The Korean Society For Biotechnology And Bioengineering

Current Issues

Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 34 , No. 1

[ Research Paper ]
Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 34, No. 1, pp.31-37
Abbreviation: KSBB J
ISSN: 1225-7117 (Print) 2288-8268 (Online)
Print publication date 31 Mar 2019
Received 22 Jan 2019 Revised 19 Feb 2019 Accepted 20 Feb 2019
DOI: https://doi.org/10.7841/ksbbj.2019.34.1.31

LPS로 자극된 RAW264.7 세포에서 신령버섯 추출물의 항염증 효과
김민선1 ; 임지성1 ; 박태진1 ; 고광욱2 ; 김승영1, *
1선문대학교 제약생명공학과
2㈜대호양행

Anti-inflammatory Activity of Agaricus blazei Extract in Lipopolysaccharide-stimulated RAW264.7 Cells
Min-Seon Kim1 ; Jisung Lim1 ; Taejin Park1 ; Kwang-Wook Ko2 ; Seung-Young Kim1, *
1Department of Pharmaceutical Engineering & Biotechnology, Sunmoon University, Chungnam 31460, Korea, Tel: +82-41-530-2390, Fax: +82-41-530-2939 (sykim01@sunmoon.ac.kr)
2DaeHo Co., Ltd., Hwaseong18577, Korea
Correspondence to : *Department of Pharmaceutical Engineering & Biotechnology, Sunmoon University, Chungnam 31460, Korea Tel: +82-41-530-2390, Fax: +82-41-530-2939 E-mail: sykim01@sunmoon.ac.kr


© 2019 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering
Funding Information ▼

Abstract

In this study, antioxidation and anti-inflammatory activity Agaricus Brazei (AC) extract were examined. Antioxidation activity was increased as the concentration of AC extract increased (Concentration-dependant manner). The contents of phenolic compounds and flavonoids were 111.3019 mg/g and 15.473 mg/g, respectively. In anti-inflammatory effect test using AC extract, no toxicity was shown. NO production was inhibited in range of 50 to 100 μg/mL of AC extract as concentration dependant manner. PGE2 and Proinflammatory cytokines IL-6 production was decreased as concentration dependant manner. However, TNF-α production was not changed compare to control. iNOS and COX-2 expression, representative factors of signal transduction of inflammatory effects, were decreased as dose-dependant manner. These result indicates that AC extract is involved in regulatory pathway of iNOS, which is related to NO, and COX-2, which is related to PGE2. As a result, AC extract is useful material which has anti-oxidant effect and anti-inflammatory effect with no toxicity.


Keywords: Agaricus blazei, anti-inflammatory, pro-inflammatory cytokine, antioxidation

1. INTRODUCTION

염증반응은 여러 가지 자극에 의한 손상을 복구시키려는 방어 기작으로 손상된 조직을 재생하기 위해 일어나는 필수적인 생체반응이며 [1], 염증반응에는 Nitric Oxide (NO), Cytokines, Prostaglandin E2 (PGE2), Lysosomal enzyme, free radicals 등 다양한 염증 매개물질이 관여한다. 그 중, 외부 자극에 의한 대식세포의 염증반응에서는 Tumor necrosis factor-α (TNF-α)와 Interleukin 6 (IL-6), Interleukin 1β (IL-1β) 같은 전염증성 cytokine의 발현이 과하게 유도되며, 이들은 Inducible nitric oxide synthase (iNOS)와 cyclooxygenase-2 (COX-2) 유전자의 발현을 자극하여 nitric oxide (NO) 및 PGE2 등의 염증인자들을 생성시킨다 [2]. Nitric oxide(NO)의 정상적인 형성은 면역반응의 역할을 수행 [3]하나, LPS, cytokines 같은 외부 자극들에 의해 발현되는 Inducible NOS (iNOS)에 의한 과도한 NO생성은 염증반응을 심화시켜 조직의 손상, 유전자 변이 및 신경손상 등을 일으킨다 [4,5]. 또한, PGE2 생성 단백질인 COX-2 (cyclooxygenase-2)는 arachidonic acid를 prostaglandins로 전환하는 효소로, 염증반응 부위에서 발현이 된다 [6]. COX-2에 의해 생성되는 PGE2는 염증 매개체로서 염증반응과 면역반응에 관여하고 혈관신생 (angiogenesis)을 활성화시키는 등 암의 유발하는 물질로도 알려져 있다 [7].

