The Korean Society For Biotechnology And Bioengineering

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Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 33 , No. 4

[ Research Paper ]
Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 33, No. 4, pp.247-252
Abbreviation: KSBB J
ISSN: 1225-7117 (Print) 2288-8268 (Online)
Print publication date 31 Dec 2018
Received 20 Nov 2018 Revised 03 Dec 2018 Accepted 04 Dec 2018
DOI: https://doi.org/10.7841/ksbbj.2018.33.4.247

커피부산물을 활용한 글루코오스 추출 최적화 연구
장정화 ; 여현진 ; 김정원 ; 김수린 ; 정영훈*
경북대학교 식품공학부

Glucose Production from Spent Coffee Grounds by Acid Pretreatment and Enzymatic Hydrolysis
Jeong Hwa Jang ; Hyeon Jin Yeo ; Jeong-won Kim ; Soo Rin Kim ; Young Hoon Jung*
School of Food Science and Biotechnology, Kyungpook National University, Daegu, Korea, Tel: +82-53-950-5777, Fax: +82-53-950-6772 (younghoonjung@knu.ac.kr)
Correspondence to : *School of Food Science and Biotechnology, Kyungpook National University, Daegu, Korea Tel: +82-53-950-5777, Fax: +82-53-950-6772 e-mail: younghoonjung@knu.ac.kr


© 2018 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering
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Abstract

Considerable increase in coffee consumption has caused the necessity of valorization of coffee waste material. Accordingly, conversion of coffee wastes containing various organic compounds such as cellulose and hemicellulose into value-added materials is getting highlighted. In this study, we evaluated the feasibility of glucose production through acid pretreatment followed by enzymatic conversion process from spent coffee grounds (SCG), one of the major coffee waste material. After pretreatment at various conditions such as solids loading of 5% (w/v), 10%, 15%, pretreatment time of 30 min, 60 min, 90 min, and acid catalyst concentrations of 0% (w/v), 1%, 5%, the chemical compositions of the SCG and the hydrolysis efficiency using 10 filter paper unit (FPU) of cellulase per g of glucan were compared. The enzymatic hydrolysis yield of SCG on the basis of theoretical maximum glucose yield was observed to be 85.4% after the pretreatment using 10% SCG for 60 min by 1% sulfuric acid. In comparison with the 7 g of glucan amount from 100 g of original SCG, the combination of pretreatment and enzymatic hydrolysis can produce 74 g of glucan. This result suggests that spent coffee grounds can be utilized as a source of glucose.


Keywords: spent coffee grounds, glucose, pretreatment, hydrolysis, lignocellulose

1. INTRODUCTION

커피부산물은 커피의 가공 과정에서 원두로부터 추출되고 남은 폐기물로써 커피펄프 (pulp), 커피겉껍질 (husk), 커피외 피 (silver skin), 커피박 (spent coffee grounds; SCG) 등으로 분 류한다 [1]. 이 중 커피박은 전체 원두 생산량의 50%에 이르 는 커피음료시장에서 커피의 가공 후에 남는 주 부산물이고, 지속적인 커피 음료 소비의 증대에 따라 그 생산량이 날로 증 대되고 있는 실정이다 [2]. 또한, 커피 원두에 존재하는 다양 한 유기화합물 (예. 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스, 단백질, 지 방, 페놀성화합물 등)은 커피 음료 추출공정의 한계로 커피박에 다량 잔존하게 된다. 따라서, 커피박 등의 커피부산물을 산업적으로 활용하기 위한 연구, 즉, 기능성 물질 추출 연구, 산업용 소재생산 연구, 바이오에탄올 등의 연료 생산 연구 등이 다양하게 진행되고 있다 [1,3]. 이러한 가능성에도 불구 하고, 커피부산물의 산업적 적용은 아직 부족한 실정이다.

