The Korean Society For Biotechnology And Bioengineering

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Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 34 , No. 1

[ Research Paper ]
Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 34, No. 1, pp.25-30
Abbreviation: KSBB J
ISSN: 1225-7117 (Print) 2288-8268 (Online)
Print publication date 31 Mar 2019
Received 12 Dec 2018 Revised 12 Jan 2019 Accepted 14 Jan 2019
DOI: https://doi.org/10.7841/ksbbj.2019.34.1.25

에리스리톨을 생산하는 새로운 효모의 분리
예수지 ; 박희영 ; 곽유리 ; 정덕열 ; 김수린*
경북대학교 식품공학부

Isolation of a New Yeast Strain Producing Erythritol
Suji Ye ; Heeyoung Park ; Yuri Kwak ; Deokyeol Jeong ; Soo Rin Kim*
School of Food Science and Biotechnology, Kyungpook National University, Daegu, Korea, Tel: +82-53-950-7769, Fax: +82-53-950-7762 (soorinkim@knu.ac.kr)
Correspondence to : *School of Food Science and Biotechnology, Kyungpook National University, Daegu, Korea Tel: +82-53-950-7769, Fax: +82-53-950-7762 E-mail: soorinkim@knu.ac.kr


© 2019 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering
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Abstract

Erythritol, a four-carbon polyol, is recently noted as promising sugar alternatives. Several yeast strains such as Candida magnoliae, Yarrowia lipolytica, and Pseudozyma tsukubaensis have been known as erythritol producers. We recently isolated a yeast strain from domestic fruit samples, and noticed that this strain can also produce erythritol. Thus, the aim of this study is to optimize fermentation conditions of the isolated yeast to maximize erythritol production. Specifically, fermentations were conducted under different temperatures, aeration conditions, glucose concentrations and with different types of reducing agents. Next, we tried to scale-up the erythritol production using a bioreactor. In comparison to other known erythritol-producing strains as control, the newly isolated yeast strain showed the greatest potential to be used as an industrial erythritol producer.


Keywords: erythritol, sugar alcohol, sugar alternative, Candida spp., fermentation, scale-up

1. INTRODUCTION

최근 우리나라 뿐만아니라 세계적으로 지속적인 당류의 섭취로 인한 만성비만 및 당뇨병 등의 건강문제를 인식하고 저당류 제품을 선호하는 사람들이 늘어나고 있다. 이에 발맞춰 식품산업도 저당에 대한 관심이 높아지고 있으며 저당 트렌드를 식품에 적용하고자 하는 움직임 또한 활발하게 일어나고 있다 [1]. 그 중에서도 대체 당으로 주목 받고 있는 당 알코올은 청량감을 비롯하여 설탕에 60~80% 해당하는 단맛을 가지고 있으나 설탕에 비해 칼로리가 낮다는 장점을 가지고 있다 [2]. 일반적으로 당 알코올은 polyol 구조를 가지고 있으며 자연계에서는 멜론, 포도 등의 과일이나 채소 등에 존재한다 [1,3]. 당 알코올에는 자일리톨, 만니톨, 소르비톨, 에리스리톨 등이 있으며 [4], 그 중에서도 에리스리톨은 4개의 탄소로 이루어진 당 알코올로 거의 0 칼로리에 가까운 저칼로리 물질이며 구강세균인 Streptococcus mutansStreptococcus sobrinus가 이용하지 못하기 때문에 충치예방에도 효과가 있다고 알려져 있다 [5]. 또한 에리스리톨은 활성산소를 제거하는 능력이 뛰어나 항산화 역할도 한다고 보고된 바 있다 [6]. 현재는 대부분이 촉매에 의한 탄수화물 수소화 반응을 통하여 만들어지지만 생산효율성이 떨어져 미생물을 이용한 당 알코올 생산에 대한 중요성이 커지고 있다 [3,4].

에리스리톨을 생산할 수 있는 균주로 가장 많이 연구된 균주는 Candida magnolia [7,8]Yarrowia lipolytica [8,9]이며 효율성이 높아 산업적으로 이용되는 대표적인 균주는 Aureobasidium sp.와 Pseudozyma tsukubaensis이다 [10]. 이번 실험에서 이용한 균주인 Candida sorbosivorans 또한 에리스리톨을 생산할 수 있는 균주로 알려져 있으나 [5,11], 그에 대한 연구가 비교적 미미하다. 따라서 이 연구의 목적은 에리스리톨 생산 균주로 알려진 C. sorbosivorans의 에리스리톨 발효 특성 기초연구 및 최적조건을 탐색하여 에리스리톨의 산업적인 생산에 기저가 되는 연구를 하고자 한다.


