The Korean Society For Biotechnology And Bioengineering

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Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 34 , No. 2

[ Research Paper ]
Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 34, No. 2, pp.73-79
Abbreviation: KSBB J
ISSN: 1225-7117 (Print) 2288-8268 (Online)
Print publication date 30 Jun 2019
Received 16 Dec 2018 Revised 04 Apr 2019 Accepted 29 May 2019
DOI: https://doi.org/10.7841/ksbbj.2019.34.2.73

CHO 세포 배양에서 Hexose 혼합 비율 조절에 의한 Albumin-erythropoietin의 Sialylation 증대
김나희 ; 차현명 ; 임진혁 ; 이지훈 ; 한혜진 ; 김동일*
인하대학교 공과대학 생물공학과

Enhanced Sialylation of Albumin-erythropoietin by Controlling Hexose Combination Ratio in Chinese Hamster Ovary Cell Cultures
Na-Hee Kim ; Hyun-Myoung Cha ; Jin-Hyuk Lim ; Ji-Hun Lee ; Hye-Jin Han ; Dong-Il Kim*
Department of Biological Engineering, Inha University, Incheon 22212, Korea, Tel: +82-32-860-7515, Fax: +82-32-872-4046 (kimdi@inha.ac.kr)
Correspondence to : *Department of Biological Engineering, Inha University, Incheon 22212, Korea Tel: +82-32-860-7515, Fax: +82-32-872-4046, E-mail: kimdi@inha.ac.kr


© 2019 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering
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Abstract

Sialylation is very important for in vivo half-life of therapeutic proteins because sialic acids can reduce the rates of clearance in hepatocyte. Many studies were developed for supplementing various carbon sources which directly influcenced cellular metabolism and glycosylation. So it is necessary to investigate interconversion of carbons sources in combination because once they are absorbed into cells and synthesized into nucleotide sugars, they can be converted to different kinds of sugars and nucleotide sugars. Albumin-erythropoietin (Alb-EPO) has three glycan sites with tetra-antennary structure, so it can be added up to 14 sialic acids. Therefore, we demonstrated the effects of combination ratios of hexose (glucose:galactose:mannose) among the generally used carbon sources essential for cell growth on sialylation of a fusion protein, Alb-EPO. As a result, there was no negative effect on cell growth except the condition of the highest concentration. The titer of Alb-EPO was increased depending on increasing concentration of hexoses in order of mannose, glucose, and galactose and reached up to 1.7-fold in comparison to the control. On the other hand, there was more than 1.5-fold increase in sialylation followed by changed nucleotide sugar pool at the conditions supplemented with glucose and galactose at high concentration. In conclusion, our strategy of controlling the concentrations of available carbon sources offers an effective approach for the improved production of highly sialylated Alb-EPO without deleterious effect on growth.


