The Korean Society For Biotechnology And Bioengineering

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Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 34 , No. 1

[ Research Paper ]
Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 34, No. 1, pp.15-24
Abbreviation: KSBB J
ISSN: 1225-7117 (Print) 2288-8268 (Online)
Print publication date 31 Mar 2019
Received 21 Jan 2019 Revised 27 Feb 2019 Accepted 11 Mar 2019
DOI: https://doi.org/10.7841/ksbbj.2019.34.1.15

Legionella pneumophila JK-3에 대한 녹차 카테킨 Epigallocatechin Gallate (EGCG)의 항세균 및 프로테옴 효과
석지원 ; 이현호 ; 오계헌*
순천향대학교 자연과학대학 생명시스템학과

Antibacterial and Proteomic Effects of Legionella pneumophila JK-3 Exposed to Green Tea Catechin, Epigallocatechin Gallate (EGCG)
Ji-Won Seok ; Hyun-Ho Lee ; Kye-Heon Oh*
Department of Life Science and Biotechnology, Soonchunhyang University, Asan 31538, Korea, Tel: +82-41-530-1353, Fax: +82-41-530-1350 (kyeheon@sch.ac.kr)
Correspondence to : *Department of Life Science and Biotechnology, Soonchunhyang University, Asan 31538, Korea Tel: +82-41-530-1353, Fax: +82-41-530-1350 E-mail: kyeheon@sch.ac.kr


© 2019 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering
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Abstract

The objective of this study was to examine the antibacterial and proteomic effects of Legionella pneumophila exposed to a large green tea component, EGCG (epigallocatechin gallate). Initially, the isolate was identified and assigned to Legionella pneumonia JK-3 using the 16S rRNA sequencing. Phylogenetic tree of JK-3 was plotted on 16S rRNA sequencing comparison. EGCG showed a dose-dependent antibacterial effect on L. pneumophila JK-3, while JK-3 treated using 2,000 ug/mL EGCG completely inhibited growth within 3 h of incubation. SEM analysis demonstrated the presence of perforations and irregular rod forms with wrinkled surfaces in cells treated with sublethal concentrations of EGCG. SDS-PAGE stained with silver revealed that the amount of lipopolysaccharide in JK-3 increased or decreased according to the concentrations and exposure times of EGCG. Both stress shock proteins (SSPs) (70-kDa DnaK and 60-kDa GroEL) increased in different concentrations of EGCG, whereas the SSPs increased during the early stage as EGCG exposure time of elapsed then gradually decreased. To identify proteins induced by EGCG exposure, 2-DE was applied to soluble protein fractions of JK-3 cultures. Notably, 19 protein spots were either increased or decreased after treatment with EGCG. Using MALDI-TOF mass spectrometry, twelve up-regulated proteins were identified as chaperones, cell envelope proteins, and cell lysis protein. Similarly, seven down-regulated proteins including proteins involved in some energy metabolism and DNA/RNA metabolism were identified. In conclusion, this study provides important clues in understanding of the cytotoxicity mechanisms that affect the antibacterial effect of EGCG exposure, and suggests its use as a phytochemical antibacterial.


Keywords: EGCG, epigallocatechin gallate, Legionella pneumophila JK-3, proteomic effect

1. INTRODUCTION

Legionella는 1967년 7월 필라델피아에서 개최된 미국재향군인회에 참석한 사람들과 지역주민을 포함한 221명에서 폐렴이 발생하여 이 가운데 34명이 사망하였으며 [1], 그 이듬해 미국질병통제센터 (Centers for Disease Control)에서는 이 질병으로 사망한 환자의 폐조직으로부터 Legionella pneumophila를 분리하여 원인균으로 알려지게 된 병원균이다 [2]. 그 후 Morris 등 [3]은 환경 시료로부터 L. pneumophila를 분리하여 에어콘의 냉각탑수와 증발형 콘덴서가 이 병원균의 전파에 중요한 요인임을 밝혔다. Tobin 등 [4]은 에어콘이 가동되지 않는 병실에 장기 입원 중인 장기이식 환자와 일반 병동의 샤워기를 사용한 환자 등으로부터 L. pneumophila를 분리하였다.

L. pneumophila는 강이나 호수 등의 자연환경 생태계에서 뿐만 아니라, 온천수, 병원, 호텔, 아파트 등의 온수배출구에서도 생장할 수 있다. 집이나 병원, 목욕탕, 리조트 등에서 사용되는 온수욕조와 사우나 시설에서 레지오넬라증이 발생한 사례도 보고된 바 있는데, 이는 사우나와 온수욕조의 사용이 레지오넬라 노출의 잠재적 위험을 제시한다 [5]. 우리나라에서도 레지오넬라증이 증가추세에 있으며, 2016년 기준으로 신고건수는 128건으로 전년 대비 54.2%가 증가하였다고 보고된 바 있다 [6].

