The Korean Society For Biotechnology And Bioengineering

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Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 34 , No. 1

[ Research Paper ]
Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 34, No. 1, pp.1-9
Abbreviation: KSBB J
ISSN: 1225-7117 (Print) 2288-8268 (Online)
Print publication date 31 Mar 2019
Received 27 Dec 2018 Revised 14 Jan 2019 Accepted 16 Jan 2019
DOI: https://doi.org/10.7841/ksbbj.2019.34.1.1

추출용매에 따른 당삼 추출물의 미백 활성 변화
박현지1 ; 안소희2 ; 최원영2 ; 이계원2 ; 권미진3 ; 조영호1, 2, *
1건양대학교 의료공학과
2건양대학교 제약생명공학과
3(주)피에스에이 R&D센터

Changes in Whitening Activity of Codonopsis pilosula Extracts according to Extraction Solvents
Hyun Ji Park1 ; So Hee Ahn2 ; Won Yeoung Choi2 ; Gye Won Lee2 ; Mi Jin Kwon3 ; Young Ho Cho1, 2, *
1Department of Medical Engineering & Science, Konyang University, Daejeon 35365, Korea, Tel: +82-42-600-8503, Fax: +82-42-600-8503 (micael@konyang.ac.kr)
2Department of Pharmaceutics and Biotechnology, Konyang University, Daejeon 35365, Korea
3R&D center, PSA Co., Ltd, Daejeon 35365, Korea
Correspondence to : *Department of Medical Engineering & Science, Konyang University, Daejeon 35365, Korea Tel: +82-42-600-8503, Fax: +82-42-600-8503 E-mail: micael@konyang.ac.kr


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Abstract

This study was designed to compare the anti-oxidant activity and anti-melanogenic effect of Codonopsis pilosula extracts (CPE) according to extraction solvents. Codonopsis pilosula was treated with distilled water (CPE-DW) and 70% EtOH (CPE-EtOH), respectively. The total polyphenol and flavonoid contents of CPE-EtOH and CPE-DW were 6.11, 8.54 μg/mg and 1.59, 2.44 μg/mg, respectively. In antioxidant activities through DPPH, ABTS radical scavenging activity, and reducing power of CPE, CPE-DW showed higher scavenging activities than those of CPE-EtOH. Furthermore, The melanin contents of CPE-EtOH and DW treatment at 100 μg/mL were significantly inhibited by 22% and 33% in melana cells, respectively (p<0.01). Its anti-melanogenic effect was originated from the inhibition of intra-cellular tyrosinase activity and melanogenesis related protein expression by CPE treatment in a dose dependent manner. Taken together, We suggest that Codonopsis pilosula extracts may be useful as a natural active ingredient for whitening cosmetics.


Keywords: Codonopsis pilosula, melan-a cells, anti-oxidant activity, anti-melanogenic effect

1. INTRODUCTION

피부는 신체의 가장 큰 기관이며 자외선에 취약하다. 자외선의 영향으로 생성된 활성산소는 피부세포를 손상시킬 뿐 아니라 이를 억제할 목적으로 멜라닌 생성을 증가시키는 것으로 알려져 있다 [1]. 이를 해결하기 위한 수단으로 항산화제는 활성산소를 제거하여 피부세포를 보호하고 멜라닌의 증가를 억제하여 멜라닌에 의한 피부의 색소침착을 줄일 수 있다 [2]. 그중 식물에서 추출한 천연 항산화제는 낮은 독성과 생물학적 활성도가 높아 기능성 소재의 새로운 자원으로 각광받고 있다 [3].

멜라닌은 멜라닌 형성세포에서 주로 합성되고, 인체의 여러 조직에 존재해 자외선에 의한 피부암 예방에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다 [4,5]. 스트레스, 자외선 및 노화로 인한 멜라닌의 과도한 생성 및 축적은 과색소침착, melasma, 염증 후 멜라닌 증후군 등의 많은 피부 질환을 일으키는 것으로 알려져 있다 [6]. 멜라닌 생합성은 tyrosinase, tyrosinase-related protein (TRP)-1, TRP-2를 포함하는 tyrosinase 계열의 단백질 참여로 일어나는데 [7], 먼저 tyrosinase는 생합성경로 내에서 초기 두 개의 별도의 반응인 L-tyrosine의 L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA)로의 수산화와 L-DOPA의 L-dopaquinone으로 산화를 촉매한다 [8]. 또한 TRP-1과 TRP-2에 의해 최종적으로 pheomelanin과 eumelanin이라고 불리는 적색과 흑갈색 색소를 각각 생합성한다 [9]. 따라서 멜라닌 생성을 조절하는 것은 인체의 건강과 미용적 외관 유지에 중요하여, 최근까지 멜라닌 생성 조절을 위한 약물 및 천연물 연구가 계속 이루어지고 있다.

