The Korean Society For Biotechnology And Bioengineering

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Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 34 , No. 2

[ Review Paper ]
Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 34, No. 2, pp.61-72
Abbreviation: KSBB J
ISSN: 1225-7117 (Print) 2288-8268 (Online)
Print publication date 30 Jun 2019
Received 14 May 2019 Revised 18 Jun 2019 Accepted 21 Jun 2019
DOI: https://doi.org/10.7841/ksbbj.2019.34.2.61

바이오센서 응용을 위한 페록시다아제 모방 나노 소재
안성훈
조선대학교 생명화학고분자공학과

Nanomaterials with Peroxidase-like Activity for Biosensor Applications
Sung Hoon Ahn
Department of Bio-chemical and Polymer Engineering Chosun University, Gwangju 61452, Korea, Tel: +82-62-230-7114, Fax: +82-62-230-7225 (sunghoon@chosun.ac.kr)

© 2019 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering

Abstract

Biocatalysts, referred as enzymes, have been widely used in life, industrial, medical, and biological fields due to their high catalytic activity and substrate specificity for specific reaction. However, it has disadvantages in industrial applications due to the drawbacks in its characteristics as a catalyst, such as the high cost, the narrow operation conditions in terms of pH and temperature, and the low durability. Recently, many studies on nanozymes for replacing enzymes have been widely conducted to overcome these drawbacks. The nanozyme has a relatively wide pH and temperature operation range as compared with the enzyme, which is a kind of protein, and has a high durability over a long period of time. It is also expected to be able to be mass-produced at relatively low cost. However, the nanozymes still lacks of the substrate specificity, which is one of the most important features of enzymes. Furthermore, only few nanozymes have been reported which exhibits higher or comparable catalytic activity compared with enzymes. This review first discusses the classification of the nanozymes and the corresponding catalytic reactions, focusing on the most developed peroxidase -mimicking nanozymes. Then, it summarizes the most effective peroxidase nanozymes including iron oxides, nanocarbon, and iron- and carbon composite materials and their corresponding reaction mechanisms. After that, the nanotechnology-based approaches to improve the catalytic activity of nanozymes as well as the substrate specificity are covered. Furthermore, the current major application of nanozyme to the biosensor are introduced. Finally, the future directions for nanozyme researches and the applications are suggested.


Keywords: nanozyme, biosensor, peroxidase, detection

1. INTRODUCTION

효소는 특정 기질에 대하여 매우 높은 선택성을 보이며, 그로 인하여 특정 화학 반응에 대하여 다른 비-생체 촉매에 비하여 높은 촉매 활성을 갖는다. 그러나 반대로, 생체 촉매이기 때문에 갖는 약점들도 존재한다. 특히 일부 특수한 효소를 제외하면 가혹 환경에서 쉽게 활성을 잃으며, 낮은 내구성으로 인해 장기간의 사용에서 약점을 보인다. 또한 재사용을 위한 회수 공정이 거의 불가능하다. 따라서 이러한 약점들을 보완함과 동시에 천연 효소의 높은 활성을 모방할 수 있는 인공 효소가 연구되었다. 2007년 서양 고추냉이로부터 추출한 천연 페록시다아제 (Horseradish peroxidase, HRP)의 과산화수소 분해 활성을 모방할 수 있는 강자성의 철 산화물 (Fe3O4) 나노 입자 연구가 보고되었다 [1]. 그 후 이러한 종류의 인공 효소, 즉 나노 크기의 (1~100 nm) 입자들로 구성되어 기존의 효소를 대체할 수 있는 높은 활성을 갖는 촉매 물질인 나노자임 (Nanozyme)이 많은 연구진에 의해 활발하게 연구되었다. 현재 금을 포함한 귀금속 [2,3], 전이 금속(M=Fe,Co,Ni) [4], 전이 금속 산화물 [5,6], 그리고 금속 파생물 [7, 8] 등의 무기물을 비롯하여, 나노 탄소 재료 [9,10]와 유-무기 복합체 [11,12] 등의 다양한 재료가 나노자임 연구에 활용되고 있으며, 천연 효소의 높은 선택성과 활성을 모방하기 위하여 나노 구조를 갖는다. 또한, 기존의 효소와 결합된 하이브리드 복합체 또한 나노자임으로 분류할 수 있다 [13]. 나노자임은 천연 효소와 비교하여 비슷한 활성을 보일 뿐만 아니라, 촉매 메커니즘 또한 생체 촉매와 유사함이 밝혀졌으며, 천연 촉매와 비교하였을 때, 특히 대량 생산을 위한 낮은 가격, 높은 안정도, 그리고 높은 내구성이 장점으로 꼽힌다. 따라서 다양한 촉매 반응에 대하여 적합한 나노자임을 찾기 위하여 연구가 활발히 진행되었다.

현재 천연 효소를 대체할 수 있는 수준의 높은 활성과 기질 선택성을 갖는 나노자임은 몇몇 종류에 한정되지만, 나노 기술의 발전 및 원자 모델에 입각한 컴퓨터 시뮬레이션과 계산 연구에 힘 입어 각 효소 반응에 대응하는 나노 구조 및 특성이 최적화되고 있다. 또한 나노자임이 모방할 수 있는 효소 반응의 종류는 점차 늘어나고 있으며, 그에 따라 응용 분야 또한 다양하게 전개되었다. 나노자임이 효과적인 효소 반응들은 크게 두 가지로 나눌 수 있는데, 첫번째는 산화-환원효소 (oxidoreductase) 그룹으로, 예를 들어 산화 효소 (oxidase), 페록시다아제 (peroxidase), 카탈라아제 (catalase), 과산화물 제거 효소 (superoxide dismutase) 등이다. 두 번째는 가수 분해 효소 (hydrolyse) 그룹으로, 핵산 분해 효소 (nuclease), 에스터 가수 분해 효소 (esterase), 인산 분해 효소 (Phosphatase), 단백질 분해 효소 (Protease) 등이다. 그 중에서도 페록시다아제 모방 나노자임은 대부분의 반응 메커니즘이 밝혀졌으며 생체물질의 검출을 위한 바이오센서를 위해 집중적으로 연구되고 있다.

현재까지 철 산화물 (Fe2O3 and Fe3O4) 기반의 나노 소재 및 탄소 기반의 나노 소재가 각각 페록시다아제 모방 나노자임에서 가장 유력한 소재로 연구되고 있으며, 현재까지 집중적으로 연구되고 있다. 또한 금 (Au)과 같은 귀금속, 전이 금속 파생물, 전도성 고분자 또한 페록시다아제 활성을 갖는 것으로 나타났다. 최근 나노자임의 바이오센서로의 응용을 포함하여, 세포 검출 등의 체외 진단 (in vitro sensing) 및 체내 (in vivo)상의 imaging 및 생체 치료 등의 다양한 응용 분야에 대한 리뷰 논문이 연이어 출판되었다 [14-16]. 나노자임의 다양한 종류 및 그에 적합한 소재 선택, 그리고 생체 진단, 의료, 환경 처리에 걸친 다양한 응용 분양 등 나노자임 연구의 광범위성을 고려했을 때, 본 리뷰에서는 가장 심도 있게 연구된 나노자임 소재인 철 및 탄소 기반의 페록시다아제 모방 나노자임에 대하여 집중적으로 논의한다. 그 중에서도 나노자임의 활성을 근본적으로 향상시킬 수 있는 기초 연구인 반응 메커니즘에 대하여 철 산화물 및 탄소 소재 각각에 대하여 논의한다. 특히 최근 가장 관심 받고 있는 접근법인 단 원자 (single-atom) 기반의 나노자임 연구를 포함하여, 촉매 활성을 향상시키기 위한 다양한 연구 방향에 대하여 각 소재별로 대표적인 사례를 들어 논의할 것이다. 마지막으로, 페록시다아제 모방 나노자임의 주요 활용 분야인 바이오센서 분야 활용 및 연구 동향에 범위를 국한하여 집중적으로 논의하고자 한다.


