The Korean Society For Biotechnology And Bioengineering

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Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 34 , No. 3

[ Research Paper ]
Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 34, No. 3, pp.135-144
Abbreviation: KSBB J
ISSN: 1225-7117 (Print) 2288-8268 (Online)
Print publication date 30 Sep 2019
Received 24 May 2019 Revised 04 Jul 2019 Accepted 10 Jul 2019
DOI: https://doi.org/10.7841/ksbbj.2019.34.3.135

발효 사역산이 항산화 및 항암활성에 미치는 영향
박영자1 ; 이상희2, *
1서라벌대학교 치위생과
2경북도립대학교 응급구조과

Effect of Fermented Sayuksan on Activities of Antioxidant and Anticancer
Young-Ja Park1 ; Sang-hee Lee2, *
1Department of dental hygiene, Sorabol college, Gyeongu 38063, Korea
2Department of Emergency Medical Technology, Gyeongbuk Provincial college, Yeochun 36830, Korea
Correspondence to : *Department of Emergency Medical Technology, Gyeongbuk Provincial college, Yeochun 36830, Korea Tel:+82-54-650-0286, Fax: 82-54-650-0259 e-mail: yj01168@hanmail.net


© 2019 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering

Abstract

Sayuksan is four kinds of medical herbs which consist of Glycrrhizae uralensis Fischer, Paeonia lactiflora Pallas, Bupleurum falcatum Linne, and Poncirus trifoliata Rafinesqul. Sayuksan was co-cultured with Lactobacillus spp. strains and a Sacchar- omyces spp. strain, and fermented Sayuksan was extracted by ethyl acetate. As for 1,1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH) and [2,2'-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)] (ABTS) free radical scavenging activities and Superoxide dismutase (SOD)-like activity as antioxidant activities, the extract of fermented Sayuksan had antioxidant activities at a lower concentration than that of Sayuksan, itself. The anticancer activity of fermented Sayuksan was confirmed in HCT 116 cells (human colon cancer cells), HepG2 cells (hepatoma cells), HeLa cells (cervical cancer cells), and MDAMB- 231 cells (breast cancer cells). Fermented Sayuksan displayed anticancer activity against those four types of cancer cells at 500 μg/mL. HeLa cells showed a concentration-dependent decrease in viability after treatment with 10–500 μg/mL of the extract from fermented Sayuksan. HeLa cells whose proliferation was inhibited even at a low concentration of the extract from fermented Sayuksan were used to verify if the anticancer activity from fermented Sayuksan resulted from apoptosis. Apoptosis was detected by the poly ADP-ribose polymerase (PARP) and cleaved PARP expression patterns. The PARP protein cleaved at higher concentrations of the extract from both Sayuksan and fermented Sayuksan and induced apoptosis. Therefore, we conclude that inhibited proliferation of HeLa cells resulted from apoptosis induction by substances produced during fermentation.


Keywords: fermented Sayuksan, antioxidant activity, anticancer activity

1. INTRODUCTION

최근 천연물질 또는 약용식물과 같은 한약재는 다양한 질환의 치료 및 예방을 위해 활발하게 사용되고 있으며, 이와 관련한 생리활성물질에 대한 연구가 활발하다. 여러 가지 천연물질 중 감초, 백작약, 시호와 지실로 구성된 사역산은 실험동물 모델에서 우울증을 감소시키고 [1], trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS)로 유도된 대장염 마우스의 대장염 치료에 효과적이며 [2], 사염화탄소 중독 흰쥐의 간 기능 개선에 효과가 있다고 한다 [3]. 이와 같이 천연물질은 그 자체가 약리작용을 가지고 있지만, 그 작용을 극대화시키기 위한 방법으로 발효를 통해 물질을 저분자 구조로 분해하고 미생물이 분비하는 각종 가수분해효소와 세포내 조직에 결합되어 있던 생리활성 물질들이 유리되어 한약성분의 체내흡수율과 생체 이용률이 훨씬 높아지는 것으로 알려져 있다 [4]. 따라서, 단일 천연물질 또는 몇 가지 천연물질을 적정한 비율로 혼합하여 제조한 후 다양한 미생물을 이용한 발효는 효능을 증가시키는 방법으로 널리 사용되고 있다. 단일 천연물질로서 감초, 백작약, 시호 또는 지실을 발효 시 항균 및 항산화에 효과적이며 [5] 뽕잎 [6], 차가버섯 또는 어성초 [7] 등을 발효시켰을 때 항산화, 항암 및 알레르기 억제효과가 높아진다는 보고가 있다. 또한 국화, 영지 및 가시오가피 외 5종과 같이 여러가지 천연물질을 혼합 및 제조 후 발효시킨 혼합 천연물질은 과잉의 유해산소 생성을 억제시킨다고 하였고 [8], 하수오 외 4종의 혼합 천연물질은 염증 유발 시 증가된다는 nitri coxide (NO) 생성 및 프로스타글라딘 생성이 감소된다고 한다 [9].

한약 발효를 위하여 사용되는 미생물은 버섯, 곰팡이, 고초균과 Lactobacillus 속 균주를 포함한 유산균 및 효모균인 Saccharomyces 속 균주 등이며, 이러한 유익한 미생물에 의해 천연물질의 생리활성 효능이 증가된 발효산물을 얻거나 상호간의 상승효과에 의해 생리활성 효능이 증가된다고 한다 [10]. 유산균은 발효를 통해 젖산을 포함한 유기산을 생산하여 유해미생물 증식을 억제하는 항균력이 있으며 [11], 유산균 발효에 의한 십전대보탕의 발효 전후 성분변화 [12]Lactobacillus 속 균주로 발효한 가미방풍통성산의 기능성 물질에 대한 연구 [13] 및 유산균 발효 겨우살이 추출물의 면역력 증강 [14] 등이 보고되고 있다. 유산균을 이용한 한방처방의 발효는 사람에 따라 구성이 다른 장내세균의 영향을 받지 않고, 유효성분의 흡수율을 높여 개인차에 의존하지 않는 보편적인 약리작용 [15]이 있어 한방처방 관련 제품개발의 가능성을 높여줄 것으로 생각된다. 또한, 효모균 발효에 의한 노화 관련 질환에 대한 항암 [16], 항산화 효과 [17] 및 항균작용 [18]이 증가된다는 보고가 있다.