당삼은 초롱꽃과에 속하는 만삼 Codonopsis pilosula (Fr.) Nannf.의 뿌리로 우리나라 강원도의 산속에 자생 혹은 재배하며, 중국에서는 간서 및 산시 지역 등 중국 북부 또는 서부지역에 분포하고 있다 [10]. 민속 의학에서는 수백 년 동안 인삼의 대용품으로써 에너지를 보충하고 면역 체계, 위장기능저하, 식욕저하, 혈압저하를 강화하는 데 사용되어 왔다. 당삼에 함유된 성분으로는 다량의 sucrose와 polysaccharides, triterpenes, saponins, phytosterols, phenolic glycosides, alkaloids, polyacetylenes 등이 있다고 보고되었다 [11]. 그 중 주요 acetylene인 lobetyolin은 NF-κB를 활성화시키고 면역 자극 효과를 나타내는 것으로 밝혀졌다 [12]. 그 외에 당삼 에탄올 추출물의 ovalbumin에 의한 알레르기 반응 저해효과 [13], 열수 추출물의 혈장 포도당 수준 저하 [14], 부탄올 추출물의 자유라디칼 소거활성 및 rat 뇌 균질액에서 지질과산화 억제효과 [15] 등의 연구가 이루어지고 있다. 그러나 당삼 추출물의 미백관련 소재로서의 효능 및 유효성분 규명에 대한 연구는 지금까지 보고된 바가 없다.

이에 본 연구에서는 물과 에탄올을 추출용매로 하여 당삼의 열수 및 에탄올 추출물을 제조하고, 항산화 활성 및 미백 활성을 확인함으로써 당삼의 미백 기능성 소재로서의 활용 가능성을 알아보고자 하였다.


2. MATERIALS AND METHOD
2.1. 시약

RPMI 1640과 fetal bovine serum (FBS)은 WELGENE (Daegu, Korea)에서 구입하였고 penicillin-streptomycin은 GibcoBRL (Eggenstein, Germany)에서 구입하였다. Phorbol 12-myristate 13-acetate (TPA)는 TOCRIS (Bristol, UK)에서 구입하였고, 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), griess reagent, quercetin, tannic acid, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), 2,2'-azino-bis(3-ethylbe-nzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS), potassium ferricyanide (III) 및 Folin-ciocalteu’s reagent는 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)에서 각각 구입하여 사용하였다. 그 외에 실험에 사용된 모든 시약들은 일급 및 특급 시약을 구입하여 사용하였다.

2.2. 당삼 추출물 제조

본 연구에서 사용한 당삼은 삼흥건재약업사 (중국)에서 구입하여 사용하였다. 구입한 당삼은 60oC에서 건조시키고 세절하여 당삼 100 g을 70% 에탄올 (EtOH, w/v) 혹은 멸균수 (DW, w/v) 1 L에 침지시킨 후 shaking water bath에서 24시간씩 3회 추출하였다. 추출물을 원심분리하여 상등액을 모은 후, 감압 농축 및 동결 건조하여 당삼의 에탄올 추출물 (CPE-EtOH)과 열수 추출물 (CPE-DW)을 각각 제조하였다 (Fig. 1).


Fig. 1. 
Preparation of Codonopsis pilosula extract (CPE).

2.3. 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량 측정

총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis 방법 [16]으로 측정하였으며, 시료에 95% 에탄올과 증류수를 첨가하고 1 N Folin-Ciocalteu’s reagent를 넣어 5분간 방치한 후, 10% Na2CO3를 가해 725 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 폴리페놀 함량은 tannic acid 표준곡선을 이용하여 구하였다.

총 플라보노이드 함량은 Moreno 등의 방법 [17]에 의해 측정하였다. 각 시료를 10% aluminum nitrate와 1 μM potassium acetate가 함유된 80% 에탄올에 혼합하여 40분 정치한 뒤 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 총 플라보노이드 함량은 quercetin 표준곡선을 이용하여 구하였다.