2. RESULTS AND DISCUSSION
2.1. 페록시다아제 나노자임
2.1.1. 철 산화물 (iron oxide) 기반 페록시다아제 나노자임

과산화수소 분해 효소인 페록시다아제는 활성 산소종(reactive oxygen species, ROS)를 중화시키거나, 병원체에 대항하여 생체를 지킬 수 있기 때문에 특히 생물학적 시스템에서 중요하게 여겨졌다. 페록시다아제의 주요 반응식은 다음과 같다.

AH2+H2O22A+2H2O(1) 

위 반응식에서, 페록시다아제는 기질인 과산화수소와 결합하여 또다른 기질인 수소 공여체 (AH2)와 반응하여 자유 라디칼을 발생시킨다. 기존의 고추냉이로부터 추출한 천연 페록시다아제 (horseradish peroxidase, HRP)를 이용하여 위의 과산화수소 분해 반응이 관여하는 생체 물질(포도당과 같은작은 분자들, DNA, cell, protein 등)을 검출 및 분석하거나, 체내 (in-vivo) 이미징을 관찰하는 데 널리 쓰인다. 그러나 기존의 단백질로 이루어진 천연 효소는 작동 pH 와 온도에서 제한이 있으며, 낮은 안정성과 내구성, 그리고 낮은 경제성에서 단점이 있었다. 그러므로, 페록시다아제의 촉매 활성을 모방하는 나노자임을 제조하기 위한 연구가 많은 연구진에 의하여 진행되었다.

그 중에서도 가장 먼저 Fe3O4 철 산화물이 페록시다아제 모방 나노자임으로 보고되었다. 철 산화물은 일반적으로 높은 생체 적합성을 갖는 것으로 알려져 있으며, 입자의 표면을 생체 친화적 고분자로 코팅함으로써 안정성을 더하여 생체 및 의료 목적으로 폭 넓게 연구되어 왔다. 2007년 Yan과 공동연구자들이 철 산화물 나노입자의 천연 페록시다아제와 비견할만한 높은 활성을 보고한 후 [1], 철 산화물을 이용한 페록시다아제 모방 나노자임 연구가 매우 활발하게 진행되었다. 이 연구에서 Fe3O4 나노 입자는 과산화수소의 존재하에서 발색성 시약인 3,3,5,5-tetramethylbenzidine (TMB)를 산화시켜 푸른 색을 띠게 하는 발색 반응을 효과적으로 촉매하였다. 다른 발색성 시약인 di-azo-aminobenzene (DAB)와 o-phenylenediamine (OPD)를 TMB 대신 썼을 경우, 각각 갈색과 오렌지색으로 변하는 발색 반응을 관찰할 수 있으며, 흡광도 측정을 통해 천연 페록시다아제와 유사한 촉매 활성이 측정되었다 (Fig. 1). 이 실험에서 나노자임의 촉매 활성은 기존 촉매와 유사한 특징인 나노 입자에 대한 크기 의존성을 보이며, 작은 크기의 나노자임은 더 높은 활성을 보였다. 나노자임의 촉매 활성은 천연 페록시다아제와 마찬가지로 온도와 pH에 의존하지만, 내구성 측면에서 큰 장점을 보인다. 즉, 천연 페록시다아제와 비교하여 비교적 넓은 온도 범위 (4~90℃) 및 pH 범위 (0-12)에서 처리 후에도 촉매 활성이 안정적으로 유지되었다.


Fig. 1. 
(a) TEM images of Fe3O4 nanoparticles with different sizes, (b) Color change from colorless to specific colors due to colorimetric reactions (blue: 3,3,5,5-tetramethylbenzidine (TMB), di-azo-aminobenzene (DAB), o-phenylenediamine (OPD) [1].

촉매의 활성은 겉보기 정상 상태에서의 kinetics 파라미터에 의하여 비교될 수 있다. 위의 과산화수소와 TMB 시스템에서 Fe3O4의 과산화수소 분해 반응은 천연 촉매와 유사한 Michaelis-Menten Kinetics를 따르기 때문에, 정상 상태의 kinetics 결과를 분석하면 페록시다아제 반응의 기질 농도에 따른 평행한 Lineweaver-Burk 플롯이 관찰된다. 즉, Km, Vmax, kcat를 결정하여 효소의 기질에 대한 친화도(Km)와 촉매 효율 (kcat or kcat/Km)을 분석할 수 있다. 천연 페록시다아제와 비교하였을 때 나노자임의 더 높은 Km은 나노자임의 과산화수소에 대한 친화성이 낮음을 의미한다. 반면, TMB에 대한 Km은 천연 페록시다아제와 비교하여 더 낮은 값을 가져, TMB에 대한 더 높은 친화도를 나타낸다. 전체 촉매 속도를 의미하는 속도 상수 kcat의 높은 값은 Fe3O4 나노자임이 천연 페록시다아제보다 40 배 가량 더 빠르게 반응한다는 것을 나타냈다. 게다가, Fe3O4 나노자임은 천연 페록시다아제와 같은 핑퐁 (ping-pong) 메카니즘을 갖는 것으로 보이는데, 이 메카니즘에서 나노자임은 첫번째 기질인 과산화수소와 결합되어 반응하면서 중간 상태인 수산화 자유 라디컬 (· OH)를 형성하며, 생산된 자유 라디컬은 TMB와 같은 수소 공여체의 H+이온을 당기게 된다. 이러한 메커니즘은 전자 스핀 공명 (Electron spin resonance, ESR) 분석을 통해 과산화수소 분해 반응 동안 생성된 · OH 중간체를 확인하면서 좀 더 명확해졌다. 이러한 자유 라디칼 중간체는 반응 특이성을 갖지 않기 때문에, 이론적으로 수소 공여자로 작용할 수 있는 화학종은 모두 과산화수소 분해 반응의 잠재적 기질이 될 수 있다.

그 후, Fe3O4 나노자임을 이용하여 과산화수소와 포도당을 감지할 수 있는 감지 플랫폼이 보고되었으며 [17,18], 이를 시작으로 다양한 종류의 어플리케이션이 보고되어 Fe3O4 나노 소재는 가장 광범위하게 연구되어 왔다. 촉매 반응 조건의 비표준화로 인해 파라미터들의 직접적인 비교는 힘들지만, 가장 대표적인 철 산화물 기반의 페록시다아제 모방 나노자임과 촉매 활성 파라미터들이 Table 1에 정리되었다. Fe3O4뿐만 아니라, Fe2O3 (hematite) [19,20], 철 인화물 [21], 그리고 금속-유기물 구조체 중 하나인 프러시안 블루 (Prussian Blue, PB) [22,23], 그리고 철과 다른 전이 금속이 섞인 두 개 이상의 이종 금속 철 산화물 [24] 등 다양한 철 기반의 나노 물질이 페록시다아제 모방 나노자임으로 연구되었다.

