The Korean Society For Biotechnology And Bioengineering

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Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 33 , No. 2

[ Research Paper ]
Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 33, No. 1, pp.41-47
ISSN: 1225-7117 (Print) 2288-8268 (Online)
Print publication date 31 Mar 2018
Received 22 Feb 2018 Revised 15 Mar 2018 Accepted 21 Mar 2018
DOI: https://doi.org/10.7841/ksbbj.2018.33.1.41

국내산 신이대 잎 추출물의 B16F10 흑색종 세포내에서 멜라닌 생성억제
최문희 ; 양승화 ; 신현재*
조선대학교 대학원 화학공학과

Inhibition of Melanogenesis by Domestic Bamboo Leaves (Sasa coreana Nakai) Extract in B16F10 Melanoma Cells
Moon-Hee Choi ; Seung-Hwa Yang ; Hyun-Jae Shin*
Department of Chemical Engineering, Graduate School of Chosun University, Gwangju 61452, Korea, Tel: +82-62-230-7518, Fax: +82-62-230-7226 (shinhj@chosun.ac.kr)
Correspondence to : Department of Chemical Engineering, Graduate School of Chosun University, Gwangju 61452, Korea Tel: +82-62-230-7518, Fax: +82-62-230-7226 e-mail: shinhj@chosun.ac.kr


© 2017 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering
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Abstract

Bamboo trees have been used as construction material, fiber and food resources. Among many parts of the tree, especially, bamboo leaves are known to contain various bioactive compounds for food and medicinal application. Polyphenols, glycosides, amino acids and minerals such as silica in bamboo leaves have provided antioxidant, astringent, antiwrinkle properties. However, there is little study on the skin whitening effect of the extract. In this study, therefore, inhibition of in-vitro tyrosinase and melanin biosynthesis by the water, ethanol, and methanol extracts of domestic bamboo Sasa coreana Nakai were investigated in B16F10 melanoma cells. The methanol extract (SCM) showed in-vitro tyrosinase inhibition activity with IC50 values of 168 μg/mL, and in-vivo cytotoxic concentration ranges > 100 μg/mL. Protein expression and transcription levels of TYR, TRP-1, TRP-2 were decreased in a dose-dependent manner by treatment with SCM. These results suggest that SCM could be used as a candidate for a potential whitening agent in cosmetics.


Keywords: bamboo leaves, Sasa coreana Nakai, tyrosinase inhibition, melanogenesis, whitening agent