2.4. 항산화 활성 측정

DPPH radical 소거활성 측정은 Blois 방법 [18]에 따라 96 well plate에 시료를 농도별로 취한 다음 실험군에는 DPPH를, 대조군에는 메탄올을 첨가하여 20분간 shaking한 후 560 nm에서 ELISA-reader로 흡광도를 측정하였다.

ABTS radical 소거활성 측정은 Re 등의 방법 [19]을 변형하여 사용하였다. 7 mM ABTS와 2.45 mM potassium persulfate를 암소에서 24시간 반응하여 라디칼을 형성시켜 ABTS stock solution을 제조하였다. 이후 증류수로 희석시키고 시료를 첨가하여 10분간 반응시킨 후 415 nm에서 흡광도를 측정하였다.

Superoxide anion radical 소거활성은 nitro blue tetrazolium (NBT) 환원법 [20]으로 측정하였다. 3 mM xanthine sodium salt와 0.6 mM NBT 용액, 15 mM Na2-EDTA용액, 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.4)를 각각 혼합하고, 시료와 xanthine oxidase (0.1 units/mL)를 첨가하였다. 5분간 차광하여 혼합하고 37oC incubator에서 15분간 반응시킨 후, 560 nm에서 흡광도를 측정하였다.

환원력 측정은 시료에 200 mM sodium phosphate buffer (pH 6.6)와 1% potassium ferricyanide을 차례로 가하여 20분간 반응시켰다. 그 후 10% trichloroacetic acid를 가하고 원심분리하여 얻은 상등액을 96 well plate에 농도별로 가하고 실험군에는 1% iron (II) chloride를, 대조군에는 증류수를 가하여 700 nm에서 흡광도를 측정하였다 [21].

2.5. 세포배양 및 세포생존율 측정

Melan-a cell은 RPMI 1640에 10% FBS와 1% penicillin-streptomycin, 200 nM phorbol 12-myristate 13-acetate (TPA)가 함유된 배지를 사용하여 37oC, 5% CO2 incubator에서 배양하였다.

당삼 추출물의 세포생존율에 미치는 영향을 측정하기 위하여 배양된 melan-a 세포를 96 well plate에 각각 1×104 cells/mL의 농도로 분주하여 배양한 후 당삼 추출물을 농도별로 첨가하여 CO2 incubator에 배양하였다. 그 후 MTT 용액 (5 mg/mL)을 첨가하여 반응시킨 뒤 dimethyl sulfoxide를 첨가하여 생성된 formazan을 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

2.6. 멜라닌 합성 저해활성

당삼 추출물이 멜라닌 합성에 미치는 영향을 측정하기 위해서 melan-a 세포를 6 well plate에 5×104 cells/well의 농도로 분주한 후, 37oC, 5% CO2 하에서 24시간 동안 배양하고 시료를 농도별로 처리해 72시간 동안 재배양하였다. 그 후 1% triton X-100이 들어있는 PBS 용액을 통해 세포를 용해시켜 e-tube에 옮겨 담고 4oC, 13,000 rpm에서 15분간 원심분리하였다. 상등액을 제거하고 cell pellet에 1 N NaOH 수용액을 첨가하여 65oC에서 1시간 동안 반응시킨 후 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.

2.7. Tyrosinase 저해활성

세포 내 tyrosinase 저해활성을 측정하기 위해서 6 well plate에 5×104 cells/well의 농도로 분주하고 37oC, 5% CO2 incubator에서 하루 동안 배양 후, 시료를 농도별로 처리하고 72시간 동안 재배양하였다. 그 후 배지를 제거하고 1% triton X-100이 들어있는 PBS 용액을 이용하여 세포를 회수하고 4oC, 13,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 상등액을 취하여 tyrosinase 용액으로 사용하였다. 96 well plate에 단백질 농도를 맞춘 시료와 L-DOPA (2 mg/mL)를 넣고 37oC에서 1시간 동안 반응시킨 후 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.