이에 본 연구에서는 Lactobacillus 속 균주와 Saccharomyces 속 균주로 복합 발효시킨 사역산을 이용하여 발효 전후의 항산화 활성 정도를 확인하기 위해 1,1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH) free radical 소거능, [2,2'-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)] (ABTS) free radical 소거능 및 superoxide dismutase (SOD) 유사활성도를 측정하였다. 또한, 항암 활성 정도를 확인하기 위해 암세포주인 HCT 116 세포(인간 대장암 세포), HepG2 세포 (간암 세포), HeLa 세포(자궁경부암세포)와 MDA-MB-231 세포 (유방암 세포)의 세포 증식 억제 정도 및 poly ADP-ribose polymerase (PARP) 단백질 발현 양상을 관찰하고자 한다.


2. MATERIALS AND METHOD
2.1. 사용 한약

본 연구에 사용한 한약은 감초, 백작약, 시호와 지실로 구성된 사역산(四逆散)을 선정하였으며, 동국대학교 부속 한방 병원에 의뢰하여 조제하였다. 한약재의 배합은 Table 1에서 보는 바와 같이 한첩 당 첨가되는 각각의 한약재 중량을 정하여 수행하였다. 배합한 한약재는 20첩 분량을 사용하였으며, 한약추출기(ME 727, 미강기업, 대한민국)에 4가지 한약재를 각각 75 g씩 넣고 물 5.7 L를 넣은 후 2시간 30분 동안 가열하여 수행하였으며 추출된 사역산은 체를 이용하여 한약재를 제거하였다.

Table 1. 
Composition of Sayuksan
Korean
medicine name
Scientific name Effective part Dose (g)
감초 Glycyrrhizaeuralensis Fischer Root 3.75
백작약 Paeoniae lactiflora
Pallas
Root 3.75
시호 Bupleurum falcatum
Linne
Root 3.75
지실 Poncirus trifoliata
Rafinesqul
Fruit 3.75

2.2. 발효
2.2.1. 발효미생물의 선정 및 배양

발효를 위해 사용한 미생물은 GRAS 미생물로서 Table 2에서 보는 바와 같이 유산균인 Lactobacillus 속 6균주와 효모인 Saccharomyces 속 2균주를 사용하였다. 유산균은 lactobacilli MRS broth (proteose peptone No. 3 10 g, beef extract 10 g, yeast extract 5 g, dextrose 20 g, polyoxyethylene sorbitan monooleate 1 g, ammonium citrate 2 g, maganesium sulfate 0.1 g, manganesse sulfate 0.05 g, dipotassium phosphate 2 g, sodium acetate 5 g/L, pH 6.5, Difco Co., USA)에, 효모는 YM broth (yeast extract 3 g, malt extract 3 g, dextrose 10 g, peptone 5 g/L, pH 7.6, Difco Co., USA)에 각각 계대배양한 후 균체를 20% glycerol이 포함된 저장액에 넣어 −70℃에 보관하였으며, 실험에 사용하기 전 계대배양을 실시하였다.

Table 2. 
Used strains for fermentation
Strains Sources
Lactobacillus plantarum subsp. plantarum
KCTC 3108
Pickled cabbage
Lactobacillus casei KCTC 3109 Cheese
Lactobacillus fermentum KCTC 3112 Fermented beets
Lactobacillus brevis KCTC 3498 Human feces
Lactobacillus helveticus KCTC 3545 Emmental (Swiss)
cheese
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus
KCTC 3635
Bulgarian yogurt
Saccharomyces cerevisiae IFO 2133 Sake
Saccharomyces ellipsoideus KCTC 7243 Wine

2.2.2. 사역산 발효

사역산은 미생물의 생육 증대를 위해 pH를 6.5로 조정하여 121℃, 15분간 멸균한 후 발효에 사용하였다. 발효에 사용된 GRAS 미생물은 유산균인 Lactobacillus 속 6균주와 효모인 Saccharomyces cerevisiae IFO 2133과 Saccharomyces ellipsoideus KCTC 7243을 사용하였다. 단일배양은 효모를 이용하여 수행하였으며, 복합배양은 효모를 접종하여 7일간 배양한 후 Lactobacillus 속 6균주를 접종하여 수행하였다. 단일배양에 사용된 Saccharomyces cerevisiae IFO 2133과 Saccharomyces ellipsoideus KCTC 7243은 균주의 농도를 1×103 cells/mL로 조정한 후 사역산에 0.2% (v/v)를 접종하여 28℃에서 7일간 정치배양을 하였다. 복합배양은 사역산에 Saccharomyces cerevisiae IFO 2133과 Saccharomyces ellipsoideus KCTC 7243을 각각 28℃에서 7일간 배양한 후 Lactobacillus 속 6균주를 각각 1×108 CFU/mL의 stock액을 제조하여 10 μL씩 혼합하여 60 μL를 첨가하였으며 37℃에서 7일간 정치배양을 하였다.

2.2.3. 발효 사역산 ethyl acetate 추출 및 농축

발효 사역산은 3,000 rpm에서 10분간 원심분리를 하였으며, 상등액은 ethyl acetate로 추출하였다. 발효 사역산의 ethyl acetate 추출액은 rotary evaporator (EYELA, Tokyo Rikakikai Co., Japan)로 농축하여 DMSO에 녹여 4℃에 보관하면서 사용하였다.

2.3. pH 측정

발효 전후의 사역산은 3,000 rpm에서 10분간 원심분리를 하였으며, 상등액은 pH meter (Mettler Toledo MP220, U.K.)를 사용하여 pH를 측정하였다.

2.4. 항산화활성 측정
2.4.1. DPPH free radical 소거능

DPPH free radical 소거능은 Blois의 방법 [19]을 변형하여 실시하였다. DPPH (Sigma Co., USA)는 실험 시작 전 methanol 에 녹인 후 0.15 mM이 되도록 하여 사용하였다. DPPH 용액과 희석된 시료를 1 : 1로 혼합하여 30분간 실온에서 반응시킨 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 음성 대조구는 시료 대신 methanol을 첨가하여 측정하였다. 전자공여능은 시료 첨가구와 음성대조구의 흡광도를 구하여 나타내었다.