L. pneumophila의 생장을 위한 적정온도는 37oC이며, 50oC 이상에서는 생장이 억제되는 것으로 알려져 있다. 수계에 존재하는 이 세균의 생장은 수온을 55oC 이상으로 유지하여 조절할 수 있으나, 온도를 유지하기 위한 비용이 많이 들고 화상을 입을 염려가 있어서 이러한 문제를 해결하려는 시도가 있어왔다 [7]. 사우나 또는 욕조와 관련된 레지오넬라증에 대한 인식의 증가와 함께, 정기적인 청소와 소독은 꼭 필요하게 되었다. 고온가열 (superheating)과 염소소독 (chlorine disinfections)에 부가하여, 다양한 식물로부터 추출한 항균제 (antibacterial agents)가 최근에 L. pneumophila에 대한 항균 특성을 위해 평가되어왔으며, 온천과 대중목욕탕에 살균제로서 여러 가지 식물추출물의 적용이 제기되었다 [5,8,9].

EGCG (epigallocatechin gallate)는 EGC (epigallocatechin), ECG (epicatechin gallate), EC (epicatechin), GCG (gallocatechin gallate)와 함께 녹차에 함유된 주요 카테킨의 한 종류로서, 항산화효과, 노화방지, 항바이러스효과, 충치예방효과 등의 다양한 효과가 있는 것으로 알려져 있다 [10]. 또한 EGCG는 Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Aeromonas 종 등의 식중독관련 미생물과 Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum 등의 구강미생물을 포함하는 다양한 종류의 미생물들에 대하여 항균효과가 있는 것으로 보고되었다 [11-13]. 최근 화학항생제에 대한 건강상의 문제가 사회적 관심으로 지속적으로 제기되는 가운데, 식물유래 천연항균물질에 대한 장점들이 부각되어 오고 있다. 특히 EGCG는 우리나라에서 재배되는 녹차로부터 유래하는 물질로서, 이미 여러 가지 세균들에 대한 살균 능력이 발표되었다. 그러나 지금까지 EGCG에 대한 L. pneumophila의 살균 및 세포반응에 대한 연구는 거의 보고된 바가 없다.

본 연구에서는 일정기간 방치된 수도꼭지로부터 L. pneumophila를 분리하여, 다양한 농도의 EGCG에 노출시켰을 때 나타나는 생존률의 변화를 조사하였으며, 주사전자현미경을 통하여 외부형태 변화를 관찰하였다. EGCG의 농도와 노출시간에 따른 지질다당류 (LPS, lipopolysaccharide)와 스트레스 충격단백질인 DnaK와 GroEL의 발현 패턴을 각각 은 염색된 SDS-PAGE와 Western blot을 통하여 각각 조사하였다. 또한 이 세균에서 EGCG 노출에 의한 단백질 발현 변화를 이차원 젤 전기영동 (2-DE PAGE)와 MALDI-TOF를 활용하여 프로테옴 분석을 실시하였다.


2. MATERIALS AND METHOD
2.1. 균주분리 및 배양조건

일정기간 방치된 수도꼭지에서 농화배양기법을 사용하여 L. pneumophila를 분리하였다. 물 시료를 채취하여 20여 분간 정치시킨 후 100 μL를 L. pneumophila의 선택배지인 BCYE (buffered charcoal yeast extract) (BBL, Sparks, MD, USA) 고체평판배지에 도말하고 37oC에서 48시간 배양하였다. 여기에서 생장상태가 가장 양호한 집락을 선별하였으며, 3회에 걸쳐 순수배양의 계대를 통하여 세균을 분리하였다. 분리세균은 Luria-Bertani (LB) 액체 또는 고체배지에 접종한 후, 분당 160회로 회전하는 37oC 진탕배양기에서 배양 유지시키면서 본 실험에 사용하였다.

2.2. 16S rRNA 염기서열 분석에 의한 동정 및 계통수 분석

분리 균주의 계통수 (phylogenetic tree)를 작성하기 위하여 16S rRNA 유전자를 PCR (polymerase chain reaction)으로 증폭하였다. Genomic DNA는 컬럼 방식의 G-spin™ Genomic DNA Extraction Kit (Intron, Korea)을 사용하여 추출하고, universal primer인 27F primer (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3')와 1492R primer (5'- TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3')를 이용하였다. PCR은 genomic DNA를 주형으로 PCR premix (GenDEPOT, Korea)를 이용하여 수행되었으며, 수행조건은 변성 (denaturation) (94oC, 1분), 냉각 (annealing) (60oC, 1분), 신장 (elongation) (72oC, 1분) 단계를 33회 반복한 뒤, 72oC에서 15분간 유지하였다. PCR을 통하여 증폭된 DNA 단편을 전기영동한 후, agarose extraction kit (Intron, Korea)을 이용하여 gel 상에서 회수하고, 부분적인 염기서열을 결정하였다.

