The Korean Society For Biotechnology And Bioengineering

Current Issues

Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 35 , No. 1

[ Research Paper ]
Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 34, No. 3, pp.145-153
Abbreviation: KSBB J
ISSN: 1225-7117 (Print) 2288-8268 (Online)
Print publication date 30 Sep 2019
Received 09 Jun 2019 Revised 09 Jul 2019 Accepted 09 Jul 2019
DOI: https://doi.org/10.7841/ksbbj.2019.34.3.145

반응표면법을 이용한 동결-융해 하이드로겔의 특성 평가 및 최적화
장현상1 ; 정형식1 ; 조영호2, * ; 이계원2, *
1건양대학교 의료공학과
2건양대학교 의료공학과 & 제약생명공학과

Characterization and Optimization of Hydrogel by Freezing-Thawing Method using Response Surface Methodology
Hyun Sang Jang1 ; Hyeong Sik Jeong1 ; Young Ho Cho2, * ; Gye Won Lee2, *
1Department of Medical Engineering & Science, Konyang University, Daejeon 35365, Korea
2Department of Medical Engineering & Science and Pharmaceutics & Biotechnology, Konyang University, Daejeon 35365, Korea
Correspondence to : *Department of Medical Engineering & Science and Pharmaceutics &Biotechnology, Konyang University, Daejeon 35365 Tel: +82-42-600-8503, Fax: +82-42-600-8503 e-mail: micael@konyang.ac.kr
Correspondence to : *Department of Medical Engineering & Science and Pharmaceutics & Biotechnology, Konyang University, Daejeon 35365 Tel: +82-42-600-8502, Fax: +82-42-600-8502 e-mail: pckmon@konyang.ac.kr


© 2019 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering

Abstract

In this study, PVA-based physically cross-linked hydrogels were prepared by changing freezing time, the content of polymer and gelling agent using freezing (–40℃) / thawing (25℃, 3hr) method. The purpose of this study is to evaluate and optimize the formulation of hydrogel based on the design of experiment (DoE) using central composite design. Melting point and moisture content of hydrogels for 3hr or more freezing time were uniform. SEM results was showed cross-linked bridge and the incorporation of dexibuprofen. On the basis of results, springiness and drug content were not affected by independent variables. AS the content of PVA and PEG increased, the hardness and peak stress increased, but the moisture content decreased. Also released drug % was increased until 10% of PEG/PVA and decreased by more than 10%. By the results we can confirm that the mechanism of drug release from hydrogel is Kormeyer-Peppas model by non-fickian diffusion. Optimized hydrogel (PVA 8.97%, PEG 12.28%) showed satisfactory results for dependent variables.


Keywords: hydrogel, freezing and thawing method, independent variables, dexibuprofen, central composite design

1. INTRODUCTION

약물전달시스템 (drug delivery system, DDS) 기술이란 일종의 biochemical engineering 기술의 응용으로 제제, 혹은 도구를 사용하여 원하는 신체 부위에 약물을 전달하거나 혹은 적절한 시간에 약물을 방출하는 기술이다 [1]. 하이드로겔은 위장관 내 약물 흡수 시 부담감 해소, 환자의 거부감 감소 및 경구 투여를 실시할 수 없는 경우에 사용이 가능하며 부작용이 나타나면 즉시 투여를 중지할 수 있기 때문에 이를 이용한 다양한 경피흡수제제 (transdemal drug delivery system, TDDS)가 개발되어 적용되고 있다 [2-4].

하이드로겔은 물에 녹지 않고 팽윤되어 구조 내에 많은 양의 수분을 함유할 수 있는 3차원 망상 구조를 갖는 친수성 고분자의 물질이며 수용액에서 팽윤된 이 후 열역학적으로 안정하고 또한 특유의 친유성과 유연성으로 인해 의약학적 분야에 다양하게 이용되어지고 있다 [5,6]. 고분자의 가교 형태에 따라 화학적 하이드로겔과 물리적 하이드로겔로 분류한다 [7-9]. 화학적 하이드로겔은 가교제로 인하여 독성 용매가 남아있거나 기포가 생성될 수 있으며 기계적 물성이 물리적으로 제조된 하이드로겔에 비해 떨어진다는 단점을 갖는다 [8,10]. 물리적 하이드로겔은 어떠한 독성 용매도 사용하지 않고 우수한 기계적 물성을 갖으며 물리적 가교방법으로서 동결-융해 방법 (freezing-thawing method), ionic interaction method, hydrophobic method, hydrogen bond method 등이 있다 [11].

동결-융해 방법은 고분자 수용액을 동결시켰다가 해동하는 과정을 수차례 반복하여 물과 고분자 사슬간의 미세 상 분리를 일으켜 고분자 사슬의 결정화를 유도하여 하이드로겔을 형성한다 [12-15].