커피부산물은 대개 약 50%의 탄수화물, 20% 이상의 리그 닌, 10-20%의 단백질, 약 5%의 지질 및 무기질로 이루어진다 [4]. 특히 이 중 50% 이상을 차지하는 고분자 당 중 셀룰로오 스와 헤미셀룰로오스는 가수분해를 통해 발효의 원료 및 화 합물 (예. furfural, hydroxymethylfurfural, organic acid, sorbitol, xylitol 등) 생산에 활용할 수 있다 [5]. 한편, 고온/고압의 커피 추출 조건으로 인해 커피 원두는 각화현상 등을 통한 구 조적 변화를 나타내고 [6], 또한 추출 후잔존하는 과량의 리그닌은 효소와의 비특이적 결합을 통해 셀룰로오스와 헤미 셀룰로오스의 발효성 당으로의 효율적인 전환을 방해한다 [7,8]. 따라서, 커피박을 바이오산업에서 효율적으로 이용하 기 위해서는 먼저 커피부산물에 다량 존재하는 리그닌을 추 출 혹은 제거하고, 고분자 당을 발효가능한 당으로 전환하는데 도움을 줄 수 있는 전처리 공정이 필수적이다 [9-11]. 예를 들면, 커피부산물로부터 유기용매, 약산, 마이크로웨이브파 등을 이용하여 탄수화물을 추출하고, 발효 과정을 통하여 에탄올, 디젤, 및 알코올 음료의 생산 등에 적용한 연구들을 살 펴볼 수 있다 [12-15]. 그중에서도 약산을 이용한 전처리 공정 은 다른 공정에 비하여 글루코오스를 선택적으로 추출할 수 있고, 상업화에 가장 가까운 기술로 평가받는다 [16]. 따라서 본 연구에서는 커피음료를 추출하고 남은 커피박의 효율적 활용방안으로 발효성 당의 일종인 글루코오스를 효소 추출 함에 있어 커피박의 화학적 조성분석 및 가수분해 효율 분석 을 통해 전처리 공정 조건 (즉, 전처리 시간과 촉매의 농도)을 최적화하고, 전처리된 커피부산물로부터의 발효성 당 생산 가능성에 대하여 비교, 평가하였다.


2. MATERIALS AND METHODS
2.1. 실험재료 및 성분분석

본 실험에서는 뚜레쥬르 (TOUS les JOURS; Daegu, Korea)에서 제공받은 커피박을 사용하였다. 시료는 미생물의 오염을 방지하고자 냉장 보관하였다. 커피박의 성분분석은 미국에 너지부 재생에너지연구소 (Department of Energy, National Renewable Energy Laboratory)에서 제공한 Laboratory Analytical Procedure의 방법을 참고하였다 [17,18]. 건조된 커피박을 72% H2SO4 (w/w)으로 30°C에서 1시간 반응 후 serum bottle 로옮 겨 4%로 희석하여 121°C에서 추가로 1시간 반응하였다. 반 응이 끝난 후 시료를 유리필터로 여과 후 filtrate는 calcium carbonate를 이용하여, 여과되지 않은 고형분은 증류수를 이 용하여 중화하였다. 이후 filtrate는 탄수화물 분석에, 고형분 은 산불용성리그닌 분석에 이용하였다. 구체적으로, high performance liquid chromatography (HPLC; Agilent Technologies 1260 series, Santa Clara, California, USA)-refractive index detector (RID; Agilent Technologies) 시스템에서 Rezex ROA-Organic Acid H+ (8%) 컬럼 (phenomenex, Torrance, California, USA)을 이용하여 이동상 0.005 N H2SO4, 온도 50°C, 유속 0.6 mL/min 로 하여 탄수화물을 분석하였다. 리그닌의 함량은 여 과되지 않은 고형분을 회화로 (Electric muffle furnace, JSMF45T, JS Research Inc., KOREA)에서 575°C, 3시간 회화 후무 게를 측정하였다. 수분함량은 105°C 상압건조법을 이용하여 3반복으로 진행하였다 [19,20].

2.2. 전처리

본 실험에서는 커피부산물의 전처리 최적조건을 확립하기 위해 커피부산물의 함량을 5% (w/v), 10%, 15%, 전처리 시간 을 30분, 60분, 90분 그리고 촉매 H2SO4의 농도를 0% (w/v), 1%, 5%로 다르게 하여 고압멸균기 (BF-60AC; BioFree, Seoul, Korea)를 이용하여 121°C에서 진행하였다. 전처리가 완료된 커피부산물은 filtration cloth (pore size: 22-25 lm; Calbiochem, La Jolla, CA, USA) 를 이용하여 고형분과 액체를 분리하였고, 고형분은 충분히 세척한 후 중화하여 당화에 이용하였다. 성 분분석을 위해 일부 전처리된 커피부산물은 45°C에서 3일간 오븐 건조하였고, 나머지 시료는 냉장 보관하였다. 최적 전처 리 조건은 효소 당화 이후 이론적 최대 가수분해율을 기준으 로 결정하였다.