2. MATERIALS AND METHODS
2.1. 균주 및 배지

본 연구에서 사용한 JM409 균주는 이전 연구와 동일한 방법 [12]으로 국내 복숭아시료에서 새롭게 분리 및 동정하였다. 분리한 효모를 10 mL YPD 배지 (10 g/L Yeast extract, 20 g/L Bacto peptone, 20 g/L Glucose)에서 30oC, 250 rpm조건으로 24시간 동안 1차 배양 (BF-30SI, BioFree, Bucheon, Korea)하였다. 배양된 균주를 원심분리 (1248R, LaboGene, Daejeon, Korea)를 통해 상등액을 제거하고 균주만 분리하여 OD600= 1.0 (OD600 1.0 = 3.5×107 cells/mL)으로 맞추어 접종하였다. 각각의 실험은 100-mL Erlenmeyer flask를 이용하여 20 mL YPD 배지에서 limited aerobic 조건 (80 rpm)으로 발효하였다. 에리스리톨 생산을 위한 최적의 발효 조건을 확립하기 위해 YPD 배지의 glucose 농도를 100 g/L, 200 g/L로, 온도는 30oC, 37oC, 산소 조건은 shaking incubator (Ist-3075, Jeiotech, Daegu, Korea)에서 80 rpm, 200 rpm, 250 rpm으로 나누어 실험하였다. 균주별 에리스리톨의 생산을 비교하기 위해 에리스리톨 생산 균주로 보고된 C. magnolia (ATCC 56463), P. tsukubaensis (ATCC 24555)와 함께 C. sorbosivorans type strain (CBS 8768)를 생물자원센터 (KCTC; Korean collection for type cultures)에서 구입하여 사용하였다.

2.2. 금속이온 종류에 따른 에리스리톨 생산

금속이온 종류에 따른 에리스리톨 생산량을 비교하기 위한 실험으로 총 다섯 가지 금속이온을 사용하여 실험하였다. Fe2+, Mg2+, Mn2+, Cu2+, Ca2+를 공급하기 위해 각각 0.35 g/L의 Fe2SO4·7H2O, MgSO4·7H2O, MnSO4·H2O, CuSO4·5H2O, CaCl2·2H2O (Duksan, Ansani, Korea)를 20 mL YPD (100 g/L) 배지에 첨가하여 250 rpm, 30oC 조건에서 발효하였다.

2.3. Scale-up 발효

에리스리톨의 scale-up 발효는 5-L bioreactor (GM-1004K-09, hanil, Liflus GM 2ch, Daegeon, Korea)에서 2 L YPD (100 g/L glucose) 배지, 30oC, 250 rpm, pH 5.0에서 fed-batch 방식으로 진행하여 기질의 농도를 일정 수준으로 유지하였다. 초기 OD600은 1.0으로 맞추어서 접종하였고 실리콘소포제 (LS-300, Dowcorning, Michigan, USA)를 antifoam으로 사용하였다.

2.4. HPLC 분석

용액 내 에리스리톨 및 glucose와 fructose의 농도는 10배 또는 100배 희석하여 13000 rpm에서 10분간 원심분리 후 상등액만을 취해 RI detector를 이용한 고 성능 액체 크로마토그래피 (HPLC, Agilent Technologies, 1260 Series, USA)로 분석하였다. Column은 Rezex ROA-Organic Acid H+ (8%) (Phenomenex Inc., Torrance, CA)을 사용하였고, 이동상은 0.005 N H2SO4을 이용하여 50oC에서 0.6 mL/min 속도로 용출시켰다. 에리스리톨 및 glucose, fructose의 retention time은 각각 6.392, 5.009, 5.374 min이다.


