The Korean Society For Biotechnology And Bioengineering

Current Issues

Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 34 , No. 1

[ Research Paper ]
Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 33, No. 4, pp.253-260
Abbreviation: KSBB J
ISSN: 1225-7117 (Print) 2288-8268 (Online)
Print publication date 31 Dec 2018
Received 09 Nov 2018 Revised 13 Dec 2018 Accepted 13 Dec 2018
DOI: https://doi.org/10.7841/ksbbj.2018.33.4.253

제주산 갯괴불주머니 추출물의 항염증 효과
장성찬1 ; 박태진1 ; 김민선1 ; 홍혜현2 ; 김미진2 ; 김승영1, *
1선문대학교 제약생명공학과
2(주)유앤아이제주

The Anti-inflammatory Activity of Corydalis platycarpa (Maxim.) Makino Crude Extract from Jeju Island
Sungchan Jang1 ; Taejin Park1 ; Min Seon Kim1 ; Hyehyun Hong2 ; Mi Jin Kim2 ; Seung-Young Kim1, *
1Department of Pharmaceutical Engineering & Biotechnology, Sunmoon University, Korea, Tel: +82-41-530-2390, Fax: +82-41-560-2939 (sykim01@sunmoon.ac.kr)
2U&I Jeju Co., Ltd. Cheomdan-ro 312-3, Jeju 690140, Korea
Correspondence to : *Department of Pharmaceutical Engineering & Biotechnology, Sunmoon University, Korea Tel: +82-41-530-2390; Fax: +82-41-560-2939 e-mail: sykim01@sunmoon.ac.kr


© 2018 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering
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Abstract

Several compounds such as libanoridin, heterocarpin, and columbianetin A and crude extract were isolated respectively from Corydalis heterocarpa and Corydalis bungeana and were reported to have anti-tumorigenic and antiinflammatory properties. Corydalis platycarpa (Maxim.) Makino, another Fumariaceae member, have acclimated and prospered in Jeju Island, South Korea. However, the synergistic and inhibition effect of Corydalis platycarpa (Maxim.) Makino crude extract on the expression of LPS-induced inflammatory cytokines and mediators has not been yet examined. Quantitative reverse transcription PCR (qRT-PCR) and immunoblotting were implemented to examine representative inflammatory markers. We found the Corydalis platycarpa (Maxim.) Makino extract (CPE) inhibited dose-dependently the secretion of the five pro-inflammatory indicators NO, PGE2 and TNF-α and suppressed mRNA expressions of iNOS, COX-2, TNF-α, IL-1β, and IL-6. Furthermore CPE exerted its dosedependent anti-inflammatory effect via NF-κB/IκB signaling pathway while down-regulating the protein expression level of iNOS and COX-2 and suppressing the secretion of pro-inflammatory cytokines such as PGE2 and TNF-α. CPE would be further applied to the development of pharmaceuticals and functional cosmetic ingredients.


Keywords: RAW264.7, Corydalis platycarpa (Maxim.) makino, anti-inflammatory, iNOS, NF-κB

1. INTRODUCTION

대기와 체내에서 정상적인 대사 작용에서 생성되는 활성산 소 (reactive oxygen species, ROS)는 산소 라디칼 및 이것으로 부터 유도된 산소화합물을 지칭하는 것으로서 과량으로 생 성되거나 체내 황산화 시스템에 오류가 일어날 경우 세포는 활성 산소에 의해 유해 작용을 받은 데 이를 산화적 스트레스 라고 한다 [1]. 염증은 여러 다양한 질병에 있어서 공통된 병 태생리로서 내외부 자극에 대한 가장 원시적인 보호 반응이 며 nitric oxide (NO)와 같은 산소 라디칼과 산화적 스트레스 가 염증 진행에 관여하는 것으로 알려져 있다 [2,3]. 대식세포 (macrophage)는 면역 반응, 알레르기, 염증 등에 있어 중요한 역할을 수행하며 식세포작용을 통해 외부 침입물질로부터 신체를 보호한다[4]. 이러한 일련의 과정 중에 대식세포는 interleukin 1β (IL-1β), tumor necrosis factor-α (TNF-α), NO, 그리고 prostagladnin과 같은 여러 종류의 염증 매개체를 생산한다 [5]. 그람 음성균 박테리아 세포벽의 구성 성분인 lipopolysaccharide (LPS)는 거대세포의 활성화를 유도하기에 염 증 반응에 사용되고 있다 [6]. 활성화된 대식세포는 induced nitric oxide synthase (iNOS) 유전자 발현을 유도하고 L-arginine의 탈아미노 반응에 의한 NO 생성을 촉진한다. iNOS에 의해 과다한 NO 분비는 패혈증성 쇼크나 염증 질환과 같은 치명적인 결과를 불러올 수 있을 뿐만 아니라 NO와 자유 라 이칼의 반응물인 peroxynitrite (ONOO-)은 세포내에서 단백 질이나 무기 성분, DNA 등과 산화나 질산화 반응을 함으로 서 노화, 알츠하이머, 암, 동맥 경화 등의 병리학적 증상을 일 으키는 것으로 알려져 있다 [7,8]. 또한 progstaglandins (PGs) 은 통증이나 열 또는 다른 증상을 유발시키는 염증 반응의 매 개체로서 작용한다 [9]. LPS에 자극받은 대식세포는 nuclear factor kappa B/Inhibitor κB (NF-κB/IκB)나 mitogen-activated protein kinase (MAPK) 신호기작을 포함한 여러 신호전달기 작을 활성화시킨다 [10].