버섯은 진균류에 속하는 담자균과 자낭균 중 자실체를 형성하는 고등 균류로서 탄수화물, 단백질, 지질, 무기질 및 비타민 등의 다양한 영양소를 골고루 함유하고 있어, 예로부터 식용 및 약용으로 널리 이용되어 왔다 [8]. 본 연구에서 사용한 신령버섯 (Agaricus blazei)은 아가리쿠스 버섯, 흰들버섯이라고도 하며, 주름버섯과 주름버섯속에 속하는 버섯으로 양송이 버섯과 생김새가 유사하지만 버섯 대가 두껍고 길며 향기가 짙은 것이 차이점이다 [9]. 신령버섯은 항종양효과, 항암효과, 혈당강하작용, 혈압강하, 콜레스테롤 저하 등의 약리작용이 보고되어 있으며, 이에 따른 생리활성 물질은 β-(1, 6)-glucosyl 기능기를 가진 β-(1,3)-glucan 이라고 연구되어졌다 [10,11]. 그러나, 화장품 원료 산업이 주목받으며 기능성 원료의 연구가 활발한 가운데, 신령버섯의 화장품 원료학적 연구로써, 항균 [12], 미백 [13] 등에 대한 연구 결과가 있으나, 항염증 연구는 미미한 실정이다. 따라서 본 논문에서는 신령버섯 추출물이 LPS에 의해 활성화된 RAW 264.7 세포에서 염증 매개 물질인 NO와 PGE2의 생성과 그에 관련한 단백질 및 전 염증성 사이토카인의 생성량을 측정함으로서 신령버섯 추출물이 항염증 반응에 미치는 영향과 원료학적 가치를 증명하고자 하였다.


2. MATERIALS AND METHOD
2.1. 재료 및 추출

신령버섯 (Agaricus blazei)은 김상민 아가리쿠스 (제주, 대한민국)에서 구입하여, 깨끗한 담수로 씻어 실온에서 완전히 건조시켰다. 추출탱크에 건조시킨 신령버섯을 투입하고, 신령버섯 무게의 10배로 정제수를 첨가하였다. 121oC에서 8~10시간 동안 추출하여 1차 추출물을 회수하고, 같은 방법으로 정제수를 추가로 첨가하여 같은 조건에서 추출하여 2차 추출물을 회수하였다. 회수한 1차 추출물과 2차 추출물을 혼합하여 1.0 μm 필터 (레인보우, 대한민국)로 여과하고, 여과된 추출물은 강압 농축하여 사용하였다.

2.2. Phenol contents 및 Flavonoid contents

총 페놀 함량은 Folin-Ciocalteau‘s phenol reagent가 각 시료의 페놀성 화합물에 의해 환원되어 몰리브덴 청색으로 발색하는 원리로 측정하였으며, Folin-Ciocalteau법 [14]을 96-well plate에 맞게 변형하여 비색 정량하였다. 신령버섯 추출물 70 ul와 2 N Folin-Ciocalteau 용액 (Sigma, USA) 70 ul를 혼합하여 3분간 실온반응 시킨 후, 2% Na2CO3 (Sigma, USA) 70 ul를 첨가하여 1시간 방치하였다. 이후, Microplate reader를 이용하여 760 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 페놀 함량은 gallic acid를 표준으로 작성한 표준곡선으로부터 구하였으며 측정 단위는 mg (Gallic acid)/g (시료)을 사용하였다. 총 플라보노이드 함량은 질산알루미늄법을 변형하여 측정하였다 [15]. 100 μL 신령버섯 추출물과 2% aluminium chloride hexahyrate 100 μL를 동량으로 혼합하여 상온에서 15 min 동안 반응 후, 430 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 플라보노이드 함량은 quercetin으로 작성한 표준곡선으로부터 mg Quercetin equivalents (QE)/g 로 나타내었다.