1. INTRODUCTION

최근 경제성장에 따른 소득 수준의 향상과 삶의 질적 수준의 요구에 맞춰 화장품산업은 보다 기능적이고 전문적인 기술을 요하는 첨단 산업으로 발전하고 있다. 이에 따라 화장품의 새로운 원료개발의 요구가 증대되고 있으며, 특히 천연물을 활용한 미백과 노화방지 등의 기능성화장품 소재개발의 중요성이 날로 커지도 있다 [1]. 화장품의 소재로써 고려되어야 하는 부분 중 가장 중요한 측면은 원료의 안정성과 환경친화적인 천연소재의 발굴이다. 화장품에 이용되는 천연물은 인체에 대해서 약리학적 유효성을 나타내는 소재가 대부분으로 여러 가지 화학물질의 혼합물이다 [2]. 따라서 역사적으로 오랜 기간 사용해온 안전한 식물로서 다양한 기능성을 제공할 수 있는 자원의 발굴이 중요하다. 대나무는 아열대성 화분과 식물로써, 우리나라에서는 호남, 영남 지방을 중심으로 군락을 이루어 자생하고 있으며, 대표적인 죽종으로는 왕대 (Phyllostachys bambusoides), 솜대 (Phyllostachys nigra vqr. Enonis Stapf), 맹종죽 (Phyllostachys pubescens), 조릿대 (Sasa borealis), 신이대 (Sasa coreana Nakai) 등이 있다 [3]. 대나무의 용도는 주로 죽세공품, 농요재, 건축용재, 펄프용재 등 다양한 자재로 사용되고 있으며, 최근에는 자재로서의 용도를 넘어 생리활성을 기반으로 식품, 화장품, 의약품의 원료 등으로 그 활용영역이 넓어지고 있다 [4]. 대나무를 화장품 소재로 이용하기 위해서 주로 이용하는 부위는 줄기와 잎이며, 대나무 줄기를 이용한 연구결과가 최근 들어 발표되고 있으며, 이는 대나무 줄기에 포함된 다양한 폴리페놀 성분에 기인한 것으로 항산화 및 항비만 효과가 보고되었다 [5]. 또한 대나무 잎에는 phenolic acids, coumarin lactones, anthraquinones, amino acids를 비롯하여 각종 플라보노이드 성분이 다량으로 함유되어 있어 항산화, 항노화 및 항균 활성이 보고되었으며, 항비만, 항콜레스테롤, 대사증후군 억제효과에 관한 연구 및 콜라겐 합성에 효과가 있음이 보고되었다 [6]. 대나무 잎 추출물의 미백활성에 관한 연구는 매우 미미한 실정이며, 특히 신이대 잎의 미백활성은 보고된 바가 없다. 기존 미백제들은 작용기전에 따라 아젤릭산 (azelaic acid), 아스코르빅산 (ascorbic acid), 코직산 (kojic acid), 알부틴 (arbutin)과 같은 타이로시네이즈 (tyrosinase) 저해제 및 자외선 차단효과가 있는 토코페롤 (tocopherol)등으로 분류할 수 있다 [7]. 그러나 이러한 합성 미백소제는 대부분 피부 알레르기 반응, 일정 농도 이상에서는 독성이 유발되는 문제점이 있어 화장품 미백 소재로써 적합하지 않다 [8]. 따라서 세포 독성 문제, 피부 홍반 및 예민 반응 등의 한계점을 극복하기 위해 보다 안정적이며 효과적인 천연소재의 개발이 필요하다. 본 연구에서는 대나무 잎 추출물의 미백 활성 기전 규명을 통해 천연 미백소재로써의 적합성에 대해서 조사하였다.


2. MATERIALS AND METHOD
2.1. 대나무 잎 추출

본 연구에서는 전라남도 담양군 담양읍에서 채취한 신이대잎 (Sasa coreana Nakai)을 dry oven을 사용하여 60oC에서 5시간 동안 건조하였으며, 각각 다른 3가지 추출 방법을 사용하였다 (Fig. 1). 건조된 대나무 잎 10 g을 물 500 mL에 넣어 120oC에서 90분동안 auto clave를 사용하여 추출한 뒤 여과하였으며 여과액을 감압농축기로 농축하여 열수 추출물을 수득하였다. 대나무 잎 10 g을 70% ethanol 250 mL에 넣어 80oC에서 6시간동안 환류 추출하고 여과액을 감압농축기로 농축하여 최종적으로 주정 추출물을 수득하였다. 대나무 잎 10 g을 100% methanol 500 mL에 넣어 상온에서 7일간 침지 추출하고 추출된 용액은 여과하였으며 여과액을 감압농축기로 농축하여 유기용매 추출물을 얻었다. 수용액, ethanol, methanol 용매를 사용하여 제조된 추출물은 각각 SCW, SCE, SCM으로 명명하였다.


Fig. 1. 
Schematic diagram of the extract preparation from Sasa coreana nakai.

