyun Sang Jeon ; Da Yeong Ryu ; Ji Young Kim ; Won Hur*
Department of Biotechnology and Bioengineering, Kangwon National University, Chuncheon 200-701, Korea, Tel: +82-33-250-6276, Fax: +82-33-259-5546 (wonhur@kangwon.ac.kr)
Correspondence to : Department of Biotechnology and Bioengineering, Kangwon National University, Chuncheon 200-701, Korea Tel: +82-33-250-6276, Fax: +82-33-259-5546 e-mail: wonhur@kangwon.ac.kr


© 2017 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering
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Abstract

Microsphere-stimulated cell migration was observed at the periphery of a confluent 3T3 cell culture even in the absence of serum. Under non-contact inhibition conditions, 3T3 cells showed a highest migratory velocity of 1.7 μm/min in a DMEM media with 0.05 mg/mL microspheres. It is 147% faster than those in DMEM with 10% serum and 194% faster than those in DMEM only. Monolayer colonies were formed from 3T3 cell spheroids in a microsphere-containing culture medium but not in a DMEM without serum. Western blot analysis showed that microsphere supplementation reduced the expression levels of focal adhesion kinase. Fibroin microsphere seems to stimulate a migratory signal cue other than focal adhesion kinase. Unlike to other nanoparticles, fibroin microspheres stimulated 3T3 cell migration, showing a potential candidate for wound healing stimulation.


Keywords: cell migration, fibroin microsphere, microsphere-stimulation

1. INTRODUCTION

세포의 이동은 발생 단계의 조직 형성부터 상처의 치료나 조직 복구에 필수적이고, 암세포의 전이에도 관련되어 있다[1]. 섬유아세포의 이동은 상처치유뿐만 아니라 피부조직의 재생에도 매우 중요하다 [2]. 조직공학에 필수적인 3차원 세포 지지체도 세포 이동이 가능하도록 설계되어야 한다 [3]. 생체 내에서 섬유아세포의 배양은 피브로넥틴이나 콜라젠 같은 세포외 물질로 구성된 3차원적 환경이 필요하지만, 그 복잡성 때문에 2차원 평판 배양을 통하여 주로 연구되었다. 혈청에는 세포의 생존과 성장을 촉진하는 인자와 별도로 세포 이동을 촉진하는 인자가 존재한다 [4]. 세포 이동은 주화성 물질의 농도구배부터 성장인자 그리고 세포외 기질을 포함한 다양한 신호전달과정을 통하여 이루어진다 [5]. 세포 이동의 신호전달 체계는 MAP 인산화효소인 u493JNK, p38 및 Erk를 경유하는 3가지의 다른 메커니즘이 존재한다 [6]. 인위적으로 섬유아세포의 이동을 촉진하는 방법으로 Focal adhesion kinase (FAK)의 과발현 [7], 저분자 히알루론산의 첨가 [8], 셀레늄의 첨가 [9], 전기장과 laphacone 첨가 [10], 헥사펩타이드의 첨가 [11] 및 갈바닉 미세구 [12]가 보고되었다.

본 연구에서는 피브로인 마이크로입자가 세포의 이동성에 미치는 영향을 조사하였다. 피브로인은 실크섬유를 구성하는 불용성 단백질이다 [13]. 화학적 수식이나 가교 결합에 의존하지 않고 제조된 피브로인 미세구는 순수한 단백질 표면을 가진다 [14]. 피브로인 미세구는 세포내로 흡수되고 배출되지만, 세포 독성이 낮고, 첨가량이 적으면 세포의 증식을 촉진한다 [14]. 따라서 피브로인을 염용액에서 가용화시켜 수용성 피브로인 용액으로 제조하고 역에멀젼상에서 감압 건조하여 피브로인 미세구를 제조하였다. 섬유아세포를 평판배양하고 피브로인 미세구를 첨가하여 세포의 이동에 영향을 미치는지 조사하였다. 이미지 트레킹 소프트웨어를 사용하여 세포의 이동속도를 측정하고, 피브로인 미세구의 첨가가 FAK와 액틴의 발현에 미치는 영향도 조사하였다. 미세구를 사용하여 3차원 배양된 세포 응집체에서 2차원 평면으로 세포의 이동성을 조사하였다.