2.4.2. ABTS free radical 소거능

ABTS free radical 소거능은 ABTS radical cation decolorization assay 방법 [20]으로 측정하였다. ABTS (Sigma Co., USA)는 7 mM의 농도로 물에 용해시켜, ABTS radical cation은 7 mMABTS 용액과 7.35 mM potassium persulfate를 2 : 1로 혼합하여 실온의 어두운 곳에 24시간 보관하여 생성시켰다. ABTS radical cation 용액은 734 nm의 흡광도에서 0.7 ± 0.02가 되도록 PBS (pH 7.4)로 희석하여 사용하였으며, 시료의 ABTS radical 소거능은 시료 10 μL에 희석한 ABTS radical cation 용액 1 mL를 첨가하여 혼합하고, 1분간 반응시킨 후 734 nm에서 흡광도를 측정하여 시료첨가구와 음성대조구의 흡광도를 구하여 나타내었다.

2.4.3. SOD 유사활성

SOD 유사활성은 Marklund의 방법 [21]에 따라 실시하였다. 각 시료 용액 0.2 mL에 Tris-HCl 완충용액(50 mM Tris, 10 mMEDTA, pH 8.5) 2.6 mL와 7.2 mM pyrogallol 0.2 mL (Sigma Co., USA)를 가하여 25℃에서 10분간 반응시킨 후 1.0 NHCl 0.1 mL를 가하여 반응을 정지시키고 반응액 중 산화된 pyrogallol의 양을 420 nm에서 측정하였다. SOD 유사활성은 시료용액의 실험구와 대조구의 흡광도 감소율로 나타내었다.

2.5. 항암활성 측정
2.5.1. 세포배양

발효 전후 사역산 ethyl acetate 추출액의 항암활성은 HCT 116 세포(인간 대장암 세포), HepG2 세포(간암 세포), HeLa 세포(자궁경부암 세포)와 MDA-MB-231 세포(유방암 세포)를 대상으로 실험하였다. 암세포주는 대구가톨릭대학교 의과대학 세포생물학교실로부터 제공받아 배양하면서 실험에 사용하였다. 10% FBS (Gibco RBL Co., USA)와 1% antibiotics (Gibco RBL Co., USA)가 함유된 DMEM 배지(Gibco RBL Co., USA)를 사용하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.

2.5.2. MTT assay

발효 전후 사역산 ethyl acetate 추출액의 암세포 증식 억제효과를 측정하기 위해 MTT assay를 Mosmann의 방법 [22]에 따라 측정하였다. 96 well plate에 2×104 cells/well이 되도록 100 μL씩 분주하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 배양한 후 배지를 제거하고 각 well당 FBS가 포함되지 않은 배지로 희석한 시료를 10 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL, 250 μg/mL 과 500 μg/mL 농도로 100 μL씩 첨가하고, 대조군에는 시료 대신 PBS를 100 μL씩 첨가하였다. 이 plate를 다시 37℃로 유지되는 5% CO2 배양기에서 24시간 배양하였다. 배양 후 MTT 시약(Generay Biotech Co., China)을 5 mg/mL의 농도로 PBS에 녹인 후, 10% FBS가 함유된 배지 9 mL와 희석하여 100 μL를 첨가하고 4시간 동안 더 배양하여 MTT가 환원되도록 하였다. 배양종료 후 생성된 formazan 결정을 가라앉힌 후 MTT 시약처리 배지를 제거하였다. 배지가 제거된 각 well에 formazan 결정을 용해시키기 위하여 DMSO와 ethanol을 1: 1로 혼합하여 100 μL씩 분주한 후 침전물을 충분히 용해시켰다. 세포 독성은 microplate reader (Infinite 200 PRO NanoQuant, Tecan Group Ltd., Switzerland)를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정한 후 확인하였다. 이 흡광도는 MTT가 세포에 의해서 환원된 양을 나타내며, 따라서 각 well에 존재하는 생존수와 비례한다.

2.5.3. Western blot analysis

HeLa 세포를 60 mm culture dish에 2×106 cells/well이 되도록 분주하여 부착시킨 다음 발효 전후 사역산 ethyl acetate 추출액을 50 μg/mL, 300 μg/mL 농도로 각각 처리하여 24시간 배양하였다. 배양된 세포를 회수하여 lysis buffer (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.5% nonidet P-40, 100 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 20 mM aprotinin, 20 mM leupeptin, pH 8.0)를 넣고 4℃에서 30분간 단백질을 용해시켰다. 12,000 rpm으로 10분간 원심분리 하여 상등액을 얻은 다음 bradford assay를 이용하여 단백질을 정량하였다. 단백질은 각각 40 μg씩을 12% SDS-PAGE로 전기영동 후 단백질을 nitrocellulose membrane (Schleicher & Schuell Bioscience Inc., USA)으로 이동시켰으며, nitrocellulose membrane은 5% skim milk로 1시간 동안 blocking 시켰다. 특이단백질을 탐색하기 위하여 1차 항체는 5% skim milk가 함유된 TBS-T (10 mM Tris, 150 mM NaCl, and 0.1% tween-20)에 1 : 1000으로 희석하여 24시간 반응시켰다. 그 후 2차 항체인 HRP-linkedanti-rabbit IgG 또는 HRP-linked anti-mouse IgG (Santa Cruz Biotechnology Inc., USA)를 5% skim milk가 함유된 TBS-T에 1 : 1000으로 희석하여 1시간 동안 반응시켰다. ECL kit (Amersham Pharmacia, Buckinghamshire, U.K.)를 사용하여 X-ray film에 노출시켜 단백질 발현 정도를 확인하였다.