일반적으로 하이드로겔의 물리적 특성은 고분자의 분자량이나 가교제에 영향을 받아 분자량이 증가함에 따라 점도가 증가되면서 용액내 분자 간 구속이 더 강하며 고분자 사슬의 히드록시기에 의한 수소결합 역시 분자 사슬이 길수록 증가하게 된다. 또한 폴리에틸렌글리콜 (PEG 400)은 분자량과 고분자의 분자 간 (inter-molecular), 분자 내 (intra-molecular) 수소결합을 유도하기 위해 중합도 조절이 용이하다는 장점을 가지고 있어 많이 사용되어지고 있다 [16,17].

설계기반 품질고도화 (quality by design; QbD)란 의약품 개발 및 제조에 통계적 분석 및 위험 관리 방법론을 적용하여 의약품의 품질을 보장하는 것을 목표로 하는 접근법이다 [18-20]. 실험계획 과정을 통해 품질과 관련된 모든 변동 원인이 파악되고 평가되며 중요한 변수의 영향력을 평가한다. 이러한 개발 방식은 원하는 품질을 확보하고 의약품 전주기에 걸쳐 확보한 지식을 통해 제품과 공정 이해도를 높일 수 있다. QbD 중 실험설계 (design of experiment; DoE)는 최소의 실험을 통하여 최대의 정보를 확보 할 수 있는 방법으로 의약품 개발과정에서 설계된 실험을 통하여 실험결과의 신뢰성과 재현성을 확보하기 위하여 수행하며 의약품 개발 및 생산 공정에 대한 실험설계 방법은 스크리닝 실험설계 (screening design), 요인 실험설계 (factorial design), 반응표면법 (response surface methodology) 등으로 구분된다. 이중 반응표면법은 중심점을 반복하여 실험을 수행함으로서 다른 설계 방법과는 다르게 곡률효과를 고려할 수 있어 정밀한 통계적 분석이 가능하다 [21].

따라서 본 연구에서는 모델약물로 위장관 장해를 동반하는 NSAIDs계 약물중 하나인 덱시부프로펜을 함유하는 하이드로겔을 반응표면법 (response surface methodology, RSM) 의 실험설계법에 따라 동결시간, 고분자와 겔화제의 비율을 달리하여 동결-융해 방법으로 제조하여 물리적 특성에 미치는 영향을 평가 하였다.


2. MATERIALS AND METHOD
2.1. 시약 및 재료

시약으로는 덱시부프로펜 (dexibuprofen)은 국전사 (Korea) 에서 그리고 폴리비닐알코올 (PVA, MW 31,000~50,000, 89,000~98,000)과 폴리에틸렌글리콜 200과 400 (PEG 200, 400)은 Aldrich사 (USA)에서 구입하여 사용하였다. 분석에 사용된 HPLC용 아세토니트릴은 J.T Baker사 (Korea)에서 구입하여 사용하였으며, 그 외 기타 시약과 용매는 특급 또는 일급을 사용하였다.

2.2. 기기

기기로서 HPLC 1260 system (Agilent, USA)를, 동결건조기는 PF-1000 (Eyela, Japan)를, 피부투과기는 FCDV-16 (Lanfine, Korea)를, 수분측정기는 MB45 (Ohaus, USA), texture analyzer는 CT3 10k (Brookfield, USA)을, FT-IR은 FT/IR-4100 (Jasco, Japan)을, rheometer는 Compac 100 (Sun, Japan)을, 시차열량주사기 (differential scanning calolimeter)는 DSC N-650 (Scinco, Korea)을 그리고 주사전자현미경 (scanning electron microscope)은 S-4800 (Hitachi, Japan)을 사용하였다.

2.3. Preliminary study of hydrogel
2.3.1. 위험성 평가 (Risk Assessment)

동결-융해 방법에 의한 덱시부프로펜을 함유하는 하이드로겔의 품질목표 항목 (quality target product profile, QTPP)은 덱시부프로펜이 피부에 국소적으로 적용하는 제제로, 핵심 품질 특성 (critical quality attributes; CQA)은 경도, 최대응력, 탄력성, 수분함량과 용출률 및 함량으로 일정범위 이상 가지도록 설정하였다 [22,23].

하이드로겔에 영향을 줄 수 있는 모든 잠재 변수를 Fishbone diagram (Ishikawa diagram)을 작성하여 파악한 후 [24], Failure mode effect analysis (FMEA)을 이용하여 위험성을 평가하였다. 이 때 모든 잠재 변수는 발생도 (Occurrence, O), 심각도 (Severity, S) 및 감지도 (Detectability, D)로 나누어 영향 정도에 따라 1~3의 점수를 부여하고 위험 우선 순위 (riskpriority number, RPN = S×O×D) 계산식을 사용하여 영향을 주는 높은 변수를 확인하였다.

2.3.2 동결시간의 검토

2.3.2.1. 하이드로겔의 제조

일반적으로 동결-융해 방법에 의해 제조되는 하이드로겔의 특성은 사용하는 고분자의 분자량, 용액의 농도, 동결온도, 동결시간, 동결 반복 횟수에 의해 달라진다고 알려져 있다 [25,26].