2.3. 균주에 대한 EGCG 처리와 생존율 조사

분리세균의 EGCG (TCI Co., Tokyo, Japan)에 대한 생존율을 알아보기 위하여 균주를 LB 액체 배지에 배양시켰다. LB 액체배지에서 자란 분리세균은 4oC에서 13,000 rpm으로 5분간 원심분리하여, 얻어진 균체를 10 mM phosphate-buffered saline (PBS) (pH 7.0)로 세척하고, 30 mL PBS (pH 7.0)에서 1.0×107 cells/mL 되도록 재현탁시켜 추후 실험에 사용될 균체를 준비하였다. 세균은 다양한 EGCG 농도에 노출시켰으며, 30분 간격으로 LB 고체 평판 배지에 100 μL씩 평판 도말하여 37oC에서 배양한 후 형성된 mL당 colony forming units (CFUs)을 계수하여 EGCG의 농도와 노출 시간에 따른 분리세균의 생존율을 각각 조사하였다. 명확한 세포변화를 관찰하는 일련의 실험을 위하여 생존율 조사에 근거한 선행 연구에서 얻어진 L. pneumophila에 대한 EGCG 처리는 노출농도 2,000 μg/mL와 노출시간 90분에서 수행하였다.

2.4. EGCG에 노출된 세균 세포의 주사전자현미경 관찰

EGCG에 노출된 분리세균의 세포 외부 형태 변화를 노출되지 않은 세포와 비교하기 위하여 주사전자현미경으로 관찰하였다. LB 고체평판에서 24시간 동안 자란 세균의 집락은 평판배지의 한천과 함께 0.5 cm3 크기의 블록형태로 잘랐다. 분리세균 세포를 포함하는 한천블록은 PBS로 37oC, 12시간 동안 2,000 μg/mL EGCG에 노출시켰다. 그 후 EGCG로 처리된 집락들은 고정, 탈수, 금으로 코팅 등의 이전에 기술된 방법에 따라, Hitachi S-2500C 주사전자현미경 (Hitachi, Japan)으로 세균의 외부 형태변화를 조사하였다 [14].

2.5. LPS 추출 및 확인

은 (silver) 염색을 한 SDS 전기영동은 EGCG의 다양한 노출시간 (0~150분)과 다양한 농도 (0~2,500 μg/mL)로 노출된 L. pneumophila의 LPS의 양적인 변화패턴을 조사하였다. 이 세균의 LPS는 hot-phenol-water 방법에 근거한 LPS extraction kit (Intron, Korea)를 이용하여 추출하였다 [15]. 추출한 LPS는 12% acrylamide gel (separating gel)과 4% acrylamide gel (stacking gel)을 사용하여 전기영동하였다. LPS는 20분 동안 40% 에탄올과 5% 아세트산이 포함된 0.7% periodic acid로 20분 동안 gel에서 산화시켰으며, 그 후, gel은 증류수로 5분간, 3회 세척하였다. Gel은 신선하게 제조된 은염색 용액 (1.3% ammonium hydroxide, 18.6% 0.1 N NaOH, 0.67% silver nitrate)으로 10분간 염색하였다. Gel은 증류수로 1회 5분간, 총 3회 세척하였고, 현상 용액 (0.005% citric acid, 0.05% formaldehyde)에서 현상하였으며, 그 후 증류수로 3회 세척하고 정지 용액인 10% 아세트산으로 1분간 처리하여 중지시켜 증감여부를 확인하였다 [16].

2.6. 단백질 획득 및 정량

L. pneumophila 세포는 EGCG에 노출시킨 후, 4oC로 유지하면서 4,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 얻어진 균체를 10 mM PBS (pH 7.0)로 3회 세척하였다. 그 후 PRO-PREPTM protein extraction solution (Intron, Korea)에 세균을 현탁하여, -20oC에서 반응시켜 단백질을 추출하였다. 추출된 단백질은 Bradford의 방법 [17]을 이용하여 단백질 정량을 실시하였다.

2.7. SDS-PAGE와 Western blot 분석

SDS-PAGE 분석은 Bollag 등 [18]의 방법에 의해 실시되었다. Separating gel은 12% acrylamide gel을 사용하였으며, stacking gel은 4% acrylamide gel을 사용하였다. 전기영동을 한 후, gel은 Coomassie brilliant blue staining solution으로 2시간 염색하였고, destaining solution I (50% methanol, 10% acetic acid, 40% 증류수)과 destaining solution II (5% methanol, 7% acetic acid, 88% 증류수)로 탈색하였다. 스트레스 충격단백질인 DnaK와 GroEL을 증감여부를 분석하기 위하여 Sambrook 등 [19]의 방법에 따라 Western blot을 실시하였다. 1차 항체는 anti-DnaK (Abcam, Cambridge, UK)와 anti-GroEL (Abcam, Cambridge, UK)을 사용하였으며, 2차 항체는 goat anti-mouse IgG H&L (HRP) (Abcam, Cambridge, UK)를 사용하였다. DnaK와 GroEL은 ECL kit (Intron, Korea)를 사용하여 X-선필름 (AGFA, Belgium)에 현상하였으며, ImageJ 프로그램 (LOCI, University of Wisconsin, USA)을 사용하여 정량하였다.