3. RESULTS AND DISCUSSION
3.1. 사역산과 발효 사역산의 pH 정도

사역산에 접종된 Saccharomyces 속 균주 및 Lactobacillus 속 6균주의 생육은 pH를 측정하여 확인하였다. 사역산의 pH는 4.8로 측정되었으며, Lactobacillus 속 균주 및 Saccharomyces 속 균주의 최적생육을 위해 pH를 6.5로 조정한 후 멸균하였다. 쌍화탕을 이용한 발효실험에서 쌍화탕의 낮은 pH로 인해 유산균의 증식이 미약하여 pH를 7.0으로 조정했을 때 균수가 활발히 증식되었다는 보고 [23]가 있으며, 많은 천연물 발효관련 논문에서 기질이 산성인 경우 미생물 생육에 불리하므로 pH 조절로 발효 기질의 조건을 개선하는 방법을 사용하고 있다 [24]. 젖산균으로 발효 시에는 유기산, 당알코올, 덱스트란 등 대사산물과 효모 발효 시에는 에탄올, 탄산가스, 유기산 및 여러 가지 방향성 물질이 생성되며 특정 효모와 젖산균의 혼합발효에 의해 효모 균체의 영양적 가치와 복합효소로서의 효과도 부여하는 것으로 알려져 있다 [25]. 본 연구에서는 사역산에 Lactobacillus 속 균주로 단일배양하였을 때는 발효반응이 잘 일어나지 않았기 때문에 효모인 Saccharomyces 속 균주와 유산균인 Lactobacillus 속 균주로 복합배양을 실시하였으며, 균의 증식정도는 pH를 측정하여 확인하였다. Fig. 1에서 보는 바와 같이 Saccharomyces 속 균주와 Lactobacillus 속 균주로 복합배양한 발효 사역산의 pH는 사역산과 Saccharomyces 속 균주로 단일배양한 발효 사역산의 pH보다 감소하였다. 이러한 결과를 통해 Lactobacillus 속 균주가 사역산에 증식하는 것을 확인하였다. 따라서 사역산에서 Saccharomyces 속 균주는 Lactobacillus 속 균주의 증식에 영향을 미쳤을 것으로 사료된다.


Fig. 1. 
pH of Sayuksan (SYS) and fermented Sayuksan (FSYS). a: Saccharomyces cerevisiae IFO 2133, b: Saccharomyces ellipsoideus KCTC 7243, 1: culture of Lactobacillus spp. 6 strains after removing Saccharomyces spp. strain, 2: coculture of Lactobacillus spp. 6 strains and Saccharomyces spp. strain.

3.2. 사역산과 발효 사역산의 항산화 활성 측정

산화에 의해 생성되는 각종 산화생성물은 DNA를 손상시키거나 암을 유발하며 인간의 노화와도 관계가 있는 것으로 알려져 있다 [26]. 과잉의 활성산소종의 제거 및 생체 내 항산화 방어 시스템의 증진에 대한 관심이 높아지고 있으며 약물이 아닌 천연 성분에서 그 효능을 찾는 연구가 활발히 이루어지고 있다 [27]. 항산화활성은 사역산을 Saccharomyces 속 균주를 이용한 단일배양과 Saccharomyces 속 균주와 Lactobacillus 속 균주로 복합배양한 발효 사역산의 항산화활성 변화를 검토하기 위해 수행하였다. 사역산의 발효 전후 항산화활성은 DPPH 및 ABTS free radical 소거능과 SOD 유사활성을 측정하여 확인하였다.

DPPH free radical 소거능은 Fig. 2(a)에서 보는 바와 같이 1 : 10으로 희석하여 측정하였을 때 사역산은 38.6±2.0%로 측정되었으며, Saccharomyces 속 균주와 Lactobacillus 속 균주를 이용하여 복합배양한 발효 사역산의 DPPH free radical 소거능은 91.0±0.1%로 높게 나타났다. ABTS free radical 소거능은 발효 전후 사역산을 1 : 20으로 희석하여 측정하였으며 사역산은 13.2±0.6%, Saccharomyces 속 균주와 Lactobacillus 속 균주를 이용하여 복합배양한 발효 사역산은 25.9±0.1%로 측정되었다 (Fig. 2(b)). 이는 승마갈근탕액과 EM복합균주 (Lactobacillus속, Bacillus속, Cordyceps속, Leuconostoc속, Saccharomyces속)로 발효 한 승마갈근탕액에 대한 DPPH 라디칼 소거능에서 200 μg/mL에서 각각 70.2% 및 74.3%로 발효 승마갈근탕액에서 다소 높은 DPPH 라디컬 소거능 결과 [28]와 유사한 결과를 타나내었다. SOD 유사활성은 발효 전후 사역산을 1 : 5로 희석하여 측정하였으며, 사역산의 SOD 유사활성은 26.8±2.7%, Saccharomyces 속 균주와 Lactobacillus 속 균주를 이용하여 복합배양한 발효 사역산은 48.7±0.9%로 측정되었다 (Fig. 2(c)). 이러한 결과를 통해 Saccharomyces 속 균주와 Lactobacillus 속 균주를 이용하여 복합배양한 발효사역산은 사역산 및 Saccharomyces 속 균주를 이용한 단일 배양보다 항산화활성 물질이 증가되는 것으로 확인되었다. 이는 발효하지 않은 홍삼추출물 0.34%, 효모발효 홍삼추출물 10.31%, 유산균과 효모를 이용한 혼합발효 홍삼추출물의 SOD 유사활성이 16.76%로 가장 높게 나타났다는 결과와 유산균 보다는 효모에 의한 발효가 또 단일균주를 이용한 발효보다는 효모와 유산균의 혼합발효가 더 효과적이라는 결과 [29]와 유사한 결과를 얻었다.


Fig. 2. 
Antioxidant activities of Sayuksan (SYS) and fermented Sayuksan (FSYS) a: Saccharomyces cerevisiae IFO 2133, b: Saccharomyces ellipsoideus KCTC 7243, 1: culture of Lactobacillus spp. 6 strains after removing Saccharomyces spp. strain, 2: coculture of Lactobacillus spp. 6 strains and Saccharomyces spp. strain. Each sample was diluted 1 : 10 (a), 1 : 20 (b) and 1 : 5 (c) in sterile DW. Data values were expressed as mean±SE.