따라서 동결-융해방법에 의한 하이드로겔의 제조조건을 확립하기 위해 고분자 (PVA) 10 %와 겔화제 (PEG 400) 10%을 사용하여 동결시간 (1, 3, 6 및 9시간)을 달리하여 1의 방법으로 제조하였다.

2.3.2.2. 하이드로겔의 평가

제조된 하이드로겔을 4℃에서 4시간 방치한 후, 약 4mg을 취하여 알루미늄 팬에 넣고 DSC로 측정하였다. 이 때 고분자 시료의 분해를 막기 위하여 질소 기류 하에서 25℃에서 150℃까지 10℃/min의 속도로 승온시키면서 열량의 변화 및 융점을 비교 측정하였다. 또한, 제조한 하이드로겔의 표면을 SEM으로 측정하여 결합된 표면 상태를 관찰하였다. 이때 측정 전류는 60 mA이었으며 시료는 측정하기 전 2주 동안 데시케이터에 넣어 건조시켜 수분을 제거하여 이온증착기로 백금 코팅하여 사용하였다.

제조된 하이드로겔 일정량을 밀폐된 용기에 일주일 동안 담가 팽윤시킨 후, 37.0±0.5℃에서 48시간 동안 건조하여 각각의 무게를 측정하여 다음과 같은 식에 의해 팽윤도를 측정하였다.

Ws- WdWd×100

여기에서 Ws는 팽윤된 하이드로겔의 무게, Wd는 건조된 하이드로겔의 무게이다.

2.3.3. 고분자 및 겔화제의 Screening

적합한 고분자와 겔화제를 선택하기 위해 동결시간을 3시간으로 고정하여 1의 방법에 따라 하이드로겔을 제조하여 경도, 최대응력, 탄력성, 수분함량, 함량 및 용출의 변화를 확인하였다.

2.4. PVA와 PEG 함량의 최적화

고분자 및 겔화제의 스크리닝 결과에 따라 선택되어진 PVA와 PEG의 함량이 하이드로겔의 특성에 미치는 영향을 평가하기 위하여 사전 실험을 통하여 정해진 범위에 따라 반응표면 설계법을 이용하여 평가하였다. 이때 하이드로겔은 덱시부프로펜 0.1 g을 그리고 PVA (X1)와 PEG400 (X2)를 각각 5~15 (W/W%)로 함유하도록 중심합성설계법 (central composite design, CCD)으로 설계하였다 [12,27]. 종속변수는 경도 (Y1), 최대응력 (Y2), 탄력성 (Y3), 수분함량 (Y4), 약물 방출률 (Y5) 및 약물 함량 (Y6)으로 하였다. 2차 다항모형은 모형의 중심점 5개, 축점 4개, 2K 요인점 4개 총 13개의 실험조건을 Minitab ver. 18 software (Minitab Inc., Pennsylvania, USA)을 사용해서 도출하였다.

이들의 상관관계에 대한 모델 적합성은 회귀분산분석 (ANOVA analysis, p<0.05) 및 다중상관계수 (R2) 통해 검증하였으며 약물 방출률 75%, 수분함량 75%, 최대응력 160,000 dyne/cm3, 경도 1,500 g, 함량 95%이상을 가지는 최적의 PVA와 PEG 400의 함량을 제시하였다.

2.4.1. 물리적 성질

제조된 하이드로겔을 30×30×20mm로 일정하게 잘라서 Texture Analyzer를 이용하여 probe (TA18번)으로 경도, 최대응력 및 탄력성을 각각 3회 반복하여 측정하였다.

제조된 하이드로겔을 약 1 g을 1×1 mm 크기로 잘라 알루미늄 팬에 펼쳐 놓은 뒤 수분측정기를 이용하여 수분함량을 3회 반복하여 측정하였다.

2.4.2. 함량 균일성

제조된 하이드로겔의 3군데를 무작위로 정하여 약 0.2 g (덱시부프로펜으로서 40 mg 해당량)을 취하여 메탄올 20 mL 을 넣고 1시간 동안 소니케이션하여 완전히 용해시킨 후, 0.45 μm멤브레인 필터로 여과하고 HPLC에 주입하여 분석하였다. 이때 컬럼은 Luna 5 μ C18 column (250×4.6 mm, particle size 5 μm), 최대흡수파장은 224 nm, 이동상은 0.01M 인산이수소나트륨 : 아세토니트릴 (38:62 V/V%), 그리고 유속은 1.0 mL/min이었다.

