The Korean Society For Biotechnology And Bioengineering

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Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 33 , No. 4

[ Research Paper ]
Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 33, No. 4, pp.237-246
Abbreviation: KSBB J
ISSN: 1225-7117 (Print) 2288-8268 (Online)
Print publication date 31 Dec 2018
Received 29 Nov 2018 Revised 12 Dec 2018 Accepted 13 Dec 2018
DOI: https://doi.org/10.7841/ksbbj.2018.33.4.237

복합기능미생물 Bacillus velezensis GH1-13을 이용한 미생물제형 개발 및 생물학적 특성
박준경1 ; 서선일1 ; 한귀환1 ; 김공민1 ; 김대혁1, 2 ; 송재경3 ; 김평일1, *
1(재)농축산용미생물산업육성지원센터
2전북대학교 자연과학대학 분자생물학과
3농촌진흥청 국립농업과학원 농업생물부 농업미생물과

Development of Microbial Formulation and Biological Properties Using Bacillus velezensis GH1-13
Jun-Kyung Park1 ; Sun-Il Seo1 ; Gui Hwan Han1 ; Kong-Min Kim1 ; Dae-Hyuk Kim1, 2 ; JaeKyeong Song3 ; Pyoung Il Kim1, *
1Center for Industrialization of Agricultural and Livestock Microorganisms (CIALM), Jeongeup, Korea, Tel: +82-63-536-6001, Fax: +82-63-536-6003 (pikim30@cialm.or.kr)
2Department of Molecular Biology, Chonbuk National University Jeonju, Korea
3Agricultural Microbiology Division, National institute of Agricultural Sciences, RDA, Wanju, Korea
Correspondence to : *Center for Industrialization of Agricultural and Livestock Microorganisms (CIALM), Jeongeup, Korea Tel: +82-63-536-6001, Fax: +82-63-536-6003 e-mail: pikim30@cialm.or.kr


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Abstract

Biological control of plant diseases including bacterial and fungal pathogens has been deliberated as a viable alternative method to harmful and expensive chemical control. Bacillus velezensis GH1-13 strain was reported as a multifunctional biological agent which inhibits the plant pathogens and utilized in sustainable agriculture for improving growth of the crops. The objective of this study is to evaluate the biological potential of Bacillus velezensis GH1-13 for effective use in agriculture and industrialization. The microbial formulations of GH1-13 strain were performed into liquid, powder, granule and pellet types. Total viable cells of four microbial formulations were verified more than 107 cfu/mL(g) during 8 weeks at 40°C, and the storage stability was considered under severe condition. Plant growth promoting of four formulation types were examined to pepper and tomato plants. The powder type showed the best effect such as stem length 25.6±0.72 cm, 10 petiole and stem length 35.3±0.46 cm, 11 petiole of pepper and tomato plant, respectively. Biocontrol effect of liquid and powder types was also tested against Colletotrichum gloeosporioides causing pepper anthracnose. The resulting, 100 fold diluted liquid type exhibited control effect of 65%, and side effect on pepper and tomato plants were not detected. From the results, we suggest that microbial formulations have significant effects as biological agents such as plant growth promoting and controlling the phytopathogenic fungi. In addition, we expect that microbial agent may be useful in agriculture, although further study is needed.


Keywords: Bacillus velezensis GH1-13, multifunctional microorganism, microbial formulation, biological control, plant growth promoting

1. INTRODUCTION

현대 농업현장에서는 작물의 생산성 증가, 품질향상, 병해충저항성 증가 등을 위해 농사기술의 개발, 화학비료 및 농약개발 등의 방법을 통해 농업의 생산성을 증가시키기 위한 노력을 기울이고 있다 [1,2].

특히, 지난 수십여 년 간 국내외적으로 품질 향상, 병해충방제를 목적으로 사용의 편의성이 높은 화학적 방제, 화학비료 및 농약을 가장 많이 사용하여 왔다. 이와 같은 무분별한 화학비료 및 농약의 사용으로 인하여, 분해되지 않는 화학물질의 생태계 잔류 문제 이로 인한 생태적 구조 파괴, 환경적오염등 사회적 문제를 야기하고 있다. 최근 화학비료 및 농약의 사용으로 인한 사회적 문제 및 환경문제를 최소화하기 위한 방법들은 개별 국가뿐만 아니라 세계적으로 친환경적 정책이 이루어지고 이에 따라 화학농약의 사용이 크게 줄어들고 있다 [3,4].