효모를 이용한 다시마 발효액 [30], 유산균을 이용한 톳 발효액 [31] 연구에서 모두 발효 후에 항산화활성이 증가되는 것으로 보고되었다. 본 실험결과와 비교해 볼 때 항산화활성이 증가하는 경향은 유사하나, 배양 시 사용된 물질과 균주에 따라 특이성이 있는 것으로 사료된다. 농도에 따른 항산화활성을 확인하기 위해 발효 전후 사역산을 ethyl acetate로 추출하여 농축 후 DPPH 및 ABTS free radical 소거능과 SOD 유사활성을 측정하여 확인하였다. Fig. 3(a)에서 보는 바와 같이 DPPH free radical 소거능을 측정하였을 때 사역산 ethyl acetate 추출액의 RC50값은 969.7±19.0 μg/mL, Saccharomyces 속 균주와 Lactobacillus 속 균주를 이용하여 복합배양한 발효 사역산 ethyl acetate 추출액의 RC50값은 230.8±7.0 μg/mL로 확인되었다. ABTS free radical 소거능을 측정하였을 때 사역산 ethyl acetate 추출액의 RC50값은 52.9±1.3 μg/mL, Saccharomyces 속 균주와 Lactobacillus 속 균주를 이용하여 복합배양한 발효 사역산 ethyl acetate 추출액의 RC50값은 11.2±0.5 μg/mL로 확인되었다 (Fig. 3(b)). SOD 유사활성을 측정하였을 때 사역산 ethyl acetate 추출액의 RC50값은 1,538.4±63.3 μg/mL, Saccharomyces 속 균주와 Lactobacillus 속 균주를 이용하여 복합배양한 발효 사역산 ethyl acetate 추출액의 RC50값은 942.4±14.9 μg/mL로 확인되었다 (Fig. 3(c)). 따라서 발효 사역산 ethyl acetate 추출액은 사역산 ethyl acetate 추출액보다 낮은 농도에서 항산화활성을 나타내어 발효 후에 항산화활성 물질이 증가된 것으로 확인되었다. 또한 단일 배양보다 복합배양한 발효 사역산 ethyl acetate 추출액의 항산화활성이 증가하는 것으로 확인되었다.


Fig. 3. 
Antioxidant activities of ethyl acetate extracts from Sayuksan (SYS) and fermented Sayuksan (FSYS). (a) DPPH free radical scavenging, (b) ABTS free radical scavenging, (c) SOD-like activity. a: Saccharomyces cerevisiae IFO 2133, b: Saccharomyces ellipsoideus KCTC 7243, 1: culture of Lactobacillus spp. 6 strains after removing Saccharomyces spp. strain, 2: coculture of Lactobacillus spp. 6 strains and Saccharomyces spp. strain, RC50: reducible concentration 50%. Data values were expressed as mean±SE.

3.3. 사역산과 발효 사역산의 항암 활성 측정
3.3.1 암세포 증식 억제효과

항암활성은 발효 전후 사역산 ethyl acetate 추출액을 10 μg/ mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL, 250 μg/mL와 500 μg/mL 농도로 암세포주인 HCT 116 세포 (인간 대장암 세포), HepG2 세포 (간암 세포), HeLa 세포(자궁경부암 세포)와 MDA-MB-231 세포 (유방암 세포)에 처리하여 세포 증식 정도를 측정하였다.

HCT 116 세포 증식에 미치는 영향을 살펴본 결과는 Fig. 4(a)에서 보는 바와 같이 사역산 ethyl acetate 추출액은 농도 의존적으로 암세포 증식 억제효과를 나타내었으나 발효 사역산 ethyl acetate 추출액은 250 μg/mL 농도까지는 암세포 증식이 억제되지 않았다. 500 μg/mL 농도에서 사역산 ethyl acetate 추출액은 44.6±7.0%, Saccharomyces 속 균주와 Lactobacillus 속 균주를 이용하여 복합배양한 발효 사역산 ethyl acetate 추출액은 9.93±7.6%의 생존율을 나타내었다. 이러한 결과는 Bacillus 속으로 발효시킨 발효 차가버섯 추출물로 인체유래 대장암세포의 생존율을 측정한 결과 0.5 mg/ mL 농도에서 40% 정도의 생존율을 타나내었다는 연구결과 [32] 보다 효과가 높은 것으로 나타났다.


Fig. 4. 
Antiproliferative effects of ethyl acetate extracts from Sayuksan (SYS) and fermented Sayuksan (FSYS) against HCT 116 cells (a) and HepG2 cells (b). a: Saccharomyces cerevisiae IFO 2133, b: Saccharomyces ellipsoideus KCTC 7243, 1: culture of Lactobacillus spp. 6 strains after removing Saccharomyces spp. strain, 2: coculture of Lactobacillus spp. 6 strains and Saccharomyces spp. strain. Data values were expressed as mean±SE.

HepG2 세포 증식에 미치는 영향을 살펴본 결과는 Fig. 4(b)에서 보는 바와 같이 250 μg/mL 농도 까지는 HepG2 세포의 증식을 억제하지 못하는 것으로 나타났다. 그러나 500 μg/mL 농도에서 사역산 ethyl acetate 추출액의 암세포 생존율은 66.2±2.3%를 나타냈으며 Saccharomyces 속 균주와 Lactobacillus 속 균주를 이용하여 복합배양한 발효 사역산 ethyl acetate 추출액은 64.3±6.7%의 암세포 생존율을 나타냈다. 이는 황련추출물과 발효추출물의 HepG2 세포의 증식에 미치는 영향에서 각 추출물의 농도가 높아짐에 따라 생존율도 감소하는 것으로 조사되었으며 400 μg/mL 농도까지 증가시켰을 때 황련 에탄올 추출물은 80.12%, 발효 추출물은 80.11%의 생존율을 나타냈다는 결과 [33]와 유사한 경향을 나타내었다.