2.2. 대나무 잎 추출물의 항산화 활성
2.2.1. DPPH radical 소거능 측정

DPPH free radical은 천연 추출물의 항산화 활성 측정하는 방법으로 널리 사용되는 방법이다. 본 실험에서는 항산화 활성 측정방법 중 Blois의 방법을 변형하여 시료의 radical 소거능을 측정하였다 [9]. Methanol에 용해시킨 0.1 mM DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl, Sigma, USA) 800 μL와 각 샘플 200 μL을 micro centrifuge tube에 넣고 voltexing하여 암실에서 15분간 반응시켰다. 남아 있는 radical의 농도를 UV-Visible spectrophotometer (SCINCO, Seoul, Korea)를 사용하여 517 nm에서 측정하였다. 양성 대조군으로는 ascorbic acid (Sigma, USA)를 사용하였고, 추출물의 DPPH에 대한 소거능 (IC50)은 용매만을 사용한 대조군의 흡광도를 50% 감소시키는데 필요한 농도로 나타내었다.

Antioxidant activity %=absorbance of control-absorbance of 시료absorbance of control×100
2.2.2. ABTS radical 소거능 측정

ABTS radical scavenging은 친수성 및 소수성 시료의 radical 소거 활성을 모두 측정할 수 있어 적용 범위가 넓다는 장점을 가지고 있다. 본 실험에서는 Jeong 등의 방법을 변형하여 측정하였다 [10]. 증류수에 용해한 7 mM의 ABTS 용액과 2.45 mM potassium persulfate를 1:1로 넣어 12시간동안 암소에 방치하였다. Radical stock solution을 흡광도 값이 0.70±0.02이 되도록 PBS (pH 7.4)로 희석하였다. 희석된 용액 800 μL에 농도 별로 제조된 시료 200 μL씩을 가하여 암실에서 15분 동안 반응 후 흡광도를 측정하였다. 양성대조군으로는 ascorbic acid (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 사용하였고, 추출물의 ABTS에 대한 소거능 (IC50)은 용매만을 사용한 대조군의 흡광도를 50% 감소시키는데 필요한 농도로 나타내었다.

Antioxidant activity %=absorbance of control-absorbance of 시료absorbance of control×100
2.3. Total polyphenol 함량 측정

Folin-Ciocalteu 시약을 증류수로 10배 희석한 용액과 2% Na2CO3 (w/v)와 1:1:1의 비율로 혼합하였다. 실온에서 30분간 반응시킨 후, 반응 혼합물의 흡광도는 UV-Visible spectrophotometer (SCINCO, Seoul, Korea)를 사용하여 750 nm에서 측정하였다 [11].

2.4. HPLC 분석

항산화 활성이 가장 높은 SCM을 대상으로 high-performance liquid chromatography (HPLC)를 사용하여 추출물 속에 함유된 polyphenol (catechin, chlorogenic acid, caffeic acid, p-coumaric acid, ferulic acid, rutin)을 정량 분석하였다. Shimadzu HPLC의 LC-20AD 펌프, diode array detector (SPD-20A) 및 XBridge C18 column (4.6×150 mm, 5 μm)을 사용하였다. HPLC의 이동상은 A: water (0.2% (v/v) TFA)와 B: methanol (0.2% (v/v) TFA)를 사용하였다. HPLC 분석조건은 0~50분, 25~55% B, 유속은 0.6 mL/min 이었다. Column 온도는 40oC이고, 흡수파장은 330 nm에서 측정되었으며, 시료 주입은 20 μL로 주사하고 표준 물질의 머무름 시간을 비교하여 화합물을 확인하였다.

2.5. Mushroom tyrosinase 저해활성 측정

SCM의 tyrosinase 저해 활성을 확인하기 위해 Macrini 방법 [12]에 따라 진행하였다. 실험방법은 시험관에 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 6.5) 220 μL와 25~100 μg/mL 농도로 제조된 신이대 추출물 20 μL, L-tyrosine (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 1.5 mM 40 μL, 1500 단위(unit)로 제조한 mushroom tyrosinase (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 20 μL을 넣고 37oC에서 15분간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 tyrosinase에 의해 3,4-dihydroxyphenylalanine (DOPA)로부터 형성되는 DOPAchrome의 양을 490 nm에서 측정하였다.