이를 대체하는 방법으로 최근 자연계에 존재하는 많은 미생물 가운데 광합성세균, 효모균, 유산균, 방선균, 고초균 등의 유용미생물을 이용한 미생물제제 개발 및 연구가 활발히 이루어지고 있다 [5,6]. 이러한 유용미생물은 인간에게 유용할 뿐만 아니라 농업분야에서 토양개량과 작물의 생장촉진 및 품질향상, 병해충 감소, 저장성 향상 등과 같은 다양한 형태로 활용되고 있으며 그 활용목적에 따라 미생물의 현장 실용화 기술 개발이 이루어지고 있다 [7,8]. 친환경 농업의 확산으로 인하여 유용미생물을 이용하는 생물적 방제 방법에 대한 연구가 활발하게 이루어지고 있다 [9-12].

최근 유기농을 포함한 친환경농산물 생산 농가수와 재배면적 증가에 따라 병해충방제용 생물농약과 유기농업자재 시장도 급속히 증가되고 있는 추세이다. 현재 국내 미생물시장규모는 약 7700억 원이며, 그 중 농업용 미생물제제 (미생물농약, 미생물비료)시장 규모는 약 650억 원으로 8.4% 정도 차지하고 있다. 국내에 등록한 농업용 미생물제제는 2014년을 기준으로 유기농자재 공시 등록 제품 1,290종과 비료용 300여 종이 등록, 시판 중이다 [1,2].

농업용으로 국한되지 않고 축산업에서도 사료나 물 등에 섞어 가축에 먹이거나 악취제거용으로 사용되고 있으며, 최근 구제역 매몰지에서는 사체분해 촉진과 유해가스, 병원균발생 억제 방안으로 미생물제제를 투입해 효과를 보고 있다 [13,14].

생물적 방제를 위한 생물농약의 재료로써 활용되는 주요미생물은 대표적으로 고초균, 효모균, 유산균, 녹농균 (슈도모나스), 사상균 (트리코더마) 등이 있으며, 이 중 가장 많이 연구, 개발되고 산업화되고 있는 고초균은 작물생육촉진, 식물병원균의 항균활성능, 병저항성 등에 대한 효능이 보고되어지고 있다 [15-18].

최근 보고된 고초균 Bacillus velezensis GH1-13은 식물에 병해를 입히는 병원성 곰팡이에 높은 항균활성을 갖는 물질인 Fengycin, Iiturin, Surfactin 등을 보유하고 있고 더불어 식물생육촉진 물질인 중 하나인 Indole-3-acetic acid (IAA)를 분비한다고 보고되었다 [19,20]. 이는 친환경 농업화를 위한 미생물 제제의 주요 재료로서 작물의 생육촉진능력과 항균활성능력 등 작물재배에 있어 복합기능미생물제제로의 개발 가능성이 높음을 확인하였다.

고추, 토마토, 감자를 포함한 가지과 작물은 국내 원예작물 시장에서 약 25% 이상 비중을 차지하는 주요 농가 소득 작물로 알려져 있다. 우리나라의 주요 소득 작물인 만큼 현재까지 가지과 작물에 발생하는 탄저병, 잿빛곰팡이병, 역병, 온실가루이, 총채벌레 등 주요 병해충 방제를 위한 친환경 작물보호제 개발 연구가 이루어지고 있지만 농업 현장에서 직접적으로 활용되고 있는 사례는 소수에 불과하다 [21,22].

현장 활용을 위한 대량생산 체계 구축 및 공정개발이 필수적이며 복합기능 활성을 최대화하는 제형화 개발과 현장적용 기술개발이 필요한 상황이다 [23-25]. 이러한 한계점을 해결하고자 농업미생물의 효율성 증대를 위한 작물별, 용도별맞춤형 미생물제제가 필요하고, 더불어 미생물의 대량생산을 위한 배양공정과 제형화 및 현장적용 기술 개발이 필요하다 [26-29].

본 연구에서는 가지과 작물을 대상으로 식물 병 방제와 작물생육촉진 효과를 가지는 복합기능미생물인 B. velezensis GH1-13 균주를 저비용이며 고효율의 최적배지를 이용해 대량생산하고, 용도별 맞춤형 미생물제형을 개발하여, 농업현장에서 복합기능미생물제제의 효능 및 안정적 활용 방법을 개발하고자 한다.


2. MATERIALS AND METHOD
2.1. B. velezensis GH1-13 균주 및 배양 조건

B. velezensis GH1-13은 농촌진흥청 국립농업과학원 농업유전자원센터 (Korean Agricultural Culture Collection)에서 분양받았다. 분양받은 균주의 장기 보존을 위해 20% Glycerol를 첨가하여 stock 제조 후 -80°C 초저온 냉동고에 보관하여 실험에 사용하였다. 본 실험에 사용한 배지는 영양배지인 Luria-Bertani (LB, DifcoTM: Tryptone 10 g, Yeast extract 5 g, NaCl 10 g per liter) 한천배지를 제조하여 고압멸균기에서 121°C 15분간 멸균하여 사용하였다. 이 후, 본 균주를 한천배지에 접종하여 37°C 항온배양기에서 24시간 이상 배양 후 순수 분리된 콜로니를 이용하여 본 연구를 수행하였다.