Table 1. 
Kinetic parameters of HRP and some typical nanozymes.
Substance Km (mM) Vmax (10-8 M s-1) kcat (s-1) References
Fe3O4 TMB 0.098 3.44 8.58 × 104 [1]
H2O2 154 9.78 3.02 × 104
GO-COOH TMB 0.0237 3.45 [25]
H2O2 3.99 3.85
CQDs TMB 0.039 3.61 [30]
H2O2 26.77 30.61
Fe3O4 NPs TMB 0.2411 65.5 3.1 × 105 [28]
Carbon NPs TMB 0.1037 56.2 2.6 × 104 [28]
Au NPs TMB 0.1277 27.5 8.1 × 102 [28]
HRP TMB 0.4376 138 2.23 × 104 [28]

2.1.2.탄소 기반 페록시다아제 나노자임

탄소 구조체를 기반으로 하는 페록시다아제 모방 나노자임은 graphene, carbon quantum dots (CQDs), 탄소 나노 튜브 (carbon nanotubes, CNTs) 등 다양한 나노탄소 소재를 이용하여 활발하게 연구되고 있다. 특히, 철 기반의 나노자임은 강자성인 철 입자가 쉽게 뭉쳐 활성을 잃는 단점이 있는데, 나노탄소의 경우 표면 개질된 탄소의 높은 용액 분산성으로 인해 장기간의 안정성 및 내구성에서 유리하다. 탄소 나노자임 연구는 카르복실 그룹으로 개질된 graphene oxide (GO-COOH)가 고유의 페록시다아제 활성을 갖는 것으로 보고되면서 [25] 활발하게 연구되었다. 밀도 범 함수 이론 (Density functional theory, DFT)에 기반한 컴퓨터 시뮬레이션과 계산에 의하여, 카르복실과 카르보닐 기로 개질된 탄소의 특정 활성 사이트에서 과산화수소가 · OH로 분해되고, 생성된 · OH에 의해 기질이 산화되는 메커니즘이 밝혀졌다 [26]. 그 후 후속 실험에서 특정 표면 작용기를 최적화하여 표면에 수산화기를 최소화하고 카르보닐 및 카르복실기를 최대화한 oxygenated graphene quantum dots (o-GQDs)을 제조하였고 (Fig. 2), 높은 페록시다아제 촉매 활성을 보고하였다 [27]. 카르복실산이 풍부한 o-GQDs은 H2O2에 대하여 기존의 GQDs와 비교하여 5배 낮고, 천연 효소인 천연 페록시다아제 보다도 낮은 Km과, 처리하지 않은 GQDs와 비교하여 세 배 높은 Vmax 값을 보였다. graphene 이외의 다른 나노탄소 소재 들, 즉 single-walled carbon nanotubes (SWCNTs), multi-walled CNTs (MWCNTs), fullerene, CQDs 등의 다양한 탄소 소재들이 페록시다아제 활성을 갖는 것으로 보고되었다. 그러나, 일반적으로 탄소의 페록시다아제 활성은 천연 HRP에 비하여 낮다. 최근, 탄소 나노소재에 질소를 도핑하여 제조한 나노자임은 페록시다아제 활성 뿐만 아니라 기질 특이성 또한 향상되는 것으로 보고되었다 [10]. DFT에 입각한 시뮬레이션 분석에 의해, 질소가 도핑된 탄소 활성점 고유의 과산화수소에 대한 높은 선택성으로 인해 나노자임의 기질 특이성과 촉매 활성이 모두 향상되는 것으로 밝혀졌다. 최근 페록시다아제의 촉매 kinetics 파라미터를 측정하는 방법에 대한 표준화된 분석 프로토콜이 보고되었으며 [28], 그에 따른 표준화된 반응 조건에서 Fe3O4 나노입자, 금 나노입자, 탄소 나노 입자 및 HRP의 kinetics 파라미터 또한 Table 1에 추가하였다. 앞으로 신뢰할 수 있는 나노자임의 특성 비교를 위하여 더욱 많은 종류의 나노자임에 대하여 표준화된 실험적 프로토콜이 필요하다.


Fig. 2. 
(a) Synthetic process for oxygenated graphene quantum dots (o-GQDs) (b) TEM image (inset: HR-TEM image), (c) AFM image of o-GQDs [27].

2.1.3. 다중 기능성 활성을 갖는 나노자임

Fe3O4 나노자임은 페록시다아제 뿐만 아니라 카탈라아제의 활성 또한 모방 할 수 있다. 두 가지 천연 효소는 공통적으로 활성점에 porphyrin heme를 포함하고 있으며, 기질로 과산화수소를 사용한다. 전자는 수소 공여체 (AH2)와 반응할 수 있는 · OH 자유 라디컬을 발생시키지만, 후자는 산소를 생성한다. 카탈라아제 활성 또한 기질과 최적의 pH와 온도를 포함하여 천연 효소와 유사한 전형적인 촉매 특징뿐만 아니라 천연 효소와 유사한 메커니즘을 갖는 것으로 밝혀졌다. 카탈라아제의 과산화수소 분해 반응은 다음과 같다.

2H2O2O2+2H2O(2) 

최근 철 기반의 나노 물질인 프러시안 블루 나노입자 (PB NP)는 산성 조건에서 활성 산화종 (ROS)를 효과적으로 제거하는 활성을 가지고 있음이 보고되었다 [23]. 이 연구에서, PB NP는 페록시다아제 뿐만 아니라 카탈라아제 및 과산화물 제거효소 (SOD)를 모방하는 다중 활성을 가짐이 밝혀졌다. TMB을 기질로 사용하였을 경우, PB NP의 kcat은 Fe3O4 NP보다 4 배 더 크다고 보고되었다. 이러한 높은 페록시다아제 촉매 활성은 산화 상태에 따라 달라지는 PB의 표준 환원 전위로 설명할 수 있다. Fig. 3에서 페록시다아제-모방 촉매 메커니즘은 다음과 같이 설명된다: 산성 조건에서 H2O2의 산화되려는 경향이 강하고, PB는 베를린 그린 (BG)나 프루시안 옐로우 (PY)로 좀 더 쉽게 산화된다 (Fig. 3의 reaction 2,3). Fig. 3a에서, PY/BG의 전위는 1.4 V이고, 이것은 TMB의 산화-환원 전위 (1.13 V)와 H2O2/H2O의 산화-환원 전위인 1.776 V 사이에 있으므로, 전자는 PY/BG에 의해 쉽게 TMB에서 H2O2로 전달된다. 이러한 과정을 거쳐, TMB는 H2O2의 존재 하에서 쉽게 산화된다. (반응4, Fig. 3(b)). 후속 연구에서, 프러시안 블루와 철 기반의 다종 금속 물질(CuFe, FeCoFe, and FeCo)의 페록시다아제 활성 비교 및 글루코스 탐지 성능 또한 비교되었다 [22].


Fig. 3. 
(a) The multi-catalytic activity of PB NPs and the standard reduction potentials corresponding to each reaction, (b) the reaction mechanism of PB in the H2O2-3,3,5,5-tetramethylbenzidine (TMB) system [23].

나노탄소 소재 또한 페록시다아제 및 과산화물 제거효소 (SOD) 모방 활성을 동시에 갖는 것으로 보고되었다. 최근, 촉매 활용 연구에서 가장 유망한 접근법인 단원자 (single-atom) 촉매의 다기능성 촉매 활성이 보고 되었다 [29]. 불균일계 (heterogeneous) 단일 철 원자 촉매의 페록시다아제, 옥시다아제 및 카탈라아제 모방 활성은 Fe3O4 나노자임의 활성을 40배 초과한다고 보고되었다. 천연의 옥시다아제, 페록시다아제, 카탈라아제 등이 공통적으로 갖는 heme 구조를 모방하여 제조한, 철 입자와 질소로 구성된 Fe-N4 활성점은 Fe3O4 나노자임에 비하여 훨씬 높은 촉매 활성과 동시에 높은 안정성을 갖는다.

2.2. 촉매 활성을 높이기 위한 접근법

대부분 나노자임의 촉매 특성은 천연 촉매 고유의 높은 기질 특이성과 촉매 활성과 비교했을 때 아직 미치지 못한다. 그러나, 나노 물질의 화학적, 물리적 성질을 설계하여 나노자임의 촉매 특성을 제어할 수 있으며, 이에 따라 나노자임의 활성 및 기질 특이성을 높이기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. 나노자임의 촉매 특성을 제어하기 위하여 나노 구조 및 화학적, 물리적 특성을 설계하는 나노 기술을 이용한 다양한 접근법에 대하여 논의한다.