3. RESULTS AND DISCUSSION
3.1. 기존 에리스리톨 생산 균주와의 비교

에리스리톨 생산 균주로 보고된 C. magnoliae, P. tsukubaensis와 함께 C. sorbosivorans type strain을 포함하여 복숭아 시료에서 새로 분리한 C. sorbosivorans JM409 균주의 에리스리톨 생산을 비교하였다. 발효조건은 20 mL YPD (100 g/L glucose) 배지, 30oC, 250 rpm이며 48시간 동안 발효하여 에리스리톨 생산량을 확인하였다. C. sorbosivorans JM409가 4.32 g/L로 가장 많이 생산하는 모습을 보였고 다음으로 P. tsukubaensis는 2.28 g/L, C. sorbosivorans type strain은 0.77 g/L 순으로 에리스리톨을 생산하였다. C. magnoliae는 에리스리톨을 생산하지 못하였다 (Fig. 1).


Fig. 1. 
Comparison of strains known as erythritol-producer. Fermentation is conducted under YPD (100 g/L glucose) medium, 250 rpm. Candida sorbosivorans JM409 most product erythritol in this condition. Error bars indicate standard deviations of two biological replicates.

3.2. 발효조건에 따른 에리스리톨 생산

복숭아에서 분리한 새로운 효모균주인 C. sorbosivorans JM 409의 발효특성을 알아보기 위해 탄소원, 온도, 당 농도 및 산소조건 등을 변화시키면서 에리스리톨 생산량을 비교하였다. 각 실험에서의 control은 C. sorbosivorans type strain으로 하였다.

첫 번째로 fructose를 선호하는 Candida 속의 균주가 있다는 연구를 참고하여 [13], carbon source로 fructose와 glucose를 비교하였다. 실험은 YPF (200 g/L fructose), 200 rpm, 30oC 조건에서 진행하였고 그 결과 C. sorbosivorans type strain과 JM409 균주 모두 fructose를 기질로 하였을 때는 에리스리톨을 생산하지 못하였다 (Fig. 2).


Fig. 2. 
Candida sorbosivorans type strain (A) and JM409 (B) do not produce erythritol using fructose as carbonsource. Error bars indicate standard deviation of two biological replicates.

다음으로 배양 온도조건을 30oC와 37oC로 다르게 하여 YPD (200 g/L glucose) 배지, 200 rpm에서 실험한 결과, 37oC에서는 생장을 거의 하지 못할 뿐만 아니라 에리스리톨 또한 거의 생산하지 못하였다 (Fig. 3).


Fig. 3. 
Fermentation data of two strains under different temperature, 30oC (a) and 37oC (b) respectively. Filled shape indicates fermentation of Candida sorbosivorans type strain and open shape is C. sorbosivorans JM409 strain. Glucose concentration (■, □), erythritol concentration (▲, △) and cell density (●, ○). Erythritol can be produced at 30oC, whereas at 37oC, both strains produce almost no erythritol. 37oC is not suitable for growth as compared to 30oC. This fermentation is conducted under YPD (200 g/L glucose) medium, 200 rpm condition. Error bars indicate standard deviations of two biological replicates.

세 번째로는 산소 조건과 당 농도에 따른 에리스리톨 생산량을 비교해 보았다 (Table 1). 발효결과 YPD (100 g/L glucose) 배지에서 80 rpm으로 실험하였을 때 C. sorbosivorans type strain은 48시간 동안 1.8 g/L의 에리스리톨을 생산하였고 (Fig. 4(a)). C. sorbosivorans JM409균주는 3.1 g/L를 생산하였다 (Fig. 4(b)). 동일한 농도의 배지로 250rpm 조건에서 실험하였을 때는 C. sorbosivorans type strain은 2.5 g/L (Fig. 4(a)), C. sorbosivorans JM409는 6.8 g/L를 생산하여 80 rpm보다 약 1.7배 정도 많이 생산하였다 (Fig. 4(b)). 배지의 당 농도를 다르게 하여 YPD (200 g/L glucose) 배지로 80 rpm, 250 rpm 각각 발효했을 때 80 rpm에서 48시간 동안 type strain은 2.6 g/L (Fig. 4(c)), C. sorbosivorans JM409 균주는 3.2 g/L의 에리스리톨을 생산하였다 (Fig. 4(d)). 반면, 극호기적 조건 (250 rpm)에서 type strain은 4.0 g/L (Fig. 4(c)), C. sorbosivorans JM409 균주는 7.4 g/L (Fig. 4(d))를 생산하였다. 두 균주 모두 당 농도에 따른 차이는 거의 없었으며 YPD (200 g/L glucose) 배지에서 glucose를 모두 발효하는데 rpm에 상관없이 96시간 이상 소모되었다. 또한, 두 균주 모두 80 rpm보다 호기적인 조건인 250 rpm에서 에리스리톨을 더 많이 생산하는 것을 확인할 수 있었으며, 특히 C. sorbosivorans JM409균주는 type strain와 비교하였을 때도 더 많은 양의 에리스리톨을 생산하였다.