2.2. B. velezensis GH1-13의 대량배양

B. velezensis GH1-13 균주 제형화 준비를 위한 첫 번째 단계로 500 L fermenter를 이용한 대량배양을 실시하였다. 종균배양의 준비는 총 2차로 진행되었으며, Luria-Bertani (LB)배지, 37°C, 150 rpm, 12시간 진탕 배양을 바탕으로 1차 종균 배양은 250 mL 삼각플라스크에 50 mL 볼륨으로 배양하고, 2차종균은 1 L를 포함한 5 L 삼각플라스크에 1% 1차 종균을 접종 후 배양하여 대량배양을 위한 종균으로 사용하였다. 본 배양은 500 L fermenter로 300 L 배양하였으며, 사용배지는 저비용 고효율 최적배지 (0.8% Soy bean flour, 0.5% glucose, 0.15% NaCl, 0.25% K2HPO4, 0.05% Na2CO3, 0.1% MgSO4·7H2O per liter)를 사용하였다. 배양 조건은 37°C, 0.4 vvm의 통기량, 내부압력 0.4 kg/cm2, 100 rpm으로 교반하여 48시간동안 진행되었으며, 배양종료 후 희석평판법을 통한 생균수측정 (colony forming unit, cfu/ml)을 통해 대량배양의 보증 균수를 확인하였다.

2.3. B. velezensis GH1-13의 미생물 제형화 공정 및 온도별 보존 안정성 조사

복합기능을 갖는 B. velezensis GH1-13 균주를 통해 용도, 환경 및 적용시기에 적합한 최적 미생물 제형을 탐색하고자 액상, 분말, 입제, 펠렛 제형 공정을 진행하였다. 액상 제형은 500 L fermenter를 이용하여 대량배양한 배양액을 사용하고, 분말 제형은 본 균주 배양액에 20% 산화전분 보조제를 첨가한 후 분무건조기 (Spray Dryer)를 이용하여 생산하였다. 입제 제형을 생산하기 위한 주요 흡착제 재료로 제올라이트를 이용하였으며 제조 방법은 먼저 제올라이트에 본 균주 배양액을 침지시킴으로써 균주가 제올라이트에 흡착될 수 있게 하였다. 이 후 키토산을 첨가하여 미생물의 흡착을 촉진시켜 주었으며 1% 알긴산을 통해 미생물이 흡착된 제올라이트를 코팅 해줌으로써 입제화하였다. 입제화시키는 제조 단계 마다 교반기를 돌려줌으로서 균주들이 제올라이트에 골고루 흡착될 수 있도록 하였다. 펠렛 제형의 경우, 주요 보존 첨가제 재료는 미강을 사용하였으며 2가지 혼합방법으로 생산하였다. 먼저 본 균주 배양액과 미강을 9:1 비율로 혼합하여 생산한 경우 (이하 펠렛I로 표기)와 미강과 탈지대두분을 7:3 비율로 혼합 후, 혼합된 보존 첨가제와 본 균주 배양액을 9:1 비율로 혼합하여 생산한 경우 (이하 펠렛II로 표기)로 설정한 후, 펠렛 제조 장비를 통해 60~80°C의 스팀 조건으로 압착한 후 3 mm 크기로 생산하였다. 이어서 용도에 따라 개발된 4종의 미생물 제형이 보관 온도에 따라 균주의 보존 안정성이 유지되는지 조사하고자 4°C (냉장), 25°C (실온), 40°C (고온)의 가혹조건에서 1주 간격으로 총 8주 동안 희석평판법을 이용한 생균수 측정을 진행하였다.

2.4. B. velezensis GH1-13 액상 제형을 이용한 작물의 약해시험

미생물 제형의 현장적용을 위하여 대량배양을 통해 확보된 복합기능미생물 B. velezensis GH1-13의 액상 제형에 대하여 고추, 토마토 유묘에 경엽 살포 후 이에 의한 약해시험을 수행하였다. 본 시험에는 부라보 고추 (아시아 종묘)와 베리킹 토마토 (아시아 종묘)를 사용하였으며 각 종자를 70% 에탄올로 표면 살균하여 2% NaOCl 용액에 15분간 침지시킨 후, 멸균된 증류수로 3회 이상 세척하였다. 이 후 50구 육묘 플러그트레이에 파종하고, 본 잎 2매 이상 생육되면 본 시험을 위한 준비로 각 유식물체를 14 cm×10 cm 크기의 포트에 이식하였다. 약해시험을 위한 대조물질은 처리하지 않은 무처리구를 대조구로 사용하였고, 처리방법으로 B. velezensis GH1-13의 액상 제형을 100배, 250배 희석으로 제조된 약제를 소형분무기를 이용하여 경엽에 약제가 흐르지 않을 정도로 뿌려주었다. 시험은 완전임의배치법으로 이루어 졌으며 경엽 살포 후 14일 동안, 각 작물에 대한 경엽의 외관상 약해 유무 달관조사와 함께 엽수조사를 진행하였다. 본 시험은 처리구별 5개체 3반복으로 진행되었으며 생육기간동안 온도 25±2°C, 습도 50±5%를 유지하였다.