HeLa 세포 증식에 미치는 영향을 살펴본 결과는 Fig. 5(a)에서 보는 바와 같이 발효 전후 사역산 ethyl acetate 추출액은 농도 의존적으로 HeLa 세포의 증식을 억제시켰다. 500 μg/mL 농도에서 사역산 ethyl acetate 추출액은 25.3±2.2%의 생존율을 보였으며, Saccharomyces 속 균주와 Lactobacillus 속 균주로 복합배양한 발효 사역산 ethyl acetate 추출액은 27.3±1.0%의 생존율을 나타내었다. 이러한 결과는 Sacharomyces cerevisiae로 발효시킨 손바닥 선인장발효액의 자궁경부암 세포주에 대한 항암활성 연구에서 항암활성이 증가한 이유는 효모 발효를 통한 2차 대사산물 혹은 효모균 벽으로부터 추출된 다당류가 만들어낸 결과 [34]라고 보고하고 있으므로, 이는 본 연구에서도 효모 발효가 유산균의 생육에 영향을 미쳐 발효가 진행되면서 암세포 증식억제 물질이 증가하였을 것으로 사료된다.


Fig. 5. 
Antiproliferative effects of ethyl acetate extracts from Sayuksan (SYS) and fermented Sayuksan (FSYS) against HeLa cells (a) and MDA-MB-231 cells (b). a: Saccharomyces cerevisiae IFO 2133, b: Saccharomyces ellipsoideus KCTC 7243, 1: culture of Lactobacillus spp. 6 strains after removing Saccharomyces spp. strain, 2: coculture of Lactobacillus spp. 6 strains and Saccharomyces spp. strain. Data values were expressed as mean±SE.

MDA-MB-231 세포 증식에 미치는 영향을 살펴본 결과는 Fig. 5(b)에서 보는 바와 같이 250 μg/mL 농도까지는 암세포 증식이 억제되지 않았다. 500 μg/mL 농도에서 사역산 ethyl acetate 추출액은 39.5±0.8%, Saccharomyces 속 균주와 Lactobacillus 속 균주를 이용하여 복합배양한 발효 사역산 ethyl acetate 추출액은 36.5±0.6%의 생존율을 나타내었다. HeLa 세포와 마찬가지로 발효 전과 후의 항암효과는 크게 차이가 나지 않았다. 본 연구에서 발효 사역산 ethyl acetate 추출액은 4종류의 암세포에 항암 효과가 있음을 밝혔으나 향후 암 치료제로서 활용하기 위해서는 추후 다양한 추가 실험이 필요할 것으로 사료된다.

3.3.2. PARP 단백질 발현 양상

세포사멸은 세포가 병리학적인 요인들에 의해 노출되어 세포 내외부의 다양한 신호전달에 의해 세포가 죽음에 이르는 생리학적 과정으로 세포내 단백질인 Bcl-2 family 및 caspase 활성화와 PAPR 분절들에 의해 조절된다 [35]. PARP는 caspase-3의 주요한 표적 단백질로 세포의 내부나 외부의 자극에 의해 세포사멸이 일어나면 caspase-3에 의해 PARP 단백질이 분절되면 불활성화 되어 세포의 분해를 촉진하여 세포사멸을 야기한다 [36]. 발효 전후 사역산 ethyl acetate 추출액의 항암효과는 세포사멸의 유도를 통한 결과인지 확인하기 위해 낮은 농도에서도 증식이 저해된 HeLa 세포를 이용하여 세포사멸 관련 단백질인 PARP의 발현 양상을 통해 확인하였다. Fig. 6에서 보는 바와 같이 발효 전후 사역산 ethyl acetate 추출액을 50 μg/mL 농도로 처리 시 분절된 PARP 단백질의 발현을 관찰할 수 없었으나 Saccharomyces 속과 Lactobacillus 속으로 복합배양한 발효 사역산 ethyl acetate 추출액을 300 μg/mL 농도로 처리 시 사역산 ethyl acetate 추출액보다 PARP의 불활성형인 분절된 PARP 단백질의 발현이 증가되었음을 확인할 수 있었다. PARP 단백질은 사역산 및 발효 사역산 ethyl acetate 추출액의 농도 증가에 따라 분절되어 세포 사멸을 유도시키는 형태로 변화되었다. 따라서 HeLa 세포의 증식 저해는 발효과정을 통해 생성된 물질의 세포사멸 유도를 통한 결과로 사료된다. 이러한 결과는 감귤추출물 보다 유산균과 효모균으로 발효한 감귤추출물이 PARP 단백질의 가수분해를 보다 효과적으로 억제하였다는 결과 [37]와 유사한 결과를 나타내었으며, 대장암 세포주에 대한 piperine 처리 농도가 증가할수록 분절된 PARP 단백질 수준이 증가하여 세포사멸이 증가되었다는 보고 [38] 및 전립선암 세포주에 대한 Silibinin의 처리농도와 시간의 증가에 따라 PARP의 분절형태가 증가함으로써 세포사멸을 유도하였다고 보고한 결과 [39]와 일치한다.


Fig. 6. 
Effect of ethyl acetate extracts from Sayuksan (SYS) and fermented Sayuksan (FSYS) a1 on poly ADP-ribose polymerase (PARP) in HeLa cells. Ethyl acetate extracts from SYS and FSYS a1 was applied at concentrations of 50 and 300 μg/mL for 24 h in HeLa cells. Western blot analysis were performed to determine the level of PARP proteins in HeLa cells. β-actin was used as a loading control. a1: culture of Lactobacillus spp. 6 strains after removing Saccharomyces cerevisiae IFO 2133.


4. CONCLUSION

천연물질은 다양한 약리작용이 있고, 혼합 천연물질에 다양한 미생물을 이용한 발효는 그 성분의 체내흡수율과 생체이용률을 높이고, 다양한 효능을 나타날 수 있다. 이에 본 연구에서는 간염, 위염과 대장염을 포함한 다양한 염증성 질환에 효과적이고, 다양한 질환에 광범위하게 응용되고 있는 한약재인 사역산에 Saccharomyces 속 균주를 이용한 단일배양과 Saccharomyces 속 균주와 Lactobacillus 속 균주를 이용한 복합배양을 통해 발효시킨 후 항산화 및 항암활성 정도를 확인하고자 하였다.