2.4.3. 약물 방출

제조된 하이드로겔의 약물 방출 평가는 하이드로겔 약 0.2 g (덱시부프로펜으로서 40 mg 해당량)을 취하여 0.45 μm 셀룰로오스아세테이트 멤브레인 필터에 Franz형 확산 셀을 사용하여 37±0.5℃로 유지시키면서 700 rpm으로 교반하면서 실시하였다. 이때 하이드로겔을 적용한 투과 면적은 2.303 cm3이었으며, receptor phase는 등장 인산염 완충액 (pH 7.4) 11.8 mL로 채웠다. 정해진 시간 (0, 0.5, 1, 1.5, 2, 4, 6, 9, 12, 24, 36 및 48시간)에 따라 receptor phase로부터 검액 0.2 mL씩 채취한 뒤 즉시 동온동량을 보충해주었으며 HPLC에 주입하여 분석하여 방출율 (%)을 구하였다.

용출시험으로부터 얻어진 각각의 데이터는 약물용출 메카니즘에 많이 이용되는 4가지 모델 (Zero order kinetic, Higuchimodel, Korsmeyer-Peppas model 및 First order kinetic)을 이용하여 하이드로겔로부터 덱시부프로펜의 용출양상으로부터 용출속도와의 상관계수를 구하였다. 이때 모델의 용출속도의 상관계수는 다음 식에 따라 구하였으며 Kormeyer-Peppas model의 경우 약물이 10~60%사이에 용출되어진 데이터만 사용하여 평가하였다 [28].

  • Zero order kinetic : Mt= K0 × t
  • Higuchi model : Mt= k1/2 × t1/2
  • Kormeyer-Peppas model : Mt/M = K × tn
  • First order kinetic : Log Mt = Log M –k/2.303 × t
  • Hixon-Crowell cube root law : M1/3– Mt1/3= K1/3× t

이들 식에서 Mt는 시간 t에서 방출된 약물의 양, M∞은 하이드로겔에 함유되어 있는 약물의 양, K는 속도상수, n은 방출 메카니즘과 관련된 지수이다. Kormeyer-Peppas model은 제형의 기하학적 형태에 따라서 조금씩 차이가 있지만 필름 형태의 경우에는 n=0.50인 경우 Fickian release, 0.50 < n < 1.00인 경우 non-Fickian release (anomalous release) 그리고 n=1.0인 경우 case-II transport를 따른다고 정의하고 있다 [29,30].


Scheme 1. 
The manufacturing process of hydrogel


3. RESULTS AND DISCUSSION
3.1. Preliminary study of hydrogel
3.1.1. 위험성 평가

동결-융해 방법의 하이드로겔에 영향을 줄 수 있다고 판단되는 모든 잠재변수를 FMEA으로 평가하여 Table 1에 나타내었다. 폴리머와 겔화제의 분자량은 모든 핵심 품질 특성 (CQA)에 대하여 높은 위험 우선 순위 (RPN) 값을 나타내는 것으로 평가되었다. 따라서 최종적으로 높은 RPN 값을 나타내는 폴리머와 겔화제의 함량을 핵심요인으로 설정하였다.

Table 1. 
RPN (risk priority number) score FMEA (failure mode effect analysis) risk assessment for hydrogel prepared by freezingthawing method
CQA
Variable
Hardness
(g)
Springiness
(mm)
Peak stress
(dyne/cm3)
Moisture content
(%)
Drug content
(%)
Drug released
(%)
API Purity Low(1*) Low(1) Low(1) Low(1) Low(1) Low(2)
Particle size Low(1) Low(1) Low(1) Low(1) Low(1) Low(4)
Solubility Low(1) Low(1) Low(1) Low(1) Low(1) Low(1)
Material Polymer type High(27) Mid.(12) High(18) Mid.(12) Mid.(12) High(27)
polymer ratio High(27) High(18) High(27) High(18) High(27) High(27)
Gelling agent type High(27) Mid.(12) High(18) Mid.(12) Mid.(12) High(27)
Gelling agent ratio High(27) High(18) High(27) High(18) High(27) High(27)
Freezing Freezing time High(27) High(27) High(27) High(27) Mid.(8) Mid.(8)
Freezing temperature Mid.(8) Mid.(6) Mid.(8) Mid.(8) Mid.(6) Mid.(8)
Freezing cycle Mid.(8) Mid.(8) Mid.(6) Mid.(8) Mid.(8) Mid.(6)
Thawing Thawing time Mid.(4) Low(2) Low(1) Mid.(4) Mid.(4) Low(1)
Thawing temperature Low(2) Low(2) Low(2) Low(1) Low(1) Low(1)
Thawing cycle Low(1) Low(2) Low(1) Low(1) Low(1) Low(1)
*RPN : Low 1~3, Middle 4~12, High 13~27
Any variable above the RPN threshold of 13 ~27 was considered as potential high risk factor.

3.1.2. 동결 시간의 검토

동결-융해과정을 3회 반복하여 동결시간을 1, 3, 6 및 9시간으로 달리하여 하이드로겔을 제조하였을 때 융점은 각각 106.64, 109.21, 109.26 및 109.98℃로서 3시간 이상 동결한 경우에는 융점의 큰 변화가 없는 것으로 나타났다 (Fig. 1).


Fig. 1. 
The change of melting point according to freezing time in DSC.