2.6. 세포배양

B16F10 cell은 한국 세포주은행에서 분양 받았으며, 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco BRL, USA), 0.2% sodium bicarbonate를 첨가한 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 배지로 사용하였고, 37oC에서 5% CO2 상태로 배양하였으며, 세포가 바닥 면적의 90% 정도까지 자란 상태에서 계대 배양하여 실험을 진행하였다.

2.7. 세포독성평가

B16F10 cell suspension을 6 well에 1×104 cells/mL 농도로 200 μL씩 분주하여 배양기에서 24시간동안 안정화를 시킨 후 시료를 농도별로 처리한 후 24시간동안 배양하였다. Choi의 방법 [13]에 따라 2.5 mg/mL MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 용액을 well 당 100 μL씩 넣어 1시간 동안 배양기에 방치한다. 이후 상등액을 제거하고 DMSO를 well 당 200 μL씩 가하고 1분간 shaking하여 formazan을 완전히 용해시킨 후 ELISA Bio-Tek instrument Inc. (Winooski, VT, USA)을 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 본 실험에 사용한 MTT, DMSO는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.

2.8. Melanin 함량 측정

Melanin 함량 측정은 Hosoi의 방법 [14]에 따라 B16F10 세포를 96 well에 1×104 cells/mL 농도로 분주하고 24시간 후에 1000 μg/mL 농도의 α-MSH와 SCM을 각 농도별 (25~100 μg/mL)로 각각 처리하였으며, 48시간 경과 후 멜라닌 생성을 확인하고 세포를 PBS로 세척하였다. 세포를 수확하고 12,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하고 생성된 pellet에 1N NaOH를 넣고 80oC에서 1시간동안 방치하여 용해시킨 후 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 멜라닌 함량은 무 처리군의 흡광도와 비교하였으며, 양성대조군으로는 arbutin을 사용하였다.

2.9. Melanogenesis 관련 단백질 발현 분석

Melanogenesis의 각 단계에 관여하는 효소인 tyrosinase와 TRP-1, TRP-2의 단백질 발현의 변화양상을 westernblot 방법으로 분석하였다 [15]. Tyrosinase, TRP-1, TRP2, actin의 일차 항체와 anti-goat, anti-rabbit, antimouse등의 이차항체는 Santa Cruz Biotechnology (CA, USA)로부터 구입하여 사용하였다. 시료 처리가 끝난 배양 세포에서 cell lysate를 추출하여 Bradford assay로 단백질 농도를 결정한 후 50 μg의 단백질을 10% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis (SDS-PAGE)로 전기영동하고 nitrocellulose membrane에 blotting한 후 1:1000으로 희석한 일차 항체와 hybridization하였다. Membrane 수세 후 horse radish peroxidase가 부착된 이차항체 (1:1000)로 1시간동안 반응시키고 chemiluminescence detection system (FluoChem®FC2, AlphaInnotech, USA)을 이용하여 단백질 발현을 분석하였다.

2.10. 통계처리

모든 결과값은 세 번 반복실험 후 통계처리하였으며, 실험에 의해 얻어진 값들의 평균±표준편차로 나타내었다. 대조군과 실험군 사이의 통계학적 유의성 검증은 SPSS 23 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하여 t-Test를 실시하였으며, p<0.05 이하 경우 통계적으로 유의하다고 판정하였다.