2.8. 멜라닌 생성 (melanogenesis) 관련 단백질 발현 측정

당삼 추출물이 멜라닌 생성에 관여하는 단백질의 발현에 미치는 영향을 측정하기 위하여 멜라닌 생성에 관여하는 효소인 tyrosinase, TRP-1 및 TRP-2와 전사인자인 microphthalmia-associated transcription factor (MITF)의 발현량 변화를 western blot으로 분석하였다. 먼저 시료를 농도별로 처리해 72시간 동안 배양한 melan-a 세포 내 단백질을 passive lysis buffer로 추출한 후, 세포용해물의 단백질 농도는 BSA (bovine serum albumin)를 표준물질로 하고, BCA protein assay kit를 사용하여 측정하였다. 단백질 30 μg을 10% sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)로 분리한 후, nitrocellulose membrane에 분리된 단백질을 blotting하였다. 그 후 membrane을 mouse monoclonal anti-MITF (1:1000 dilution), mouse monoclonal anti-tyrosinase (1:1000 dilution), rabbit monoclonal anti-TRP-1 (1:5000 dilution)과 rabbit monoclonal anti-TRP-2 (1:5000 dilution) 항체와 4oC에서 반응시켰다. 그 후 membrane을 wash하고 HRP-conjugated-secondary antibody와 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 단백질 발현은 enhanced chemiluminescence (ECL) detection system (AI680, GE healthcare, Uppsala, Sweden)을 이용하여 분석하였다.

2.9. 통계처리

모든 실험결과는 평균±표준편차로 표기하였으며, 각 군 간의 통계적 유의성 검증은 SPSS 18.0 (SPSS Inc., IL, USA)을 이용한 Student’s t-test로 하였으며, p 값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의하다고 판단하였다.


3. RESULTS AND DISCUSSION
3.1. 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량 측정

항산화, 항암, 항균 등 다양한 생리활성을 가지는 것으로 알려진 폴리페놀과 플라보노이드는 천연물 대상 연구에서 그 함량이 중요하게 다뤄지고 있다 [22]. 당삼 추출물의 총 폴리페놀과 플라보노이드 함량은 각각의 표준물질인 tannic acid와 quercetin의 검량선에 대입하여 비교 측정하였다 (Table 1). Table 1에 나타낸 바와 같이 CPE-EtOH과 DW의 총 폴리페놀 함량은 각각 6.11, 8.54 μg/mg이고, 총 플라보노이드 함량은 1.59, 2.44 μg/mg이었다. 당삼을 열수로 추출할 경우 에탄올로 추출했을 때보다 총 폴리페놀의 함량은 약 1.4배, 총 플라보노이드의 경우 약 1.5배 정도 증가하는 것으로 나타났다. Yoo 등 [23]의 연구에서 당삼을 메탄올로 추출한 경우 총 폴리페놀 함량은 0.38 μg/mg이었고, 총 폴리페놀 함량은 2.10 μg/mg으로 나타났다. 이러한 결과로 보아 당삼의 경우 알코올 (메탄올, 에탄올)보다는 열수로 추출할 경우 유효성분의 추출효율이 증가하는 것을 알 수 있다.

Table 1. 
Total polyphenol and flavonoid contents of Codonopsis pilosula extract (CPE)
Contents (μg/mg) CPE-EtOH CPE-DW
Phenolics 6.11±0.22 8.54±0.30
Flavonoids 1.59±0.08 2.44±0.42

3.2. 항산화 활성 측정

당삼 추출물의 항산화 활성을 측정하기 위하여 DPPH radical. ABTS radical 및 superoxide anion radical 소거활성과 환원력을 평가하였으며, 그 결과를 Fig. 2Table 2에 각각 나타내었다. Fig. 2(A)는 당삼 추출물의 DPPH radical 소거활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다. 그 결과, CPE-EtOH과 CPE-DW 모두 대조군에 비해 시료의 농도가 증가함에 따라 유의적으로 radical 소거활성이 증가하는 것으로 나타났다 (p<0.001). 즉, CPE-EtOH과 DW는 1,000 μg/mL의 농도에서 radical을 30% 이상, 5,000 μg/mL에서 90% 이상 각각 소거시키는 것으로 나타났으며, CPE-EtOH의 SC50 (radical을 50% 소거하는데 필요한 시료의 농도)값은 2,122.51 μg/mL, CPE-DW의 SC50값은 1.642 μg/mL으로 에탄올보다 열수로 추출할 경우 DPPH radical 소거활성이 더 높은 것으로 나타났다. 이 때 양성 대조군인 L-ascorbic acid의 SC50값은 2.69 μg/mL로 나타났다 (data not shown). Yoo 등 [23]의 연구에서 당삼 메탄올 추출물이 1,000 μg/mL에서 DPPH radical을 약 19% 저해한 것과 비교할 때, CPE-EtOH과 DW의 DPPH radical 소거활성이 더 높은 것은 총 폴리페놀과 플라보노이드 함량이 상대적으로 많아서 나타나는 결과로 사료된다.