제조된 하이드로겔의 표면에서는 구 형태의 입자 모양을 나타내는 PVA가 겔화제인 PEG에 의해 감싸져 있는 가교 현상을 SEM으로 확인할 수 있었다 (Fig. 2). 또한, 동결시간이 길어짐에 따라 공극의 수와 크기가 작아졌으며, 특히 1시간과 3시간 동결하여 제조한 하이드로겔의 결합 사이마다 공극이 존재하여 특히 1시간 후에 가장 많은 공극이 존재하는 것을 관찰할 수 있었다. 하이드로겔의 팽윤도는 1, 3, 6 및 9시간에 각각 3.46±0.02, 3.50±0.06, 2.92±0.05 및 2.74±0.04%로서 3시간 이후에는 오히려 감소하였다. 이는 동결시간이 너무 길어지면 매트릭스를 이루는 내부 공간들이 좁아지면서 물 함유율도 줄어들 수 있기 때문인 것으로 사료되어진다 [31].


Fig. 2. 
SEM pictures of hydrogel according to freezing time (×6,000).

따라서 동결-융해과정을 3시간~4시간으로 3회 반복하여 제조하는 것이 가장 바람직한 물성을 나타내는 것으로 사료되어 이후 과정에서는 동일한 조건으로 제조하였다.

3.1.3. 고분자 및 겔화제의 Screening

제조된 하이드로겔의 경도와 최대응력은 낮은 PVA와 PEG 분자량에서 감소하였으며 탄력성과 함량은 영향을 받지 않았다. 또한 용출은 PVA의 분자량이 낮아지면 조금 감소하는 경향을 보였지만 저분자량의 PEG에서 감소되었다 (Table 2). 따라서 이후 실험에서는 높은 분자량을 가지는 PVA와 PEG를 선택하여 하이드로겔을 제조하여 평가하였다.

Table 2. 
The screening experimental results of hydrogel prepared by freezing-thawing method
Formulation (%) Item
A B C D Hardness(g) peak stress(dyne/cm3) Springiness(mm) Moisture content (%) Drug content (%) Drug released (%)
10 10 1546±201 188015±29121 13±1.2 78.21±2.11 100.21±1.12 81.12±1.54
10 10 232±28 25279±2316 13±2.1 75.23±2.54 99.64±2.35 78.43±3.14
10 10 878±49 95742±8540 14±1.9 76.87±3.12 98.54±3.12 26.86±3.98
A: PEG 200, B: PEG 400, C: PVA (MW 89,000~98,000), D: PVA (MW 31,000~50,000)

3.2. PEG와 PVA 함량의 최적화

RA를 통해 독립변수를 PVA의 함량 (X1), PEG의 함량 (X2)으로 설정하여 중심합성설계에 대한 종속변수의 결과, 모형 적합성을 위한 2차 항에 대한 회귀분산분석 (p<0.05) 및 다중 상관계수를 Table 3Table 4에 각각 나타내었다. 또한 반응표면법과 등고선도를 Fig. 34에 나타내었다.

Table 3. 
The experimental results of dexibuprofen hydrogel
Run no. X1 X2 Hardness (g) Springiness (mm) Peak stress (dyne/cm3) Moisture content (%) Drugreleased (%) DrugContent (%)
1 15 5 1323±126 14.1±0.3 140124±12564 75.6±2.7 22.4±2.3 98.4±1.2
2 2.92 10 399±56 13.6±0.4 43530±4546 89.2±2.2 61.0±3.3 101.7±2.7
3 10 10 1546±126 14.1±0.5 188015±10421 78.1±2.0 81.3±0.4 97.3±2.3
4 10 10 1523±254 14.0±0.5 186721±10569 78.3±1.6 81.2±4.2 98.3±1.2
5 10 2.92 788±65 13.5±0.2 85862±6842 81.3±3.0 19.2±.3.4 103.2±3.3
6 10 10 1512±214 13.9±0.5 189721±15648 77.9±1.8 82.5±5.2 98.6±1.3
7 10 17.07 1877±226 14.0±0.1 204523±20486 71.2±3.3 37.0±3.3 96.6±0.3
8 10 10 1543±221 14.1±0.4 187812±14623 78.6±2.5 81.5±4.3 98.3±1.7
9 15 15 3156±265 13.6±0.7 302123±34654 73.8±1.6 33.3±1.3 101.3±3.3
10 17.07 10 2600±205 13.5±0.2 283376±26468 72.6±1.5 77.5±3.7 99.5±2.7
11 5 5 212±32 14.0±0.3 21291±2654 87.6±2.3 13.3±0.3 98.6±1.7
12 5 15 484±82 13.9±0.4 50212±5461 81.5±3.7 18.3±1.2 102.3±2.3
13 10 10 1556±132 13.9±0.2 188098±11468 77.8±2.9 81.0±4.2 99.3±2.4