디톡스 (해독, Detox) 또는 클렌징 (Cleansing)은 독성학 또는 대체의학적 관점에서 인체 내에 축적된 활성산소 등의 독 소 (toxin) 또는 유해 요소 (poison)를 제거하는 것을 의미한다 [11]. 환경 오염물과 합성 화합물에 대한 노출의 빈도가 증가함에 따라 디톡스와 유기농 제품에 대한 관심 또한 증가하고 있다. 디톡스와 클렌징 제품의 상당 수의 성분이 식물로부터 추출되고 있으며 이들의 디톡스 효과와 안전성 평가가 이루 어지고 있다 [12-15].

제주도는 생태지리와 기후의 다양성으로 잘 알려져 있으며 여러 희귀종의 식물을 찾아볼 수 있다. 현호색과 (Fumariaceae) 식물에는 제주도에 서식하는 2년생 초본 갯괴불주머니 (Corydalis platycarpa (Maxim.) Makino)를 포함 염주괴불주 머니 (Corydalis heterocarpa), 자주괴불주머니 (Corydalis incisa), 줄현호색 (Corydalis bungeana) 등이 있다 [16]. 갯괴불주 머니와 유사종인 염주괴불주머니 (Corydalis heterocarpa)에 서 추출한 columbianetin A이라는 활성성분은 항암효과를 보이고 있고 이외에 줄현호색 추출물과 염주괴불주머니의 libanoridin과 hetercarpin이라는 개별 활성성분들은 인간 직장암 세포와 마우스 대식세포 RAW264.7에서 항염 효과가 있다고 보고되었다 [17-20]. 본 연구에서는 LPS를 RAW264.7 세포에 서 갯괴불주머니의 원추출물 (CPE)에 함유된 활성성분 뿐만 아니라 불활성 성분들이 NO, prostagladin E2 (PGE2)의 분비와 IL-1β, IL-6, 리고 TNF-α 등의 3가지 전염증성 사이토카인과 iNOS와 cyclooxygenase-2 (COX-2) 등의 단백질과 mRNA 발 현의 억제 효과를 조사했다. 나아가 염증 반응 동안 갯괴불주 머니 추출물이 NF-κB/IκB 신호전달 경로를 통해 항염증성 사이토카인 분비와 매개체의 발현에 영향을 주는 것인가를 조사함으로서 갯괴불주머니 추출물의 기능성 화장품 소재나 약재 원료로서의 활용가능성을 모색하고자 한다.


2. MATERIALS AND METHOD
2.1. 갯괴불주머니 추출물 제조

본 연구에 사용된 갯괴불주머니 [Corydalis platycarpa (Maxim.) Makino] 는 제주특별자치도 서귀포 법환동에서 6월에 채집되었으며 제주생물자원(주)으로부터 제공받았다. 제공받은 갯괴불주머니는 70% 에탄올에 24시간 동안 실온에서 추출하였으며, 필터로 여과 한 후 감압농축기를 사용하여 농축하였다. 농축된 추출물은 -20°C에서 동결 건조하여 phosphate buffer saline (PBS)에 용해하여 실험에 사용하였다.

2.2. 세포배양

마우스 대식대포 RAW264.7은 American Type Culture Collection (ATCC)에서 분양받아 10% v/v fetal bovine serum (FBS) 와 100 units/mL penicillin-streptomycin가 함유된 Dublcco’s Modified Eagle Medium (Gibco, USA) 배양액에서 37°C, 5% CO2에서 배양하고 매 3일마다 계대배양을 실시하였다.

2.3. 갯괴불주머니 추출물의 NO 생성 억제 효과

RAW264.7 cell를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하 여 한 1.8×105 cells/mL로 24-well plate에 넣고 37°C, 5% CO2 배양조건에서 18시간 배양하였다. 이후 배지를 제거하고 시 료와 LPS (1 μg/mL)를 투여 후 24시간 배양하였다. 세포배양 상등액 100 μL와 Griess 시약 (Sigma, USA) 100 μL를 혼합하 여 96-well plate에서 10분 동안 반응시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

2.4. 갯괴불주머니 추출물의 RAW264.7 세포에서의 생존률 평가

RAW264.7 세포를 10% v/v FBS가 첨가된 DMEM 배지에 3.0×105 cells/mL로 24-well plate에 넣고 18시간 배양 후 시료 와 LPS (1 μg/mL)를 동시 처리 후 24시간 배양하였다. 이후 500 μg/mL의 최종 농도로 MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide]를 첨가하여 37°C에서 3~4 시간 동안 반응시킨 후, 상등액을 제거하였다. MTT는 살아 있는 세포내로 들어가 대사작용을 통해 분홍색의 formazan을 생성한다. Formazan 침전물을 DMSO로 완전히 용해시킨 다 음, 이를 96-well plate에 옮긴 후 ELISA reader를 이용해 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존률 (cell viability)은 아래와 같은 식에 의해 백분율로 계산되었다.