2.3. 효소 가수분해

다양한 전처리 조건에서 전처리한 커피부산물의 최대가수분 해율을 비교하기 위해서 미처리 혹은 전처리된 커피부산물의 불용성 고형분 1%에 sodium citrate buffer (50 mM, pH 5.0) 와 5, 10, 15 FPU/g의 복합 cellulase (97 FPU/mL, Cellic® CTec2, Novozyme, Denmark) 및 Celluclast 1.5L (32 FPU/mL, Novozyme)을 반응하여 당화 실험하였다. 미생물 오염을 방 지하기 위해 2% sodium azide (DaejungChem, Siheung, Korea)을 사용하였다. 혼합한 시료는 shaking incubator (BF-50SIR; BioFree) 50°C, 300 rpm에서 48시간 반응시켰다. 효소적 가수 분해 공정을 통해 생성된 포도당 양은 HPLC-RID 시스템을 이용하여 정량분석하였다 [21]. 이론적 최대가수분해율은 기 질에 존재하는 글루코오스 함량 대비 당화 후 생성된 총 글루 코오스 함량 기준 백분율 값으로 측정하였다.


3. RESULTS AND DISCUSSION
3.1. 전처리 조건에 따른 커피부산물 성분 변화 및 전처리 최적조건

본 연구에서는 커피부산물로부터 발효 가능한 당 (예. 글루코 오스)을 추출하기 위하여 121°C에서 황산 촉매를 이용하여 전처리를 시행하였다. 바이오매스의 화학적 성분 및 구조에 크게 영향을 미치는 주요 변수인 바이오매스 로딩량, 전처리 시간, 그리고 촉매의 농도 조건을 다양하게 하여 전처리를 수 행 후 커피부산물의 성분변화를 분석하였다. 처리 전 커피박 은 셀룰로오스 6.4%, 만난 33.4%, 리그닌 39.7%로 이루어져 있었다. 먼저 바이오매스 로딩량을 최적화하기 위해서 5% (w/v), 10%, 15%의 커피박을 1% (w/v) H2SO4와 121°C에서 60분간 전처리하였을 때, 셀룰로오스 회수율은 각각 65.9%, 87.2%, 76.2%이었으며, 10% (w/v)의 커피박을 전처리했을 때 셀룰로오스 회수율이 가장 높았다 (Fig. 1). 만난 회수율 역시 각 14.9%, 31.9%, 23.4%이며 10% (w/v)의 커피박에서 31.9%로, 5%와 15% 커피박에서 각각 14.9%와 23.4%로 보다 더 높은 회수율을 나타냈다. 리그닌 제거율은 30.8%, 29.8%, 21.6% 으로 5%와 10% (w/v) 커피박을 전처리했을 때 15% 커 피박을 처리했을 때보다 유의적으로 높았다. 전처리된 커피 박을 활용하여 셀룰라아제를 이용한 효소적 글루코오스 추 출의 효율성을 시험할 때, Celluclast 1.5L (10 FPU/g)을 사용한 효소 당화율은 17.3%, 88.2%, 84.3%로 10% 커피박 함량에서 가장 높은 글루코오스 추출 효율을 나타내었다. 가장 효 소 당화율이 높은 조건인 10%, 121°C, 황산 1%, 60분 전처리 조건을 100% 기준으로 비교시 상대적 효소적 당화율은 5%, 10%, 15% 전처리 공정에서 각각 20%, 100%, 96%를 보였고, 이는 일반적으로 리그노셀룰로오스 고체 함량이 15% 이상일 때 전처리 과정 중 열 전달과 물질 전달이 저해되기 때문이라 고 생각할 수 있다 [3]. 따라서 커피박 함량 10%를 최적 조건 으로 하여 추후 실험을 진행하였다.


Fig. 1. 
Effect of spent coffee grounds (SCG) loading amounts on (A) insoluble glucan recovery yield, (B) insoluble mannan recovery yield, (C) lignin removal yield, and (D) enzymatic hydrolysis yield during sulfuric acid pretreatment conducted at 121°C for 1 h.