Keywords: albumin-erythropoietin, CHO cell, hexose, sialylation

1. INTRODUCTION

Erythropoietin (EPO)은 1세대 블록버스터 바이오의약품으로 빈혈치료를 목적으로 하는 재조합 당단백질이다. 하지만 체내 반감기가 4~13시간으로 매우 짧기 때문에 환자에게 여러 번 투약해야한다는 단점이 있다. EPO는 3개의 Nglycosylation site를 가지는데 글리칸 말단에 시알산이 부가되지 않으면 hepatocyte에서 발현되는 asialoglycoportein receptor와의 작용 기작에 의해 빠르게 제거 된다 [1]. 따라서 재조합 당단백질의 반감기를 증대시키는 것을 목적으로 Nglycan의 시알산 함량을 증대시키기 위한 많은 연구들이 진행되었다 [2]. 글리칸을 제어하기 위해서는 세포 대사 필수 성분의 조성을 조절하거나, glycosylation 관련 효소 활성에 영향을 주는 물질을 첨가하는 방법이 많이 사용 된다 [3]. 배지에 존재하는 탄소원은 세포 내부로 흡수되어 glycolysis, pentose phosphate pathway 등에 사용되는 동시에 글리칸 합성에 필요한 형태로 전환된다. 따라서 탄소원 첨가 농도가 단백질의 glycosylation에 직접적인 영향을 미치기 때문에 다양한 탄소원을 사용하거나 첨가 농도를 조절하여 글리칸을 조절하려는 시도들이 보고되었다 [4]. 특히 glucose, galactose, mannose 등의 hexose 단당류는 세포 성장에 필수적인 당 성분 중 가장 일반적으로 사용되는 것으로, 첨가 농도에 따른 글리칸 구조의 변화가 생산 단백질의 품질에 직접적인 영향을 미친다 [5-7]. 또한, 당은 세포 내부에서 다른 종류의 당으로 전환되거나 [8], nucleotide sugar로 합성된 후 또 다른 종류로 전환되는 여러 가지 상호 전환 과정을 거치기 때문에 탄소원이 혼합되어 첨가되었을 경우에 상호작용에 의하여 개별적인 첨가와는 다른 글리칸 합성 경향이 나타나게 된다 [9]. 따라서 탄소원 각각의 영향을 확인하는 것에서 그치지 않고 탄소원의 혼합 첨가 시 sialylation에 미치는 영향을 확인하는 것이 필요하다. 또한, 다양한 종류의 탄소원 첨가는 세포배양에 많은 영향을 주기 때문에 글리칸 구조만을 변형시킬 수 있는 최적의 농도를 찾는 것이 중요하다.

본 연구에서는 albumin-erythropoietin (Alb-EPO)을 생산하는 Chinese hamster ovary (CHO) 세포에서 glucose, galactose, mannose 세 가지의 hexose의 비율을 조절하여 첨가함으로써 N-glycan의 sialylation을 증대시키고자 하였다. 혼합 비율이 sialylation에 미치는 영향을 확인하는 동시에 세포 성장 및 단백질 생산성 등을 확인하여 세포대사에 부정적인 영향 없이 목적 단백질의 sialylation을 증대시킬 수 있는 탄소원 성분 비율을 제시하고자 하였다. 또한 이러한 결과가 세포내 nucleotide sugar의 변화에 영향을 미치는지 확인하여 탄소원의 첨가 비율에 따른 영향을 확인하였다.


2. MATERIALS AND METHODS
2.1. 세포 배양

본 연구에서 사용된 세포주는 형질 전환된 CHO 세포로 Alb-EPO 단백질을 생산한다 [10]. 세포 배양에 사용된 배지는 IS CHO-CD XP (Irvine scientific, Santa Ana, CA)이며 8 mM의 L-glutamine을 첨가하여 20 mL의 working volume으로 배양을 진행하였다. 125 mL Erlenmeyer flask (Corning, Corning, NY)에 3×105 cells/mL의 세포를 seeding하여 orbital shaker를 이용하여 100 rpm, 5% CO2가 공급되는 humidified CO2 incubator (Sanyo, Osaka, Japan)에서 배양하였다. 계대 배양은 3일 간격으로 수행하였다.

Table 1. 
Experimental conditions for using different culture media containing various ratio of glucose, galactose and mannose to study their sialylation profiles on Alb-EPO
Run Glucose (mM) Galactose (mM) Mannose (mM) Abbreviation
1 0 0 0 Control
2 L L L LLL
3 L L H LLH
4 L H L LHL
5 H L L HLL
6 L H H LHH
7 H L H HLH
8 H H L HHL
9 H H H HHH
10 Osmotic control (NaCl, 370 mOsm/kg) OC
L, 10 mM; H, 30 mM

2.2. Hexose 첨가

배지에 탄소원으로 hexose인 D-(+)-Glucose (Thermo scientific, Waltham, MA), D-(+)-Galactose (Duchefa, Haarlem, Netherlands), D-(+)-Mannose (Duchefa)를 첨가하였다. 첨가 농도는 glucose, galactose, mannose를 각각 10 mM, 30 mM 두 가지 농도 범위로 설정하였으며 탄소원들이 혼합된 첨가 조건은 Table 1에 나타내었다. 추가로, 배지에 첨가된 탄소원으로 인한 삼투압의 영향을 확인하기 위하여 가장 고농도 조건인 HHH 실험군의 삼투압과 일치하도록 NaCl (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri)을 첨가한 osmotic control (OC) 실험군을 설정하였다.