Table 4. 
Results of polynomial equations derived for various responses
Variables Observed response
bo X1 X2 X12 X22 X12
Y1 Coefficient 1536.0 862.0 455.6 −48.8 −132.3 390.2
P-Value 0.000 0.000 0.000 0.371 0.036 0.001
−263+55.3X1+40.9X2−1.95X12-5.29X22+15.61X1X2(R2=0.985, P=0.000)
Y2 Coefficient 188073 88742 44841 −18782 −27912 33269
P-Value 0.000 0.000 0.000 0.012 0.002 0.003
−132789+19466X1+17990X2−751X12−1116X22+1331X1X2(R2=0.983, P=0.000)
Y3 Coefficient 13.982 −0.0325 0.0026 −0.1441 −0.0591 −0.092
P-Value 0.000 0.693 0.975 0.132 0.507 0.434
12.859+0.1458X1+0.0848X2−0.00577X12−0.00237X22−0.00370X1X2(R2=0.363, P=0.584)
Y4 Coefficient 78.140 −5.397 −2.773 1.642 −0.683 1.075
P-Value 0.000 0.000 0.000 0.007 0.166 0.107
102.62−2.823X1−0.439X2+0.0657X12−0.0273X22+0.0430X1X2(R2=0.972, P=0.000)
Y5 Coefficient 81.50 5.93 5.13 −12.83 −33.41 1.46
P-Value 0.000 0.282 0.348 0.051 0.000 0.845
−119.7+10.87X1+27.17X2−0.513X12−1.336X22+0.058X1X2(R2=0.857,P=0.007)
Y6 Coefficient 98.358 −0.540 −0.337 1.090 0.745 −0.19
P-Value 0.000 0.512 0.680 0.236 0.405 0.869
106.69−0.904X1−0.587X2+0.0436X1X1+0.0298X2X2−0.0076X1X2 (R2=0.292, P=0.716)


Fig. 3. 
Response surface plots of mechanical property, moisture content, released drug % and drug content as a function for PVA (%) and PEG (%) in hydrogel.


Fig. 4. 
Contour plots of mechanical property, moisture content, released drug % and drug content as a function for PVA (%) and PEG 400 (%) in hydrogel.

경도, 최대응력, 수분함량은 회귀분산분석결과 회귀 모형에 적합한 것으로 나타났다 (R2>0.98). 경도는 PVA가 증가함에 따라 직선적으로 증가하였으나 PEG는 2차식의 곡선형태를 보이며 교호작용을 나타내었다.

최대응력은 PVA와 PEG에 모두 이차식의 곡선형태를 보이며 교호작용을 나타내었다. 또한 수분함량은 경도와 달리 PVA에 대해 2차 곡선 형태를 보였으나 PEG와의 교호 작용은 없었다.

탄력성과 함량은 회귀 모형에 적합하지 않으므로 PVA와 PEG 400의 양에 의해 큰 영향을 받지 않고 덱시부프로펜이 균일하게 분산되어 제조되어진다고 할 수 있다.

6시간 후에 약물 방출률은 PVA와 PEG가 10 %까지 증가하지만 그 이상에서는 오히려 낮아지는 2차식의 곡선형태를 나타내었으나 교호작용은 없는 것으로 확인되었다.

하이드로겔로부터 덱시부프로펜의 방출은 Kormeyer-Peppas model을 따르는 것으로 평가되어졌으며 release exponent는 0.49~0.90으로서 anomalous (non-Fickian) diffusion mechanism을 나타내는 것으로 나타났다 (Table 5).

Table 5. 
Regression coefficient (R2) values of dexibuprofen release data obtained from hydrogel
Formulation Correlation Coefficient (R2)
Zero order Higuchi
model
Hixon-
Crowell
First order Peppas model
PVA (%) PEG (%) k n R2
A 15 5 0.9463 0.9795 0.8471 0.958 0.0011 0.9046 0.9642
B 2.92 10 0.8500 0.9196 0.7806 0.9039 0.0183 0.6974 0.9351
C 10 10 0.8394 0.9222 0.7566 0.949 0.0042 0.869 0.9519
D 10 2.92 0.8412 0.9276 0.7407 0.8556 0.0026 0.7286 0.9238
E 10 17.07 0.9510 0.9736 0.8858 0.9681 0.0039 0.7749 0.9607
F 15 15 0.9541 0.9877 0.8557 0.9711 0.0024 0.8349 0.9726
G 17.07 10 0.8613 0.9336 0.7715 0.9507 0.0113 0.8161 0.9610
H 5 5 0.8543 0.9391 0.7715 0.8645 0.0075 0.4917 0.9479
I 5 15 0.8398 0.9261 0.7158 0.8547 0.0012 0.8444 0.9261