2. MATERIALS AND METHOD
2.1. 실험 재료 및 시약

본 연구에 사용된 실크 피브로인은 화인코 (Chuncheon, Korea)에서 제공받았다. 기타 시약 및 Sorbitan monooleate (Span 80), Polyoxyethylene 20 sorbitan monooleate (Tween 80), n-Decane, Dimethyl slufoxide (DMSO), Propidium-iodide (PI)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구매하였다. 항 FAK 항체 sc-271126과 항 β-actin 항체 sc-47778은 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)에서 구매하였다. 항 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) 항체 D4C6R은 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)에서 구입하였다.

2.2. 세포배양

마우스 섬유아세포 BALB/3T3 clone A31는 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)에서 구입하여 사용하였다. 3T3 세포는 Fetal bovine serum (FBS; Lonza, NJ, USA) 10%, Penicillin/streptomycin (Lonza)를 1% 첨가한 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium 12-604 (DMEM; Lonza)를 사용하여 37oC, CO2 5% 조건에서 배양하였다.

2.3. 피브로인 미세구의 제조

실크 피브로인 미세구를 제조하기 위하여, 증류수에 피브로인을 2%(w/v)로 녹이고 10 μm의 공극을 갖는 종이 필터를 사용하여 감압 여과하여 불용성 피브로인을 제거하였다. Span 80 2.2 mL와 Tween 80 1.8 mL을 Decane 16 mL에 섞은 후 40oC에서 보관하여 유기상을 제조하였다. 상온으로 식힌 유기상에 2%의 피브로인 용액 8 mL를 첨가한 후, 균질기 (homogenizer; Polytron PT 2100, Kinematica, Switzerland)를 이용하여 30,000 rpm에서 1분간 처리하여 에멀젼을 제조하였다. 이후 회전 진공건조기 (EYELA, N-1110 series, Rikakikai, Japan)를 이용하여 40oC에서 45분간 수분을 증발시킨 뒤 회수하였다. 회수된 용액을 5,000 rpm으로 5분간 원심분리하여 상등액을 제거하고, 침전물을 무수에탄올로 5회 세척하였다. 세척한 침전물을 알루미늄 접시에 담아 50oC 오븐에 건조시켰다.

2.4. 주사전자현미경 분석

피브로인 미세구의 형태와 크기는 고분해능 주사전자현미경 (UHR-SEM; S4800, Hitachi, Tokyo, Japan)을 이용하여 관찰하였다. 건조된 피브로인 미세구 1 mg을 증류수 1mL에 넣고 초음파 분쇄기를 사용하여 분산시켰다. 미세구 분산액에 증류수를 첨가하여 순차적으로 희석하고, 각각의 희석액 50 μL를 카본테이프가 부착된 전자현미경 시편대에 올리고 건조하였다. 건조된 미세구 시료는 sputter (E-1010, Hitachi, Japan)로 백금 코팅 후 15.0 kV에서 주사현미경으로 관찰하였다.

2.5. 세포증식 및 생존율 측정

세포 증식을 확인하기 위하여 3T3 세포를 12-well plate에 4×104 씩 분주하여 배양하였고, 실크 피브로인 마이크로스피어를 첨가하여 배양하였다. 배양접시에 남아있는 배지를 제거하고, 차가운 인산완충용액 (PBS, pH 7.4, GIBCO)으로 세척하고, 트립신 (Lonza 17-161) 1 mL를 첨가하여 분리된 세포를 혈구계수기를 사용하여 계수하였다. 세포의 생존율은 유속세포분석기 (FACSCalibur, BD Biosciences, San Jose, CA, USA)와 PI를 사용하여 측정하였다. 3T3 세포를 12-well plate에 4×104 씩 분주하고, 피브로인 미세구를 0.1 mg/mL의 농도로 첨가하여 1~3일 배양하였다. 배양 후 Tripsin-EDTA로 처리하여 배양접시에서 세포를 떼어낸 뒤 인산완충용액에 재현탁하였다. 최종농도가 2 μg/mL가 되도록 PI를 첨가하여 4oC, 암조건에서 30분 동안 염색하였다. 유속세포분석기를 사용하여 PI 형광을 나타내는 세포를 계수하였다.