2.8. 이차원 젤 전기영동 (2-DE)과 in-gel digestion

2-DE는 이전에 기술된 방법에 따라 실시되었다 [14]. 이미지 획득은 Image scanner (Amersham Pharmacia Biotech, UK)에서 수행되었으며, 이들 이미지는 Phoretix 2-DE Evolution software (Nonlinear Dynamics, Newcastle upon Tyne, UK)에 의해 정량적으로 분석되었다. 대조군과 실험군의 단백질 스팟들은 이미지 분석을 통해 표준화 및 정량화하여 증감을 비교하였다. 염색된 protein spot은 젤에서 잘라내어, 30 mM potassium ferricyanide와 100 mM sodium thiosulfate를 사용하여 탈염색하고, 증류수로 세척하였다. 잔존하는 액체를 제거시키고, 그 gel은 50% acetonitrile과 100% acetonitrile으로 각각 15분간 수축시킨 후, 200 μl의 100 mM NH4HCO3 (pH 7.8)로 재수화(rehydration)하였으며, 마지막으로 100% acetonitrile로 다시 수축시켰다. 진공원심분리기로 건조시킨 후, gel은 50 mM NH4HCO3 (pH 7.8)를 포함하는 digestion buffer에서 재팽창시켜, 0.2 μg trypsin (Promega, USA)로 37oC에서 16시간 동안 처리하였다. 그 peptides는 elution buffer [50% acetonitrile, 5% trifluoroacetic acid (TFA)]로 용해시키고, 얻어진 peptide extract는 수거하여 진공 원심분리기로 동결건조한 후 -20oC에 저장하였다.

2.9. MALDI-TOF/MS에 의한 peptide sequencing

Digested peptides는 0.1% TFA 용액을 사용하여 다시 녹여, zip-tip C18 pipette tips (Millipore, MA, USA)를 사용하여 탈염하였다. Peptides는 CHCA matrix solution (10 mg/mL CHCA in 0.5% TFA/50% ACN, 1:1)을 사용하여 MALDI plate로 추출하였다. Mass spectra는 4700 Proteomics Analyzer (Applied Biosystems, CA, USA)를 사용하여 얻었다. 그 후, 단백질은 NCBI 데이터베이스에 대한 MASCOT (http://www.matrixscience.com)를 사용한 MALDI fingerprint data로부터 동정되었다 [20].


3. RESUTLS AND DISCUSSION
3.1. 균주의 분리 및 배양

본 연구에 사용된 균주는 대학연구실의 급수관에서 농화배양기법을 이용하여 분리하였으며, 3회에 걸친 BCYE 고체배지 상에서 도말평판법으로 분리한 균주로서, 생육이 우수한 균주 JK-3을 선별하였다. BCYE 배지에서 자란 이 균주의 집락은 매끄럽고 볼록한 면을 나타내었으며, 이 세균을 도말한 후 그람염색을 하여 위상차 현미경으로 관찰하였을 때 음성으로 나타났다. 이 세균은 LB 액체배지에 접종하여 진탕배양기 (37oC, 160 rpm)에서 배양조건을 유지하면서 본 실험에 이용하였다.

3.2. 16S rRNA 염기서열에 의한 동정 및 계통수 분석

분리세균 JK-3은 동정 및 계통수 (phylogenetic tree)를 작성하기 위하여 16S rRNA 염기서열 분석 (16S rRNA sequencing)을 실시하였다. JK-3으로부터 16S rRNA 유전자를 universal bacterial primer set을 사용하여 PCR을 통하여 증폭하고, 부분적인 염기서열을 결정하였다. 결정된 1472 bp의 염기서열은 NCBI의 Nucleotide BLAST 분석프로그램에서 Legionella 속의 데이터베이스를 기반으로 한 계통유전학적 분석을 실시하였으며, 그 결과 이 균주는 L. pneumophila로 동정되었으며, L. pneumophila JK-3으로 명명하였다. 또한 염기서열 데이터베이스로 상동성을 비교한 결과, 이 세균은 L. pneumophila와 99%의 유전적 상동성을 보여주었다. 이를 바탕으로 L. pneumophila JK-3과 L. pneumophila 종에 속하는 다른 세균들과의 유사성은 Fig. 1에 분자유전학적 계통수로 나타내었다.