2.3. 세포 수 및 생존도 측정

배양 중인 CHO 세포를 1일차에서 8일차까지 24시간마다 sampling하였다. 이를 trypan blue (Thermo scientific)와 1:1의 비율로 희석하여 세포를 염색하였다. 그 후에 광학현미경에서 hemocytometer (Marienfeld Superior, Lauda-Königshofen, Germany)를 이용하여 세포 수 및 생존도를 측정하였다.

Viable cell density (cells/mL) =average live cells × dilution factorvolume of a square (mL)
Viability %=Number of live cellsNumber of live + dead cells×100
IVCD cells day/mL=VCD1+VCD22×t2-t1
2.4. Alb-EPO 정량분석

배양과정동안 생산된 Alb-EPO를 정량분석하기 위하여 배양액을 회수한 뒤 sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)의 방법으로 분석하였다. 1st antibody는 goat antihuman albumin antibody (Abcam, Cambridge, MA)를, 2nd antibody는 peroxidase-labeled goat anti-human albumin antibody (Abcam)를 이용하였다. Human serum albumin (Abcam)을 표준물질로 사용하였고, 기질로는 ABTS peroxidase substrate (KPL Inc, Gaithersburg, MD)를 사용하여 발색반응을 진행하였다. Alb-EPO 농도에 따른 기질의 발색 정도는 Multiskan GO Microplate Spectrophotometer (Thermo scientific)를 이용하여 405 nm에서 측정하였다.

2.5. Cell metabolite 분석

배양액 내의 glucose와 lactate 농도를 분석하기 위하여 0일차부터 6일차까지의 배양액을 회수한 뒤 Aminex HPX-87H column (Bio-Rad, Hercules, CA)을 사용하여 ion-exclusion chromatography 방법으로 high-performance liquid chromatography (HPLC)를 이용하여 분석을 진행하였다. HPLC 분석 장비로는 YL9100 HPLC system (Younglin, Anyang, Korea)을 사용하였다. 0.005 M H2SO4를 이동상으로 사용하였고 0.6 mL/min의 유속으로 50분간 흘려주었다. Carbohydrate 분석을 위한 refractive index detector (RID)와 organic acid를 분석하기위한 photodiode array (PDA) detector를 이어서 연결하여 사용하였다. YL9160 PDA detector (Younglin)는 210 nm의 UV wavelength, band width 10, reference 360으로 설정하였고 190 nm에서 600 nm 범위로 spectrum값을 설정하였다. YL9170 RID (Younglin)는 50℃에서 분석하였다.

2.6. Nucleotide sugar 분석

6일차 세포의 내부에 존재하는 nucleotide sugar를 추출하기 위하여 1.5×107 세포를 phosphate buffered saline으로 세척 후, 1,000 g에서 10분간 원심 분리하여 상등액을 제거하였다. 원심 분리된 pellet에 메탄올 수용액 (MeOH : distilled water (DW) = 2 : 0.8)을 280 μL 첨가하고 5초간 2번 반복하여 초음파 분쇄하였다. 여기에 chloroform과 정제수를 각각 200 μL 첨가하여 혼합하여 준 뒤 18,000 g, 4℃에서 10분간 원심 분리를 수행하였다. 분리된 3가지 층 중에서 최상층에 존재하는 nucleotide sugar를 회수하여 동결건조한 후, DW를 50 μL 첨가하고 0.2 μm spin filter (Corning)에 여과하여 HPLC로 분석하였다.

HPLC 분석은 Inertsil ODS-4 HP column (GL Sciences, Tokyo, Japan)을 이용하여 mobile phase A (100 mM potassium phosphate buffer + 8mM tetrabutylammonium hydrogensulphate (pH 6.4))를 100%로 35분 동안 흘려준 뒤, 이어서 40분 동안 100%에서 23%, mobile phase B (70% mobile phase A + 30% acetonitrile)를 0%에서 77%로 농도구배를 주어 분석하였다. 유속과 온도는 계속해서 각각 0.8mL/min과 40℃로 유지하였으며, UV detector를 통해 254 nm에서 nucleotide sugar를 검출하였다. 표준물질로는 uridine diphosphate-N-acetylglucosamine (UDP-GlcNAc; Sigma-Aldrich), uridine diphosphate-galactose (UDP-galactose; Sigma-Aldrich), cytidine monophosphate-Nacetylneuraminic acid (CMP-sialic acid; Sigma-Aldrich)를 혼합하여 사용하였다.