다음으로 10%의 커피박을 1% (w/v) H2SO4, 121°C 조건에서 각각 30분, 60분, 90분 동안 전처리하였다 (Fig. 2). 이 때, 셀 룰로오스 회수율은 각각 84.2%, 87.2%, 89.8%이며 커피박을 90분간 전처리했을 때 셀룰로오스 회수율이 가장 높았다. 한 편 만난 회수율은 각 36.0%, 31.9%, 27.6%이며 커피박을 30 분간 전처리했을 때 만난 회수율이 높았다. 리그닌 제거율은 20.2%, 29.8%, 28.3% 으로 커피박을 60분간 전처리했을 때 리그닌 제거율이 높았다. 이는 전처리 시간의 증가에 따라 바 이오매스의 각 구성성분이 반응도가 다르기 때문으로, 본 결과에 따라 셀룰로오스에 비하여 헤미셀룰로오스가 황산 가 수분해에 의하여 빠르게 가수분해됨을 확인할 수 있었다. 커 피박 10%, 121°C, H2SO4 1%, 60분 전처리 조건에서 얻어진 효소적 가수분해율을 100% 기준으로 비교시 전처리 시간이 30분에서 60분으로 증가함에 따라 커피박의 효소적 당화율 은 유의적으로 증가하였다. 반면, 추가적인 전처리는(즉, 90분) 효소적 당화율에서의 뚜렷한 증가를 나타내지 않았다. 이는 전처리 시간 60분에서 가장 낮은 리그닌 함량(즉 53.8%) 을 보이기 때문으로 생각된다.


Fig. 2. 
Effect of pretreatment time on (A) insoluble glucan recovery yield, (B) insoluble mannan recovery yield, (C) lignin removal yield, and (D) enzymatic hydrolysis yield during sulfuric acid pretreatment conducted at 121°C.

전처리 촉매의 농도는 전처리의 효율성을 확인하는데 필요한 다른 하나의 조건이 될 수 있다. 따라서 121°C, 60분, 커피 박 함량 10%의 조건에서 황산 농도를 0% (w/w), 1%, 5%로 다르게 하여 전처리를 수행하였다 (Fig. 3). 황산의 첨가 없이 전처리 한 경우 불용성 고체의 약 66%가 회수되었으며 이는 황산 1% 이상의 조건에서 50% 이상의 고체가 소실되는 것 을 고려할 때, 전처리가 비효율적임을 암시한다. 이와 더불 어 커피박의 상대적 효소당화율은 H2SO4 1%를 기준으로 살 펴볼 때 9%를 보였다. 결론적으로, 셀룰라아제 당화효소를 이용하여 커피박으로부터 글루코오스를 추출하기 위한 최 적 조건은 커피박 10% 함량, 121°C, 60분, H2SO4 1%임을 알 수 있다.


Fig. 3. 
Effect of sulfuric acid concentration on (A) insoluble glucan recovery yield, (B) insoluble mannan recovery yield, (C) lignin removal yield, and (D) enzymatic hydrolysis yield during sulfuric acid pretreatment conducted at 121°C for 1 h.

3.2. 효소적 가수분해 효율

최적화된 조건에서 전처리 후 탈구조화된 커피박을 활용하 여, 실제 글루코오스의 추출 수율을 비교하고자, 상업용 효소 2종 (Celluclast와 Cellic CTec2)을 이용하여 시험하였다 (Fig. 4). 미처리 커피박과 최적조건 (커피박 10% 함량, 121°C, 60분, H2SO4 1%)으로 전처리한 커피박 1%에 각각의 효소 5 FPU/g, 10 FPU/g, 15 FPU/g을 첨가하여, 48시간 동안 당화 후 가수분해 정도를 비교하였다. 2종의 셀룰라아제에서 모두효 소의 사용 농도가 증가할수록 글루코오스 생성정도가 증가함을 확인할 수 있었고, 셀룰라아제 이외에 다양한 효소 (헤 미셀룰라아제 등)가 복합적으로 들어 있는 CTec2에서의 글 루코오스 전환능이 더뛰어남을 확인할 수 있었다. Celluclast 효소 5, 10, 15 FPU/g는 미처리 커피박에서 1.35%, 2.45%, 4.59%, 전처리한 커피박에서 37.55%, 66.97%, 79.46% 당화 율을 나타내었고, CTec2효소 5, 10, 15 FPU/g는 미처리 커피 박에서 3.24%, 7.00%, 4.59% 당화율, 전처리한 커피박에서 66.44%, 85.40%, 101.56% 당화율을 나타내었다. 이를 통해 미처리한 커피박보다 산으로 전처리한 커피박의 효소적 가 수분해 효율이 더 높으며 산으로 전처리를 했을 시 효소적 접 근도가 향상되어 글루코오스를 효율적으로 생산할 수 있을 것으로 사료된다.