Fig. 1. 
Phylogenetic trees of the strain, L. pneumophila JK-3 (●) based on 16S rRNA gene sequences. The trees were constructed by the neighbor-joining method. Number at nodes are bootstrap percentage based on 1000 resampled data sets. GenBank accession numbers are given in parentheses. Bar, 0.0050 changes per nucleotide.

3.3. EGCG 노출에 따른 JK-3의 생존율 조사

EGCG의 농도증가에 따른 L. pneumophila의 노출은 EGCG가 살균력을 가지고 있다는 것을 보여주었다. L. pneumophila의 CFUs는 EGCG의 노출시간이 경과함에 따라 점차적으로 감소하였으며, 그 감소비율은 사용된 EGCG의 농도에 비례하였다 (Fig. 2). 약 1.0×107 CFU/mL의 접종으로 시작하여, 본 연구에서 사용된 EGCG의 농도 범위 (500~2,500 μg/mL)에서 2,000 μg/mL의 농도에서 180분간 노출 또는 2,500 μg/mL EGCG에서 150분간 노출 후 L. pneumophila의 집락은 완전히 제거되어, 이 농도에서 살균력이 가장 우수한 것으로 나타났다. L. pneumophila가 염소, 열, 오존, 자외선 등에 노출되었을 때 노출시간과 농도에 따라 살균력이 영향을 미친다는 것이 보고되었다 [7]. 자몽씨앗 추출물, 계피 오일, 키토산 용액 등의 천연물질 추출물에서 L. pneumophila의 살균력이 보고된 바 있으며 [5,21,22], 본 연구에서 사용된 EGCG도 L. pneumophila에 대하여 살균력이 우수한 것으로 나타났다.


Fig. 2. 
Survival of L. pneumophila after EGCG shock. The cells were maintained at EGCG concentrations of 0 μg/mL (○), 500 μg/mL (●), 1,000 μg/mL (◆), 1,500 μg/mL (▲), 2,000 μg/mL (■), and 2,500 μg/mL (◇), respectively. At intervals, the numbers of colony-forming units per mL (CFU/mL) of culture were determined.

3.4. EGCG 노출에 따른 세포 외부형태 변화

생존율 실험과 관련하여, EGCG 노출에 따른 L. pneumophila JK-3 세포의 외부형태 변화를 주사전자현미경을 사용하여 관찰하였다. 사진에서 보여주는 바와 같이, EGCG에 노출되지 않은 상태에서 자란 세포들은 전형적으로 매끈한 막대형을 보여주었다 (Fig. 3a). 그러나 2,000 μg/mL EGCG에서 90분 동안 처리된 세포들은 세포 표면에 구멍이 생기거나 움푹패이고, 표면이 쭈그러지는 것이 관찰되었다 (Fig. 3b). 구강에 존재하는 S. mutans, Streptococcus salivarius, S. aureus, Neisseria meningitidis, L. plantarum 등의 다양한 세균들이 녹차폴리페놀 (green tea polyphenol)에 노출되었을 때, 주사전자현미경 관찰에서 처리된 모든 세균들이 제각기 다른 양상으로 세포가 파괴되는 것이 보고된 바 있다 [23]. 몇 가지 연구에서 다양한 화학물질과 천연허브추출물이 세포 표면의 변형이나 파괴에 의하여 세포가 죽게 된다는 것을 보여준 바 있다 [24-26].


Fig. 3. 
Scanning electron micrographs of L. pneumophila treated with EGCG. (a) untreated cells; (b) cells treated with 2,000 μg/mL EGCG for 90 min.