2.7. Alb-EPO의 시알산 함량 분석

배양액을 6일차에 회수한 뒤 Hitrap Blue HP (GE Healthcare, Chicago, IL) column을 이용하여 affinity chromatography 방법으로 Alb-EPO를 정제하였다. 글리칸 말단의 시알산을 정량 분석하기 위해서 정제된 Alb-EPO를100 mM의 HCl과 1:1 (v/v)의 비율로 혼합한 후, 80℃에서 1시간 동안 가수분해하여 시알산을 분리하였다. Sialic acid fluorescence labeling kit (Takara, Tokyo, Japan)를 사용하여 1,2-diamino-4,5-methyleneoxybenzene (DMB) labeling 반응 시킨 뒤 HPLC 분석하였다. Zorbax ODS column (Agilent, Santa Clara, CA)을 이용하여 mobile phase (9% acetonitrile, 7% MeOH, 84% 정제수)를 100%로 30분간 흘려서 분석하였다. 유속은 1 mL/min, 온도는 40℃로 유지하였다. Fluorescence detector (Agilent)를 이용하여 excitation은 373 nm, emission은 448 nm의 파장에서 DMB 표지된 시알산을 검출하였다.


3. RESULTS AND DISCUSSION
3.1. Hexose 혼합 첨가에 의한 cell performance 변화

CHO 세포 배양에서 배지에 glucose, galactose, mannose 세 가지의 hexose를 여러 가지 비율로 혼합하여 첨가할 경우, 세포 성장에 미치는 영향을 확인하였다 (Fig. 1 (a-c)). 가장 고농도의 hexose가 첨가된 HHH 실험군의 경우 viable cell density (VCD)가 저해되는 경향을 보였는데, 이 실험군의 osmolality와 같도록 NaCl을 첨가한 OC에서도 VCD에 부정적인 영향을 미치는 것으로 보아 높은 삼투압에 의해 세포 성장이 저해되었음을 알 수 있었다. 그러나 일정 농도 이하로 첨가된 실험군의 경우에는 VCD와 viability에 유의미한 영향을 주지 않는 것을 확인하였다 (Fig. 1(a,b)). 이러한 영향으로 integral viable cell density (IVCD)에서도 HHH는 control 대비 87.3% 로 감소하였고, OC에서는 77%로 크게 감소하였다 (Fig. 1(c)). 따라서 HHH 실험군을 제외한 농도범위 이내에서의 hexose 첨가는 세포 성장에 부정적인 영향을 미치지 않는 것을 확인할 수 있었다.


Fig. 1. 
Comparison of cell performances by adding hexoses in combination: (a) viable cell density, (b) viability, (c) integral viable cell density, and (d) productivity of Alb-EPO. The error bar represents standard deviation (SD) of experiment in duplicate. (LLL, glucose: galactose:mannose=10 mM:10 mM:10 mM; LLH, glucose:galactose:mannose=10 mM:10 mM:30 mM; LHL, glucose:galactose: mannose=10 mM:30 mM:10 mM; HLL, glucose:galactose:mannose=30 mM:10 mM:10 mM; LHH, glucose:galactose:mannose=10 mM:30 mM:30 mM; HLH, glucose:galactose:mannose=30 mM:10 mM:30 mM; HHL, glucose:galactose:mannose=30 mM:30 mM:10 mM; HHH, glucose:galactose:mannose=30 mM:30 mM:30 mM)

Hexose 혼합 첨가에 따른 Alb-EPO의 생산량을 확인하기 위하여 ELISA 분석을 수행하였다 (Fig. 1(d)). 첨가된 mannose 농도가 증가할수록 Alb-EPO의 생산량이 증가하는 양상을 보였다. Mannose는 mannose-specific transporter를 주로 사용한다고 알려져 있는데 glucose와 galactose와는 달리 별도의 transporter를 사용하여 두 탄소원과 비경쟁적으로 대사되기 때문에 생산량 증가에 큰 영향을 미치는 것으로 사료된다. 또한 mannose를 탄소원으로 사용 시, specific oxygen consumption rate가 감소하여 생산성의 증가로 이어진다는 선행 연구가 보고된 바 있다 [11].