2.2.1. 온도, pH, 기질 농도 등 촉매 반응의 조건 최적화

나노자임은 천연 페록시다아제 효소와 유사한 촉매 특성을 갖는다. 즉, 나노자임의 촉매 활성은 온도 및 pH, 그리고 기질의 농도에 의존하며, 최적의 조건에서 활성은 극대화된다. 그러나, 나노자임은 천연 촉매와 비교하여 비교적 높은 온도와 강산 혹은 강염기 등의 가혹 조건에서도 촉매 활성을 유지할 수 있다. 페록시다아제 활성은 또한 천연 효소처럼 높은 과산화수소 농도에서 활성이 감소하는데, 이는 천연 페록시다아제와 같이 인공 촉매 또한 핑퐁 메커니즘을 따름을 의미한다.

2.2.2. 나노입자의 크기

대부분의 무기 촉매 입자처럼, 나노자임 또한 입자의 크기에 많은 영향을 받는다. Fe3O4 나노 입자의 경우, 30, 150, 300 nm의 입자 크기 중 Fe3O4의 페록시다아제 촉매 활성은 30 nm 크기의 나노 입자가 가장 높았으며, 300 nm의 활성은 가장 낮았다 [1]. 이것은 더 작은 나노 입자가 기질에 대하여 쉽게 접근할 수 있기 때문이다. 또한, 탄소 나노자임의 경우 graphene 산화물에 비하여 훨씬 크기가 작은 CQDs의 경우 페록시다아제 모방 촉매 활성을 비교하였을 때 graphene 산화물보다 5배 높은 활성이 보고되었다 [30].

2.2.3. 나노 구조

나노자임의 촉매 성능은 또한 나노 구조에 크게 의존한다. Fe3O4 나노자임을 다양한 구조로 제조하여 각각의 페록시다아제 활성을 비교하고 분석한 결과, 페록시다아제 촉매 활성의 나노 구조에 대한 의존성이 보고되었다 [31,32]. 예를 들어, 구형의 Fe3O4 나노입자는 깎은 정팔면체 (truncated octahedron) 구조에 비하여 촉매 활성이 낮은 것으로 보고되었다. 이러한 형태 의존성은 서로 다른 Fe3O4 나노 입자의 결정면(facet)에서의 에너지 차이로 설명된다. 즉, 철 원자 또는 철 결정면의 (110)과 같은 높은 에너지면을 우선적으로 과산화수소 분해 반응에 노출시켜 촉매의 활성을 향상시킬 수 있다. 탄소 나 노자임의 경우, 이차원적 면을 갖는 graphene과 비교하여 모서리면이 좀 더 노출된 탄소 나노 튜브 구조 (CNTs), 탄소 양자점 (CQDs), nanohorn 등의 나노 구조는 향상된 촉매 활성을 갖는 것으로 보고되었으며, 그에 따라 다양한 크기와 나노 구조를 갖는 탄소 소재들이 연구되고 있다.

2.2.4. 소재의 복합화, 하이브리드화

페록시다아제 모방 나노자임 연구에서, 최근 가장 각광받고 있는 접근법은 나노자임 촉매 입자와 탄소 소재를 결합하여 복합체를 형성하는 것이다. 철과 질소를 탄소 소재에 동시에 도입하면 시너지 효과가 일어나 페록시다아제 활성을 크게 향상시킬 수 있다. 이러한 금속-탄소 복합체에서 탄소의 역할은 크게 두 가지인데, 첫 번째는 탄소 나노구조에 촉매 입자를 담지하여, 금속 또는 금속 산화물의 높은 표면 에너지로 인해 쉽게 뭉쳐서 촉매 활성을 잃는 것을 방지한다. 그와 동시에, 높은 표면적과 전도도를 갖는 탄소 나노 구조가 촉매 나노입자의 활성을 높이는 시너지 효과를 일으킨다. 두 번째는 탄소 나노물질 고유의 촉매 활성이 전체 촉매 활성에 기여할 수 있다. 철 입자 이외에, 활성 및 내구성을 높이기 위하여 다양한 종류의 금속 산화물, 칼코게나이즈 계열의 금속 파생물, 귀금속을 포함하는 금속 입자들, 그리고 금속과 유기물 복합체 등이 탄소와 결합되어 나노자임으로 연구되었다. 특히 철 나노 입자가 탄소와 결합되어 복합체를 형성하면 탄소 매트릭스 사이로 입자들이 고르게 분산되어 작은 크기를 유지할 수 있기 때문에 높은 촉매 활성을 오랫동안 유지할 수 있다. 예를 들어, 철과 질소 복합체인, porphyrin 구조의 hemin과 graphene은 π–π상호작용으로 결합되어 페록시다아제 모방 나노자임이 보고되었다 [33]. 이 복합 나노자임에서 hemin은 기질이 흡착되어 과산화수소 분해 반응이 진행되는 활성점을 제공하고, hemin은 높은 전도도를 갖는 graphene 탄소 매트릭스로 연결된다. 이러한 hemin-graphene의 결합은 iron-porphyrin 구조가 깨지는 것을 막고 hemin의 높은 촉매 활성을 유지시킨다.

하이브리드 나노자임은 특히 두 가지 서로 다른 활성을 갖는 촉매를 하나의 matrix로 결합시켜 제조할 수 있다. 각기 다른 활성을 갖는 천연 효소와 나노자임을 결합시키거나, 서로 다른 나노자임을 결합하여 일련의 연속 반응을 촉매하는 하이브리드 나노자임을 제조한다. 예를 들어, 천연 글루코스 산화 효소 (GOx)효소와 페록시다아제 모방 나노자임을 결합시켜 음료수나 혈당 포도당을 검출할 수 있다. 최근, GOx를 모방할 수 있는 금 입자 (Au NP)와 페록시다아제를 모방하는 2D 금속-유기물 구조체 (tetrakis(4-carboxyphenyl)porphyrin, TCPP)를 결합하여 제조한 하이브리드 나노자임은 포도당을 검출하는 연속 반응을 촉매 할 수 있음이 보고되었다 [34] (Fig. 4).


Fig. 4. 
(a) The cascade reaction for glucose detection with hybrid Au NPs/Cu-TCPP(M-TCPP, M = Fe,Co), (b),(c) UV-vis absorption spectra of 3,3,5,5-tetramethylbenzidine (TMB) solution. It is observed that the absorption of a specific wavelength is increased by the colorimetric reaction with H2O2 [34].

2.2.5. 표면 개질

다양한 방법으로 나노자임의 표면을 개질하여 나노자임의 특성을 제어할 수 있다. 특히, 코팅하는 물질의 종류, 코팅의 두께, 그리고 그로 인한 표면의 전하의 종류에 따라 나노자임의 촉매 활성이 크게 달라질 수 있다. 예를 들어, Fe3O4 입자 표면을 SiO2, 3-aminopropyltriethoxysilane, polyethylene glycol, dextran 등의 다양한 화합물로 코팅하여 촉매 활성을 측정했을 때, dextran이 생체 적합성을 제공함과 동시에 촉매 활성을 가장 높게 유지하는 것이 관찰되었다 [1]. 후속 연구에서, 촉매 입자의 표면 개질을 통해 특정 전하를 띠도록 유도하면, 정전기적 상호작용을 이용하여 기질에 대한 친화도와 촉매 활성을 제어할 수 있다. Fe3O4 나노 입자의 표면을 glycine, polylysine, poly(ethyleneimine)로 개질하여 양전하로 하전시키면 음 이온성인 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid (ABTS)의 산화(발색) 반응에 더 높은 활성을 보이지만, 반대로 citrate, carboxymethyl dextran, and heparin를 이용하여 음전하로 하전시킨 Fe3O4 나노 입자는 양 이온 성인 TMB 를 기질로 하는 산화 반응에 더 높은 촉매 활성을 보인다 [35]. 또한 표면 코팅이 두꺼워지면 나노자임의 활성점이 가려지고 기질과의 접촉이 방해되어 촉매 반응 속도가 저해된다. 최근에 페록시다아제 모방 나노자임의 나노 입자 표면을 single-stranded DNA(ss-DNA)로 개질하면 촉매 활성을 향상시킬 수 있음을 보고되었다 [12,36]. DNA 개질은 나노입자의 표면 전하를 양성에서 음성으로 변화시켜 양 이온성 TMB 기질에 대한 친화성을 높일 수 있다. 반대로 음 이온성 ABTS가 기질로 사용될 때 페록시다아제의 촉매 활성은 감소한다.