2.5. B. velezensis GH1-13 제형별 작물 생육 증진 효과 시험

B. velezensis GH1-13 균주로부터 개발된 미생물제형별 작물생육 증진 효과시험을 위해 대표적인 가지과 작물인 고추와 토마토를 이용하였다. 본 시험에서는 청진고추 (주식회사 다농), 토마토 (썬글로브)를 사용하였고, 먼저 각 종자를 70% 에탄올로 표면 살균하여 2% NaOCl 용액에 15분간 침지시킨 후, 멸균된 증류수로 3회 이상 세척하였다. 이 후 50구 육묘플러그트레이에 파종하고, 본 잎 2매 이상 생육되면 본 시험을 위한 준비로 각 유식물체를 15 cm×13.5 cm크기의 플라스틱 화분에 이식하였다. 작물 생육 효과시험의 대조구는 별도의 대조물질의 처리는 하지 않고 무처리구를 대조구로 사용하였으며 미생물제형별 처리방법으로 액상 및 분말은 100배 희석하여 50 ml씩 관주처리, 입제는 화분 상단에 10 g씩 살포해주었고, 펠렛의 경우 10 g씩 토양 혼화처리로 진행되었다. 작물의 줄기길이, 가지 개수를 생육 효과 조사항목으로 설정하고, 조사 횟수는 7일 간격으로 총 3회 진행하였다. 본 시험은 작물체당 5반복으로 진행되었으며 생육기간동안 온도 25±2°C, 습도 50±5%를 유지하였다.

2.6. B. velezensis GH1-13 액상, 분말 제형의 고추탄저병 방제 효과시험

작물 생육 증진효과와 더불어 식물병 방제 효과시험을 위하여 본 시험에서는 B. velezensis GH1-13의 액상 제형과 분말제형을 사용하였다. 먼저, 고추 열매에 탄저병을 일으키는 탄저병균 (Collectotrichum gloeosporioides KACC40690)은 농촌진흥청 농업유전자원센터 (Korean Agricultural Culture Collection)에서 분양받았다. 탄저병균은 Potato Dextrose Agar (PDA, DifcoTM: Potato starch 4 g, Dextrose 20 g, Agar 15 g perliter)에서 25°C로 일주일간 배양한 후 고추열매에 인위 접종하여 병원성을 확인한 후 사용하였다.

본 시험에서는 먼저 고추 열매를 70% 에탄올로 소독하여 풍건하였다. 이 후, 플라스틱 상자 (24 cm×18 cm×9.5 cm)에 탈지면을 깔아주고 증류수 100 mL을 넣어 곰팡이 병 발생에 유리한 다습한 환경을 만들어 주었다. 이 후, 건조된 고추를 플라스틱 상자에 놓고 2 cm의 작은 핀으로 고추 열매당 3부위에 상처를 주고 상처부위에 먼저 시험 농도 (액상제형 100배, 250배 희석, 분말제형 1%, 0.4% 희석)로 제조된 제형을 접종하고 충분히 건조시켰다. 병원균 접종 준비로 Potato Dextrose Agar (PDA, DifcoTM)에서 일주일간 배양된 탄저병균에 멸균수를 부어 포자 회수 후 포자현탁액 농도를 1×106 spore/ml로 맞추어 건조된 고추의 상처부위에 접종하였다. 접종 후 플라스틱 상자에 랩을 씌워 30°C에서 7일간 배양하면서 발생한 탄저병 병징의 병반면적 조사를 통해 B. velezensis GH1-13의 액상, 분말제형의 탄저병에 대한 약효를 조사하였다. 약효시험은 모두 3반복으로 진행되었으며, 시험은 미생물제형을 처리한 처리구와 처리하지 않은 대조구, 시판되는 농약 처리구도 포함하여 상호비교하였다 [30,31].