2.3. DPPH Radical scavenging Activity

DPPH법은 자유 라디칼 특유의 색을 전자나 수소원자에 의해 전자가 쌍이 되어 비 라디칼이 되면 특유의 색이 사라지게 되는 DPPH의 화학적 성질을 이용한 방법이다. DPPH Radical scavenging activity 측정은 A, B, C, D 네 그룹으로 나눠서 시험하였다. A group은 2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl radical을 0.1 mM이 되도록 MeOH에 녹인 용액 (DPPH 시약) 150 ul과 시료용액의 용매를 동량으로 혼합한다. B group은 MeOH 150u l와 시료용액의 용매를 동량으로 혼합, C group은 DPPH 시약 150 ul와 일정농도의 시약을 동량으로 혼합, D group은 MeOH 150 ul와 일정농도의 시약을 동량으로 혼합하여 25oC에서 10분간 반응시킨 후, 565 nm에서 흡광도를 측정하였다.

(%)=[(CD)  (AB)] / (CD) × 100

A : Abs of experimental group

B : Abs of blank of expreimental group

C : Abs of control group

D : Abs od blank of control group

2.4. ABTS Radical scavenging Activity

ABTS radical을 이용한 항산화 활성 측정은 potassium persulfate의 반응에 의해 생성된 ABTS free radical이 시료 내의 활성물질에 의해 소거되어 청록색의 radical 특유의 색이 탈색되는 것을 이용한 방법으로 Van den Berg 등의 방법 [16]을 변형하여 측정하였다. 7.4 mM ABTS 용액과 2.6 mM Potassium persulfate 용액을 24시간 이상 암소에 방치하여 청록색의 ABTS 라디칼을 형성시킨 후, 734 nm에서 흡광도를 2.5가 되도록 희석하여 사용하였다. 이 용액에 시료 20 μL를 가한 후 10분 동안 암반응 하였으며, ABTS 라디칼 소거능은 시료 무첨가군 대비 흡광도 감소율로 나타내었다.

ABTS radical scavenging activity(%) = [1  (/)] × 100
2.5. 세포배양

RAW264.7 세포는 한국세포주은행에서 구입하여 사용하였으며, Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Gibco, Grand Island, NY, USA)에 10% fetal bovine serum (FBS), 100 units/mL penicillin-streptomycin을 혼합한 배지를 사용하여 37oC, 5% CO2 조건에서 배양하였다.

2.6. 세포 독성 측정

신령버섯 추출물의 독성 평가는 RAW 264.7 cell를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 8.0 × 104 cells/well로 분주하여 18시간 전 배양 후 시료와 LPS (1 μg/mL)를 동시 처리하여 24시간 배양하였다. 이후 독성평가는 MTT assay 방법 [17]에 따라, 배양액 제거 후, MTT 시약을 3시간 동안 처리하였다. 이후, DMSO에 용해시켜 흡광도를 측정하였다.

2.7. Nitric oxide (NO) 생성 억제 활성 측정

RAW 264.7 세포 (8.0 × 104 cell/well)를 18시간 전 배양 후 시료와 LPS (1 μg/mL)를 동시 처리하여 24시간 배양하였으며, 생성된 NO는 Griess 시약을 이용하여 세포 배양액 중에 존재하는 NO2-의 형태로 측정하였다. 세포배양 상층액 100 μL와 Griess 시약을 동량 혼합하여 10 분간 암반응 시킨 후 ELISA reader를 이용하여 540 nm에서 측정한 흡광도 값을 결과로 나타내었다.

2.8. Prostaglandin E2 (PGE2) 생성 억제 활성 측정

RAW 264.7 세포 (8.0 × 104 cell/well)에 시료와 LPS (1 μg/mL)를 동시 처리하여 24시간 배양한 후, 배양 배지를 원심분리 (800 rpm, 3 min)하여 얻어진 상층액의 PGE2함량을 control 대비 백분율로 나타내었다. PGE2 함량은 mouse enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 측정 하였다.

2.9. 전염증성 cytokines (TNF-α, IL-6) 생성 억제 활성 측정

RAW 264.7 세포를 8.0 × 104 cells/well로 조절한 후 전 배양하였다. 이후, 시료와 LPS (1 μg/mL)를 동시 처리하여 24시간 배양하였으며, 배양 배지를 원심분리 (800 rpm, 3 min)하여 얻어진 상층액의 전염증성 cytokine의 생성량을 측정하였다. 전염증성 cytokine은 mouse enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)kit (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 측정하였다.