Fig. 4. 
Enzymatic hydrolysis yield with different amounts of enzyme such as 5, 10, and 15 FPU of g glucan. Enzymatic hydrolysis was performed using (A) Celluclast 1.5 L and (B) Cellic CTec2 at pH 4.8, 50°C, and 300 rpm for 48 h.

3.3. Mass balance

커피박으로부터 글루코오스를 생산하기 위한 최적화된 공정의 활용 가능성을 비교하고자, 물질수지를 비교하였다 (Fig. 5). 전처리 전과 후의 커피박의 사진을 통해 전처리가 커피박의 입자를 각화시켰고 색 또한 어두워졌음을 확인하였다 (Fig. 6), 이는 커피박을 구성하는 성분의 상당부분이 용해되 었기 때문으로 유추해볼 수 있다. 전처리하지 않은 커피박 100 g으로부터 효소적 가수분해를 통해, 약 0.45 g의 글루칸을 생산할 수 있었다. 반면, 커피박의 효소적 가수분해 효율을 증가시키기 위해 커피박을 전처리 후, 효소적 가수분해를 실시하였을 때, 전처리 후 약 49.4 g의 커피박이 불용성 고체 형태로 회수되었으며, 효소적 가수분해를 통해 약 4.77 g의 글루칸을 생산할 수 있었다. 추 후 커피박 전처리 시 손실된 51.6 g의 가용성 고체의 형태로 용해된 당을 회수하여 이용한 다면, 이론적으로 최대 5.8 g의 글루칸을 생산할 수 있을 것으 로 추정되며, 이는 커피박 100 g에 존재하는 6.4 g의 글루칸을 가정 시 약 90% 이상의 추출수율을 얻을 수 있을 것이다.


Fig. 5. 
Mass balance of the overall process.


Fig. 6. 
The photos of spent coffee grounds (A) before pretreatment and (B) after pretreatment.


4. CONCLUSION

본 연구에서는 버려지는 커피부산물의 식품 및 바이오소재 로의 사용 가능성을 제시하기 위하여, 그 일종인 커피박을 탈 구조화하기 위한 전처리 공정을 최적화하고, 전처리된 커피 박으로부터 효소적 전환 공정을 통해 글루코오스의 생산 가 능성을 확인하는 연구를 수행하였다. 커피박 함량 5% (w/v), 10%, 15%, 전처리 시간 30분, 60분, 90분, 황산촉매농도 0% (w/v), 1%, 5%의 다양한 전처리 조건 후 셀룰라아제 10 FPU/g으로 효소추출하여 전처리의 효율성을 판단하였다. 결과적 으로, 커피박 함량 10%(w/v), 전처리 시간 60분, 황산 촉매의 농도 1%의 전처리 시 커피박의 효소적 당화율이 이론수율 대 비 85.4%%로관찰되었다. 이를 통하여, 100 g의 커피박으로부 터 커피박에 존재하는 글루칸 함량 대비 약 74%의 글루칸을 추출할 수 있었다. 본 결과는 점차 증가하는 커피부산물을 식 품 및 바이오소재로 사용하는 하나의 가능성을 제시해준다.


Acknowledgments

본 논문은 2018년 재단법인 동일문화장학재단의 학술연구비 지원사업 및 한국연구재단의 일반연구자지원사업 (세부과제 번호: 03030504)의 지원에 의해 수행되었으며 이에 감사드립니다.