3. RESULTS AND DISCUSSION
3.1. B. velezensis GH1-13의 500 L Fermenter를 이용한 대량배양

B. velezensis GH1-13의 대량생산을 위해 저비용 고효율 최적배지 300 L를 제조하여 500 L fermenter를 이용해 대량배양을 수행하였다. 기초배지 (NaCl 0.15%, K2HPO4 0.25%, Na2CO3 0.05%, MgSO4·7H2O 0.1%, pH 7.5)를 바탕으로 대량배양용 최적배지 개발을 위해 최적의 탄소원과 질소원 선발을 수행하였다. 9종 탄소원 (glucose, frucotose, sucrose, lactose, glycerol, maltose, xylose, dextrin, soluble starch)과 6종 질소원 (yeast extract, peptone, tryptone, soytone, (NH4)2SO4, soy bean flour)을 대상으로 각각의 농도별 최적 조건을 선발하였다 (data not shown). 그 결과 0.5% glucose, 0.8% soy bean flour를 저비용 고효율 최적배지의 탄소원과 질소원으로 결정하였다. 발효 공정의 재현성을 확보하기 위해 총 3회의 대량배양을 수행하였으며, 결과 배양 30시간 후 균체 회수가 최적값으로 산출되었고, B. velezensis GH1-13의 생균수는 평균 8.0×108cfu/mL로 측정되었다. 이어서 B. velezensis GH1-13의 포자형 성률을 증가시키기 위해 열처리를 수행하였다. Fermenter의 온도를 60°C로 조절하여 1시간 동안 처리 후 내생포자 균수를 측정한 결과, 6.8×108 cfu/ml로 측정되었으며, 전체 B. velezensis GH1-13 대량배양 공정의 내생포자 형성률은 약 85% 였다. 이 후 제형화 실험에서는 8.0×108 cfu/mL의 보증 균수를 갖는 액상 제형을 사용하였다 (Fig. 1).


Fig. 1. 
Culture profile of B. velezensis GH1-13 with optimal medium by 500 L fermenter.

3.2. B. velezensis GH1-13의 제형 및 안정성 조사

복합기능미생물의 현장적용을 위하여 B. velezensis GH1-13 균주를 액상, 분말, 입제 및 펠렛 형태로 제형화하였다. 제형방식에 따른 균체 보존율을 확인하기 위해 희석평판법을 이용하여 B. velezensis GH1-13의 생균수를 측정하였다. 그 결과, 액상 8.0×108 cfu/g, 분말 7.2×109 cfu/g, 입제 5.6×107 cfu/g, 펠렛I 6.3×107 cfu/g, 펠렛II 5.4×107 cfu/g으로 본 연구에서 시도한 4종의 제형에서 B. velezensis GH1-13는 보증 균수가 107cfu/g 이상으로 측정되었다 (Fig. 2).


Fig. 2. 
The microbial formulations of B. velezensis GH1-13 with total viable cell counts per each formulation. (A): Liquid, (B): Powder, (C): Granule, (D): Pellet I, (E): Pellet II.

제형 형태에 따라 확보된 4종의 B. velezensis GH1-13 제제의 열에 대한 안정성을 조사하기 위해 4°C, 25°C, 40°C를 보관온도로 하여 8주간 보존율을 확인하였다. 그 결과, 액상 제형은 보관온도 4°C, 25°C, 40°C에서 각각 평균 8.0×108±0.3 cfu/g, 7.1×108±0.6 cfu/g, 4.6×108±0.3 cfu/g의 생균수가 조사되었으며 초기 액상제형 대비 생균수 보존율은 각각 94%, 84%, 54%로 확인되었다. 액상 제제의 보관은 4°C에서 최적이었으며, 8주 경과 후에도 90%이상의 보존율을 확인하였다 (Fig. 3(A)). 분말 제형은 보관온도 4°C, 25°C, 40°C에서 각각 6.8×109±0.6 cfu/g, 6.5×109±0.3 cfu/g, 6.4×109±0.6 cfu/g의 생균수가 조사되었으며, 초기 분말제형 대비 94%, 90%, 그리고 89%의 온도별 보존율을 나타냈다 (Fig. 3(B)). 입제의 경우 4°C, 25°C, 40°C에서 각각 6.0×107±0.3 cfu/g, 6.0×107±0.2 cfu/g, 5.8×107±0.3 cfu/g의 생균수가 측정되었고 (Fig. 3(C)), 펠렛I의 경우 6.1×107±0.4 cfu/g, 6.1×107±0.3 cfu/g, 5.8×107±0.4 cfu/g (Fig. 3(D)), 펠렛II의 경우 5.7×107±0.3 cfu/g, 5.8×107±0.3 cfu/g, 5.4×107±0.3 cfu/g (Fig. 3(E))로 입제, 펠렛I, 펠렛II 모두 90% 이상 보존율을 확인하였다. 이에 따라 본 균주로 개발된 미생물제형은 보관온도에 따라 급격하게 감소되지 않고 보증균수 수준으로 유지됨을 확인하였다.


Fig. 3. 
Effect of temperature on storage stability of four microbial formulations. (A): Liquid, (B): Powder, (C): Granule, (D): Pellet I, (E): Pellet II.