Cell viability (%) = (시료 첨가군의 흡광도 / 시료 무첨가군의 흡광도) × 100

2.5. Prostaglandin E2 (PGE2) 생성 억제 활성 측정

RAW264.7 cell를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하 여 1.8×105 cells/mL로 24 well plate에 접종하고, 37°C, 5% CO2 incubator에서 18시간 배양하였다. 이후 배지를 제거하고 각기 다른 농도의 시료 50 μL와 LPS (1 μg/mL)를 함유한 450 μL의 배지를 동시에 처리하여 24시간 배양하였다. 24시간 후 배양 배지를 원심분리 (12,000 rpm, 3 min)하여 얻어진 상층 액의 PGE2 함량을 측정하였다. 모든 시료는 정량 전까지 냉 동보관 (-20°C)하였다. PGE2는 mouse enzyme-linked immnunosorbent assay (ELISA) kit (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 정량하였으며 표준곡선의 r2값은 0.99 이상이었다.

2.6. 전염증성 사이토카인 (TNF-α) 생성 억제 활성 측정

RAW264.7 세포 (1.8×105 cells/mL)를 24-well plate에 접종하 고, 37°C, 5% CO2 incubator에서 18시간 배양하였다. 이후 배 지를 제거하고 각각의 시료 50 μL와 LPS (1 μg/mL)를 함유한 450 μL의 배지를 동시에 처리하여 24시간 배양하였다. 이후 배양 배지를 원심분리 (12,000 rpm, 3 min)하여 얻어진 상층 액의 전염증성 사이토카인 생성 함량을 측정하였다. 모든 시 료는 정량 전까지 냉동보관 (-20°C)하였다. 전염증성 cytokines은 mouse enzyme-linked immnunosorbent assay (ELISA) kit (R&D Systems Inc., USA)를 이용하여 정량하였으며 표준 곡선의 r2값은 0.99 이상이었다.

2.7. 정량 역전사 중합 효소 연쇄반응

RAW264.7 세포 (3×105 cells/3 mL/well)를 6-well plate에 접종하고, 37°C, 5% CO2 incubator에서 18시간 배양하였다. 이후 배지를 제거하고 각기 다른 농도의 추출물 시료 300 μL와 LPS (1 μg/mL)를 함유한 2.7 mL 배지를 동시에 처리하여 24 시간 배양하였다. RNeasy Mini Kit (Qiagen, USA)를 이용해 서 RNA를 추출하였다. PrimeScript 1st cDNA Synthesis Kit (Takara, Japan)을 이용하여 800 ng RNA에서 cDNA로 역전사 를 시켰다. 이렇게 확보한 cDNA는 TB Green Premix Ex Taq II (Takara, Japan)와 iNOS, COX-2, TNF-α, IL-1β, IL-6, GAPDH primers (Table 1)를 각각 혼합하고 StepOnePlus Real-Time PCR system (Thermos Fisher Scientific, USA)를 이용해 서 정량 PCR을 시행하였다. 유전자별 무처리군 대비 각 시료 처리군의 RNA 발현 변화 (fold change)는 comparative CT method를 사용하여 계산되었다.

Table 1. 
PCR Primer List
Primer name Forward Primer Sequences 5’-3’ Reverse Primer Sequence 5’-3’
GAPDH GGC ATG GCC TTC CGT GT GGT TTC TCC AGG CGG CA
iNOS AAT GGC AAC ATC AGG TCG GCC ATC ACT GCT GTG GTC ACA GAA GTC TCG AAC TC
COX-2 CGG ACT GGA TTC TAT GGT GAA A CTT GAA GTG GGT CAG GAT GTA G
TNF-α TCC AGG CGG TGC CTA TGT CGA TCA CCC CGA AGT TCA GT
IL-1β ACC TGT CCT GTG TAA TGA AAG ACG TGG GTA TTG CTT GGG ATC C
IL-6 GTC TGT AGC TCA TTC TGC TCT G GAA GGC AAC TGG ATG GAA GT

2.8. Western Blotting

RAW264.7 세포 (3×105 cells/3 mL/well)를 6-well plate에 18시 배양 후 시료와 LPS (1 μg/mL)를 동시 처리하여 24시간 배양하였다. 이후 세포를 PBS로 2회 세척하고 단백질분해효소 저 해제[1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 1 mM Na3VO4, 1 mM NaF, 1 μg/mL aprotinin, 1 μg/mL pepstatin, and 1 μg/mL leupeptin] 가 함유된 1X RIPA buffer (Upstate Cell Signaling Solution, USA)로 1시간 동안 lysis 시킨 후 원심분 리 (15,000 rpm, 15 min, 4°C) 하여 단백질 상층액을 분리하였 다. 단백질 농도는 bovine serum albumin (BSA)을 기준으로 Bio-Rad protein assay reagent를 사용하여 정량하였다. 정량 한 단백질을 8-12%의 polyacylamid gel에 전기영동하고 polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane (Milipore, USA)에 200 mA, 2시간 동안 전이시켰다. 단백질이 전이된 membrane 을 5% 탈지분유를 포함한 0.05% Tween20/Tris-buffered saline (0.05% T/TBS)에 넣고 상온에서 1시간 blocking 시킨 후, 1차 항체와 반응시켰다. 1차 항체 반응은 iNOS antibody (1:500, Bio Rad, USA), COX-2 antibody (1:5,000, Rockland, USA), p-NF-κB p65 (1:1,000, Cell Signaling Tech, USA), IκB-α antibody (1:1,000, Cell Signaling Tech, USA), β-actin antibody clone AC-74 (1:10,000, Sigma, USA)를 이용하여 4°C에서 하 루 밤 동안 반응시켰다. 1차 항체 반응이 끝난 membrane은 0.05% T/TBS 용액으로 3회 세척 후 horseradish peroxidase (HRP) 결합 2차 항체 (Jackson ImmunoResearch, USA)를 1: 10,000으로 희석하여 상온에서 1시간 반응한 뒤 0.05% T/TBS 용액으로 3회 세척하였다. 단백질은 Enhanced Chemiluminescence (ECL) 방법을 이용해 LAS-4000 Mini Luminescence Image Analyzer (Fujifilm Life Science, Japan)에서 결과를 확인하였다.