3.5. LPS의 silver stained SDS-PAGE

다양한 노출 농도 및 다양한 노출 시간동안 EGCG로 처리된 L. pneumophila JK-3의 LPS 양적 변화는 SDS-PAGE와 silver staining을 통하여 관찰되었다. JK-3에서 LPS의 함량은 EGCG의 농도가 증가함에 따라 약 35-kDa과 45-kDa 사이의 여러 개의 밴드들이 선명해지고 짙어지는 것으로 나타났다. 특히 약 32-kDa의 밴드는 EGCG의 노출농도가 증가함에 따라 짙고 선명하였던 밴드가 서서히 흐려지는 것이 관찰되었다 (Fig. 4a). 2,000 μg/mL ECGC에서 다양한 노출시간 (0~150분)에 따른 JK-3에서의 LPS 함량 변화를 관찰하였다. 특히 EGCG에 미노출된 경우에 약 35-kDa 크기의 밴드는 처리한 후 30분부터 선명하게 나타나기 시작하였으며, 120분이 경과하면서부터 이 밴드는 서서히 감소하는 것으로 관찰되었다 (Fig. 4b). LPS는 그람음성 세균의 외막을 구성하는 성분으로 lipid A, core oligosaccharide, O-antigen (또는 O-specific polysaccharide)의 세 도메인으로 이루어져 있으며, 몇몇 그람음성 병원성 세균의 병원성에 관여하는 주요 요인으로 알려져 있다 [27]. Yan 등 [28]은 기회성 병원균인 Cronobacter의 여러가지 혈청형으로부터 LPS를 분리하여 O-antigen과 lipid A의 밴드 크기와 패턴의 차이를 관찰하였다. 본 연구에서도 JK-3 균주에 대하여 LPS를 분리하여 실시하였으며, 그 결과 Cronobacter에서와 동일한 분자량 범위에서 O-antigen과 lipid A가 확인되었다. Ikigai 등 [29]은 녹차추출물이 EGCG를 포함하는 카테킨으로 포함되어 있으며 E. coliS. aureus 세포에서 이중막 (bilayer)에 손상을 초래한다는 것을 보고하였다. 장미 추출물을 E. coli에 노출시켰을 때 LPS의 생합성이 감소되어 생존에 커다란 영향을 미치는 것으로 보고된 바 있다 [30]. 이들 보고를 바탕으로 EGCG의 농도 증가와 노출시간의 증가는 L. pneumophila 세포에서 LPS를 감소시켜 궁극적으로 상당한 항균 효과를 나타내는 것으로 사료된다.


Fig. 4. 
Silver-stained SDS-PAGE gel profiles of LPS extracted from untreated L. pneumoplila JK-3 cells, (a) cells treated with different concentrations of EGCG for 90 min, and (b) cells treated with 2,000 μg/mL of EGCG at different exposure times.

3.6. SDS-PAGE와 Western blot

L. pneumophila 세포를 다양한 농도의 EGCG (500~2,500 μg/mL)에 노출시킨 후에 경과시간에 따른 세포 내에서 발현되는 스트레스 충격단백질의 발현을 조사하였다. EGCG 농도가 증가함에 따라 JK-3에서 발현되는 DnaK와 GroEL의 양은 점차로 증가하는 것을 보여주었으며, 그 발현량은 대조군과 비교하여 2,500 μg/mL EGCG에서 각각 약 1.8배와 1.4배 정도 증가하였다 (Fig. 5). 또한 EGCG의 정해진 농도에서 노출시간 변화에 따른 스트레스 충격단백질의 발현정도를 비교하였다. L. pneumophila 세포가 2,000 μg/mL EGCG에 노출되었을 때, DnaK와 GroEL 모두에서 90분에서 최대 발현을 보여주었으며, 대조군과 비교하여 1.4배와 1.2배 정도 증가하는 것으로 나타났다 (Fig. 6). 주어진 노출시간에서 EGCG 농도가 증가함에 따라 L. pneumophila 세포에서 유도되는 스트레스 충격단백질 DnaK와 GroEL의 발현량도 증가하였으며, 주어진 EGCG 농도에서 노출시간이 경과함에 따라 충격단백질 DnaK와 GroEL의 발현량은 노출 후 90분을 정점으로 감소하기 시작하였다. 이 상태의 세포를 주사전자현미경으로 관찰하였을 때 형태의 변형과 손상이 이루어져 죽게되는 것이 관찰되었다. EGCG에 노출된 여러 가지 세균 (예, Klebsiella pneumoniae, B. cereus, Aeromonas sp.)에서 스트레스 단백질인 DnaK와 GroEL이 발현되는 것이 보고되었다 [11,12,26]. 본 연구에서 EGCG 노출에 대한 L. pneumophila의 DnaK와 GroEL의 발현이 처음으로 확인되었다.


Fig. 5. 
Induction of stress shock protein (SSPs) in L. pneumophila JK-3 treated with different EGCG concentrations for 90 min; 0 μg/mL (lane 1), 500 μg/mL (lane 2), 1,000 μg/mL (lane 3), 1,500 μg/mL (lane 4), 2,000 μg/mL (lane 5), 2,500 μg/mL (lane 6). The SSPs were analyzed by SDS-PAGE (a), and western blot with anti-DnaK (b), and anti-GroEL (c) monoclonal antibodies, respectively. The initial colony-forming units per mL (CFU/mL) were approximately 1.0×107, and sample with equal amounts of protein (40 μg) were subjected to western blotting.


Fig. 6. 
Induction of stress shock proteins (SSPs) in L. pneumophila JK-3 treated with 2,000 μg/mL EGCG for different exposure times (h). The SSPs were analyzed by SDS-PAGE (a), and western blot with anti-DnaK (b), and anti-GroEL (c) monoclonal antibodies, respectively. The initial colony-forming units per mL (CFU/mL) were approximately 1.0×107, and sample with equal amounts of protein (40 μg) were subjected to western blotting.