3.3. 미생물 액상 제형의 작물에 대한 약해시험

저비용 고효율 최적배지를 이용하여 500 L fermenter를 통해 생산된 B. velezensis GH1-13의 액상 제형을 경엽 살포해줌으로써 고추, 토마토에 대한 약해 유무를 확인하였다. 경엽 살포 후 14일 동안 작물 경엽의 외관상 약해 유무를 조사한 결과, 두 작물 모두 반점 및 반문의 유무, 황변 또는 엽소 여부, 경엽의 위조여부, 경엽의 고사여부, 기타 발육 생육상태 불량과 같은 약해 증상은 나타나지 않았다 (Fig. 4). 또한 두 작물의 엽수 조사 결과 무처리구 대비 엽수는 변화가 나타나지 않았다 (Table 1). 이를 통해 미생물 제형들을 현장적용하는데 있어 기본이 되는 액상 제형과 이를 기초로 개발되는 분말, 입제, 펠렛 제형에서도 시험 작물 대한 약해가 발생하지 않음을 확인하였다.


Fig. 4. 
Phytotoxicity effects on pepper (P) and tomato (T) leaves from our liquid formulations for 14 days. P(A): Control, P(B): 100X treatment, P(C): 250X treatment; T(a): Control, T(b): 100X treatment, T(c): 250X treatment.

Table 1. 
The number of petiole count on pepper and tomato by our liquid formulation
Microbial formulation Crop Control Dilution (100X) Dilution (250X)
Bacillus velezensis GH1-13 liquid type Pepper 7 7 7
Tomato 4 4 4

3.4. 미생물 제형별 작물 생육 증진 효과 시험

제형 형태에 따른 고추, 토마토의 생육 증진 효과 시험을 수행하였다. 생육 증진 효과 시험은 3주 동안 이루어졌으며 시험 작물의 줄기길이, 가지 개수를 측정하여 진행되었다. 먼저, 고추의 결과를 보면 각각의 미생물 제제 처리 후 1주차 평균줄기 길이 10.5±0.34 cm, 가지 수 4개가 측정되었으며, 2주차 평균 줄기 길이 13.7±0.6 cm, 가지 수 7개로 측정되었다. 초기 1~2주차 시험에서는 생육증진 효과에 대한 유효성 있는 결과가 측정되지 않았다. 이 후 3주차 생육 조사에서 고추 줄기 길이 측정 결과, 무처리구의 경우 18.2±0.71 cm으로 측정되었고 액상 제형은 평균 17.9±0.78 cm, 입제는 22.9±0.96 cm, 펠렛I 제형은 20.6±0.83 cm으로 측정되었다. 고추의 가지 갯수 측정은 무처리를 포함한 액상, 입제, 펠렛I 제형에서 평균 9개가 측정되었다. 특히, 분말과 펠렛II는 각각 줄기 길이 25.6±0.72 cm, 23.2±0.93 cm로 측정되었고 가지 개수는 대조구 대비 평균 10개의 가지 수가 측정되어 대조구 대비 140%, 127%의 고추 생육 증진 효과가 나타났다 (Fig. 5(P)), (Table 2).


Fig. 5. 
Plant growth-promoting effects on Pepper (P) and Tomato (T) for 21 days utilizing our microbial formulations. P(a): Control, P(b): Pellet II, P(c): Liquid, P(d): Pellet I, P(e): granule, P(f): Powder; T(a): Control, T(b): Pellet I, T(c): Liquid, T(d): Granules, T(e): Powder, T(f): Pellet II.

토마토의 경우, 각각의 미생물 제제 처리 후 1주차 평균 줄기 길이 10.5±0.34 cm, 가지 수 4개가 측정되었으며, 2주차 평균 줄기 길이 13.7±0.6 cm, 가지 수 7개가 측정되었다. 초기 1~2주차 시험에서는 고추와 마찬가지로 생육증진 효과에 대한 유효성 있는 결과가 측정되지 않았다. 이 후 3주차 생육 조사에서 토마토 줄기 길이 측정 결과, 무처리구는 28.4±0.98cm으로 측정되었고 액상 제형은 평균 31.3±0.82 cm, 입제는 32.8±0.69 cm, 펠렛II 제형은 29.0 ±0.50 cm 으로 측정되었다. 토마토의 가지 개수 측정은 무처리와 펠렛I 제형에서 10개, 액상, 입제, 펠렛II 제형에서는 평균 9개가 측정되었다. 특히, 분말과 펠렛I에서 토마토 줄기 길이가 35.3±0.46 cm, 34.1±0.43 cm으로 측정되었고, 가지 개수는 두 제형 모두 평균 11개가 측정되어 대조구 대비 124%, 120%의 토마토 생육 증진효과가 나타났다 (Fig. 5(T)), (Table 2).