Fig. 2. 
Antioxidant activity of CPE. (A) DPPH radical scavenging activity. (B) ABTS radical scavenging activity. (C) Superoxide anion radical scavenging activity (***p<0.001 compared with control).

Table 2. 
Effects of CPE-EtOH and CPE-DW on reducing power
Sample conc.
(μg/mL)
Reducing Power (O.D)
CPE-EtOH CPE-DW
control 0.37±0.00 0.39±0.01
62.5 0.69±0.02*** 0.76±0.01***
125 0.97±0.02*** 1.05±0.02***
250 1.41±0.05*** 1.60±0.01***

Fig. 2(B)는 당삼 추출물의 ABTS radical 소거활성을 측정한 결과이다. Fig. 2(B)에 나타난 바와 같이 CPE-EtOH과 DW의 SC50값은 각각 147.59 μg/mL, 127.61 μg/mL로, CPE-DW의 소거활성이 더 높게 나타났다. 이때, 양성 대조군인 butylated hydroxy anisole (BHA)의 SC50값은 1.81 μg/mL로 나타났다 (data not shown).

Superoxide dismutase (SOD)는 superoxide anion radical을 과산화수소로 전환시키는 효소 [24]로 자외선으로 인한 피부손상을 예방하는 세포 내 중요한 항산화제 역할을 하는 것으로 알려져 있다 [25]. 당삼 추출물의 superoxide anion radical 소거활성을 통하여 SOD-like activity를 측정한 결과 CPE-EtOH은 1,000 μg/mL 농도에서 소거활성이 50%를 넘지 못하였는데 반해, CPE-DW는 SC50값이 459.50 μg/mL으로 나타나 CPE-EtOH보다 2배 이상의 높은 superoxide anion radical 소거활성을 보였다 (Fig. 2(C)).

당삼 추출물의 환원력은 Table 2에 나타낸 바와 같이 CPE-EtOH과 DW는 250 μg/mL의 농도에서 각각 1.41과 1.60이었다. 이러한 결과는 radical 소거활성 결과와 마찬가지로 환원력도 당삼을 에탄올로 추출할 경우보다 열수로 추출할 경우 더 높은 것으로 나타났다.

3.3. 당삼 추출물의 세포 생존율

당삼 추출물의 멜라닌 합성 저해 활성 평가를 위해 먼저 당삼 추출물이 melan-a 세포의 세포 생존율에 미치는 영향을 MTT 분석으로 측정하였다 (Fig. 3). Fig. 3에 나타낸 바와 같이 melan-a 세포에 당삼 추출물을 6.25, 12.5, 25, 50, 100 μg/mL의 농도로 24시간, 48시간 처리하였을 때 CPE-EtOH과 DW 모두 90% 이상의 생존율을 나타내어 독성이 없는 것을 확인하였으며 이후 실험의 농도는 세포생존율에 큰 변화를 보이지 않는 100 μg/mL까지로 결정하여 수행하였다.


Fig. 3. 
Effect of Codonopsis pilosula extract (CPE) on the viability in Melan-a cells. Viability of Melan-a cells treated with CPE-EtOH (A) and CPE-DW (B) for 24 hrs, 48 hrs was analyzed using MTT assays. Values are the mean±SD of three independent experiment (*p<0.05 and **p<0.01 compared with control).