2.10. Western blot analysis

RAW 264.7 세포 (3.0 × 105 cell/well)를 18시간 전 배양 후 시료와 LPS (1 μg/mL)를 동시 처리하여 24시간 배양하였다. 이후 세포를 PBS로 2회 세척하고 lysis buffer를 이용해 1시간 동안 lysis 시킨 후 원심분리하여 단백질 상등액을 분리하였다. 단백질 농도는 BCA kit (Bio-Rad, USA)를 이용하여 정량하였다. 정량한 단백질을 8~12%의 polyacrylamaide gel에 전기영동하고 Poly-vinylidene difluoride (PVDF) membrane (Milipore, USA)에 200 mA, 2시간 동안 전이시켰다. 단백질이 전이된 membrane을 5% 탈지분유를 포함한 0.05% Tween 20/Tris-buffered saline (0.05% T/TBS)에 넣고 상온에서 blocking 시킨 후, 1차 항체와 반응시켰다. 1차 항체 반응은 iNOS antibody (1:5000, Calbiochem, USA), COX-2 antibody (1:1000, BD Biosciences Pharmingen, USA), β-actin antibody (1:10,000, Sigma, USA)를 이용하여 4oC에서 24시간 반응시킨 후 TBST로 4회 세척한 다음 2차 항체 (Jackson ImmunoResearch, USA)를 1:5,000 또는 1:10,000으로 희석하여 상온에서 1시간 반응한 뒤 TBST로 3회 세척하였다. 단백질은 ECL kit (Bio-Rad, USA) 사용하여 imaging densitometer (model GS-700, Bio-rad, USA)를 통해 측정하였다.

2.11. 통계처리

모든 실험은 3회 반복하여 측정하였고, 그 결과는 평균값±표준편차로 나타냈으며 통계적 분석은 SPSS 10.0 프로그램을 이용하여 각 처리구간의 유의성 (p<0.05, 0.01) 검증을 위해 분산분석 (analysis of variance, ANOVA) 후 tukey test로 다중비교를 실시하였다.


3. RESULTS
3.1. Phenol contents 및 Flavonoid contents

페놀성 화합물은 식물계에 널리 분포되어 있으며, 특히 식물의 고유의 색깔을 띄도록 하며, 식품의 떫은맛과 쓴맛과 같은 특유한 맛을 내기도 한다 [18]. 이러한 페놀성 물질은 최근 활성산소를 제거하는 항산화 작용, 항암작용과 같은 생리활성을 나타낸다고 보고되었다 [19]. 폴리페놀의 일종인 플라보노이드는 자연계에 널리 분포하고 있으며, 식물의 줄기, 잎, 뿌리 등 다양한 부위에 함유 되어있다 [20]. 본 연구에 사용한 신령버섯 추출물의 총 폴리페놀 함량 측정 결과는 111.3019 mg/g이며, Flavonoid content는 15.473 mg/g으로 측정되었다 (Fig. 1). 이는 신령버섯 추출물은 Flavonoid 계열을 제외한 페놀성 화합물의 함량이 더 많다는 것을 시사하며, 다른 성분에 대한 추가적인 연구가 필요할 것이라 사료된다.


Fig. 1. 
Flavonoid contents and Phenol contents of Agaricus extract.

3.2. DPPH Radical scavenging 및 ABTS Radical scavenging activity

본 연구에서는 항산화 측정에 가장 많이 쓰이는 방법 중 하나인 전자공여능을 측정하여 신령버섯 추출물이 DPPH 라디칼 (2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl radical)을 소거하여 탈색되는 정도를 565 nm에서 측정하였다. 신령버섯 50, 100, 200 ug/ml 농도별로 DPPH 라디칼 소거활성 시험을 진행한 결과 50 ug/ml의 농도에서는 11.780%, 100 ug/ml의 농도에서는 16.300%, 200 ug/ml의 농도에서는 18.883%의 활성으로 다소 낮은 저해 활성을 보였다 (Fig. 2). ABTS radical을 이용한 항산화 활성 측정은 potassium persulfate의 반응에 의해 생성된 ABTS free radical이 시료 내의 항산화 물질에 의해 소거되어 청록색의 radical 특유의 색이 탈색되는 것을 이용한 방법으로 ABTS 라디칼을 소거하여 탈색되는 정도를 734 nm에서 측정하였다. 그 결과, 50 ug/ml의 농도에서는 14.102%, 100 ug/ml의 농도에서는 22.445%, 200 ug/ml의 농도에서는 33.608%의 활성을 나타내었다 (Fig. 3). 위 결과로 보아, 신령버섯 추출물은 DPPH Radical 소거능에 비해 ABTS Radical 소거능에 더 뛰어난 활성을 나타내는 것으로 확인되었다. 이는 DPPH radical은 유리 라디칼 반응을 이용하여 소수성 물질의 항산화 활성을 측정하는 반면, ABTS는 양이온 라디칼과 친수성 및 소수성 화합물의 상호 작용에 의한 항산화 활성 측정 방법에 차이에 의한 결과로 사료된다 [21].