Table 2. 
Pot assay for analyzing plant (pepper and tomato) growth-promoting effects by our microbial formulation. The treatment was performed for 21 days
Treatment Pepper Tomato
Stem length (cm) Number of petiole Stem length (cm) Number of petiole
Control 18.2±0.71 9 28.4±0.98 10
Liquid 17.9±0.78 9 31.3±0.82 9
Powder 25.6±0.72 10 35.3±0.46 11
Granule 22.9±0.96 9 32.8±0.69 9
Pellet I 20.6±0.83 9 34.1±0.43 11
Pellet II 23.2±0.93 10 29.0±0.50 9

B. velezensis GH1-13 제형별 가지과작물의 생육 증진 효과는 분말과 펠렛 제형에서 가장 높게 측정되었으며, 이러한 결과는 B. velezensis GH1-13 균주가 갖는 식물 생장 촉진 효과가 안정적으로 보존되었음을 의미한다. B. velezensis GH1-13균주의 식물 생장 촉진 효과는 auxin의 대표물질인 IAA (indole-3-acetic acid)에 의한 것으로 미생물 균주와 식물간의 신호물질전달체계를 통해 식물의 줄기, 뿌리의 세포분열 및 신장 생육을 유도하는 것으로 알려져 있다 [32-34]. 본 결과를 바탕으로 한 B. velezensis GH1-13 균주 배양 및 제형화 연구를 통해 분말 및 펠렛 제형이 B. velezensis GH1-13 에서 생성된 IAA를 안정하게 보존하는 제형 조건임을 확립하였다.

3.5. 미생물 액상, 분말 제형의 고추탄저병 방제 효과시험

Collectotrichum sp. 병원균에 의해 발생되는 탄저병은 식물체에 감염되면 병반이 원형내지 부정형의 겹무늬 증상으로 확대되어 병반주위가 물러지고 결국엔 말라버리는 죽는 현상이 나타나게 된다 [30,31]. 이러한 병해에 대하여 B. velezensis GH1-13의 액상 제형과 분말제형을 이용한 고추 탄저병방제 효과시험을 통해 병해충 방제용 미생물제제로서의 가능성을 탐색하고자 하였다. 대상 병원균은 1×106 spore/ml 농도로 포자 현탁액을 준비하고 먼저 이들의 병 발생상황을 확인하였다. 멸균수를 접종한 무처리구의 고추 열매에 작은 핀으로 상처를 낸 후 상처부위에 인위 접종한 결과, 병반면적이 11.44±0.95 mm, 이를 통한 병 발생률은 100%로 측정되어 고추 탄저병 방제효과를 검정하는데 충분한 상황임을 확인하였다 (Fig. 6). 본 시험의 결과 액상 제형의 경우 100배 희석처리했을 때 병반면적은 4.0±0.33 mm로 측정되었고 이를 고추 탄저병에 대한 방제가로 환산했을 때 대조구 대비 65%의 병 방제효과가 나타났다. 액상 제형 250배로 희석된 처리구는 병반면적률 7.11±0.51 mm로 측정되었고 대조구 대비 방제가는 37%로 확인되어 100배 희석한 처리구보다 절반으로 측정되었다. 분말 제형의 경우 1% 농도로 처리한 처리구에서 병반면적은 4.89±0.19 mm로 측정되었고, 대조구 대비 고추탄저병에 대한 방제가를 환산하였을 때 57%의 병 방제효과가 나타났다. 0.4% 농도로 처리한 처리구의 경우 7.0±0.33 mm의 병반면적과 고추탄저병의 방제효과가 39%로 확인되었다. 상호비교로 양성대조구로 사용한 살균제 안트라콜 수화제 (Bayer Inc.)는 고추 탄저병에 대해 2.11±0.38 mm의 병반면적과 82%의 방제가가 측정되었다 (Fig. 7).


Fig. 6. 
Biological control effect by liquid and powder formulations on pepper at pin-prick wound inoculation by Collectotrichum gloeosporioides. The negative control were D.W treatment and positive control used was agricultural pesticide. (A): Positive Control, (B): Negative Control, (C): Liquid 100X, (D): liquid 250X, (E): powder 1%, (F): powder 0.4%.


Fig. 7. 
Biocontrol efficacies by liquid and powder formulations of B. velezensis GH1-13. The formulated cells and Collectotrichum gloeosporioides were wound inoculated to green peppers and incubated for 7 days at 30°C. D.W and agricultural pesticide were used as negative and positive control, respectively. The control value results from pathogen was based on the areas of the infected lesion. A: Positive control; B: Negative control; C: 100X diluted liquid type; D: 250X diluted liquid type; E: Powder 1%; F: Powder 0.4%. Data are means ± standard deviations of three independent experiments per treatment.