3.4. 멜라닌 합성 저해 활성

높은 항산화 활성을 가지는 당삼 추출물의 Melan-a 세포에서 멜라닌 합성 저해 활성을 측정하여 Fig. 4에 나타내었다. CPE-EtOH과 DW는 100 μg/mL의 농도에서 멜라닌 합성을 각각 22%, 33%로 유의적으로 억제하였다 (p<0.01). 당삼 추출물의 멜라닌 합성 저해 활성의 정도는 양성대조군으로 사용한 arbutin과 동일 농도 비교 시 낮게 나타났으나 단일 화합물이 아닌 추출물임을 감안할 때 높은 미백 활성을 가지는 것으로 사료된다. 이들 결과는 B16/BL6 melanoma 세포에서 가래나무 에탄올 추출물이 100 μg/mL의 농도에서 대조군에 비해 멜라닌 합성을 약 25% 저해하였다는 이전 연구 [26]와 비교할 때, CPE-DW의 멜라닌 합성 저해 활성이 더 높은 것으로 판단된다.


Fig. 4. 
Effect of Codonopsis pilosula extract (CPE) on melanin production in Melan-a cells. Melanin content in the cells treat with arbutin (100 μg/mL) and CPE for 72 hrs was measured with an ELISA reader (A). The melanin level in Melan-a cells was visualized after dissolving cell pellet in 1N NaOH (B). Values are the mean±SD of three independent experiment (*p<0.05, **p<0.01 and ***p<0.001 compared with control).

3.5. Tyrosinase 저해 활성

Tyrosinase는 멜라닌 생성에 핵심적인 역할을 하는 효소로 tyrosinase 저해 활성 효과는 미백 효과를 나타내는 중요한 지표로 사용되고 있다 [27]. 본 연구에서는 당삼 추출물의 멜라닌 합성 저해 활성이 tyrosinase의 활성 저해에 기인하는지를 세포 수준에서 알아보기 위해 Melan-a 세포에 당삼 추출물을 농도별로 처리하여 tyrosinase 활성에 미치는 영향을 분석하였다 (Fig. 5). 그 결과 당삼 추출물은 50 μg/mL 이상부터 tyrosinase 활성을 유의적으로 감소시켜 100 μg/mL의 농도에서 CPE-EtOH는 약 13%, CPE-DW는 약 32% 감소시키는 것으로 나타났다. 이를 통해 당삼 추출물의 tyrosinase 저해 활성은 열수 추출물이 에탄올 추출물보다 약 3배 이상 높게 나타내는 것으로 확인되었다. 양성대조군인 arbutin은 100 μg/mL의 농도에서 대조군에 비해 tyrosinase 활성을 약 47% 억제하였다. Park 등 [28]의 연구에서 Melan-a 세포에 대석조생, 퍼플킨, 포모사 과피 열수 추출물을 처리하고 세포 내 tyrosinase 저해활성을 측정하여 50 μg/mL 이상의 농도에서 각각 대조군에 비해 약 34%, 36% 및 37%로 보고된 바 있다. 이와 같은 결과를 통하여 당삼 추출물의 멜라닌 생합성 저해는 tyrosinase의 활성 억제를 통하여 일어남을 확인하였다.


Fig. 5. 
Effect of Codonopsis pilosula extract (CPE) on tyrosinase activity in Melan-a cells. Tyrosinase activity in the cells treated with arbutin (100 μg/mL) and CPE for 72 hrs was measured with an ELISA reader. Values are the mean±SD of three independent experiment (*p<0.05, **p<0.01 and ***p<0.001 compared with control).