2.9. 통계처리

대조군과 각각의 추출물 시료로부터 얻은 실험 결과들의 유의성을 검정하기 위하여 분산분석 (ANOVA)을 행한 후 *p<0.05, **p<0.01 수준에서 student’s t-test 하였으며, 그 결과는 평균 (mean) ± 표준오차 (standard error of mean, SEM)로 표시하였다.


3. RESULTS AND DISCUSSION
3.1. 갯괴불주머니 추출물의 세포 독성 측정

마우스의 대식세포인 RAW264.7 세포에 대한 추출물의 세포 독성을 알아보기 위해 MTT 분석을 이용하여 세포 생존율을 조사하였다. RAW264.7 세포에 갯괴불주머니 추출물 (50, 100, 200 μg/mL)과 LPS (1 μg/mL)를 동시 처리하여 24시간 배양한 후 MTT 분석을 실시하였다. MTT는 살아 있는 세포 내로 운반되어 세포의 대사 작용에 의해서 formazan으로 환 원이 되며 DMSO에 용해시킨 후 570 nm에서 흡광도를 측정한다 [21]. 따라서 각 추출물 처리 농도별 세포 생존률을 무첨 가대조군과 비교 시 큰 변화가 없음을 확인하였으며 갯괴불주머니 추출물은 RAW264.7 세포에 독성을 보이지 않는 것으 로 판단된다 (Fig. 1).


Fig. 1. 
Effect of Corydalis platycarpa (Maxim.) Makino extract on cell viability in RAW 264.7 cells. The Cytotoxicity was determined by MTT assay in RAW264.7 cells stimulated with LPS (1 μg/mL) alone or in the combination of extract (50, 100, and 200 μg/mL) for 24 h. Values are the mean±SEM of triplicate experiments. *p<0.05; **p<0.01.

3.2. 갯괴불주머니 추출물의 NO (nitric oxide) 생성 억제와 iNOS의 발현량 측정

MTT 분석을 통해 200 μg/mL 추출물 농도는 세포에 독성을 주지 않음을 확인하였다. 이를 바탕으로 RAW264.7 cell에 LPS (1 μg/mL)를 갯괴불주머니 추출물 (50, 100 및 200 μg/mL)과 동시에 처리할 경우 NO 생성 억제 활성을 조사했다. 그 결과 LPS 단독 처리군과 비교하였을 시 50 μg/mL 추출물 농도에서는 NO 감소가 약 7%로 미비하였으나 100, 200 μg/mL에서는 NO 생성이 각각 60%, 90% 감소된 것으로 보아 갯괴불주머니 추출물의 농도가 증가함에 따라 NO 생성 억제 활성 또한 증가하는 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 2). NO는 염 증 반응을 포함한 다양한 생리학적이고 병리학적 과정에 있 어 중요한 역할을 한다 [22]. iNOS에 의한 NO 생성에는 대식 세포가 주로 관여하는 것으로 알려져 있으며 NO 생성 증가는 만성 염증이나 자가 면역 등의 해로운 영향을 주는 것으로 보고되었다 [23-26]. 따라서 NO 억제는 매우 중요한다고 할 수 있다. LPS 단독 처리군과 비교시 추출물 투여 농도 증가에 따른 NO 생성 감소와 더불어 iNOS mRNA와 단백질 발현에 서도 그 감소를 확인할 수 있었다 (Fig. 3, 4). 최근의 in vitroin vivo 연구는 PGs 생성 경로를 통제하는 분자 기작과 이것을 조절함에 있어 PGs와 NO 생성의 cross talk가 있음을 지적하고 있다 [27]. 따라서 추출물의 농도증가에 따른 NO 생성 감소가 PGE2에도 반영되는 지를 조사해보았다.


Fig. 2. 
Inhibitory effects of Corydalis platycarpa (Maxim.) Makino extract on NO production in RAW 264.7 cells. The NO production was measured by Griess system in RAW264.7 cells stimulated with LPS (1 μg/mL) alone or in the combination of extract (50, 100, and 200 μg/mL) for 24 h. Values are the mean±SEM of triplicate experiments. *p<0.05; **p<0.01.