2.6. 세포이동성 측정

피브로인 미세구가 세포의 이동성에 주는 영향을 평가하기 위하여 접촉저해 상태의 단층세포에 형성된 상처 영역으로 이동하는 세포를 관찰하였다. 이를 위하여 12-well plate에 well당 3T3 세포를 1×105씩 분주하고 5일간 배양하였다. 단층으로 자란 세포를 마이크로 피펫 팁을 사용하여 긁어 떼어내었다. 배지를 제거하고 0.9 mL의 신선한 DMEM을 첨가하였다. 여기에 멸균증류수에 분산된 마이크로스피어를 0.5, 0.05, 0.005 mg/mL의 최종농도가 되도록 첨가하고, 24시간 배양하였다. 배양하는 동안 3시간 간격으로 도립현미경으로 관찰하였다. 피펫 팁으로 형성된 상처 영역으로 이동하는 세포의 사진을 이미지 프로세서 소프트웨어인 ImageJ로 분석하여 이동 거리를 측정하였다.

추가로 세포의 이동성을 측정하기 위하여 3차원으로 배양된 3T3 세포집합체를 사용하였다. 세포를 6-well ultra-low attachment plates (Corning, NY, USA)에서 3일간 배양한 후 10 μL 팁을 이용해 팁의 내경보다 작은 세포 집합체를 골라내어 6-well plate에 옮겨 배양하였다. 여기에 피브로인 마이크로스피어를 0.5, 0.05, 0.005 mg/mL의 농도가 되도록 첨가하여 일주일간 배양하였다.

2.7. 세포 이동속도 측정

세포를 1×104씩 분주하고, 3시간 동안 배양시켜 부착시켰다. 원격 카메라 조정 프로그램을 이용하여 5분 간격으로 4시간 동안 타임랩스를 진행하여 5456×3632 pixels의 현미경 사진을 43장 얻었다. 200×400 pixel로 축약시킨 이미지를 소프트웨어 iTrack4U [15]를 이용하여 세포의 이동 속도를 측정하였다.

2.8. Western blot

세포 이동에 영향을 미치는 관련 단백질의 발현 정도를 확인하기 위해, 배양접시에 배양된 세포에 마이크로스피어를 농도별로 첨가하고 24시간 동안 배양하였다. 배양된 세포를 Trypsin-EDTA로 배양접시에서 세포를 떼어내고 세포 계수기 (LUNA cell counter, Logos Biosystems, Korea)를 이용하여 세포 수를 측정하였다. 5×104개의 세포를 10 μL SDS 버퍼에 섞고 100oC에서 5분간 가열 후 냉각시켜서 시료를 준비하였다. 시료는 8~16% gradation SDS-polyacrylamide gel (Koma biotech. Korea)에 전기영동을 실시하였다. 전기영동된 아크릴아마이드 겔의 단백질을 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 옮긴 후, 1.5% 스킴 밀크를 이용하여 멤브레인을 30분간 실온에서 처리하였다. 항 FAK 및 항 액틴, 항 GAPDH 항체를 섞고 실온에서 4시간 보관하였다. HRP가 붙어있는 2차 항체를 붙여 ECL용액을 이용한 화학발광 검출법으로 각각의 단백질 발현을 측정하였다.

2.9. 통계처리

통계 처리를 위해 마이크로소프트 엑셀을 이용해서 Student t-test를 시행했으며, 측정 결과는 대조군과 각각의 실험군에 대해 평균 (mean) ± 표준오차 (standard error)로 나타냈다. 각 실험군의 분석 항목별 통계의 유의성 검증은 분산분석과 Student t-test를 이용하여 p<0.05 수준에서 검증하였다.


3. RESULTS AND DISCUSSION
3.1. 피브로인 미세구의 제조 및 세포배양 첨가

실크 피브로인을 사용하여 피브로인 미세구를 제조하였다. 제조된 미세구를 건조하여 얻은 분말 시료를 주사전자현미경으로 관찰하였다. 피브로인 미세구는 대부분 1 μm 이하의 직경을 가진 구형의 입자로 구성되어 있었다. 주사전자현미경 사진으로부터 무작위로 200개의 입자의 크기를 측정하였다. Fig. 1은 미세구의 크기의 분포를 나타내었다. 미세구의 평균 지름은 327 nm이고 최빈값은 266 nm이다. 부피가중 평균 지름은 488 nm이며 최빈값은 383 nm이다. 배양액에 첨가된 피브로인 미세구의 팽윤은 관찰되지 않으나, 미세구의 단백질 표면은 수화된다. 따라서 전자현미경으로 측정한 지름보다 큰 수화된 미세구가 세포의 표면에 작용한다.