그리고 같은 mannose 농도일 때에는 glucose, galactose 순서로 농도가 증가됨에 따라 생산량이 증대되는 모습을 보여 glucose가 galactose 보다 titer에 긍정적인 영향을 미치는 것을 확인하였다. 이는 glucose가 galactose보다 훨씬 빠르게 glucose transporter 1 (GLUT1)을 통해 전달되기 때문에 대사에 더 큰 영향을 미치는 것으로 생각된다. Mannose-glucosegalactose 농도 증가 순서대로 생산량이 계속해서 증가하다가 세 가지 탄소원이 모두 고농도로 첨가된 HHH 실험군의 경우에 titer 감소가 시작되었다. 이는 삼투압 측정 결과에서 보이는 것처럼 HHH 실험군의 높은 삼투압 등의 이유로 IVCD가 감소하여 생산량 감소로 이어진 것으로 사료된다.

3.2. 배지의 당 조성이 metabolite에 미치는 영향

CHO 세포 배양에서 배지에 첨가되는 당의 종류와 농도를 다르게 하여 혼합 첨가 하였을 때 당을 소모하는 속도와 이로 인한 metabolite의 변화를 측정하기 위하여 HPLC 분석을 진행하였다. 0일차부터 6일차까지 specific glucose consumption rate (qGlc), specific galactose/mannose consumption rate (qGal+Man), specific lactate production rate (qLac)를 측정하였다 (Fig. 2). 예상과 같이 galactose와 mannose에 의하여 qGlc가 크게 감소하는 경향을 보였다 (Fig. 2 (a)). 따라서 glucose가 적고 galactose와 mannose가 많이 들어간 LHH 실험군의 qGlc가 크게 감소하였다. 이는 galactose, mannosse가 glucose와 transporter를 경쟁적으로 사용하여 consumption rate에 영향을 미치기 때문이다. 그러나 glucose 소비 패턴의 변화에도 불구하고 specific lactate production rate (qLac)는 큰 변화가 없었는데 이는 에너지 대사에 필요로 하는 glucose 양보다 많은 glucose가 공급되었기 때문에 lactate 대사에 영향을 적게 미쳤을 것으로 사료된다 (Fig. 2 (c)). 다만 삼투압의 증가에 의한 효과로 농도에 비례하여 qLac가 증가하였으며 가장 고농도 실험군인 HHH와 삼투압 대조군인 OC에서 가장 높은 qLac를 나타내었다.


Fig. 2. 
Comparison of cellular metabolites by addition of hexoses in combination: (a) qGlu, (b) qGal/Man, (c) qLac. Values of each parameter represent mean±SD from experiment in duplicate. (LLL, glucose:galactose:mannose=10 mM:10 mM:10 mM; LLH, glucose:galactose:mannose=10 mM:10 mM:30 mM; LHL, glucose: galactose:mannose=10 mM:30 mM:10 mM; HLL, glucose: galactose: mannose=30 mM:10 mM:10 mM; LHH, glucose:galactose: mannose=10 mM:30 mM:30 mM; HLH, glucose:galactose: mannose= 30 mM:10 mM:30 mM; HHL, glucose:galactose:mannose= 30 mM:30 mM:10 mM; HHH, glucose:galactose:mannose=30 mM :30 mM:30 mM)

따라서 CHO 세포 배양 시 세 가지 종류의 hexose를 혼합하여 첨가하였을 때, galactose와 mannose의 농도가 높아짐에 따라 qGlc가 감소하였으며 lactate 대사 과정은 hexose의 종류에 의해서는 큰 영향을 받지 않았지만 농도에 의해 영향을 받았다.