사역산은 Saccharomyces 속 균주 및 Lactobacillus 속 균주를 이용하여 단일배양 및 복합배양을 실시하였으며, ethyl acetate를 이용하여 추출 후 농축하였다. 발효 전후 사역산의 항산화활성은 DPPH 및 ABTS free radical 소거능과 SOD 유사활성을 확인한 결과 발효 사역산은 사역산보다 항산화 활성 정도가 증가하였다. 농도에 따른 항산화 활성 정도를 확인하기 위해 발효 전후 사역산 추출액의 DPPH 및 ABTS free radical 소거능과 SOD 유사활성을 확인한 결과, 발효 사역산 추출액은 사역산 추출액 보다 낮은 농도에서 항산화 활성 정도가 높게 나타났고, 이는 사역산 발효 전 보다 발효 후에 항산화활성 물질이 증가되었다는 것을 암시한다. 항암활성은 발효 전후 사역산 추출액을 10 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL, 250 μg/mL와 500 μg/mL 농도로 HCT 116 세포 (인간대장암 세포), HepG2 세포 (간암 세포), HeLa 세포 (자궁경부암 세포)와 MDA-MB-231 세포 (유방암 세포)에 처리하여 세포증식 정도를 확인하였다. Saccharomyces 속 균주 및 Lactobacillus 속 균주를 이용하여 복합 배양한 발효 사역산 추출액은 500 μg/mL의 농도로 처리 시 4종류의 암세포에 모두 항암 활성을 나타내었다. 낮은 농도에서도 증식이 억제되었던 HeLa 세포에 대한 발효 전후 사역산 추출액의 항암활성은 세포사멸의 유도를 통한 결과인지 확인하기 위해 농도가 증가할수록 증식을 억제시켰던 HeLa 세포를 이용하여 세포사멸 관련 단백질인 PARP의 발현 양상을 확인하였다. PARP 단백질은 사역산 및 발효 사역산 추출액의 농도가 증가할수록 PARP의 불활성형인 분절된 PARP 수준이 증가하였고, 이러한 결과는 세포사멸을 유도하여 암세포의 증식이 억제되었다고 생각된다.

본 연구에서 발효 사역산 추출액은 4종류의 암세포에 항암 효과를 확인하였으나, 추후 암 치료제로서 활용하기 위해서는 다양한 추가 실험이 필요할 것으로 생각된다.