Fig. 1. 
Number and volume weighted size distribution of fibroin microspheres with a scanning electron micrograph (inset).

피브로인 미세구가 세포의 성장과 생존에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 24시간 동안 배양된 섬유아세포에 미세구를 0.005 mg/mL로 첨가하고 96시간까지 세포를 계수하였다 (Fig. 2a). 미세구를 참가한 조건에서 배양된 세포의 수는 2.21 ×105 /cm2으로 미세구를 첨가하지 않은 조건보다 2배 이상 많았다. 아울러 72, 96시간에서 통계적인 유의성을 나타내었다. 시간에 따른 세포 수 변화를 통해 비 증식속도를 계산한 결과, 첨가했을 때와 첨가하지 않았을 때 각각 0.0523, 0.0307 h-1이었다. 피브로인 미세구를 첨가하여 배양한 3T3 세포의 비증식 속도는 첨가하지 않았을 경우에 비해 1.7배 더 높았다.


Fig. 2. 
The effect of fibroin microspheres on 3T3 cell proliferation (a) and on the viability estimated by Propidium iodide exclusion (b).

피브로인 미세구 첨가가 3T3 세포의 생존율에 영향을 주는지 조사하였다. 미세구의 농도를 0.1 mg/mL로 증가시켜 첨가하고 각각 1, 2, 3일 동안 3T3 세포를 배양하고, 유속세포분석기로 PI 생존율을 측정하였다 (Fig. 2b). 배양 3일 차에 미세구를 처리한 세포의 PI 생존율은 97.6±0.4%이고, 미세구를 첨가하지 않은 대조군은 97.0±0.5%이다. 세포의 생존율은 2일차 이후에는 모두 95% 이상으로 나타났다.

피브로인 미세구는 0.05 mg/mL이하의 농도에서 3T3 세포의 성장을 촉진하였다. 아울러 0.1 mg/mL 농도에서도 세포의 생존율에 영향을 미치지 않았다.

3.2. 미세구에 의한 세포의 이동

피브로인 미세구가 접촉저해에서 해제된 3T3 세포의 이동에 영향을 주는지 조사하였다. 배양접시를 완전히 덮을 정도로 자란 3T3 세포의 단층 일부분을 긁어 제거하고, 세포의 이동 정도를 측정하는 방법을 사용하였다 [16]. 혈청을 첨가하지 않은 DMEM 배지를 단층배양된 3T3 세포에 공급하고, 여기에 미세구의 농도가 0.005, 0.05, 0.5 mg/mL이 되도록 첨가하였다. 이후 24시간 동안 세포가 이동한 거리를 측정하였다 (Fig. 3). 단층세포가 제거된 절단면에서 24시간 동안 세포가 이동한 거리는 DMEM에 미세구를 첨가한 경우 이동거리는 142±25 μm이었다. 소태아혈청을 10% 포함한 배지에서 이동거리는 254 μm인 반면에 DMEM 기초 배지에서 116 μm이었다. 미세구가 첨가된 조건에서 3T3 세포의 이동성은 기초배지인 DMEM에서 보다 높으나, 혈청이 포함된 배지에서 3T3의 세포 이동보다는 낮았다.


Fig. 3. 
Photographic image (a) and migration distance (b) in a scratch assay of 3T3 cell migration with varying microsphere concentration.