3.3. 세포 내 nucleotide sugar pool 확인

세포 배양 시 hexose의 첨가에 따른 세포 내부 nucleotide sugar pool (NSP)의 변화를 관찰하고자 하였다 (Fig. 3). N-글리칸 합성에 사용되는 nucleotide sugar 기질인 UDPGlcNAc, UDP-galactose, CMP-sialic acid의 세포 내 함량을 HPLC 방법으로 측정하였다. 모든 당 첨가 조건에서 NSP가 대조군 대비 증가하였으므로 배지에 추가로 첨가된 hexose가 NSP 합성에 있어 긍정적인 영향을 미치는 것을 알 수 있다 (Fig. 3). UDP-GlcNAc은 control 대비 최대 3.10배 (Fig. 3(a)), CMP-sialic acid는 최대 2.46배 (Fig. 3(b)), UDP-Gal은 최대 2.52배 (Fig. 3(c)) 증가하였다. 특히, UDP-GlcNAc의 합성이 증대되고, 이를 기질로 사용하여 UDP-GlcNAc 2- epimerase/N-acetylmannosamine kinase에 의해 CMP-sialic acid로 전환되기 때문에 두 NSP의 변화 경향성이 일치하는 것으로 볼 수 있다 [9]. 당의 첨가 농도에 의존하여 NSP가 증 대되지만 고농도로 갈수록 증가폭이 감소하는 경향을 보였다. 또한 glucose가 가장 크게 NSP를 증대시켰고 다음으로는 galactose가 NSP 증대에 긍정적인 영향을 미쳤다. 하지만 mannose는 UDP-GlcNAc과 CMP-sialic acid 합성에 있어서는 glucose, galacotse보다 영향을 적게 주었다. 마지막으로 OC에서는 UDP-GlcNAc이 control 대비 20% 감소하였는데 안테나 구조를 형성하는데 이용되는 UDP-GlcNAc의 감소가 sialylation의 제한요소로 작용한 결과라고 판단된다.


Fig. 3. 
The intracellular NSP profiles on 6 day of culture: (a) UDP-GlcNAc, (b) CMP-sialic acid and (c) UDP-galactose. The data are represented as mean (±SD) of experiment in duplicate. (LLL, glucose:galactose:mannose=10 mM:10 mM:10 mM; LLH, glucose:galactose:mannose=10 mM:10 mM:30 mM; LHL, glucose: galactose:mannose=10 mM:30 mM:10 mM; HLL, glucose: galactose: mannose=30 mM:10 mM:10 mM; LHH, glucose:galactose: mannose=10 mM:30 mM:30 mM; HLH, glucose:galactose: mannose=30 mM:10 mM:30 mM; HHL, glucose:galactose:mannose= 30 mM:30 mM:10 mM; HHH, glucose:galactose:mannose= 30 mM:30 mM:30 mM)

3.4. Alb-EPO의 시알산 함량 변화

당의 첨가로 인한 Alb-EPO의 시알산 함량 변화를 확인하기 위하여 6일차의 배양액을 회수하여 정제 후, DMB-labeling 방법을 통해 시알산 정량을 수행하였다 (Fig. 4). Glucose와 galactose를 첨가한 실험군은 모두 sialylation이 증대 되었고 농도에 의존하여 증가하였지만 고농도로 첨가될수록 sialyatlion 증대 폭이 감소하는 것을 확인하였다. 따라서 glucose와 galactose가 고농도로 첨가된 HHL 실험군에서 시알산이 최대 1.50배 증가하였다. 하지만 mannose 첨가 실험군에서는 각 실험군의 mannose 미첨가 대조군에 비해 모든 조건에서 시알산이 감소하였다. 이는 mannose 첨가에 따라 highmanose 형태가 증가하고, galactosylation 된 형태의 글리칸이 줄어드는 선행연구의 결과와 일치한다 [7].