Table 1. 
The titer of erythritol production under different aeration condition and glucose concentration condition with Candida sorbosivorans type strain and JM409 strain at 48 hours
Titer (g/L) under 100 g/L glucose Titer (g/L) under 200 g/L glucose
Aeration condition Candida sorbosivorans
type strain
Candida sorbosivorans
JM409
Candida sorbosivorans
type strain
Candida sorbosivorans
JM409
80 rpm 1.80 ± 0.10 3.12 ± 0.16 2.63 ± 0.35 3.16 ± 0.41
200 rpm 4.20 ± 0.20 8.47 ± 0.26 3.86 ± 0.03 6.94 ± 0.69
250 rpm 2.49 ± 0.50 6.77 ± 0.20 4.03 ± 0.39 7.41 ± 0.38


Fig. 4. 
The effect of glucose concentration (100, 200 g/L) and aeration (80, 200, 250 rpm) on the erythritol production. Erythritol production at 100 g/L (a, b) or 200 g/L (c, d) glucose concentration with both Candida sorbosivorans type strain (a, c) and JM409 (b, d) strain. There is big differences of erythritol production between two strains and aeration but no big differences as glucose concentration. Error bars indicate standard deviations of two biological replicates.

3.3. 에리스리톨 생산에서 금속이온의 역할

Rpm에 따른 에리스리톨 생산 실험결과를 통해 (Fig. 4) C. sorbosivorans JM409 균주가 호기적인 조건일수록 에리스리톨을 잘 생산한다는 결론을 얻을 수 있었다. 이와 같은 이유로 에리스리톨 관련 실험에서 주로 촉매제 또는 환원제 역할을 하는 금속 이온의 한 종류인 Fe2SO4·7H2O [5,8] 또는 MgSO4 [14]을 배지에 첨가하여 실험을 진행하거나 금속이온 종류에 따른 에리스리톨 생산량을 비교 [15-17]한 연구도 있어 금속이온 또한 에리스리톨 생산에 관련이 있을 것이라고 판단하였다. 따라서 금속이온 종류에 따른 C. sorbosivorans JM409 균주의 에리스리톨 생산량을 확인하고 해당 균주에 적합한 금속이온을 찾고자 하였다. 실험은 0.35 g/L 농도의 Fe2SO4·7H2O, MgSO4·7H2O, MnSO4·H2O, CuSO4·5H2O, CaCl2·2H2O를 사용하였다. 각각의 금속이온을 첨가하여 에리스리톨 생산량을 측정한 결과 Fe2+에서 9.38 g/L의 에리스리톨을 생산하였고 금속이온을 첨가하기 전보다 생산량이 증가 했을 뿐만 아니라 다른 금속이온과 비교하였을 때도 가장 많은 에리스리톨을 생산하였다 (Table 2).

Table 2. 
Titer of erythritol under different reducing agents with Candida sorbosivorans type strain and JM409 strain
Titer (g/L) No addition Ca2+ Cu2+ Mg2+ Mn2+ Fe2+
Candida sorbosivorans
type strain
2.49 ± 0.50 2.06 ± 0.16 0.00 ± 0.00 4.46 ± 0.11 2.15 ± 0.08 3.56 ± 1.19
Candida sorbosivorans
JM409
6.77 ± 0.20 4.62 ± 0.21 2.53 ± 0.00 5.82 ± 0.19 3.95 ± 0.55 9.38 ± 0.97