배양접시에 3T3 세포가 서로 떨어져 접촉저해가 없는 조건에서, 미세구가 개별 세포의 이동성에 미치는 영향을 조사하였다. 배양접시에 3T3 세포가 서로 접촉하지 않을 만큼 접종하고 24시간 배양한 후, 4시간 동안 위상차 현미경으로 관찰하였다. 5분 간격으로 촬영된 40× 배율의 디지털 이미지를 자동 세포 이미지 추적 소프트웨어인 iTrack4U를 사용하여 분석하였다. 개별 세포 각각 40여 개를 추적하여 시작점으로부터 이동 정도를 나타내고 이동속도를 측정하였다 (Fig. 4). 미세구를 첨가한 DMEM 배지에서 3T3 세포는 활발하게 움직였고, 대부분 시작점에서 멀리 벗어났다. 평균이동속도는 1.69 μm/min이었다. 반면 혈청을 포함한 배지에서도 세포가 활발하게 움직였으나, 일부세포에 국한되는 경향을 보였다. 혈청이 있는 조건에서 평균 이동속도는 1.16 μm/min으로 미세구가 첨가된 조건보다 낮았다. 기초배지인 DMEM에서 세포는 원위치를 중심으로 이동하는 모습을 보였으나 멀리 벗어나지는 않았다. 평균 이동속도는 0.87 μm/min으로 가장 낮았다. 접촉저해가 없는 배양환경에서 미세구를 첨가한 3T3 세포의 이동 속도는 FBS를 첨가한 양성 대조군보다 147% 높게 나타났다.


Fig. 4. 
Automatic tracking of 3T3 cells in DMEM media with microspheres at a concentration of 0.05 mg/mL (a), with 10% serum (b), without supplementation. The average velocities of 3T3 cells supplemented with microspheres or serum (d).

일반적으로 나노입자는 세포의 이동성을 방해하는 것으로 보고되었다. 나노입자가 마이크로 튜블에 흡착하여 세포 수축력을 증가시키거나 [17], 마이크로 튜블의 아세틸화를 감소시키기 때문이다 [18]. 반대로 본 연구에서 피브로인 미세구는 세포의 이동을 촉진하는 결과를 나타내었다. 세포의 이동을 촉진하는 여러 가지 물질이 알려져 있으나 미세구처럼 불용성 물질은 갈바닉 입자가 유일하다 [12]. 그러나 갈바닉 입자가 형성하는 전기장이 세포의 이동을 촉진하므로, 피브로인 미세구에 의한 세포 이동의 촉진과는 다른 메카니즘이 작용할 것으로 추정된다.


Fig. 5. 
Crystal violet-stained monolayer culture of 3T3 cells for 8 days after inoculation with 3T3 spheroids in DMEM with microspheres (a), with 10% serum (b) and DMEM only (c). The average size of monolayer cultures (d).

3.3. FAK와 액틴의 발현에 대한 미세구의 영향

위 연구결과로부터 피브로인 미세구는 FBS가 없는 조건에서도 3T3 세포의 이동을 촉진시켰다. 따라서 세포의 이동에 관여하는 단백질인 FAK와 액틴의 발현 정도를 웨스턴블롯으로 조사하였다. 접촉저해가 발생하기 전까지 48시간 동안 각각의 조건에서 배양한 3T3 세포를 회수하여 웨스턴블롯에 사용하였다 (Fig. 6). GAPDH 대비 FAK 발현은 혈청이 없는 DMEM 배지에서 1.3배, 미세구가 0.005 mg/mL 및 0.05 mg/mL의 농도로 존재할 때 각각 1.5배 및 1.2배 증가하였다. 그러나 미세구의 농도가 0.5 mg/mL의 조건에서 FAK의 발현은 절반으로 감소하였다. 반면에 GAPDH에 대비 액틴의 발현은 미세구의 첨가는 영향을 주지 않았다.p


Fig. 6. 
The effect of microsphere supplementation on the expression levels of focal adhesion kinase (FAK) (a) and β-actin (b).

CHO 세포에서 FAK의 과발현은 세포의 이동을 촉진한다고 보고되었다[7]. 그러나 위 결과에서는 미세구의 첨가는 세포의 이동을 촉진하였으나 FAK의 발현은 감소시키는 경향을 나타내었다. 따라서 미세구에 의한 세포의 이동은 FAK의 발현과 관련성을 확인할 수 없었다. 세포의 이동과 관련된 신호전달 체계는 3가지가 알려져 있다 [6]. 첫 번째는 혈청이나 EGF, TGF-β에 의하여 활성화된 JNK에 의하여 세포골격의 재구성을 동반한다. 두 번째는 p38 신호전달 경로이고, 세 번째는 Erk/MAPK 경로이다. 첫 번째와 두 번째 경로는 액틴의 동적 발현이 필요하지만 세 번째 경로의 세포 이동은 Myocin이 관여한다. 따라서 피브로인 미세구는 FAK의 발현 정도와 무관하고 액틴의 동적발현이 필요한 p38 신호전달체계를 자극하여 세포의 이동을 촉진시켰을 가능성을 배제할 수 없다. 본 연구에서 세포 이동과 관련된 신호전달에 대하여 더 실험을 진행하지 않았으나, 미세구에 의한 세포의 이동과 관련된 세포막의 수용체에서 p38이나 Erk/MAPK로 전달되는 신호체계에 대한 추가적인 연구가 필요하다.