Fig. 2. 
DPPH Radical Scavenging activity of AC. Data represent the means±SD with three separate experiments. One-way ANOVA was used for comparisons of multiple group means followed by t-test (significant as compared to control. *p<0.05, **p<0.01).


Fig. 3. 
ABTS Radical Scavenging activity of AC. Data represent the means±SD with three separate experiments. One-way ANOVA was used for comparisons of multiple group means followed by t-test (significant as compared to control. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.005).

3.3. 세포독성 및 NO 생성량 측정

L-arginine으로부터 생성되는 무기 유리체인 NO는 면역반응 등 여러 생물학적인 신호에 관여하며, 세포 기능에 중요한 역할을 하며 세포독성을 일으키기도 한다 [22]. 본 연구에서는 LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에서 NO생성량이 신령버섯 추출물에 의해 나타나는 변화를 조사 하였다. 그 결과, 50, 100 μg/mL 농도에서 NO생성을 저해하였으며, 200 μg/mL의 농도에서는 활성이 나타나지 않았다 (Fig. 5). 또한, 동일한 농도에서 MTT assay법을 통하여 세포독성을 측정한 결과, 신령버섯 추출물 (AC)의 전 농도 (50, 100, 200 μg/mL)에서 독성이 나타나지 않았다 (Fig. 4). 이는 신령버섯이 독성을 나타내지 않는 범위 내에서 염증 억제제로서의 가능성이 있음을 시사한다.


Fig. 4. 
Cell viability of AC in LPS-stimulated RAW264.7 cells. The cells were stimulated with 1 μg/mL of LPS only or with LPS plus various concentrations (25, 50, 100 μg/mL) of AC for 24 h. Cell viability was determined from the 24h culture of cells stimulated with LPS (1 μg/mL) in the presence of AC. The cells were stimulated with 1 μg/mL of LPS only or with LPS plus various concentrations (25, 50, 100, 200 μg/mL) of AC for 24 hr. One-way ANOVA was used for comparisons of multiple group means followed by t-test (significant as compared to control. *p<0.05, **p<0.01).


Fig. 5. 
Effect of AC on nitric oxide production in LPS-stimulated RAW264.7 cells. The cells were stimulated with 1 μg/mL of LPS only or with LPS plus various concentrations (50, 100, 200 μg/mL) of AC for 24 h. Nitric oxide production was determined by the Griess reagent method. Data represent the means±SD with three separate experiments. One-way ANOVA was used for comparisons of multiple group means followed by t-test (significant as compared to control. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.005).

3.4. Prostaglandin E2 (PGE2) 생성 억제 활성 측정

염증 매개물질인 Prostaglandin (PG)에 속하는 PGE2는 혈관확장, 부종, 발열, 동통 등을 매개한다 [23]. 신령버섯 추출물을 농도별로 처리하여 24시간 배양 후, PGE2의 생성량을 측정한 결과를 Fig. 6에 나타내었다. 신령버섯 추출물 처리 시, PGE2의 생성량의 변화는 50 μg/mL 농도에서 20% 감소하였으며, 100 μg/mL 농도에서 30%, 200 μg/mL 농도에서 40% 감소로, 신령버섯 추출물의 처리에 따라 농도 의존적으로 감소하였다. 이는 신령버섯의 특정 생리활성 물질 혹은, 생리활성 물질의 복합적인 작용이 NO 생성 억제 기작과 다른 경로에 영향을 미쳐 PGE2의 합성량을 조절하는 것으로 판단된다. 따라서 신령버섯은 NO와 PGE2 두가지 염증 매개 물질의 생성기작에 모두 작용함으로서 강력한 항염증 활성을 기대할 수 있다.


Fig. 6. 
Inhibitory effects of AC on PGE2 production in RAW 264.7 cells. The production of PGE2 was assayed in the culture medium of cells stimulated with LPS (1 μg/mL) for 24 h in the presence of AC (50, 100, and 200 μg/mL). Data represent the means±SD with three separate experiments. One-way ANOVA was used for comparisons of multiple group means followed by t-test (significant as compared to control. *p<0.05; **p<0.01).