3. RESULTS AND DISCUSSION
3.1. DPPH radical 및 ABTS radical 소거능 측정

국내산 신이대 잎 (Sasa creana Nakai)을 3가지 방법 (autoclave, 70% ethanol, 100% methanol)으로 추출하였다. SCW, SCE, SCM의 추출 수율은 각각 고형분 기준으로 13%, 16%, 17%로 확인되었으며, 100% methanol을 사용하여 추출한 SCM의 수율이 가장 높게 확인되었다. 신이대 잎 추출물들의 항산화 특성을 DPPH, ABTS radical을 사용하여 radical 소거 활성에 대해 분석하였다. 각 시료의 DPPH IC50 범위는 604~797 μg/mL로 확인되었으며, ABTS의 IC50범위는 117~166 μg/mL로 확인되었다 (Table 1). 특히 신이대 잎 추출물 중 100% methanol로 추출된 SCM의 DPPH와 ABTS IC50는 각각 604 μg/mL, 117 μg/mL로 3가지 추출물 중 가장 높은 항산화 활성이 확인되었다. 기존의 연구에서 왕대, 솜대, 맹종죽, 조릿대 및 오죽 추출물의 항산화 활성을 조사하였는데 IC50 범위는 200~1600 μg/mL로 보고되었다 [16-18]. 본 실험 결과가 기존의 항산화 활성보다 높은 항산화 활성을 나타내는 이유는 대나무 잎의 종류와 추출방법이 다르기 때문으로 판단되며, 자생지 및 채취 시기에 따라 대나무 잎의 폴리페놀 성분 및 생리활성을 나타내는 성분들의 함량도 달라질 수 있을 것으로 생각된

Table 1. 
Antioxidant activity and total polyphenol content results of Sasa coreana Nakai extracts
Sample DPPH IC50a (μg/mL) ABTS IC50 (μg/mL) TPCb (GAEc μg/mg)
SCW 608 166 24
SCE 797 138 25
SCM 604 117 42
Ascorbic acid 25 56 -
aIC50 Inhibitory concentration
bTPC Total polyphenol content
cGAE Garlic acid equivalent

3.2. Total polyphenol 함량 측정

각각 다른 방법으로 추출된 국내산 신이대 잎 (SCW, SCE, SCM)의 총 polyphenol의 함량을 확인한 결과 SCM의 polyphenol 함량이 gallic acid 기준으로 보았을 때, 42 μg/mg로 가장 높은 polyphenol 함량이 확인되었다 (Table 1). 기존의 연구에서 조릿대 열수 추출물과 80% methanol 추출물의 총 polyphenol 함량은 각각 15 μg/mL, 12 μg/mL로 확인되었는데 총 polyphenol 함량이 높을수록 높은 항산화 활성이 높다고 보고되었다 [19-21]. 본 연구의 실험결과와 비교해보았을 때 SCM의 총 polyphenol 함량이 기존의 연구 결과보다 더 높은 것으로 확인되었다.

3.3. HPLC 분석

기존 연구결과에 따르면 대나무 잎 추출물에는 caffeic acid, isoorientin, orientin, p-coumaric acid, ferulic acid, hesperidin 등의 phenolic acid가 함유되어 있는 것으로 알려져 있다 [22]. SCM을 HPLC 분석을 통하여 추출물 속에 함유되어 있는 polyphenol을 정량하였다. HPLC 분석 결과 catechin 409 μg/g, chlorogenic acid 178 μg/g, caffeic acid 109 μg/g, p-coumaric acid 54 μg/g, ferulic acid 4 μg/g, rutin 39 μg/g이 함유된 것을 확인하였다 (Fig. 2). SCM에 다량으로 함유되어 있는 catechin, chlorogenic acid, caffeic acid, p-coumaric acid는 천연 항산화제로 알려져 있는 성분이다. 기존의 연구에서 신이대 잎 methanol 추출물의 ethyl acetate fraction에서 hesperidin, naringin, isoorientin, ferulic acid, vitexin 등의 순으로 phenolic compound의 함량이 높은 것으로 보고되었다 [23]. 이와 같은 결과는 대나무 잎의 추출 용매에 따라 phenolic compound의 종류가 달라지는 것을 나타내며, 추출 방법에 따라 다른 항산화 활성이 확인되는 것을 의미한다.


Fig. 2. 
High-performance liquid chromatography (HPLC) chromatograms of (A) SCM and (B) standard.