일반적으로 천연 효소의 뛰어난 활성은 대응하는 기질에 대한 기질 특이성에서 기인한다. 그러므로 천연 촉매의 미세 구조를 모방하기 위하여 Fe3O4 나노입자의 표면을 아미노산인 histidine으로 개질하여 나노자임과 H2O2와의 상호작용을 강화하는 접근법 또한 보고되었다 [11]. 또한, 천연 페록시다아제의 Fe-porphyrin으로 이루어진 hemin 구조를 모사하는 Fe-N-C 촉매는 노출된 hemin 가장자리에서 기질이 결합되고 Fe-N4 중심에서 촉매 반응이 진행되는 것으로 밝혀졌다 [37,38]. 최근 Fe3O4 입자를 형상 기억 고분자로 코팅한 후 TMB 분자를 imprint 하여 TMB 분자에 대하여 높은 선택성을 갖는 특정화된 일종의 pocket을 만드는 연구가 보고되었다 [39] (Fig. 5). 이를 이용하면 TMB 분자 구조로 imprint된 고분자로 인해 TMB 기질에 대한 기질 특이성을 향상시킬 수 있으며, 촉매 반응의 선택성 및 활성 또한 향상시킬 수 있다.


Fig. 5. 
(a) Fe3O4 nanozyme without the substrate selectivity for 3,3,5,5-tetramethylbenzidine (TMB)/ABTS, (b) molecular imprinted Fe3O4 nanozyme with substrate selectivity for TM [39]

2.2.6. 단원자 (single-atom) 나노자임을 위한 접근법

최근, 원자 크기로 분산된 단일 원자 촉매는 무기물 기반의 촉매 연구에서 새로운 접근법을 제시하고 있다. 단원자 (single-atom) Fe를 중심으로 질소 원소가 결합된 탄소 나노 복합체가 포함하는 원자 크기의 Fe-Nx 활성점 또한 우수한 페록시다아제 활성을 가짐이 보고되었다 [37,40] (Fig. 6). 천연 효소에 존재하는, 철 이온과 포피린의 배위 결합으로 생성되는 heme을 모방하여 철 단원자를 중심으로 철 이온과 포피린을 결합시켜 제조한 단원자 나노자임의 경우, heme의 가장자리 부분의 노출도를 높여 기질에 대한 선택성을 높이고 그에 기인하는 높은 활성을 기대할 수 있다. 특히, 금속-유기물 구조체와 철의 결합을 이용하여 제조한 heme를 갖는 단원자 촉매는 페록시다아제, 옥시다아제와 카탈라아제를 모두 모방할 수 있는 촉매 능력을 갖는 것으로 밝혀졌고 [37], Fe-N4 활성점에서 H2O2분자는 H2O로 해리되면서 O = Fe = O 중간체를 형성하는 촉매 반응 메커니즘은 DFT 계산에 의하여 분석되었다 [29]. Fe-N4뿐만 아니라, 아연으로 이루어진 Zn-N4 활성점 또한 페록시다아제 모방 단원자 촉매로 보고되었다 [41]. 불포화된 Zn-N4 활성점에서 H2O2의 분해와 수산화 자유 라디컬(· OH)이 형성되는 유사한 페록시다아제 모방 촉매 메카니즘 또한 DFT를 이용한 컴퓨터 계산 및 시뮬레이션을 이용하여 분석되었다.


Fig. 6. 
The synthetic process for single-atom based Fe-Nx nanozyme mimicking heme in HRP, and its application to paper bioassays [40].

2.3. Biosensor Applications

현재까지 나노 자임은 광범위한 응용 분야에서 높은 가능성을 보여 왔다. 특히 나노자임의 제어 가능한 물리적, 화학적 특성 및 촉매 작용을 통해 많은 나노 자임 기반 플랫폼 기술이 개발되었으며, 생물학적 검출, 질병 진단 및 의약품 개발에 적용될 수 있다. 예를 들어 표적 항체가 결합 된 강자성 나노 자임은 표적 포획, 자기 분리, 검출을 위한 발색 반응의 세 가지 기능을 동시에 제공한다. 또한, 탄소 소재의 SOD 모방 나노 자임은 ROS의 축적을 제거함으로써 효과적인 신경 보호성 항산화제로 활용될 수 있다. 본 리뷰에서는 나노자임의 많은 응용 가능성 중, 페록시다아제 모방 나노자임의 주된 응용 분야인 바이오 센싱 분야에 대하여 집중적으로 다룬다. 특히, 과산화수소, 작은 분자, DNA, 단백질 및 암 세포 등의 검출을 위한 바이오 센싱 분야에 대하여 논한다. 페록시다아제 모방 나노자임의 바이오센서로의 활용은 크게 세 가지로 나뉘어진다. 첫 번째로 나노자임을 이용하여 과산화수소 분자를 검출할 수 있다. 즉, 과산화수소의 분해 반응에서 관찰되는 변화를 통해 과산화수소의 존재 및 농도를 탐지할 수 있다. 두 번째는 일련의 연속 반응(cascade reaction)을 통해 과산화수소를 만들어내는 분자를 탐지할 수 있다. 예를 들어 글루코스가 글루코닉 산으로 산화됨과 동시에 과산화수소를 생성할 경우, 이를 다시 페록시다아제 모방 반응을 통해 분해하면서 생기는 변화를 통해 글루코스를 탐지할 수 있다. 마지막으로, 과산화수소에 의해 산화될 수 있는 분자들을 탐지할 수 있다. 즉, 과산화수소가 분해되려면 수소를 제공할 수 있는 수소 공여체가 필요한데, 페록시다아제 모방 나노자임을 이용하여 수소 공여체를 탐지할 수 있다.

2.3.1. 과산화수소 탐지

과산화수소 분해 반응은 위에서 언급한 것처럼 두 가지 기질을 필요로 하는데, 첫번째는 과산화수소 분자이며, 두 번째는 수소를 제공할 수 있는 수소 공여체이다. 페록시다아제가 과산화수소를 분해할 때 TMB, ABTS 등의 수소 공여체가 수소를 제공하면서 산화됨과 동시에 무색에서 특정 색으로 변하는 발색 반응이 진행된다 [42] (Fig. 7). 그러므로, H2O2의 농도는 특정 흡광도의 변화를 측정함으로써 정량화 될 수 있다. 표색계 (Colorometric) 방법 이외에도, 기질 선택의 다양성으로 인해 형광 (fluorescence), 전기화학적, 그리고 표면 라만 산란법 (surface enhanced Raman scattering, SERS) 방법 등을 이용하여 과산화수소의 탐지가 가능하다. 예를 들어, 촉매 입자인 Cu2+와 형광 물질인 Tb3+를 금속-유기물 구조체 (metal-organic framework, MOF)안에 하이브리드화 시키면, H2O2의 촉매 반응이 일어남과 동시에 Tb3+를 활성화하여 강한 형광 빛을 발산시킬 수 있다 [43]. 또한, 수소 공여체 없이 과산화수소를 분해시켜 산소로 만드는 카탈라아제 모방 나노자임인 CeO2에 Eu3+를 도핑함으로써 다른 종류의 과산화 탄소 탐지 나노자임이 보고되었다 [44]. 이 카탈라아제 모방 발광 나노자임은 H2O2를 O2로 분해함과 동시에 나노입자의 발광을 촉진하여 과산화탄소를 검출할 수 있다.