B. velezensis GH1-13의 액상, 분말 제형의 고추탄저병에 대한 방제 효과는 액상 제형에서 100배 희석된 처리구가 다른 처리구에 비해 높은 효과를 나타내었다. 이는 B. velezensis GH1-13 균주가 Fengycin, Iturin, Surfactin, Bacilysin, Bacillomycin 등과 같은 식물 병원성 곰팡이에 강한 길항작용을 하는 물질이 제형화 후에도 유지되고 있음을 의미한다. 한편 액상 제형이 갖는 고추탄저병에 대한 방제가는 양성대조구로 사용한 안트라콜 수화제의 방제가 보다 약 20% 낮게 측정되었지만 고추 탄저병에 대한 약효는 뚜렷이 확인되었기에 B. velezensis GH1-13의 액상 제형과 분말 제형은 병해충 방제용미생물제제 연구개발의 가치가 높은 친환경 생물농약으로서 그 활용 가능성을 확립하였다.


4. CONCLUSION

가지과 작물 재배농가의 실제 현장 적용을 위한 연구로 복합기능미생물 Bacillus velezensis GH1-13 균주의 용도 및 시기에 맞는 최적 미생물 제형화 개발과, 이를 이용한 작물의 in vivo 검정을 통해 친환경적인 농업 미생물제제로의 가능성 탐색하였다. 간척지 토양으로부터 분리된 본 균주는 내염성을 가지고 있으며 작물생육을 촉진하는 IAA (Indole-3-acetic acid)와 같은 물질을 분비하고, 동시에 식물병을 일으키는 병원균의 생육을 억제하는 항균활성능력을 가지고 있다 [20]. 이를 활용하기 위한 연구로 먼저 최적배지를 사용하여 500 L Fermenter를 이용한 300 L 대량배양을 통해 보증 균수 8.0×108 cfu/ml, 내생포자 6.8×108 cfu/ml로 85%의 내생포자 형성률을 확인하였다. 이를 기초로 4종의 미생물 제형화 (액상, 분말, 입제, 펠렛)공정을 완료하였으며, 본 균주의 제형별 보존성 및 안정성 확인을 위해 저온, 실온, 가혹조건에서 8주 동안 조사한 결과, 액상 8.0×108 cfu/g, 분말 7.2×109 cfu/g, 입제 5.6×107 cfu/g, 펠렛I6.3×107 cfu/g, 펠렛II 5.4×107 cfu/g으로 모든 제형에서 보증 균수가 107 cfu/mL(g) 이상으로 조사되었다.

미생물제제의 용도, 시기에 맞는 최적 제형 선별을 위해 작물의 약해시험, 생육증진 효과시험 그리고 고추 탄저병 방제효과시험을 수행하였다. 최적배지를 통해 배양된 Bacillus velezensis GH1-13의 액상 제형은 고추, 토마토에 대하여 약해가 발생되지 않았고, 분말 제형과 펠렛 제형은 고추와 토마토의 생육 증진에 있어 120%이상의 생육 증진 효과를 나타내었다. 또한 액상 제형이 고추 탄저병에 대해 65%의 방제 효과를 나타내었다. 이를 통해 각각의 미생물 제형마다, 사용목적에 따라 그 효과가 다르게 나타나는 결과를 알 수 있었고, 실제 현장에서는 작물재배용, 병해충 방제용, 토양개량용과 같이 미생물 제제를 사용하고자 하는 용도를 미리 설정한 후 사용한다면 더욱 효율적인 친환경농산물 생산 증대에 기여할 뿐만 아니라, 작물재배의 작목, 환경 및 시기별 용도에 따른 노동력 및 비용 절감과 편리성 도모를 높일 수 있다.

국내는 아직 농산물의 친환경적인 방제 연구가 시작 단계이며, 인체에 대한 식품의 안전성이 종종 사회적인 이슈가 되고 있는 점을 감안할 때, 미생물을 이용한 무공해·친환경 제제의 수요는 계속 증가할 것이며 이에 대한 지속적인 투자와 연구가 필요한 상황이다.

실제로 본 연구를 바탕으로 Bacillus velezensis GH1-13균주액상 제형을 시제품으로 제작하여 기술이전을 통해 친환경유기농업자재 등록 추진 중에 있다. 최적배지를 통한 대량배양 및 제형화 연구는 친환경 생물학적 방제를 위한 주요 기초연구로 활용이 가능하고, 향후 지속적인 연구개발 및 농가 현장적용 실용화를 통해 친환경 미생물제제로서 가치를 구축할 예정이다.


Acknowledgments

본 연구는 농촌진흥청 공동연구사업 (과제번호 PJ012467)의 지원에 의해 이루어졌으며 이에 감사드립니다.


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