Fig. 3. 
Inhibitory effect of Corydalis platycarpa (Maxim.) Makino extract on iNOS protein expression in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. The protein expression level relative to control was quantified by Image J in RAW264.7 cells stimulated with LPS (1 μg/mL) alone or in the combination of extract (50, 100, and 200 μg/mL) for 24 h.


Fig. 4. 
Inhibitory effect of Corydalis platycarpa (Maxim.) Makino extract on iNOS mRNA expression in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. The mRNA level was measured by RT-PCR in RAW264.7 cells stimulated with LPS (1 μg/mL) alone or in the combination of extract (50, 100, and 200 μg/mL) for 24 h. Values are the mean ± SEM of triplicate experiments. *p<0.05; **p<0.01.

3.3. 갯괴불주머니 추출물의 PGE2 생성 억제와 COX-2의 발현량 측정

Cyclooxygenase (COX)는 housekeeping COX-1과 inducible COX-2로 분류된다. COX-2는 전자와 달리 염증과 같은 외부 스트레스가 주어질 경우 그 발현이 증가하는 것으로 알려져 있다 [28]. Prostaglandin H2는 COX-1과 COX-2의 효소작용의해서 arachidonic acid에서 생성되며 tissue-specific synthase에 의해 PGE2, PGI2, PGF2, TXA2 등의 prostanoid를 생성한다 [29]. 염증 반응 동안 PGE2 증가는 발열, 홍조, 부기 등의 전형 적인 염증 증상을 일으키는 것으로 알려져 있다 [29]. 따라서 세포내 COX-2 발현의 감소와 더불어 세포외 PGE2 감소는 염 증반응이 진정되고 있다고 판단할 수 있을 것이다.

NO 실험과 동일한 조건으로 PGE2 ELISA kit를 이용하여 PGE2 생성 억제 활성을 확인한 결과, 갯괴불주머니 추출물은 LPS 단독 처리군과 비교했을 때 각각의 처리 농도에서 81%, 76% 및 70%로 PGE2의 생성을 감소시켰으며 추출물 농도의 증가에 따라 PGE2의 생성 억제도 증가함을 확인할 수 있었다 (Fig. 5). 또한 LPS 단독 처리군과 비교시 추출물 투여 농도가 증가함에 따라 COX-2 mRNA와 단백질 발현 레벨도 확연히 감소함을 확인할 수 있었다 (Fig. 6, 7).


Fig. 5. 
Inhibitory effect of Corydalis platycarpa (Maxim.) Makino extract on PGE2 release in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. The PGE2 release was measured by PEG2 ELISA kit in RAW264.7 cells stimulated with LPS (1 μg/mL) alone or in the combination of extracts (50, 100, and 200 μg/mL) for 24 h. Values are the mean ± SEM of triplicate experiments. *p<0.05; **p<0.01.


Fig. 6. 
Inhibitory effect of Corydalis platycarpa (Maxim.) Makino extract on COX-2 protein expression in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. The protein expression level was quantified by Image J in RAW264.7 cells stimulated with LPS (1 μg/mL) alone or in the combination of extract (50, 100, and 200 μg/mL) for 24 h. *p<0.05; **p<0.01.


Fig. 7. 
Inhibitory effect of Corydalis platycarpa (Maxim.) Makino extract on COX-2 mRNA expression in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. The mRNA expression level was measured by RT-PCR in RAW264.7 cells stimulated with LPS (1 μg/mL) alone or in the combination of extract (50, 100, and 200 μg/mL) for 24 h. Values are the mean ± SEM of triplicate experiments. *p<0.05; **p<0.01.

3.4. 전염증성 cytokines (TNF-α, IL-6, IL-1β) 생성 억제

TNF-α는 두 개의 TNFR1과 TNFR2라고 불리는 두 개의 transmembrane receptors를 통해서 신호가 전달되며 세포 증식, 생 존, 분화, 세포 자살(apoptosis)을 조절한다 [30]. 염증 반응 동 안 TNF-α 분비와 합성은 증가하며 IL-1β나 IL-6 등의 전염증 성 사이토카인 생성에 주도적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다 [31]. IL-6는 LPS에 의해 유도된 발열의 내생적인 매개 체로 알려져 있다 [32, 33]. IL-1은 다기능성 사이토카인으로 서 호스트의 면역 방어와 상처에 대한 반응에 관여하며 주로 대식세포에서 생성된다 [34]. RAW264.7 cell에서 갯괴불주머니 추출물이 전염증성 사이토카인 TNF-α, IL-6, IL-1β의 발현에 미치는 영향을 ELISA kit와 RT-PCR을 이용하여 조사하였 다. RAW264.7 cell에 LPS(1 μg/mL)와 갯괴불주머니 추출물 을 50, 100 및 200 μg/mL 농도로 처리하여 TNF-α, IL-6, 및 IL-1β의 생성 억제 활성을 확인하였다. 갯괴불주머니 추출물 은 LPS 단독 처리군과 비교했을 때 추출물 처리 농도가 증가함에 따라 TNF-α의 생성은 조금씩 감소했으며 LPS 단독처리 군 대비 200 μg/mL 추출물 처리시 83%까지 감소하는 것을 확인하였으며 mRNA 발현 감소도 확인되었다 (Fig. 8, 9). IL-1β mRNA 발현은 50 μg/mL 추출물 농도에서 조금 증가하였 으나 추출물 농도가 증가함에 급격히 감소하였으며 100, 200 μg/mL 추출물 농도에서는 LPS 단독 처리군 대비 각각 약 2배, 4배 정도로 감소하는 것을 확인 할 수 있었다 (Fig. 10). 그리 고 IL-6 mRNA 발현은 LPS 단독처리군 대비해서 추출물 투 여 농도가 증가함에 따라 확연히 감소되는 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 11). 그리고 이 결과는 염증반응 시 나타나는 사이 토카인에 의한 세포독성이 갯괴불주머니 추출물의 농도 의 존적으로 억제되고 있음을 시사하고 있다.