Fig. 4. 
Variation of sialic acid contents of Alb-EPO on 6 day of culture by adding hexoses in combination. The data are represented as mean (±SD) of experiment in duplicate. (LLL, glucose: galactose:mannose=10 mM:10 mM:10 mM; LLH, glucose:galactose: mannose=10 mM:10 mM:30 mM; LHL, glucose:galactose: mannose=10mM:30 mM:10 mM; HLL, glucose:galactose:mannose = 30mM:10mM:10mM; LHH, glucose:galactose:mannose= 10mM: 30 mM:30 mM; HLH, glucose:galactose:mannose= 30 mM:10 mM: 30 mM; HHL, glucose:galactose:mannose = 30 mM:30 mM:10 mM; HHH, glucose:galactose:mannose=30 mM:30 mM:30 mM)

하지만 sialylation은 NSP가 가장 많이 증가된 HHH 조건이 아닌 HHL 조건에서 가장 크게 증대 되었는데, 이는 HHH 조건의 높은 osmolality로 인한 glycosylation-related gene이 down-regulation 되었기 때문으로 사료된다. 또한, viability의 감소에 따라 배양액 내의 sialidase가 증대되었기 때문일 수 있다. OC 조건에서는 sialylation이 74%로 감소하였는데 이는 높은 osmolality 환경에서 단백질의 sialylation이 감소한다는 선행 연구의 결과와 일치한다 [12].

이러한 결과를 통해 glucose와 galactose를 첨가함으로써 Alb-EPO의 시알산 함량을 증대시킬 수 있으며 mannose는 시알산에 긍정적인 영향을 미치지는 않지만 생산량을 증대시키는 효과가 있어 이 세 가지 단당류를 적절히 혼합하여 첨가함으로써 Alb-EPO의 생산량을 증대시키면서도 높은 품질의 단백질을 생산할 수 있음을 확인하였다.


4. CONCLUSION

Glycosylation 과정에 영향을 미치는 탄소원의 종류와 농도를 조절하여 혼합 첨가함으로써 Alb-EPO 당단백질 의약품의 시알산을 증대시키고자 하였다.

세 개의 hexose를 각각의 농도 범위로 혼합하여 첨가하였을 때, 가장 고농도 실험군인 HHH 조건을 제외하고는 VCD와 viability에 영향을 주지 않음을 확인하였다. HHH 조건은 OC와 비교하여 보았을 때 높은 삼투압에 의한 영향으로 VCD가 감소되었음을 알 수 있었다. VCD의 감소로 인해 IVCD 또한 HHH 조건과 OC 조건에서 감소하였다. Alb-EPO의 생산량은 mannose 첨가 농도가 높아질수록 증가하는 양상을 보였으며, 다음으로는 glucose, galactose 순으로 titer에 긍정적인 영향을 주었다. 생산량이 탄소원 첨가에 따라 계속해서 증가하여 최대 1.70배까지 증대되었다. 6일차의 CHO 세포 내 NSP를 분석한 결과 모든 당 첨가 조건에서 대조군 대비 증가하였으며 glucose가 pool을 크게 증가시키는 경향을 보였고, 나머지 두 탄소원과는 다르게 mannose는 NSP에 큰 영향을 미치지 않았다. HHH 조건에서 pool이 가장 크게 증대 되었으나 최종 시알산 농도는 HHL 조건이 가장 높았다. 이는 높은 osmolality에 의한 glycosylation-related gene의 down-regulation으로 인한 것으로 추측된다. 또한 intracellular NSP의 변화 양상과 일치하는 경향으로 glucose와 galactose가 시알산에 긍정적인 영향을 주어 HHL 실험군에서 sialylation이 최대 1.50배 증대 되었다.

이를 통해 CHO 세포 배양 시 glucose, galactose, mannose를 다양한 비율로 혼합 첨가함으로써 NSP pool의 변화를 유도하여 Alb-EPO의 시알산 함량을 증대시킬 수 있었다. 동시에 세포 성장에 부정적인 영향을 주지 않으면서 생산량을 크게 증대시킬 수 있는 간단하고 빠른 전략임을 확인하였다.


Acknowledgments

이 성과는 정부 (과학기술정보통신부)의 재원으로 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 연구임 (No. 2019R1F1A1061676).


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