3.3. Formulation의 최적화

하이드로겔은 물리적 특성 중 수분함량이 떨어지고, 기계적인 경도나 탄성이 작아지면 겔의 특성이 악화되는 특징을 가지는 것으로 알려져 있다 [33]. 따라서 독립변수의 영향을 받는 종속변수 중 용출률과 다른 종속변수들과의 상관성 분석을 실시하였다. Pearson 상관계수가 0.8 이상에서는 강한 상관성을 0.4 이하에서는 상관성이 약하거나 없다고 판단할 수 있다. 즉, 용출에 대한 경도, 최대응력, 수분함량의 Pearson 상관계수는 각각 0.325, 0.474, −0.187로 영향을 주지 않았다. 따라서 경도, 최대응력, 수분함량은 중간 값 이상을 가지도록 설정하여 각각 경도 >1,500 g, 수분함량 >75%, 최대응력 >160,000 dyne/cm3 및 용출 >75%의 값을 가지도록 겹쳐지는 영역을 표시하여 Fig. 5에 나타내었다. 즉, PVA와 PEG는 각각 8.96~14.24와 8.07~12.76%의 범위에서 하이드로겔은 바람직한 특징을 나타내었고 두 요인을 모두 만족하는 PVA와 PEG의 범위는 각각 10.06~12.45와 9.48~11.62%이었다.


Fig. 5. 
Overlay plot that satisfied the target value for the response variables.

CQA의 최소 필요 범위 값에 해당하는 목표값으로 최적화를 실시하였을 때 만족하는 PVA 8.97과 PEG 400 12.28% 함유하도록 하이드로겔을 제조하여 평가한 결과는 예측된 결과값과 일치하였다 (Table 6, Fig. 6).

Table 6. 
The results of hydrogel containing dexibuprofen prepared by optimized formulation
Item Formulation
Optimized value Actual value
Hardness (g) 1499.69 1509.67 ± 19.60
Peak stress (dyn/cm3) 180505 175550 ± 8720
Springiness (mm) >13 14.14 ± 0.24
Moisture content (%) 77.81 78.10 ± 0.20
Drug content (%) 95~105 99.38 ± 1.61
Drug released (%) 75 75.26 ± 2.66


Fig. 6. 
Drug release profile for dexibuprofen hydrogel prepared by optimized formulation.


4. CONCLUSION

모델약물로 위장관 장해를 동반하는 NSAIDs계 약물중 하나인 덱시부프로펜을 함유하는 하이드로겔을 반응표면법 (response surface methodology)의 실험설계법에 따라 동결시간, 고분자와 겔화제의 비율을 달리하여 동결-융해 방법으로 제조하여 물리적 특성에 미치는 영향을 평가하였다. 그 결과 동결시간을 달리한 하이드로겔의 융점과 표면을 관찰하였을 때 3시간에서 가장 많은 수의 공극을 가질 뿐만 아니라 융점의 변화가 없었다.

제조된 하이드로겔의 탄력성, 수분함량 및 약물함량은 PEG와 PVA의 분자량에 의해 영향을 받지 않았지만 경도, 최대응력, 용출은 분자량이 증가할수록 증가하였다.

제조된 하이드로겔의 함량과 탄력성은 PEG와 PVA의 양에 의해 영향을 받지 않았으나 경도, 수분함량, 용출은 영향을 받아 경도와 최대응력은 증가할수록, 수분함량은 감소할수록 증가하였다.

하이드로겔에서 덱시부프로펜은 Kormeyer-Peppas model에 의해 non-fickian diffusion으로 방출되었다.