3.4. 3T3 세포의 이동과 콜로니 형성

미세구가 3T3 세포의 콜로니 형성에 미치는 영향도 조사하였다. 배양된 구형의 3T3 세포응집체를 DMEM 배지에 접종하고 8일간 배양하였다. 혈청이 포함된 DMEM 배지에서는 3.76±0.56 mm2의 콜로니를 형성하였다 (Fig. 5). 미세구를 포함한 DMEM 배지에서는 면적 1.45±0.31 mm2의 콜로니를 형성하였다. 반면 미세구나 혈청이 첨가되지 않은 DMEM 배지에 접종된 3T3 구형세포응집체는 3번의 시도 중 2회는 부착하지 않았고 나머지 1회는 부착하였으나 사진으로 측정한 면적은 0.05 mm2으로 거의 자라지 않았다. 미세구의 첨가는 양성대조군인 FBS의 첨가에는 미치지 못하였으나, 세포의 이동을 촉진시킴을 알 수 있었다.

혈청 대신 미세구가 첨가된 DMEM 배지에서 3T3 세포를 8일 동안 배양시켜 얻어진 콜로니를 현미경으로 관찰하였다 (Fig. 6). 콜로니는 대체로 원형이며 미세구와 혈청이 포함된 경우 직경은 각각 0.68 mm 및 1.1 mm이었다. 콜로니는 길게 늘어난 방추형 형태를 보이는 세포들이 약 200 μm의 테두리층을 형성하고 있다. 반면 콜로니의 중앙부에는 크기가 작고 극화되지 않은 세포들로 대부분 채워져 있다. 반면 접종시 사용된 3차원 세포집합체는 남아 있지 않았다. 혈청이나 미세구가 첨가되지 않는 DMEM 배지에서는 접종시 사용된 3차원 세포집합체가 3회 중 2회는 부착하지 않았다. 따라서 미세구가 첨가된 DMEM 배지에서는 3차원 배양된 세포가 모두 2차원 평면으로 부착하고 이동한 것으로 판단된다.

피브로인은 혈청의 기능을 대체할 수 없지만, 세포의 부착을 촉진한다. 양잠 누에의 피브로인은 콜라젠과 상응하는 수준으로 섬유아세포의 부착이 가능하고, 야생 누에의 피브로인은 펩타이드 서열 Arg-Gly-Asp를 제공하여 세포의 부착을 촉진한다 [19]. 그뿐만 아니라 피브로인은 혈청 제거 후 곤충 세포의 사멸을 방지하고 [20], 피브로인과 같이 실크섬유를 구성하는 세리신은 무혈청 세포동결액에 사용된다 [21]. 따라서 피브로인 미세구 역시 세포의 부착에 도움을 주는 것으로 추정된다.


4. CONCLUSION

피브로인 미세구는 무혈청 조건에서 단층배양 절단면으로부터 세포의 이동을 촉진하는 것으로 관찰되었다. 접촉 억제가 없는 조건에서 미세구가 0.05 mg/mL의 농도로 첨가되었을 때, 3T3 세포의 이동속도는 1.7 μm/min였다. 이것은 혈청 10%를 포함한 DMEM 배지보다 147% 빠르고, DMEM의 경우보다 194% 빨랐다. 미세구가 포함된 배지에서 3T3 세포는 단층배양 콜로니를 형성하였으나, 무혈청 DMEM 배지에서는 형성되지 않았다. 웨스턴블롯 분석에서 미세구의 첨가는 FAK의 발현을 감소시키지만, 액틴의 발현에는 영향을 주지 않았다. 본 연구결과로부터 피브로인 미세구는 3T3 세포 이동을 자극하였다.


Acknowledgments

본 연구는 한국연구재단 NRF-2016R1D1A1B01011660와 2015년도 강원대학교 대학회계 학술연구조성비(관리번호-520160198)로 연구하였습니다. 연구비 지원에 감사드립니다.


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