3.5. 전염증성 cytokines (TNF-α, IL-6, IL-1β) 생성 억제 활성 측정

Cytokine은 면역세포가 분비하는 단백질로서 면역세포의 활성 및 증식 등을 조절하여 염증반응을 매개하는 인자이다. 염증성 질환의 치료를 위해 cytokine의 역할 및 기능이 주목 받고 있으며, 그 중, TNF-α 와 IL-6는 in vitro 및 in vivo에서 염증반응을 조절 가능하며 대표적인 pro-inflammatory cytokine으로 알려져 있다 [24]. 따라서 본 연구에서는 LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에 신령버섯 처리를 통해 전염증성 사이토카인의 생성량의 변화를 조사하였다. 그 결과, 신령버섯 추출물은 TNF-α의 생성량 감소에는 영향을 미치지 않았다 (Fig. 7). 반면, IL-6의 생성량은 100, 200 μg/mL 농도에서 약 20% 가량 억제되었다 (Fig. 8). 위와 같은 결과로 신령버섯 추출물은 전염증성 사이토카인을 조절하며, 그에 따른 수용체와 하위인자들이 조절되어 항염증 작용에 유의적인 활성이 나타나는 것으로 사료된다.


Fig. 7. 
Effect of AC on TNF-α production in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. The cells were stimulated with 1 μg/mL of LPS only or with LPS plus various concentrations (50, 100, 200 μg/mL) of AC for 24 hr. TNF-α production was determined by ELISA method. One-way ANOVA was used for comparisons of multiple group means followed by t-test (significant as compared to control. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.005).


Fig. 8. 
Effect of AC on IL-6 production in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. The cells were stimulated with 1 μg/mL of LPS only or with LPS plus various concentrations (50, 100, 200 μg/mL) of AC for 24 hr. IL-6 production was determined by ELISA method. Data represent the means±SD with three separate experiments. One-way ANOVA was used for comparisons of multiple group means followed by t-test (significant as compared to control. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.005).

3.6. Western Blot을 통한 iNOS 및 COX-2 측정

본 연구에서 신령버섯 추출물이 NO와 PGE2의 생성량을 억제시키는 것을 확인하였다. NO는 Nitric oxide synthase (NOS)에 의해 생성되며 그중 iNOS에 의한 생성이 절대적으로 많다. 따라서 iNOS 단백질의 발현량을 조사하여 NO 생성량 감소가 iNOS 단백질에 의한 것인지 알아보고자 Western Blot을 실시하였다. 그 결과, 신령버섯 추출물 50, 100 μg/mL 농도에서 iNOS 단백질의 발현량이 감소하는 것이 확인되었으며, 이는 NO 생성량 감소와 동일한 패턴으로 나타났다 (Fig. 9). 또 다른 염증인자인 PGE2는 COX-2에 의해 생성된다. 신령버섯 추출물을 처리하여 COX-2의 발현량을 조사한 결과, PGE2와 동일하게 농도 의존적으로 발현량이 감소하였다 (Fig. 10). 두 결과는 각각 NO와 PGE2 생성량 저해 패턴에 상응하는 결과로써, 신령버섯 추출물이 iNOS 및 COX-2의 발현을 억제하여 항염증 효과를 나타내는 것으로 사료된다.


Fig. 9. 
Effect of AC on the protein level of iNOS in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. RAW 264.7 cells (3.0 × 105 cell/mL) stimulated with LPS (1 μg/mL) in the presence of AC (50, 100, 200 μg/mL) for 24 hr. Whole-cell lysates (30 μg) were prepared and the protein level was subjected to 10% SDS-PAGE, and expression of iNOS and β-actin were determined by western blotting. The β-actin as a loading control.


Fig. 10. 
Effect of AC on the protein level of COX-2 in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. RAW 264.7 cells (3.0 × 105 cell/mL) stimulated with LPS (1 μg/mL) in the presence of AC (50, 100, 200 μg/mL) for 24 hr. Whole-cell lysates (30 μg) were prepared and the protein level was subjected to 10% SDS-PAGE, and expression of COX-2 and β-actin were determined by western blotting. The β-actin as a loading control.