3.6. 멜라닌 생성 (melanogenesis) 관련 단백질 발현에 미치는 영향

본 연구를 통하여 당삼 추출물이 멜라닌 합성을 저해시켰을 뿐만 아니라 tyrosinase 활성도 억제시키는 것으로 확인됨에 따라 멜라닌 합성의 각 단계별 핵심적인 단백질 중 멜라닌 형성 세포 특이적 전사인자인 MITF [29]와 그 타겟 유전자인 tyrosinase, TRP-1 및 TRP-2의 발현정도를 살펴보았다 (Fig. 6). 먼저 당삼 추추물의 MITF 단백질 발현에 미치는 영향을 측정한 결과 양성대조군인 arbutin은 100 μg/mL에서 대조군 대비 약 40% 정도 발현이 억제되는 것으로 나타났고, CPE-EtOH는 50, 100 μg/mL에서 대조군에 대비 각각 40%, 51% 정도 발현을 억제하였다. 또한 당삼 추출물의 TRP-1과 TRP-2의 발현에 미치는 영향을 측정한 결과 CPE-EtOH는 농도별 유의적인 차이는 보이지 않지만, TRP-2에서 대조군 대비 약 50%의 발현억제를 보여 양성대조군인 arbutin과 비슷한 경향을 나타내었다. 또한 tyrosinase의 발현에 미치는 영향을 측정한 결과 arbutin은 100 μg/mL의 농도에서 대조군에 비해 발현을 약 41% 억제하였고, CPE-EtOH는 50 μg/mL 이상부터 발현을 억제하여 100 μg/mL의 농도에서 약 30% 정도 억제하는 것으로 나타났다 (Fig. 6(A)). 한편, CPE-DW의 TRP-1과 TRP-2의 발현에 미치는 영향을 측정한 결과 대조군에 비해 유의적인 차이를 보이지 않아 TRP-1과 TRP-2의 발현에는 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다. 또한 MITF의 발현에 미치는 영향을 측정한 결과 50, 100 μg/mL의 농도에서 대조군에 비해 약 34%, 56% 정도 발현을 억제하였고, tyrosinase의 발현에 미치는 영향을 측정한 결과 100 μg/mL에서 약 54% 정도 감소시켜 양성대조군인 arbutin보다 더 높은 발현 억제효과를 나타내었다. 이러한 연구를 통해 당삼 추출물은 추출 용매에 따라 MITF의 발현억제를 통해 타겟 유전자의 발현을 각각 다른 방식으로 억제하는 것으로 확인되었다. 즉, CPE-EtOH의 경우 TRP-2와 tyrosinase 단백질 발현을, CPE-DW의 경우 tyrosinase 단백질 발현을 각각 억제함으로써 멜라닌 합성을 억제하여 미백작용을 나타내는 것으로 사료된다. Jin 등 [30]의 연구에서 산초 추출물의 멜라닌 생성 저해능은 MITF 단백질 발현 억제를 통하여 타겟 유전자인 tyrosinase, TRP-1 및 TRP-2의 발현을 억제하여 일어난다고 보고하였다.


Fig. 6. 
Effect of Codonopsis pilosula extract (CPE) on melanogenesis related protein expression in Melan-a cell. (A) and (B) are representative blots and (C) is quantification of the ratio of protein expression (C) in Melan-a cells treated by arbutin, CPE-EtOH, and CPE-DW. The data show the means±SD from three independent experiments.


4. CONCLUSION

본 연구에서는 당삼 에탄올 (CPE-EtOH) 및 열수 추출물 (CPE-DW)의 항산화 활성 및 미백 활성을 melan-a 세포를 이용하여 분석함으로써 기능성 미백 화장품 소재로서의 활용 가능성을 검토하였다.

당삼 추출물 (CPE-EtOH, DW)의 총 폴리페놀 함량은 각각 6.11, 8.54 μg/mg, 플라보노이드 함량은 각각 1.59, 2.44 μg/mg으로 열수 추출물이 에탄올 추출물에 비해 약 1.4배 정도 높은 것으로 나타났다. DPPH radical 및 ABTS radical 소거활성은 CPE-DW의 SC50 값이 각각 1,642.47 μg/mL, 196.54 μg/mL, CPE-EtOH의 SC50 값이 각각 2,122.51 μg/mL, 276.38 μg/mL으로 열수 추출물이 에탄올 추출물에 비해 우수한 항산화 활성을 나타내었다.

Melan-a 세포에서 당삼 추출물의 tyrosinase 저해 활성과 멜라닌 합성 저해 효과는 100 μg/mL의 농도에서 CPE-DW는 각각 약 32%, 33%, CPE-DW는 각각 약 13%, 22%로 나타나 열수 추출물이 에탄올 추출물에 비해 상대적으로 억제 활성이 우수한 것으로 판단된다. 이러한 결과는 당삼 추출물의 멜라닌 생성 억제능이 멜라닌 형성에 관여하는 tyrosinase 효소 활성 억제 및 melanogenesis에 관련된 단백질 (MITF, tyrosinase, TRP-2) 발현 저해에 따른 것으로 사료된다. 따라서 이러한 결과를 통해 당삼 추출물은 기능성 미백 화장품소재로 활용 가능성이 있을 것으로 기대된다.


Acknowledgments

이 논문은 2018년 정부재원 (과학기술정보통신부 여대학(원)생 공학연구팀제 지원사업)으로 과학기술정보통신부, 한국연구재단과 한국여성과학기술인지원센터의 지원을 받아 연구되었습니다.


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