3.7. EGCG 노출에 따른 프로테옴의 변화

2-DE protein profiles 변화분석은 L. pneumophila에서 세포 단백질이 EGCG에 노출된 후에 증가 또는 감소여부를 조사하기 위하여, EGCG 미처리 세균세포와 2,000 μg/mL EGCG로 90분간 처리된 세포를 사용하여 실시되었다 (Fig. 7). 대략 150 protein spots가 isoelectric focusing (pH 4~7)의 2-DE gel과 12% polyacrylamide SDS gel 상에서 검출되었다. 25 protein spots 이상이 EGCG로 처리된 세균의 2-DE 상에서 발현되었으며, 이들 protein spots 가운데 EGCG 처리에 의해 유도되어 크기가 변화된 19개를 동정하기 위하여 선발하였다. MALDI-TOF를 사용한 peptide mass fingerprinting은 2-DE에서 변화된 발현을 보여준 단백질을 동정하기 위하여 실시되었으며, 그 분석으로부터 얻어진 결과는 Table 1에 열거되었다. 2,000 μg/mL EGCG에서 90분간 처리된 L. pneumophila JK-3 세포에서 chaperone protein HSPs, 세포막의 구성과 기능에 관련된 단백질, cell lysis factor, 일부 에너지 대사에 관여하는 단백질들이 증가하였으며, DNA/RNA 대사와 일부 에너지대사에 관여하는 단백질이 감소되는 것으로 확인되었다. 특히 흥미있는 사실은 LPS transport peripheral protein (LptA), LPS export system protein LptA precursor, LPS core heptosyltransferase (RfaQ), ADP-heptose-LPS heptosyltransferase, LPS biosynthesis glycosyltransferase 등의 여러 가지 LPS-관련 단백질들의 발현 증가이다. LPS는 그람음성세균의 외막의 중요한 구성요소로서, 내독소로 알려져 있으며, 약물저항성, 병인 (pathogenesis) 등의 불리한 환경으로부터 세균을 보호하는데 필수적인 역할을 한다 [31]. Sciuto 등 [32]Pseudomonas aeruginosa에서 LPS 수송 단백질(Lpt proteins)의 한 종류인 LptA가 세포질에서 합성된 LPS를 세포 외피 (cell envelope)로 운반한다는 결과를 보고하였다. 또한 Parker 등 [33]E. coli K-12의 rfa locus에 위치하여 RfaC와 RfaF와 상동성을 공유하는 RfaQ가 LPS 코어 (core)의 heptose 영역 합성 및 변형에 관여한다고 보고하였다. 본 연구에서 확인된 EGCG 노출에 의한 L. pneumophila에서 LptA와 관련 단백질들, 그리고 RfaQ의 발현증가는 LPS의 수송과 생합성 기작에 영향을 미치는 것으로 사료된다. EGCG의 세균에 대한 살균작용에 관한 기작은 아직까지 명확하게 알려지지는 않았으나, (i) EGCG를 포함하는 녹차추출물의 카테킨 성분이 세포막의 지질 이중층에 손상을 주어 세균의 살균에 영향을 준다는 보고 [29]와 (ii) EGCG가 직접 펩티도글리칸에 결합하여 세포벽에 손상시키고 세포벽의 생합성을 저해한다는 보고가 있다 [34]. 이러한 보고들을 바탕으로, 본 연구의 결과와 비교하여 볼 때, L. pneumophila에서 EGCG 노출은 LPS의 양적 변화와 MALDI-TOF의 결과는 세포막에 존재하는 LPS의 구조, 기능, 또는 생합성과 관련된 단백질에 영향을 주어 궁극적으로 살균에 관여하는 것으로 사료된다.


Fig. 7. 
Two-dimensional gel electrophoresis pattern of EGCG-induced proteins of L. pneumophila JK-3 (a) control cells, and (b) cells treated with 2,000 μg/mL EGCG for 90 min. The numbers associated with MALDI-TOF identified spots are listed in Table 1.