4. CONCLUSION

본 연구에서는 신령버섯 추출물의 항산화 및 항염효과를 확인하기 위해 Nitric Oxide (NO) 저해 활성, Prostaglandin E2 (PGE2) 생성 억제 활성, Pro-inflammatory cytokines 생성 저해 활성, COX-2 및 iNOS 단백질 발현 억제 활성을 분석하였다. 신령버섯 추출물의 항산화 활성을 측정한 결과 농도 의존적으로 항산화 효과를 확인하였으며, 이와 관련하여 다양의 페놀계 화합물이 함유되어 있는 것을 확인하였다. 또한, 신령버섯 추출물의 항염증 효과를 조사한 결과, 모든 농도에서 독성이 발견되지 않았으며, 신령버섯 추출물 50, 100 μg/mL 농도에서는 NO생성을 농도 의존적으로 저해하는 경향을 보이나 200 μg/mL의 에서는 활성이 농도 의존적으로 나타나지 않았다. 이는 신령버섯의 생리활성 물질인 β-Glucan이 대식세포를 자극하여 돌연변이 세포를 인식하고 공격하는 항종양 효과가 Mizuno [25] 등의 연구결과에 보고되어 있어, 본 결과에서도 농도가 높아짐에 따라 대식세포 자극 물질의 함유량이 높아져 NO의 생성량이 증가된 것으로 추측된다. PGE2의 생성량 측정결과, LPS 처리군에 비하여 추출물 처리에 따른 농도의존적인 감소경향을 나타내었으며, 전 염증성 사이토카인 IL-6의 생성량은 억제하였으나, TNF-α 생성에 관여하지 않는 것으로 관찰되었다. 또한, 대표적인 염증 관련 신호 전달 경로 인자인 iNOS 및 COX-2의 발현을 검토한 결과 신령버섯 추출물은 iNOS 와 COX-2의 발현을 농도 의존적으로 감소시키는 것으로 관찰되었다. 이와 같은 결과는 신령버섯 추출물이 iNOS와 NO 및 PGE2와 COX-2 조절 경로에 서로 병립적으로 조절하고 있음을 제시하고 있다. 본 연구 결과로 신령버섯 추출물은 독성과 부작용이 적은 항산화와 항염증 효능을 가진 기능성 화장품 소재로써 개발 가능성이 있다고 사료된다.


Acknowledgments

본 연구는 중소벤처기업부과 한국산업기술진흥원의 “지역특화산업육성사업”으로 수행된 연구결과입니다 (연구번호 R0006496).