Fig. 8. 
Inhibitory effect of Corydalis platycarpa (Maxim.) Makino extract on TNF-α production in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. The TNF-α production was measured by a TNF-α ELISA kit in RAW264.7 cells stimulated with LPS (1 μg/mL) alone or in the combination of extract (50, 100, and 200 μg/mL) for 24 h. Values are the mean ± SEM of triplicate experiments. *p<0.05; **p<0.01.


Fig. 9. 
Inhibitory effect of Corydalis platycarpa (Maxim.) Makino extract on TNF-α mRNA expression in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. The mRNA expression level was measured by RT-PCR in RAW264.7 cells stimulated with LPS (1 μg/mL) alone or in the combination of extract (50, 100, and 200 μg/mL) for 24 h. Values are the mean ± SEM of triplicate experiments. *p<0.05; **p<0.01.


Fig. 10. 
Suppressive effect of Corydalis platycarpa (Maxim.) Makino extract on IL-1β mRNA expression in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. The IL-1β mRNA expression level was measured by RTPCR in RAW264.7 cells stimulated with LPS (1 μg/mL) alone or in the combination of extract (50, 100, and 200 μg/mL) for 24 h. Values are the mean ± SEM of triplicate experiments. *p<0.05; **p<0.01.


Fig. 11. 
Suppressive effect of Corydalis platycarpa (Maxim.) Makino extract on IL-6 mRNA expression in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. The IL-6 mRNA expression level was measured by RTPCR in RAW264.7 cells stimulated with LPS (1 μg/mL) alone or in the combination of extract (50, 100, and 200 μg/mL) for 24 h. Values are the mean ± SEM of triplicate experiments. *p<0.05; **p<0.01.

3.5. NF-κB/IκB 신호경로를 통한 갯괴불주머니 추출물의 항염효과

염증과 같은 스트레스가 없는 경우에는 대부분의 NF-κB는 IκB와 결합하여 비활성화된 상태로 존재한다. NF-κB가 핵으로 이동하여 전염증성 사이트카인과 그 매개체들에 대한 유 전자 전사를 유도하기 전에 NFκB는 먼전 인산화가 될 필요 가 있다. 이와는 반대로 IκB-α는 인산화되고 proteasome에 의해 분해된다 [35]. 따라서 염증반응시 인산화된 NF-κB p65 (p-p65)는 증가하고 비인산화된 IκB-α는 감소하게 된다. 갯괴 불주머니 추출물의 의한 NO, PGE2 생성 억제 활성이 NF-κB/IκB pathway에 의한 것인지 확인하기 위하여 RAW264.7 cell에 LPS (1μg/mL)와 갯괴불주머니 추출물 50, 100, 200 μg/mL 농도로 처리하여 24시간 배양한 후 LPS 단독처리군 대비 pp65와 IκB-α의 단백질 발현레벨을 immunoblotting으로 확인하였다. 그 결과 LPS 단독처리군과 대비 추출물 처리농도가 증가함에 β-Actin 대비 p-p65 단백질 발현은 감소하고 IκB-α 단백질 발현은 증가되는 것을 확인 했으며 p-p65/IκB-α 단백 질 비율은 추출물의 농도 의존적으로 감소되는 것을 확인하였다 (Fig. 12). 이는 전염증성 사이트카인의 인자 생성과 조 절이 NF-κB/IκB 신호경로를 통해 이루어지고 있음을 제시하 고 있으며 갯괴불주머니 추출물이 항염증에 효과가 있을 것 이라고 사료된다.


Fig. 12. 
The anti-inflammatory effect of Corydalis platycarpa (Maxim.) Makino extract via NFκB/IκB signaling pathway. The protein expression level was measured by immunoblotting in RAW264.7 cells stimulated with LPS (1 μg/mL) alone or in the combination of extract (50, 100, and 200 μg/mL) for 24 h. The phospho-NFκB protein expression level was normalized to IκB-α.