Table 1. 
Identification of induced proteins in L. pneumophila by MALDI-TOF fingerprinting
Spot No. Identified protein Accession Sequence coverage (%) Fold change
Chaperone
1 Chaperone protein, DnaK GAN27316.1 52 +1.39 / ↑
2 Chaperone protein, GroEL ANH18047 56 +1.21 / ↑
Cell envelope
3 Lipopolysaccharide transport periplasmic protein, LptA ANN91896.1 82 +6.33 / ↑
4 Lipopolysaccharide export system protein LptA precursor GAN25969.1 78 +1.45 / ↑
5 Lipopolysaccharide core heptosyltransferase RfaQ GAN28022 51 +2.22 / ↑
6 ADP-heptose – LPS heptosyltransferase ANN96721 54 +1.10 / ↑
7 Lipopolysaccharide biosynthesis glycosyltransferase AEW51106 78 +2.17 / ↑
8 Outer membrane protein ADG26344 65 +1.27 / ↑
Cell lysis factor
9 Lytic transglycosylase ANN95209.1 69 +1.20 / ↑
Energy metabolism, pathway factors
10 Aminopeptidase KZX34037.1 38 +1.06 / ↑
11 Adenine deaminase GAN25707 49 +1.59 / ↑
12 Phosphomethylpyrimidine kinase. partial WP_062789922 42 +2.09 / ↑
13 Peptide synthetase, TycC WP_062725606 38 -1.10 / ↓
14 Deoxyguanosinetriphosphate triphosphohydrolase GAN27153 71 -1.11 / ↓
15 Phosphotransferase ANN94522 46 -1.39 / ↓
16 Enoyl-CoA hydratase AEW51799.1 55 -1.10 / ↓
DNA, RNA metabolism
17 Chromosomal replication initiation protein, DnaA ANN94177 48 -1.24 / ↓
18 Conjugative transfer relaxase/helicase TraI WP_061828205.1 98 -1.08 / ↓
19 Threonine – tRNA ligase GAN31116.1 70 -1.07 / ↓
↑, up-regulation by EGCG; ↓, down-regulation by EGCG

녹차로부터 유래하는 EGCG는 일정한 농도 이상에서 다양한 종류의 병원성 세균에 대하여 시험관 (in vitro) 또는 생체 내 (in vivo)에서 강력한 항균효과를 가지는 것이 명백하다. 오늘날 사우나, 욕조, 냉방기 등의 급수관, 배수관, 고여 있는 물에서 L. pneumonia의 출현은 건강상에 커다란 문제를 초래할 수 있다. 이를 해결하기 위한 화학소독제의 오남용의 문제점은 국민의 건강에 매우 심각할 수 있다는 것이 입증되었다. 이러한 문제점의 대안으로서 천연허브로부터 인체에 무해하고 항균력을 가지는 성분을 추출하여 새로운 약제로 개발하고자 하는 연구가 많은 관심의 대상이 되고 있다. 그 일환으로 녹차 성분인 EGCG를 이용한 본 연구는 매우 유용할 것으로 사료된다. 향후의 연구는 녹차추출물을 구성성분이 가지는 항균활성에 대한 연구를 통하여 단일 천연 phytochemical의 항균활성을 비교평가하고, 그 기작을 밝히는 방향으로 추진되어야 할 것이다.


4. CONCLUSION

본 연구는 일정기간 방치된 수도꼭지에서 분리한 L. pneumophila JK-3의 EGCG 노출에 따른 항균활성과 프로테옴 반응을 알아보기 위하여 수행되었다. 먼저 분리균주는 16S rRNA 염기서열분석을 통하여 균주를 동정하였고, 그 결과 L. pneumophila JK-3로 명명하였으며, 유전학적 계통수를 작성하였다. EGCG는 L. pneumophila JK-3에 대하여 노출농도에 따른 항균효과를 보여주었으며, 2,000 μg/mL EGCG에서 JK-3 균주는 3시간 이내에 완전히 저해되었다. 적정 농도 이상의 EGCG에 노출된 JK-3 세포들은 세포 표면에 구멍이 생기거나 표면이 쭈그러지는 등의 세포의 외부 형태변화가 일어나는 것이 주사전자현미경에 의해서 확인되었다. 은 염색한 SDS-PAGE에서 L. pneumonia JK-3의 LPS 함량은 EGCG 노출농도와 노출 시간에 따라 증가되거나 감소는 것으로 나타났다. 스트레스 충격단백질 (SSPs) (예, 70-kDa DnaK, 60-kDa GroEL)은 EGCG의 노출농도가 증가함에 따라 증가하였으나, 노출시간이 경과하면서 초기에는 증가하였으나 점차 감소하였다. EGCG 노출에 의해 유도되는 단백질을 확인하기 위하여 L. pneumophila JK-3 배양의 수용성 단백질 분획을 2-DE로 전개시켰다. 특히 EGCG에 노출시킨 후 19개의 단백질 스팟이 증가하거나 감소하였다. MALDI-TOF mass spectroscopy를 사용하여, 12개의 단백질 chaperones (예, DnaK, GroEL), cell envelope proteins (예, LptA, RfaQ), cell lysis protein이 증가하였고, 일부 에너지 대사 (TycC), DNA/RNA 대사 (예, DnaA, TraI)에 관여하는 단백질을 포함하여 7개의 단백질이 감소하는 것으로 확인되었다. 결론적으로 EGCG 노출에 따른 살균효과에 영향을 미치는 세포독성 기작을 이해하는데 중요한 단서를 제공하고, 식물화학 항균제 (phytochemical antibacterial)로 사용될 수 있다는 것을 제시한다.


Acknowledgments

이 논문은 2018학년도 순천향대학교 교수 연구년제에 의하여 연구하였으며, 순천향대학교 학술연구비의 일부지원으로 수행되었음.


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