References
1. Lee, H. J., E. A. Hyun, W. J. Yoon, B. H. Kim, M. H. Rhee, et al., (2006), In vitro anti-inflammatory and anti-oxidative effects of Cinnamomum camphora extracts, J. Ethnopharmacology, 103, p208-216.
2. Shin, J. S., J. M. Kim, and W. G. An, (2012), Anti-inflammatory effect of red ginseng through regulation of MAPK in lipopolysaccharide-stimulated RAW264.7, J. Physiol. Pathol. Korean Med., 26, p293-300.
3. Moncada, S. R. M. J., (1991), Nitric oxide: Physiology, pathophysiology, and pharmacology, Pharmacol. Rev., 43, p109-142.
4. Nava, E., R. M. Palmer, and S. Moncada, (1992), The role of nitric oxide in endotoxic shock: effects of NG-monomethyl-L-arginine, J. Cardiovascular Pharmacology, 20, pS132-S134.
5. Kim, D. H., E. Y. Hwang, and J. H. Son, (2013), Anti-inflammatory activity of Carthamus tinctorious seed extracts in Raw 264.7 cells, J. Life Sci., 23, p55-62.
6. Seibert, K., Y. Zhang, K. Leahy, S. Hauser, J. Masferrer, W. Perkins, and P. Isakson, (1994), Pharmacological and biochemical demonstration of the role of cyclooxygenase 2 in inflammation and pain, Proc. Natl. Acad. Sci., 91, p12013-12017.
7. Masferrer, J. L., B. S. Zweifel, P. T. Manning, S. D. Hauser, K. M. Leahy, W. G. Smith, and K. Seibert, (1994), Selective inhibition of inducible cyclooxygenase 2 in vivo is antiinflammatory and nonulcerogenic, Proc. Natl. Acad. Sci., 91, p3228-3232.
8. Kim, I. H., E. J. Jin, and J. H. Lee, (2006), Antioxidant and antimicrobial activities of cambodian mushroom, Environ. Mutagen. Carcinog., 26, p41-44.
9. Hong, J. H., S. Y. Kwang, and H. C. Yong, (2004), Characteristics of crude protein-bound polysaccharide from Agaricus blasei Murill by extraction and precipitation conditions and its antitumor effect, Korean J. Food Sci. Technol., 36, p586-593.
10. Nakajima, A., T. Ishida, M. Koga, T. Takeuchi, O. Mazda, and M. Takeuchi, (2002), Effect of hot water extract from Agaricus blazei Murill on antibody-producing cells in mice, Int. Immunopharmacol., 2, p1205-1211.
11. Chang, H. L., G. R. Chao, C. C. Chen, and J. L. Mau, (2001), Nonvolatile taste components of Agaricus blazei, Antrodia camphorata and Cordyceps militaris mycelia, Food Chem., 74, p203-207.
12. Soković, M., and L. J. van Griensven, (2006), Antimicrobial activity of essential oils and their components against the three major pathogens of the cultivated button mushroom, Agaricus bisporus, Eur. J. Plant Pathol., 116, p211-224.
13. Mahmoud, M. E., A. E. L. Hesham, Y. A. G. Ahmed, and M. Sayed, (2010), Inhibition of melanogenesis by the extract from Agaricus blazei without affecting iNOS gene expression, World J. Microbiol. Biotechnol., 26, p2029-2035.
14. Kujala, T. S., J. M. Loponen, K. D. Klika, and K. Pihlaja, (2000), Phenolics and betacyanins in red beetroot (Beta vulgaris) root: Distribution and effect of cold storage on the content of total phenolics and three individual compounds, Journal of Agricultural and Food Chem., 48, p5338-5342.
15. Zhishen, J., T. Mengcheng, and W. Jianming, (1999), The determination of flavonoid contents in mulberry and their scavenging effects on superoxide radicals, Food Chem., 64, p555-559.
16. Van den Berg, R., G. R. Haenen, H. van den Berg, and A. A. L. T. Bast, (1999), Applicability of an improved Trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC) assay for evaluation of antioxidant capacity measurements of mixtures, Food Chem., 66, p511-517.
17. Denizot, F., and R. Lang, (1986), Rapid colorimetric assay for cell growth and survival: modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability, J. Immunol. Method., 89, p271-277.
18. Kim, I. W., D. H. Shin, and U. Choi, (1999), Isolation of antioxidative components from the bark of Rhus verniciflua stokes screened from some Chinese medicinal plants, Korean J. Food Sci. Technol., 31, p855-863.
19. Lee, S. O., H. J. Lee, M. H. Yu, H. G. Im, and I. S. Lee, (2005), Total polyphenol contents and antioxidant activities of methanol extracts from vegetables produced in Ullung island, Korean J. Food Sci. Technol., 37, p233-240.
20. Kim, E. J., J. Y. Choi, M. R. Yu, M. Y. Kim, S. H. Lee, and B. H. Lee, (2012), Total polyphenols, total flavonoid contents, and antioxidant activity of Korean natural and medicinal plants, Korean J. Food Sci. Technol., 44, p337-342.
21. Floegel, A., D. O. Kim, S. J. Chung, S. I. Koo, and O. K. Chun, (2011), Comparison of ABTS/DPPH assays to measure antioxidant capacity in popular antioxidant-rich US foods, J. Food Compos. Anal., 24, p1043-1048.
22. Kim, J. Y., K. S. Jung, and H. G. Jeong, (2004), Suppressive effects of the kahweol and cafestol on cyclooxygenase-2 expression in macrophages, FEBS Lett., 569, p321-326.
23. Ninnemann, J. L., (1984), Prostaglandins in inflammation and disease, Immunol. Today, 5, p173-175.
24. Namkoong, S., S. A. Jang, E. H. Sohn, J. P. Bak, E. Sohn, H. J. Koo, and H. S. Han, (2015), Comparative study of Litsea japonica leaf and fruit extract on the anti-inflammatory effects, Korean J. Plant Resour., 28, p145-152.
25. Mizuno, M., M. Morimoto, K. I. Minato, and H. Tsuchida, (1998), Polysaccharides from Agaricus blazei stimulate lymphocyte T-cell subsets in mice, Biosci. Biotechnol. Biochem., 62, p434-437.