Fig. 7. 
Degradation of hydrogen peroxide in peroxidase-mimicking nanozyme. The substrate in this figure provides the hydrogen molecules in this reaction as a hydrogen donor [42].

2.3.2. 과산화수소 H2O2를 생산할 수 있는 생체 분자 검출

과산화수소는 종종 다른 반응의 생성물로서 만들어질 수 있기 때문에, 일련의 캐스케이드 반응을 통하여 과산화수소를 생산할 수 있는 분자를 검출할 수 있다. 예를 들어, Fe3O4 나노자임은 GOx와 결합되어 포도당을 포함하는 다양한 기질을 검출할 수 있다 [45]. GOx는 포도당과 산소가 만나 산화되면서 과산화수소를 생산하는 반응을 촉매 하고, 그 후 생산된 과산화수소가 페록시다아제에 의해 분해되면서 수반되는 반응을 검출하는 연속 반응이 진행된다. TMB와 같은 발색 기질의 존재 하에 포도당 농도에 비례하는 색 신호를 검출하며, 이러한 방식으로 3μM의 포도당 검출이 가능한 전형적인 포도당 농도 - 반응 곡선을 얻어 포도당 검출을 위한 빠르고, 간단하고, 민감하며, 선택적 색채 측정 방법이 보고 되었다. 이 생체 센서를 이용하여 희석된 혈액이나 시판되는 과일 주스와 같은 실제 샘플에서 포도당을 검출할 수 있었다. 이러한 프로토콜은 포도당뿐만 아니라 과산화수소를 생산하는 반응의 기질인 Galactose, Alcohol, Acetylcholine, Cholesterol 등의 검출에도 성공적으로 적용되었으며 [46] (Fig. 8), 대응 하는 각각의 효소들의 존재 하에서 해당 기질을 산화시켜 H2O2를 생산함으로써 분자들을 검출할 수 있다.


Fig. 8. 
(top) Cascade reaction with peroxidase-mimic iron oxide nanozymes, (bottom) Various types of substrates capable of producing hydrogen peroxide and corresponding reactions [46].

포도당을 분해시키는 GOx는 해당 반응을 모방하는 나노자임으로 다시 대체될 수 있다. 예를 들어, GOx를 대체하는 금 나노 입자는 페록시다아제 모방 나노자임인 Fe3O4 나노 입자의 표면에 조립되어 포도당을 감지하는 일련의 순차적인 반응을 일으킨다 [47]. 이러한 캐스케이드 반응이 일어나는 나노 반응기는 0.5 μM의 검출 한계로 글루코스 농도를 검출하여 당뇨병 진단의 혈당 측정 키트로 사용할 수 있다.

2.3.3. 핵산 (DNA 및 RNA) 검출

특정한 핵산을 검출하는 연구는 유전학, 임상 진단, 세포학 등의 분야에서 중요한 역할을 담당한다. 특히 악성 종양의 조기 진단 및 위험성을 평가하기 위하여 핵산의 변형을 검출 할 수 있다. 나노 탄소와 DNA와의 결합력 차이를 이용하여 특정 DNA를 탐지할 수 있다. 예를 들어, 금 입자와 탄소 소재 기반의 나노자임은 ss-DNA와 ds-DNA (double-stranded DNA)와 확연히 다른 결합력을 갖는다 [48,49]. 이를 이용하여 ss-DNA와 ds-DNA를 각각 나노자임과 결합하여 과산화수소 분해 반응을 진행시키면, 발색 반응의 결과물의 흡광도를 측정하여 특정 DNA를 탐지할 수 있다. 또한, 돌연변이 dsDNA와 정상인 dsDNA의 나노탄소 물질 (SWCNT and/or graphene)을 결합시키면, TMB와 H2O2의 존재 하에서 진행된 발색 반응 후 흡광도에서 확연한 차이를 보인다. 위와 비슷한 접근법을 이용하여 ss-DNA와 hemin-graphene 나노자임을 결합하여 금속 이온, DNA, 그리고 작은 분자들을 탐지 할 수 있다 (Fig. 9). 즉, 타겟 ssDNA가 결합된 hemin-graphene은 서로 간에 응집현상으로 인해 원심 분리 후 가라앉게 되고, 위의 supernatants를 이용한 H2O2와 TMB의 존재 하에서 진행되는 발색 반응에서 확연하게 페록시다아제 활성이 감소하는 것을 확인할 수 있다 [47]. 마찬가지로, 최근 메조기공을 갖는 Fe2O3 나노자임을 이용하여 대장암 세포에서 추출한 DNA를 검출하는 연구가 보고되었다. 암 세포에서 추출한 변형된 ss-DNA를 전기화학 전극에 흡착시킨 후, 5-methylcytosine 항체로 개질한 Fe2O3 나노자임을 이용하여 target DNA를 검출할 수 있다. 이 때, 5-methylcytosine에 의하여 개질된 Fe2O3 나노자임은 ss-DNA이 흡착된 전극에 흡착되어 TMB의 산화 반응을 촉매하여 청색을 띠거나, 전기화학적 전류 밀도 변화를 통해 검출을 위해 사용될 수 있다 [6].


Fig. 9. 
The schematic illustration of target detection process. The hemin-graphene conjugated with the target DNA is submerged after centrifugation due to aggregation, and then no significant increase of absorption is observed after the colorimetric reaction with the supernatant [50].

2.3.4. 단백질 및 암세포 진단을 위한 ELISA 면역진단

나노자임이 활용되는 응용 분야 중 효소 결합 면역흡수진단법 (enzyme-linnked immunosorbent assay, ELISA)은 체외 진단법 중의 하나로, 이를 통해 특정 단백질을 검출할 수 있다. 검출하고자 하는 항원 물질, 그리고 이와 결합하는 일차 항체, 다시 이와 결합하는 이차 항체를 이용하는데, 나노자임은 이차 항체와 결합되어 결합체와 특정 기질과의 반응을 통해 항원 (antigen)을 검출하는 방식이다. 특히 페록시다아제 나노자임은 이차 항체와 결합되어 위에서 언급한 발색 및 전기화학적 반응을 통해 신호를 증폭시킬 수 있다. 최근 Fe-N-C 페록시다아제 나노자임은 항체와 화학적으로 결합하여 ELISA 측정법을 통해 소화기암 특이항원인 CEA (carcinoembryonic antigen) 검출에 사용되었다 [51]. 또한 Fe3O4/SiO2 나노자임과 anti-CEA를 결합하여 전기화학적 임피던스 측정법 (electrochemical impedance spectroscopy, EIS)를 이용하여 CEA를 검출하는 면역센서가 보고되었다 [52]. 최근 호흡 장애 바이러스 (respiratory syncytial virus) 를 검출하기 위하여 금 입자와 graphene기반의 페록시다아제 나노자임을 이용한 면역진단법이 보고되었다 [53]. 또한, 유행성 바이러스 질병의 경우 특성상 재난 지역에서의 간단하고 빠른 진단이 필요한데, 최근 에볼라 바이러스 (EBOV)를 검출하기 위해 Fe3O4 나노자임을 이용하여 종이 기반의 일종의 스트립 방식의 진단 키트가 보고되었다 [54]. 산화철 기반의 나노자임 스트립은 기존의 금 콜로이달 입자와 비교하여 100배 더 민감하게 신호를 증폭할 수 있다. 또한, ELISA 방식과 비교하였을 때 민감도는 비슷하지만 훨씬 빠르고 (30분 이내), 특별한 장비가 필요 없이 간단하게 사용할 수 있다.