3.4. Tyrosinase 저해활성

Tyrosinase는 구리를 함유한 효소이며, 멜라닌 생성에 있어서 결정적인 역할을 하는 효소이다. Melanosome 내에서tyrosine을 산화시켜 DOPA를 만드는 tyrosine hydroxylase로 DOPA를 산화시켜 DOPA quinone을 만드는 DOPA oxidase로써 작용하여 멜라닌 중합체를 합성한다 [24]. 본 연구에서는 신이대잎 추출물 (SCM)의 tyrosinase 저해 활성을 측정하기 위해 SCM을 각 농도별 (25, 50, 100 μg/mL)로 처리하여 실험을 진행하였다. 대조군으로 tyrosinase 저해제로 알려져 있는 ascorbic acid와 catechin을 사용하였으며, SCM의 저해 활성을 측정한 결과는 Fig. 3에 나타내었다. 본 실험에서 SCM의 tyrosinase 저해결과 IC50값은 164 μg/mL으로 측정되었으며, 양성대조군으로 사용한 ascorbic acid 과 catechin의 IC50값은 각각 38 μg/mL과 97 μg/mL 로 나타났다. 이와 같은 결과는 양성대조군으로 사용한 ascorbic acid와 catechin보다는 낮은 저해활성을 나타내지만 천연물 수준에서는 매우 높은 저해 활성이라 할 수 있다. 일반적으로 페놀류 화합물을 다량으로 함유하는 식물체와 그 추출물은 높은 항산화능을 갖기 때문에, tyrosinase에 의한 가역적 산화반응을 억제시키는 특성을 나타낸다 [25]. 또한 페놀류 화합물은 tyrosinase의 기질인 tyrosine과 구조적으로 유사하여 tyrosinase의 활성을 저해한다고 알려져 있다 [26]. 효소반응에서 inhibitor는 기질과 구조 및 모양이 유사하며 효소의 활성부위 에 기질과 경쟁적으로 결합한다 [27]. 기존의 연구에서 catechin은 강력한 tyrosinase 저해제로써, 100 μM 이하의 저농도에서 효과가 있음이 밝혀졌으며, 또 다른 연구에서는 대나무 맹종죽 추출물 및 발효 추출물의 tyrosinase 저해활성을 조사하였는데 625~1550 μg/mL의 농도범위에서 50% 이상 저해능이 있다고 보고하였다 [28]. 이와 같은 결과로 보았을 때 대나무의 종류와 추출방법에 따라 tyrosinase 저해활성이 다른 것을 확인할 수 있으며, 본 연구에서 기존의 실험에 비해 높은 tyrosinase 저해 활성이 확인된 이유는 SCM에 포함되어 있는 catechin, chlorogenic acid 등 다양한 polyphenol 성분들이 tyrosinase 활성을 강력하게 저해한 것으로 생각된다.


Fig. 3. 
The inhibitory effect of mushroom tyrosinase from SCM, ascorbic acid, and catechin using a cell-free system.

3.5. 세포독성 평가 (MTT assay)

국내산 신이대 잎 (SCM)의 세포 독성을 측정하기 위해 각각 25, 50, 100 μg/mL 농도범위에서 세포 독성을 측정하였다. 실험한 농도 전체에서 24시간이 지난 후 세포독성은 나타나지 않았다 (Fig. 4). 이와 같은 결과는 기존의 연구에서 대나무 맹종죽 수액을 처리했을 때, 200 μg/mL 이하의 농도에서 세포독성을 나타내지 않았던 연구 결과와 유사하다 [29]. 화장품 성분은 화학물질, 합성 유래 또는 천연물 유래 등이 있으며, 경우에 따라 단독 또는 혼합물의 형태로 사용되는데 최종 제품의 안전성을 확보하기 위해서는 먼저 원료 성분의 안전성이 확보되어야 한다. 본 실험의 결과로 보았을 때 SCM은 화장품 원료로써 비교적 안전한 성분으로 판단되며, 추후 인간 유래 세포 및 추가적인 임상 실험을 통해 안전성을 확인할 필요가 있다.


Fig. 4. 
Cytotoxicity of SCM in B16F10 melanoma cells (1×104 cells/mL) by MTT assay. MTT assay was performed in B16F10 melanoma cells treated with different concentrations of SCM for 24 h at 37oC in 5% CO2 condition. The data represent the mean±S.D of triplicate experiments. *p<0.05.