4. CONCLUSIONS

본 연구에서는 갯괴불주머니 추출물의 항염 효과를 확인하 기 위하여 LPS를 처리한 RAW264.7 세포주에서 nitric oxide (NO)저해 활성, prostaglandin E2(PGE2), TNF-α, IL-1β, IL-6, COX-2, iNOS을 포함한 전염증성 사이트카인과 매개체의 생성억제 활성을 확인하였다. 갯괴불주머니 추출물과 LPS를 동시에 처리했을 경우 LPS 단독 처리군에 대비하여 추출물 이 증가함에 NO, PGE2, TNF-α 생성도 감소되어가는 것을 ELISA kit로 확인하였다. 이를 바탕으로 염증반응이 일어날시 면역세포가 분비하는 단백질로서 면역세포의 활성, 증식 및 분화를 조절하여 염증반응을 매개하는 인자로 알려진 사 이토카인과 매체개의 발현과 분비에 갯괴불주머니 추출물이 미치는 영향을 mRNA와 단백질 발현레벨에서 연구하였다. 그 결과 갯괴불추출물은 LPS 단독처리군과 비교하여 농도 의존적으로 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 mRNA 발현을 억제시키는 것으로 확인된 바 이는 항염 효능이 있는 것으로 확인되었으며, 염증반응에 관여하는 효소인 iNOS와 COX-2 단백질 발현도 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다. 나아가 본 연구에서는 갯괴불추출물이 NF-κB/IκB signaling pathway 를 경유하여 전염증성 사이토카인과 그 매체개의 발현을 조 절하는 것을 확인하였다. 이상의 연구결과는 갯괴불주머니 의 추출물이 항염 효과가 있음을 제시하고 있으며 기능성 화 장품 원료의 연구 개발에 활용될 수 있을 것이다.


Acknowledgments

이 논문은 산업통상자원부의 경제협력권산업육성사업 비즈니스협력형 (과제번호: R0006242)의 지원을 받아 수행된 연구입니다.