3. CONCLUSION

최근 나노 기술의 급격한 발전에 힘입어, 천연 효소를 대체 할 수 있는 나노자임 연구는 대단한 관심을 받고 있다. 새로운 종류의 나노자임을 개발하고, 나노자임을 생체, 의학, 환경 등 다양한 분야에서 산업적으로 활용하기 위한 프로젝트가 많은 연구 그룹에 의하여 수행되었고 그 결과, 5년간 1100여편의 국제 논문이 출판되었다. 현재 나노자임의 응용 분야는 주로 바이오센서를 이용한 탐지 및 분석에 초점을 맞춰 많은 진보가 이루어졌다. 또한 체내 진단 및 치료, 환경, 항균, 항암 요법, 항산화 등 나노자임의 응용 분야는 점차 확대되고 있으나, 아직 실험 단계에 머무르고 있다.

나노자임은 천연 효소의 많은 단점을 극복하였고, 특히 저비용과 우수한 안정성 및 내구성에서 많은 이점을 갖는다. 그러나, 천연 효소의 고유한 특성인 기질 특이성 (선택도)을 모방하기 위한 연구는 아직 충분하지 않다. 또한 일부 나노자임을 제외한 대부분 나노자임의 촉매 활성은 천연 효소의 촉매 활성과 비교하였을 때 아직 열등하다.

나노자임의 상술한 단점을 보완하기 위하여 현재 가장 유망하게 생각되는 접근법은 효소 모사 반응의 메커니즘 및 활성점을 밝히고 이를 이용하여 나노자임을 설계하고 제조하는 것이다. 나노자임의 메커니즘과 그에 따른 적합한 재료의 선택을 위해, 최근 원자 모델을 이용한 컴퓨터 시뮬레이션 및 메커니즘 연구가 진행되고 있으며, 이에 따라 세 가지 이상의 원소로 구성된 나노자임의 복합 촉매의 활성점과 촉매 메커니즘 또한 밝혀질 수 있다. 본 리뷰에서 다루고 있는, DFT와 같은 계산 시뮬레이션을 토대로 설계 및 연구되고 있는 원자 기반의 나노자임 연구는 이러한 기초 (fundamental) 연구의 대표적인 사례로 볼 수 있다. 또한 나노자임의 특성 한계를 breakthrough하고, 각각의 응용 연구의 수준을 상용화 수준까지 높이는 데 있어서 다양한 분야의 연구자들과의 융합 연구가 필수적이다.