3.6. Melanin contents 측정 및 morphology 변화

외부자극에 의해 유발된 B16F10 melnoma 세포에서 SCM을 각 농도별로 처리하고 α-MSH (1 μg/mL)병용 처리하여 48시간 배양한 후 melanin 생성량을 측정하였다. Melanin 생성량 실험결과 α-MSH (1 μg/mL) 처리군은 control 실험군에 비해서 melanin 함량이 95.69%로 증가 되었으며, SCM 처리군은 α-MSH (1 μg/mL) 처리군에 비해 25, 50, 100 μg/mL 농도에서 30.8%, 69.6%, 86.4%로 melanin 생성이 감소되었고, 각각 arbutin은 100 μg/mL 농도에서 59.2% 정도 melanin 생성량이 감소 morphology를 관찰하였을 때 48시간 이후 melanin 형성이 저해되는 것을 확인하였다 (Figs. 5, 6).


Fig. 5. 
SCM inhibits α-MSH-induced melanogenesis in B16F10 melanoma cells. B16F10 melanoma cells (1×104 cells/mL) were preincubated for 24 h, melanin content were measured in the cells treated with α-MSH (1μg/mL) and SCM after 72 h incubation at 37oC in a 5% CO2 atmosphere. The bar graph represents mean±SEM (n=3). #p<0.05 vs. vehicle control; *p<0.05 vs. a-MSH alone.


Fig. 6. 
Morphology changes of SCM on melanogenesis in B16F10 melanoma cells. B16F10 melanoma cells were cultured for 48 h in the presence of SCM 25~50 μg/mL. SCM were inhibits of α-MSH-induced melanogenesis in B16F10 melanoma cells.

3.7. 단백질발현 측정결과 (western blot assay)

B16F10 melanoma 세포에 α-MSH를 유도하고 SCM 추출물 각 농도별로 처리하여 melanin합성에 관여하는 tyrosinase, TRP-1, TRP-2의 단백질 발현에 미치는 영향을 조사하였다. α-MSH로 색소침착을 유도시킨 세포주에 SCM을 25, 50, 100 μg/mL 농도로 48시간 동안 처리한 결과 tyrosinase, TRP-1, TRP-2에서 높은 단백질 발현억제 효과를 나타냈으며 농도 의존적으로 발현이 억제됨을 확인할 수 있었다 (Fig. 7). 이와 같은 결과는 기존의 연구에서 제주 조릿대 추출물을 1~100 μg/mL 농도 범위에서 처리하고 단백질 발현감소를 확인하였던 결과와 매우 유사하다 [30].


Fig. 7. 
Effect of the SCM on the protein expression levels of tyrosinase, TRP-1, TRP-2 in B16F10 melanoma cells. B16F10 melanoma cells were treated with the indicated concentration (25, 50, 100 μg/mL) of the SCM extract or with arbutin prior to α-MSH treatment for 48 h.


4. CONCLUSION

본 연구에서는 국내산 신이대 잎 추출물이 mouse 흑색종인 B16F10 melanoma 세포 내에서 tyrosinase 저해활성 및 melanin 생성억제 효과가 있음이 확인되었다. 100 μg/mL 이하의 농도에서 멜라닌 합성 관련 단백질인 tyrosinase 및 TRP-1, TRP-2의 발현을 억제하였다. 이와 같은 결과로 보았을 때 국내산 신이대 잎 추출물은 매우 높은 항산화 활성 및 미백 활성을 가지고 있어 인체에 유해한 화학소재를 대체할 수 있는 천연 미백 소재로써 가능성이 있다고 판단된다.


Acknowledgments

이 논문은 2017-18년도 교육부와 한국연구재단의 지역혁신창의인력양성사업의 지원을 받아 수행된 연구입니다 (NRF-2015H 1C1A1035883).


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