에리스리톨 생산 수율 결과 또한 Fe2+의 첨가에 의해 가장 높은 수율 (0.09 g/g glucose consumed)을 보인 반면, 이를 제외한 다른 금속이온의 첨가는 첨가하지 않은 조건보다 낮은 생산 수율을 보였다 (Fig. 5(a)). Fe2+이온이 가장 많은 영향을 주는 것을 확인한 후 금속이온의 농도에 따른 에리스리톨 생산량을 확인하기 위해 0.35 g/L 와 0.7 g/L의 Fe2SO4·7H2O를 첨가하여 비교하였다. 그 결과 농도가 높은 0.7 g/L의 Fe2SO4·7H2O를 첨가하였을 때는 4.2 g/L의 에리스리톨을 생산하였지만, 0.35 g/L의 Fe2SO4·7H2O를 첨가하였을 때는 9.1 g/L의 에리스리톨을 생산하여 0.7 g/L Fe2SO4·7H2O을 첨가한 조건에 비해 에리스리톨 생산량이 약 2배 증가한 결과를 확인할 수 있었다. 따라서 C. sorbosivorans JM409균주가 에리스리톨 생산을 위해 환원제의 역할을 하는 금속이온은 Fe2+이지만, Fe2+의 첨가량이 에리스리톨 생산과 정비례하지 않음을 확인하였다.


Fig. 5. 
The effect of types of reducing agents on erythritol production (a). Few effect of reducing agents with control strain. Candida sorbosivorans JM409 strain more produce erythritol adding reducing agents. Among the 5 metal ions used as reducing agents, Fe2+ ions was the most effective by nearly four times increasing the production of erythritol with C. sorbosivorans JM409. Error bars indicate standard deviations of two biological replicates. The effect of concentration of reducing agents on erythritol production (b). The higher the Fe2+ ion concentration, the more erythritol production is not increased.

3.4. 5-L bioreactor를 이용한 에리스리톨 생산 확인

앞서 진행한 실험을 바탕으로 가장 많은 에리스리톨을 생산한 조건에서 5-L bioreactor scale-up 발효를 진행하였다. 2 L YPD (100 g/L glucose) 배지에 250 rpm, 30oC, pH 5.0을 유지하면서 fed-batch 방식으로 glucose와 Fe2SO4·7H2O를 공급하여 기질의 농도를 일정 수준으로 유지하였다. 216시간 발효를 진행하는 동안 Cell density (OD600)는 34.2까지 증가하였고 최종적으로 11.2 g/L의 에리스리톨을 생산하였다 (Fig. 6). Glucose를 공급해줄 때마다 에리스리톨을 생산이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.


Fig. 6. 
Scale-up fermentation data of Candida sorbosivorans JM409 using 5-L bioreactor. Glucose and Fe2+ as reducing agents were added Fed-batch method in 2 L YPD (100 g/L glucose) medium maintaining 250 rpm, 30oC and pH 5.0. Silicon-antifoam is used. In the 5-L bioreactor, 11 g/L of erythritol is produced.


4. CONCLUSION

본 실험은 복숭아에서 분리된 새로운 효모균주가 에리스리톨을 생산할 수 있는 균주임을 확인하고 생산능력을 최대화하기 위해 균주의 발효특성을 파악한 후 최적조건을 탐색하는 것이 목표였다. Candida sorbosivorans의 에리스리톨 생산경로는 정확하게 모두 밝혀져 있지는 않지만 같은 속인 Candida magnoliea의 에리스리톨 생산 경로을 살펴보면 보조인자인 NAD(P)H를 이용하여 에리스로즈에서 에리스리톨로 전환되고 [18] 이 때 전자를 전달시켜줄 매개체가 필요하다. 보고된 연구결과와 함께 실험을 통해 C. sorbovisorans JM409 균주가 호기적인 조건 (250 rpm)에서 에리스리톨 생산량이 가장 많은 것을 확인하였다. 이와 함께 환원제 역할을 하는 것으로 여겨지는 Fe2+ 금속이온을 첨가하였을 때 생산량이 더 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 미생물 생육에 영향을 주는 요인이 다양하지만 산소 조건이 C. sorbosivorans JM409 균주의 에리스리톨 생산에 주요한 요인이라고 판단하였다.


Acknowledgments

이 논문은 농촌진흥청 연구사업 (세부과제번호: PJ01279801)의 지원을 받아 수행된 연구입니다. 또한 이 논문은 2017년 정부재원 (미래창조과학부 여대학(원)생공학연구팀제 사업)으로 한국연구재단과 한국여성과학기술인지원센터의 지원을 받아 연구되었습니다.


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