References
1. Hwa, S. S., Y. M. Kweon, and S. D. Park (2004) Antidepressant effect of Sayuksan and its influence on monoamines of depression model rats. Kor. J. Herb. 19: 71-82.
2. Sun, Y., T. T. Cai, Y. Shen, X. B. Zhou, T. Chen, and Q. Xu (2009) Si-Ni-San, a traditional Chinese prescription and its active ingredient glycyrrhizin ameliorate experimental colitis through regulating cytokine balance. J. Int. Immunopharmacol. 9: 1437-1443.
3. Jung, S. Y., S. D. Park, and W. H. Park (1996) The effect of the water extract of Sayeuksan, and Shiho, Kamcho against CCl4- induced hepatotoxicity in rat. J. Dong Guk Oriental Med. 5: 53-77.
4. Hubert, J., M. Berger, F. Nepveu, F. Paul, and J. Dayde (2008) Effects of fermentation on the phytochemical composition and antioxidant properies of soy germ. Food Chem. 109: 709-721.
5. Park, Y. J., D. H. Kang, and H. S. Kim (2014) Antibacterial activities of fermented Sayuksan ingredient extracts for multidrug-resistant strains. Kor. Soc. Biotechnol. Bioeng. J. 29: 210-219.
6. Lee, S. I., Y. K. LEE, I. A. Lee, J. K. Choi, S. D. Kim, and J. W. Suh (2013) Effect of mulberry leaf tea fermented by monascus pilosus on body weight and hepatic antioxidant enzyme activities in mouse fed high-fat diet. Kor. J. Food & Nur. 26: 66-77.
7. Cha, J. Y., B. S. Jeon, J. W. Park, J. C. Moon, and Y. S. Cho (2004) Effect of fermented compositions containing Inonotus obliquus with Houttuynia cordata on growth of human AGS gsatric and HCT-15 colon cells. J. Kor. Soc. Appl. Chem. 47: 202-207.
8. Lee, U. J0, N. S. Kim, M. S. Shon, G. N. Kim, Y. I. Hwang and E. J. Park (2016) Effect of fermented herbal mixture against oxidative stress in HepG2 and PC12 cells. J. Kor. Soc. Food Sci. Nutr. 45: 1057-1064.
9. Jung, M. Ha. (2018) Anti-inflammatory and cellular proliferation effects of ethanol extracts from 5 kinds of oriental medical plants. J. Life Sci. 28: 1022-1029.
10. Jeon, B. S., J. W. Park, B. K. Kim, H. K. Kim, T. S. Jung, J. R. Hahm, D. R. Kim, Y. S. Cho, and J. Y. Cha (2005) Fermented mushroom milk-supplemented dietary fibre prevents the onset of obesity and hypertriglyceridaemia in Otsuka Long-Evans Tokushima fatty rats. Diabetes Obes. Metab. 7: 709-715.
11. Lee, M. K., B. K. Park, C. K. Jeong, and D. H. Oh (2001) Antimicrobial activity of glycerol monolaurate and organic acids on the survival of Escherichia coli O157:H7. J. Food Sci. Nutr. 6: 6-9.
12. Yang, M. C., S. W. Jeong, and J. Y. Ma (2011) Analysis of constituents in Sipjundaebo-tangs fermented by lactic acid bacteria. Kor. J. Microbiol. Biotechnol. 4: 350-356.
13. Kang, D. H. (2012) Studies on functional substances of Gamibangpungtongsungsan fermented by Lactobacillus spp. strains. Ph.D. Thesis. Keimyung University, Daegu, Korea
14. Yoon, T. J., W. S. Yang, S. M. Park, H. Y. Jung, A. N. Lee, J. H. Jung, et al. (2009) In vivo toxicity and immunoadjuvant activity of Korean mistletoe (Viscum album coloratum) extract fermented with Lactobacillus. Kor. J. Food Sci. Technol. 41: 560-565.
15. Rhee, Y. K., M. H. Kim, Y. C. Lee, J. H. Rho. J. Y. Ma, and C. W. Cho (2011) Characteristic changes of Galgeuntang fermented with lactic acid bacteria. Kor. J. Food Sci. Technol. 43: 655-658.
16. Dayan, I. E., K. Y. Arga, and K. O. Ulgen (2017) Multiomics approach to novel therapeutic targets for cancer and aging-related diseases role of sld7 in yeast Aging network. J. Integrative Biol. 21 : 100-113.
17. Rajkumari, J., M. Dyavaiah, S. J. Sudharshan, and S. Busi. (2018) Evaluation of in vivo antioxidant potential of Syzygium jambos (L.) alston and terminalia citrina Roxb. towards oxidative stress response in Saccharomyces cerevisiae. J. Food Sci. Technol. 55: 4432-4439.
18. McFarland, L. V. (2010) Systemic review and meta-analysis of Saccharomyces boulardii in adult patients. World J. Gastroenerol. 16: 2202-2222.
19. Blois, M. S. (1958) Antioxidant determination by use of stable free radical. Nature 181: 1199-1200.
20. Re, R., N. Pellegrini, A. Proteggente, A. Pannala, M. Yang, and C. Rice-Evans. (1999) Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. Free Radic. Biol. Med. 29: 1231-1237.
21. Marklund, S. and G. Marklund (1974) Involvement of the superoxide anion radical in the autoxidation of pyrogallol and a convenient assay for superoxide dismutase. Eur. J. Biochem. 47: 469-474.
22. Mosmann, T. (1983) Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol. Methods 65: 55-63.
23. Eum, H. A., J. H. Lee, M. C. Yang, K. S. Shin, J. H. Lee, and J. Y. Ma (2011) Protective effect of Ssanghwa-tang fermented by Lactobacillus plantarum against carbon tetrachloride-induced acute hepatotoxicity in rats. Afr. J. Tradit. Complement Altern. Med. 8: 312-321.
24. Bae, E. A., M. J. Han, E. J. Kim, and D. H. Kim (2004) Transfomation of ginseng saponins to ginsenoside Rh2 by acids and human intestinal bacteria and biological activities of their transformants. Arch. Pharm. Res. 27: 61-67.
25. Jung, D. S., Y. K. Lee, and K. W. Lim (2000) Characteristics of fermented fruit and vegetable mixed broth using by bacteriocinproducing lactic acid bacteria and yeast. Kor. J. Food Sci. Technol. 32: 1358-1364.
26. Cross, C. E., B. Halliwell, E. T. Borish, W. A. Pryor, B. N. Ames, et al. (1987) Oxygen radicals and human disease. Ann. Intern. Med. 107: 526-545.
27. Shin, J. H. and S. K. Yoo (2012) Antioxidant properties in microbial fermentation products of Lonicera japonica Thumb extract. J. East Asian Soc. Dietary Life 22: 95-102.
28. In, J. P., J. M. Shin, S. J. Hur, and S. K. Lee (2014) Antioxidative, antimicrobial and anticytotoxic activities of Seungmagalgeuntang and fermented Seungmagalgeuntang. J. Kor. Soc. Food Sci. Nutr. 43: 980-988.
29. Kim, H. J., M. H. Seo, E. K. Lee, H. E. Cho, Y. H. Choi, et al. (2009) Effect of fermented red ginseng extracts on physiological activity and blood glucose level in streptozotocin induced diabetic rats. Kor. J. Oriental Physiol. Pathol. 23: 1087-1094.
30. Eom, S. H., B. J. Lee, and Y. M. Kim (2010) Effect of yeast fermentation on the antioxidant and anti-inflammatory activity of sea tangel water extract. Kor. J. Fish. Aquat. Sci. 43: 117-124.
31. Song, H. S., H. K. Kim, H. O. Min, J. D. Choi, and Y. M. Kim (2011) Changes of physicochemical and sensory properties of Hizikia fusiformis water extract by the fermentation of lactic acid bacteria. Kor. J. Fish Aquat. Sci. 44: 104-110.
32. Cha, J. Y., S. H. Park, J. S. Heo, and Y. S. Cho (2007) Effects of water extract from fermented chaga mushroom (Inonotus obliquus) on the proliferation of human cancer cell lines. J. Life Sci. 5: 671-677.
33. Jung, Y. H. (2010) Studies on the antimicrobial effect and antioxidative activity of fermented Coptidis Rhizoma extract. Ph.D. Thesis. Joongbu University, Geunsan, Chungnam, Korea.
34. Choi, H. J., S. J. Park, and T. H. Hong (2005) Anti-tumor activity of fermented liquid Opuntia humifusa in cervical cancer cells its chemical composition. J. Kor. Soc. Food Sci. Nutr. 34: 1525-1530.
35. Eom, K. S., H. J. Kim, H. S. So, P. Park, and T. Y. Kim (2010) Berberine-induced apoptosis in human glioblastoma T98G cells is mediated by endoplasmic reticulum stress accompanying reactive oxygen species and mitochondria dysfunction. Biol. Pharm. Bull. 33: 1644-1649.
36. Oliver, F. J., G. de la Rubia, V. Rolli, M. C. Ruiz-Ruiz, G. de Murcia, and J. M-de. Murcia (1998) Importance of poly (ADP-ribose) polymerase and its cleavage in apoptosis lesson from an uncleavable mutant. J. Biol. Chem. 273: 33533-33539.
37. Moon, S. W., S. H. Kang, Y. J. Jin, J. G. Park, Y. D. Lee, et al. (2004) Fermentation of Citrus unshiu Marc. and functional characteristics of the fermented products. Kor. J. Food. Sci. Tech. 36: 669-676.
38. Kim, E. J., H. S. Park, M. J. Shin, H. K. Shin, and J. H. Yoon (2009) Induction of apoptosis in HT-29 human colon cancer cells by the pepper component piperine. J. Kor. Soc. Food Sci. Nutr. 38: 442-450.
39. Kim, S. H., K. U. Kim, S. N. Yu, H. J. Jeon, Y. R. Jin, et al. (2011) Silibin inhibits cell growth and induces apoptosis through cell-cycle arrest in PC-3 prostate cancer cells. J. Life Sci. 21: 1573- 1578.