References
1. Bu, H. J., H. J. Lee, E. S. Yoo, D. S. Jung, K. Z. Riu, and S. J. Lee, (2004), Antioxidant effects and inhibitory effect on NO synthesis by extracts of Canavlia lineata, Kor. J. Pharmacogn, 35, p338-345.
2. Conner, E. M., and M. B. Grisham, (1996), Inflammation, free radicals, and antioxidants, Nutrition, 12, p274-277.
3. Shi, C., S. Yuan, H. Zang, T. Zhang, L. Wang, and Z. Xu, (2009), Cell-mediated immune responses and protective efficacy against infection with mycobacterium tuberculosis induced by Hsp65 and hIL-2 fusion protein in mice, Scand. J. Immunol, 69, p140-149.
4. Nazimek, K., W. Ptak, J. Marcinkiewicz, and K. Bryniarski, (2013), Macrophage function in allergic and autoimmune responses, J. Physical Therapy and Health Promotion, 1, p36-45.
5. Shao, J., Y. Li, Z. Wang, M. Xiao, P. Yin, et al, (2013), A novel naphthalimide derivative, exhibited anti-inflammatory effects via targeted-inhibiting TAK1 following down-regulation of ERK1/2and p38 MAPK-mediated activation of NF-κB in LPS-stimulated RAW264.7 macrophages, Int. Immunopharmacol, 17, p216-228.
6. Poltorak, A., X. He, I. Smirnova, M. Y. Liu, C. Van Huffel, et al, (1998), Defective LPS signaling in C3H/HeJ and C57BL/10Sc Cr mice: mutations in Tlr4 gene, Sci, 282, p2085-2088.
7. Jung, Y. S., D. H. Kim, J. Y. Hwang, N. Y. Yun, Y. H. Lee, et al, (2014), Anti-inflammatory effect of tricin 4’-O-(threo-beta-guaiacylglyceryl) ether, a novel flavonolignan compound isolated from Njavara on in RAW264.7 cells and in ear mice edema, Toxicol. Appl. Pharm, 277, p67-76.
8. Özben, T., A. Tomasi, and V. P. Skulachev, (2003), Free radicals, nitric oxide, and inflammation: molecular, biochemical, and clinical aspects, IOS Press, Antalys, Turkey.
9. Jin, M., S. J. Suh, J. H. Yang, Y. Lu, S. J. Kim, et al, (2010), Anti-inflammatory activity of bark of Dioscorea batatas DECNE through the inhibition of iNOS and COX-2 expressions in RAW264.7 cells via NF-kappa B and ERK1/2 inactivation, Food Chem. Toxicol, 48, p3073-3079.
10. Guha, M., and N. Mackman, (2001), LPS induction of gene expression in human monocytes, Cell Signal, 13, p85-94.
11. Allen, J., M. Montalto, J. Lovejoy, and W. Weber, (2011), Detoxification in naturopathic medicine: A survery, J. Altern. Complement Med, 17, p1175-1180.
12. Bojanowski, K., (2013), Hypodermal delivery of cosmetic actives for improved facial skin morphology and functionality, Int. J. Cosmetic Sci, 35, p562-567.
13. Shahinuzzaman, M., Z. Yaakob, and M. Moniruzzaman, (2016), Medicinal and cosmetics soap production from Jatropha oil, J. Cosmet. Dermatol, 15, p185-193.
14. Thogchai, W., and B. Liawruangrath, (2013), Micellar liquid chromatographic determination of arbutin and hydroquinone in medicinal extracts and commercial cosmetic products, Int. J. Cosmet. Sci, 35, p257-263.
15. Dongyan, T., D. Yinmao, L. Li, L. Yueheng, H. Congfen, and L. Jixiang, (2014), Antioxidant activity in mung bean sprouts and safety of extracts for cosmetic use, J. Cosmet. Sci, 65, p207-216.
16. Korea National Arboretum, Korea Biodiversity Information System, http://www.nature.go.kr/kbi/plant/pilbk/selectPlantPilbkGnrlList.do, (2018).
17. Zhai, X.-T., J.-Q. Chen, C.-H. Jiang, J. Song, D.-Y. Li, et al, (2016), Corydalis bungeana Turcz. attenuates LPS-induced inflammatory responses via the suppression of NF-κB signaling pathway in vitro and in vivo, J. Ethnopharmacol, 94, p153-161.
18. Kim, Y. A., C. S. Kong, H. H. Park, E. K. Lee, M. S. Jang, et al, (2015), Anti-inflammatory activity of heterocarpin from the salt marsh plant Corydalis heterocarpa in LPS-induced RAW264.7 macrophage cells, Molecules, 20, p14474-14486.
19. Kang, K. H., C. S. Kong, Y. G. Seo, M. M. Kim, and S. K. Kim, (2009), Anti-inflammatory effect of coumarins isolated from Corydalis heterocarpa in HT-29 human colon carcinoma cells, Food Chem. Toxicol, 47, p2129-2134.
20. Kim, J. J., T. H. Kang, J. U. Seo, H. J. Na, S. J. Kim, et al, (2010), Libanoridin inhibits the mast cell-mediated allergic inflammatory reaction, Immunopharmacol. Immunotoxicol, 32, p258-264.
21. Berridge, M.V., P. M. Herst, and A. S. Tan, (2005), Tetrazolium dyes as tools in cell biology: New insights into their cellular reduction, Biotechnol. Ann. Rev, 11, p127-152.
22. Król, W., Z. P. Czuba, M. D. Threadgill, B. D. Cunningham, and G. Pietsz, (1995), Inhibition of nitric oxide (NO) production in murine macrophages by flavones, Biochem. Pharmacol, 50, p1031-1035.
23. Kole, L., B. Giri, S. K. Manna, B. Pal, and S. Ghosh, (2011), Biochanin-A, an isoflavon, showed anti-proliferative and anti-inflammatory activities through the inhibition of iNOS expression, p38MAPK and ATF-2 phosphorylation and blocking NFκB nuclear translocation, Eur. J. Pharmacol, 653, p8-15.
24. Kim, A. R., J. Y. Cho, Y. Zou, J. S. Choi, and H. Y. Chung, (2005), Flavonoids differentially modulate nitric oxide production pathways in lipopolysaccharide-activated RAW264.7 cells, Arch. Pharm. Res, 28, p297-304.
25. Yoon, S., Y. Lee, S. K. Park, H. Kim, H. Bae, et al, (2009), Anti-inflammatory effects of Scutellaria baicalensis water extract on LPS-activated RAW264.7 macrophages, J. Ethnopharmacol, 125, p286-290.
26. Sandhiutami, N. M. D., M. Moordiani, D. R. Laksmitawati, N. Fauziah, M. Maesaroh, and W. Widowati, (2017), In vitro asses ment of anti-inflammatory activities of coumarin and Indonesian cassia extract in RAW264.7 murine macrophage cell line, Iran J. Basic Med. Sci, 20, p99-106.
27. Hsieh, I. N., A. S. Chang, C. M. Teng, C. C. Chen, and C. R. Yang, (2011), Aciculatin inhibits lipopolysaccharide-mediated inducible nitric oxide synthase and cyclooxygenase-2 expression via suppressing NF-κB and JNK/p38 MAPK activation pathways, J. Biomed. Sci, 18, p1-28.
28. Nørregaard, R., T. H. Kwon, and J. Frøkiær, (2015), Physiology and pathophysiology of cyclooxygenase-2 and prostaglandin E2 in the kidney Kidney, Res. Clin. Pract, 34, p194-200.
29. Ricciotti, E., and G. A. FitzGerald, (2011), Prostaglandins and inflammation, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol, 31, p986-1000.
30. Parameswaran, N., and S. Patial, (2010), Tumor necrosis factor-α signaling in macrophages., Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr, 20, p87-103.
31. Levine, B., J. Kalman, L. Mayer, H. M. Fillit, and M. Packer, (1990), Elevated circulating levels of tumor necrosis factor in severe chronic heart failure, N. Engl. J. Med, 323, p236-241.
32. van Meir, E., Y. Sawamura, A. C. Diserens, M. F. Hamou, and N. de Tribolet, (1990), Human glioblastoma cells release interleukin 6 in vivo and in vitro, Cancer Res, 50, p6683-6688.
33. Morrissey, P. J., and K. Charrier, (1994), Treatment of mice with IL1 before infection increases resistance to a lethal challenge with Salmonella typhimurium. The effect correlates with the resistance allele at the Ity locus, J. Immunol, 153, p212-219.
34. Kielian, T., E. D. Bearden, A. C. Baldwin, and N. Esen, (2004), IL-1 and TNF-alpha play a pivotal role in the host immune response in a mouse model of Staphylococcus aureus-induced experimental brain abscess, J. Neuropathol. Exp. Neurol, 63, p381-396.
35. Yamamoto, Y., and R. B. Gaynor, (2004), IkB kinases: key regulators of the NF-kB pathway, Trends in Biochemical Sciences, 29, p72-79.