References
1. Gao, L., J. Zhuang, L. Nie, J. Zhang, Y. Zhang, et al, (2007), Intrinsic peroxidase-like activity of ferromagnetic nanoparticles, Nature Nanotech, 2, p577.
2. Comotti, M., C. Della Pina, R. Matarrese, and M. Rossi, (2004), The catalytic activity of “naked” gold particles, Angew. Chem. Int. Ed, 43, p5812-5815.
3. Zhang, H. J., X. Liang, L. Han, and F. Li, (2018), “Non-naked” gold with glucose oxidase-like activity: a nanozyme for tandem catalysis, Small, 14.
4. Mu, X. Y., J. Y. Wang, Y. H. Li, F. J. Xu, W. Long, et al, (2019), Redox trimetallic nanozyme with neutral environment preference for brain injury, Acs Nano, 13, p1870-1884.
5. Ray, C., S. Dutta, S. Sarkar, R. Sahoo, A. Roy, and T. Pal, (2014), Intrinsic peroxidase-like activity of mesoporous nickel oxide for selective cysteine sensing, J. Mater. Chem.B, 2, p6097-6105.
6. Bhattacharjee, R., S. Tanaka, S. Moriam, M. K. Masud, J. Lin, et al, (2018), Porous nanozymes: the peroxidase-mimetic activity of mesoporous iron oxide for the colorimetric and electrochemical detection of global DNA methylation, J. Mater. Chem. B, 6, p4783-4791.
7. He, Y. F., F. Qi, X. H. Niu, W. C. Zhang, X. F. Zhang, and J. M. Pan, (2018), Uricase-free on-demand colorimetric biosensing of uric acid enabled by integrated CoP nanosheet arrays as a monolithic peroxidase mimic, Anal. Chim. Acta, 1021, p113-120.
8. Niu, X., Y. He, J. Pan, X. Li, F. Qiu, et al, (2016), Uncapped nanobranch-based CuS clews used as an efficient peroxidase mimic enable the visual detection of hydrogen peroxide and glucose with fast response, Anal. Chim. Acta, 947, p42-49.
9. Cao, F. F., Y. Zhang, Y. H. Sun, Z. Z. Wang, L. Zhang, et al, (2018), Ultrasmall nanozymes isolated within porous carbonaceous frameworks for synergistic cancer therapy: enhanced oxidative damage and reduced energy supply, Chem. Mater, 30, p7831-7839.
10. Hu, Y. H., X. J. J. Gao, Y. Y. Zhu, F. Muhammad, S. H. Tan, et al, (2018), Nitrogen-doped carbon nanomaterials as highly active and specific peroxidase mimics, Chem. Mater, 30, p6431-6439.
11. Fan, K., H. Wang, J. Xi, Q. Liu, X. Meng, D. Duan, L. Gao, and X. Yan, (2017), Optimization of Fe3O4 nanozyme activity via single amino acid modification mimicking an enzyme active site, Chem. Commun, 53, p424-427.
12. Liu, B., and J. Liu, (2015), Accelerating peroxidase mimicking nanozymes using DNA, Nanoscale, 7, p13831-13835.
13. Wang, Q. Q., X. P. Zhang, L. Huang, Z. Q. Zhang, and S. J. Dong, (2017), GOx@ZIF-8(NiPd) Nanoflower: an artificial enzyme system for tandem catalysis, Angew. Chem. Int. Ed, 56, p16082-16085.
14. Wu, J., X. Wang, Q. Wang, Z. Lou, S. Li, et al, (2019), Nanomaterials with enzyme-like characteristics (nanozymes): next-generation artificial enzymes (II), Chem. Soc. Rev, 48, p1004-1076.
15. Huang, Y. Y., J. S. Ren, and X. G. Qu, (2019), Nanozymes: classification, catalytic mechanisms, activity regulation, and applications, Chem. Rev, 119, p4357-4412.
16. Sun, H. J., Y. Zhou, J. S. Ren, and X. G. Qu, (2018), Carbon nanozymes: enzymatic properties, catalytic mechanism, and applications, Angew. Chem. Int. Ed, 57, p9224-9237.
17. Wang, Q. Q., X. P. Zhang, L. Huang, Z. Q. Zhang, and S. J. Dong, (2017), One-Pot synthesis of Fe3O4 nanoparticle loaded 3D porous graphene nanocomposites with enhanced nanozyme activity for glucose detection, Acs Appl. Mater. Interfaces, 9, p7465-7471.
18. Lu, N., M. Zhang, L. Ding, J. Zheng, C. X. Zeng, et al, (2017), Yolk-shell nanostructured Fe3O4@C magnetic nanoparticles with enhanced peroxidase-like activity for label-free colorimetric detection of H2O2 and glucose, Nanoscale, 9, p4508-4515.
19. Lu, C., X. J. Liu, Y. F. Li, F. Yu, L. H. Tang, et al, (2015), Multifunctional janus hematite silica nanoparticles: mimicking peroxidase-like activity and sensitive colorimetric detection of glucose, Acs Appl. Mater. Interfaces, 7, p15395-15402.
20. Chaudhari, K. N., N. K. Chaudhari, and J. S. Yu, (2012), Peroxidase mimic activity of hematite iron oxides (alpha-Fe2O3) with different nanostructres, Catal. Sci. Technol, 2, p119-124.
21. Wang, W., X. Jiang, and K. Chen, (2012), Iron phosphate microflowers as peroxidase mimic and superoxide dismutase mimic for biocatalysis and biosensing, Chem. Commun, 48, p7289-7291.
22. Vazquez-Gonzalez, M., R. M. Torrente-Rodriguez, A. Kozell, W. C. Liao, A. Cecconello, et al, (2017), Mimicking peroxidase activities with prussian blue nanoparticles and their cyanometalate structural analogues, Nano Lett, 17, p4958-4963.
23. Zhang, W., S. L. Hu, J. J. Yin, W. W. He, W. Lu, et al, (2016), Prussian blue nanoparticles as multienzyme mimetics and reactive oxygen species scavengers, J. Am. Chem. Soc, 138, p5860-5865.
24. Chen, Y., H. Cao, W. Shi, H. Liu, and Y. Huang, (2013), Fe-Co bimetallic alloy nanoparticles as a highly active peroxidase mimetic and its application in biosensing, Chem. Commun, 49, p5013-5015.
25. Song, Y. J., K. G. Qu, C. Zhao, J. S. Ren, and X. G. Qu, (2010), graphene oxide: intrinsic peroxidase catalytic activity and its application to glucose detection, Adv. Mater, 22, p2206-2210.
26. Zhao, R., X. Zhao, and X. Gao, (2015), Molecular-level insights into intrinsic peroxidase-like activity of nanocarbon oxides, Chem. – A European J, 21, p960-964.
27. Wang, H., C. Liu, Z. Liu, J. Ren, and X. Qu, (2018), Specific oxygenated groups enriched graphene quantum dots as highly efficient enzyme mimics, Small, 14, p1703710.
28. Jiang, B., D. Duan, L. Gao, M. Zhou, K. Fan, et al, (2018), Standardized assays for determining the catalytic activity and kinetics of peroxidase-like nanozymes, Nature Protocols, 13, p1506-1520.
29. Zhao, C., C. Xiong, X. Liu, M. Qiao, Z. Li, et al, (2019), Unraveling the enzyme-like activity of heterogeneous single atom catalyst, Chem. Commun, 55, p2285-2288.
30. Shi, W., Q. Wang, Y. Long, Z. Cheng, S. Chen, et al, (2011), Carbon nanodots as peroxidase mimetics and their applications to glucose detection, Chem. Commun, 47, p6695-6697.
31. Fu, S. Y., S. Wang, X. D. Zhang, A. H. Qi, Z. R. Liu, et al, (2017), Structural effect of Fe3O4 nanoparticles on peroxidase-like activity for cancer therapy, Colloids and Surfaces B-Biointerfaces, 154, p239-245.
32. Puvvada, N., P. K. Panigrahi, D. Mandal, and A. Pathak, (2012), Shape dependent peroxidase mimetic activity towards oxidation of pyrogallol by H2O, RSC Advances, 2, p3270-3273.
33. Xue, T., S. Jiang, Y. Qu, Q. Su, R. Cheng, et al, (2012), Graphenesupported hemin as a highly active biomimetic oxidation catalyst, Angew. Chem. Int. Ed, 51, p3822-3825.
34. Huang, Y., M. Zhao, S. Han, Z. Lai, J. Yang, et al, (2017), growth of au nanoparticles on 2d metalloporphyrinic metal-organic framework nanosheets used as biomimetic catalysts for cascade reactions, Adv. Mater, 29, p1700102.
35. Yu, F., Y. Huang, A. J. Cole, and V. C. Yang, (2009), The artificial peroxidase activity of magnetic iron oxide nanoparticles and its application to glucose detection, Biomaterials, 30, p4716-4722.
36. Zeng, C. X., N. Lu, Y. L. Wen, G. Liu, R. Zhang, et al, (2019), Engineering nanozymes using dna for catalytic regulation, Acs Applied Materials & Interfaces, 11, p1790-1799.
37. Ma, W. J., J. J. Mao, X. T. Yang, C. Pan, W. X. Chen, et al, (2019), A single-atom Fe-N4 catalytic site mimicking bifunctional antioxidative enzymes for oxidative stress cytoprotection, Chem. Commun, 55, p159-162.
38. He, F., L. Mi, Y. F. Shen, T. Mori, S. Q. Liu, and Y. J. Zhang, (2018), Fe-N-C Artificial enzyme: activation of oxygen for dehydrogenation and monoxygenation of organic substrates under mild condition and cancer therapeutic application, Acs Applied Materials & Interfaces, 10, p35327-35333.
39. Zhang, Z., X. Zhang, B. Liu, and J. Liu, (2017), Molecular imprinting on inorganic nanozymes for hundred-fold enzyme specificity, J. Am. Chem. Soc, 139, p5412-5419.
40. Cheng, N., J.-C. Li, D. Liu, Y. Lin, and D. Du, (2019), Single-Atom Nanozyme Based on Nanoengineered Fe–N–C Catalyst with Superior Peroxidase-Like Activity for Ultrasensitive Bioassays, Small, pe1901485.
41. Xu, B. L., H. Wang, W. W. Wang, L. Z. Gao, S. S. Li, et al, (2019), A single-atom nanozyme for wound disinfection applications, Angew. Chem. Int. Ed, 58, p4911-4916.
42. Gao, L. Z., K. L. Fan, and X. Y. Yan, (2017), Iron oxide nanozyme: A multifunctional enzyme mimetic for biomedical applications, Theranostics, 7, p3207-3227.
43. Qi, Z., L. Wang, Q. You, and Y. Chen, (2017), PA-Tb-Cu MOF as luminescent nanoenzyme for catalytic assay of hydrogen peroxide, Biosens. Bioelectron, 96, p227-232.
44. Pratsinis, A., G. A. Kelesidis, S. Zuercher, F. Krumeich, S. Bolisetty, R. Mezzenga, J.-C. Leroux, and G. A. Sotiriou, (2017), Enzymemimetic antioxidant luminescent nanoparticles for highly sensitive hydrogen peroxide biosensing, ACS Nano, 11, p12210-12218.
45. Wei, H., and E. Wang, (2008), Fe3O4 magnetic nanoparticles as peroxidase mimetics and their applications in h2o2 and glucose detection, Anal. Chem, 80, p2250-2254.
46. Wang, X., Y. Hu, and H. Wei, (2016), Nanozymes in bionanotechnology: from sensing to therapeutics and beyond, Inorganic Chem. Frontiers, 3, p41-60.
47. He, X., L. Tan, D. Chen, X. Wu, X. Ren, et al, (2013), Fe3O4–Au@mesoporous SiO2 microspheres: an ideal artificial enzymatic cascade system, Chem. Commun, 49, p4643-4645.
48. Poon, L., W. Zandberg, D. Hsiao, Z. Erno, D. Sen, et al, (2010), Photothermal release of single-stranded dna from the surface of gold nanoparticles through controlled denaturating and au−s bond breaking, ACS Nano, 4, p6395-6403.
49. Guo, Y., L. Deng, J. Li, S. Guo, E. Wang, and S. Dong, (2011), Hemin−graphene hybrid nanosheets with intrinsic peroxidase-like activity for label-free colorimetric detection of single-nucleotide polymorphism, ACS Nano, 5, p1282-1290.
50. Tao, Y., Y. Lin, J. Ren, and X. Qu, (2013), Self-assembled, functionalized graphene and DNA as a universal platform for colorimetric assays, Biomaterials, 34, p4810-4817.
51. Yang, W., T. Huang, M. Zhao, F. Luo, W. Weng, et al, (2017), High peroxidase-like activity of iron and nitrogen co-doped carbon dots and its application in immunosorbent assay, Talanta, 164, p1-6.
52. Pan, J., and Q. W. Yang, (2007), Antibody-functionalized magnetic nanoparticles for the detection of carcinoembryonic antigen using a flow-injection electrochemical device, Anal. Bioanal. Chem, 388, p279-286.
53. Zhan, L., C. M. Li, W. B. Wu, and C. Z. Huang, (2014), A colorimetric immunoassay for respiratory syncytial virus detection based on gold nanoparticles–graphene oxide hybrids with mercury-enhanced peroxidase-like activity, Chem. Commun, 50, p11526-11528.
54. Duan, D., K. Fan, D. Zhang, S. Tan, M. Liang, et al, (2015), Nanozyme-strip for rapid local diagnosis of Ebola, Biosens. Bioelectron, 74, p134-141.