References
1. Murthy, P. S., and M. M. Naidu, (2012), Sustainable management of coffee industry by-products and value addition - A review, Resour. Conserv. Recy, 66, p45-58.
2. Scully, D. S., A. K. Jaiswal, and N. Abu-Ghannam, (2016), An investigation into spent coffee waste as a renewable source of bioactive compounds and industrially important sugars, Bioeng, 3, p33.
3. Caetano, N. S., V. F. M. Silva, A. C. Melo, A. A. Martins, and T. M. Mata, (2014), Spent coffee grounds for biodiesel production and other applications, Clean Technol. Environ. Policy, 16, p1423-1430.
4. Campos-Vega, R., (2015), Spent coffee grounds: A review on current research and future prospects, Trends Food Sci. Technol, 45, p24-36.
5. Mussatto, S. I., E. M. S. Machado, S. Martins, and J. A. Teixeira, (2011), Production, composition, and application of coffee and its industrial residues, Food Biopro. Technol, 4, p661-672.
6. Oksanen, T., J. Buchert, and L. Viikari, (1997), The role of hemicelluloses in the hornification of bleached kraft pulps, Holzforschung, 51, p355-360.
7. Öhgren, K., R. Bura, J. Saddler, and G. Zacchi, (2007), Effect of hemicellulose and lignin removal on enzymatic hydrolysis of steam pretreated corn stover, Bioresour. Technol, 98, p2503-2510.
8. Palonen, H., F. Tjerneld, G. Zacchi, and M. Tenkanen, (2004), Ad sorption of Trichoderma reesei CBH I and EG II and their catalytic domains on steam pretreated softwood and isolated lignin, J. Biotechnol, 107, p65-72.
9. Mussatto, S. I., and I. C. Roberto, (2005), Acid hydrolysis and fermentation of brewer’s spent grain to produce xylitol, J. Sci Food Agric, 85, p453-460.
10. Neureiter, M., H. Danner, S. Fruhauf, S. Kromus, C. Thomasser, et al , (2004), Dilute acid hydrolysis of presscakes from silage and grass to recover hemicellulose-derived sugars, Bioresour. Technol, 92, p21-29.
11. Roberto, I. C., S. I. Mussatto, and R. C. L. B. Rodrigues, (2003), Dilute-acid hydrolysis for optimization of xylose recovery from rice straw in a semi-pilot reactor, Ind. Crops Prod, 17, p171-176.
12. Fischer, M., S. Reimann, V. Trovato, and R. J. Redgwell, (2001), Polysaccharides of green Arabica and Robusta coffee beans, Carbohydr. Polym, 330, p93-101.
13. Mussatto S., I., L. M. Carneiro, J. P. A. Silva, I. C. Robertob, and J. A. Teixeira, (2011), A study on chemical constituents and sugars extraction from spent coffee grounds, Carbohydr. Polym, 83, p368-374.
14. Passos, C. P., and M. A. Coimbra, (2013), Microwave superheated water extraction of polysaccharides from spent coffee grounds, Carbohydr. Polym, 94, p626-633.
15. Ballesteros L., F., M. A. Cerqueira, J. A. Teixeira, and S. I. Mussatto, (2015), Characterization of polysaccharides extracted from spent coffeegrounds by alkali pretreatment, Carbohydr. Polym, 127, p347-354.
16. Jung, Y. H., and K. H. Kim, (2014), Pretreatment of biomass: Processes and technologies, p27-50, In Pandey, A., Negi, S., Binod, P., Larroche, C. (Eds.), Aidic Pretreatment, Academic Press, Cambridge, Massachusetts, USA.
17. Sluiter, A., B. Hames, R. Ruiz, C. Scarlata, J. Sluiter, D. Temple-ton, and D. Crocker, (2008), Laboratory analytical procedure: Determination of structural carbohydrates and lignin in biomass. National Renewable Energy Laboratory, Technical Report NREL/TP510-42618, April. Colorado, USA..
18. Sluiter, A., B. Hames, R. Ruiz, C. Scarlata, J. Sluiter, and D. Templeton, 2005, Laboratory analytical procedure: Determination of ash in biomass, Technical Report NREL/TP-510-42622, July, 17, Columbus, USA.
19. Jung Y., H., S. Kim, T. H. Yang, H. J. Lee, D. Seung, Y. -C. Park, J. -H. Seo, I. -G. Choi, and K. H. Kim, (2012), Aqueous ammonia pretreatment, saccharification, and fermentation evaluation of oil palm fronds for ethanol production, Bioproc. Biosys. Eng, 35, p1497-1503.
20. Jung Y., H., I. J. Kim, H. K. Kim, and K. H. Kim, (2013), Dilute acid pretreatment of lignocellulose for whole slurry ethanol, Bioresour. Technol, 132, p109-114.
21. Jung, Y. H., H. M. Park, D. H. Kim, Y.-C. Park, J. -H. Seo, and K. H. Kim, (2015), Combination of high solids loading pretreatment and ethanol fermentation of whole slurry of pretreated rice straw to obtain high ethanol titers and yields, Bioresour. Technol, 198, p861-866.