중심합성설계법에 따라 최적화된 PVA 8.97과 PEG 12.28% 을 함유하는 하이드로겔은 높은 중합도를 가지고 예측된 값과 일치하였다


Reference
1. Jin, H. E., J. H. Kim, and I. Y. Park (2005) Transdermal drug delivery system. J. Korean Ind. Eng. Chem. 16: 10-17.
2. Mignani, S., S. E. Kazzouli, M. Bousmina, and J. P. Majoral (2013) Expand classical drug administration ways by emerging routes using dendrimer drug delivery systems: A concise overview. Adv. Drug Deliv. Rev. 65: 13-20.
3. Shingada, G. M., Q. Aamer, P. M. Sabale, N. D. Grampurohit, M. V. Gadhave, et al. (2012) Recent trend on transdermal drug delivery system. J. Drug Delivery Therapeutics 2: 66-75.
4. Choi, D. S., D. Y. Lee, and B. K. Yoon (2012) Effects of transdermal estrogen gel in postmenopausal Korean woman. J. Korean Soc. Menop. 18: 112-117.
5. Kopeck, J., and J. Y. Ang (2007) Hydrogels as smart biomaterials. Polym. Int. 56: 1078-1098.
6. Hennink, W. E., and C. F. Van Nostrum (2002) Novel cross-linking methods to design hydrogels. Adv. Drug Deliv. Rev. 54: 13-36.
7. Purss, H. K., G. G. Qiao, and D. H. Solomon (2005) Effect of “glutaraldehyde” functionality on network formation in poly(vinyl alcohol) membranes. J. Appl. Polym. Sci. 96: 780-792.
8. Hassan C. M. and N. A. Peppas (2000) Structure and applications of poly(vinyl alcohol) hydrogels produced by conventional crosslinking or by freezing/thawing methods. pp. 37-65. In: Biopolymers · PVA Hydrogels, Anionic Polymerisation Nanocomposites. Advances in Polymer Science, Vol 153. Springer, Berlin, Heidelberg, Germany.
9. Willcox, P. J., W. Douglas, and J. R. Howie (2000) Microstructure of poly(vinyl alcohol) hydrogels produced by freeze/thaw cycling. J. Polym. Sci. 37: 3438-3454.
10. Hassan, C.M., J. H. Ward, and N. A. Peppas (2000) Modeling of crystal dissolution of poly(vinyl alcohol) gels produced by freezing/ thawing processes. Polymer 41: 6729-6739.
11. Wang, C., Y. Zheng, K. Qiao, Y. Xie, and X. Xie (2015) An environmentally friendly preparation and characterization of waterborne polyurethane hydrogels by polyvinyl alcohol physical crosslinking to improve water absorption. RSC Advances 5: 73882- 73891.
12. Park, S. H. (2011) Modern Design of Experiments. pp. 521-571. Minyoug Pub., Seoul, Korea
13. Nakaoki T. and H. Yamashita (2008) Bound States of Water in Poly(vinyl alcohol) hydrogel prepared by repeated freezing and melting method. J. Mol. Struct. 875: 282-287.
14. Stauffer, S. R. and N. A. Peppas (1992) Poly(vinyl alcohol) hydrogels prepared by freezing-thawing cyclic processing. Polymer 33: 3932-3936.
15. Kim, J. O., J. K. Park, and J. H. Kim (2008) Development of polyvinyl alcohol-sodium alginate gel-matrix-based wound dressing system containing nitrofurazone. Int. J. Pharma. 359: 79-86.
16. Choi, J. Y., B. S. Hatice, and O. K. Muratoglu (2007) Effects of solvent dehydration on creep resistance of poly(vinyl alcohol) hydrogel. Biomaterials 28: 772-780.
17. Haticek, B. S., J. Y. Choi, and O. K. Muratoglu (2008) The effect of polyethylene glycol on the stability of pores in polyvinyl alcohol hydrogels during annealing. Biomaterials 29: 141-149.
18. Patil, A. S. and A. M. Pethe (2013) Quality by Design (QbD) : A new concept for development of quality Pharmaceuticals. IJPQA 4: 13-19.
19. ICH pharmaceutical development guideline (Q8, Q9, Q10) http://www.ich.org/products/guidelines/quality/article/quality-guidelines. (2009)
20. Xu, X., M. A. Khanb, and D. J. Burgessa (2011) A quality by design (QbD) case study on liposomes containing hydrophilic API: I. Formulation, processing design and risk assessment. Int. J. Pharm. 419: 52-59.
21. Bhaumik, R., N. K. Mondal, S. Chattoraj, and J. K. Datta (2013) Application of response surface methodology for optimization of fluoride removal mechanism by newely developed biomaterial. Am. J. Anal. Chem. 4: 404-419.
22. Aksu, B., A. Paradkar, M. de Matas, O. Ozer, T. Güneri, and P. York (2012) Quality by design approach: application of artificial intelligence techniques of tablets manufactured by direct compression. AAPS Pharm. Sci. Tech. 13: 1138-1146.
23. Ishigawa, K. (1986) Guide to quality control. 2nd ed., Asian productivity organization, Tokyo, Japan
24. Mesut, B., Y. Ozsoy, and B. Aksu (2015) The place of drug product critical quality parameters in quality by design (QbD). Turk. J. Pharm. Sci. 12: 75-92.
25. Khang, G., M. S. Kim, and B. H. Min (2006) Scaffolds for tissue engineering. Tissue Eng. Regen. Med. 3: 376.
26. Fouladi, F. and S. A. Mortazavi (2012) Preparation and in vitro evaluation of gastroretensive Bupropion hydrochloride tablets. Trop. J. Pharm. Res. 11: 351-359.
27. Delozier, M. R. and S. Orlich (2003) Discovering influential cases in linear regression with MINITAB: Peeking into multidimensions with a MINITAB macro. Mathematics Preprint Archive. 6: 459-476.
28. Fouladi, F. and S. A. Mortazavi (2012) Preparation and in vitro evaluation of gastroretensive Bupropion hydrochloride tablets. Trop. J. Pharm. Res. 11: 351-359.
29. Siepmann, J. and N. A. Peppas (2001) Modeling of drug release from delivery systems based on hydroxypropyl methylcellulose (HPMC). Adv. Drug Deliv. Rev. 48: 139-157.
30. Ritger, P. L. and N. A. Peppas (1987) A simple equation for description of solute release II. Fickian and anomalous release from swellable devices. J. Control. Rel. 5: 37-42.
31. Choi. E. K., H. I. Kim, K. R. Park, and Y. C. Nho (2003) Preparation and characterization of PVA/PVP/PEG/chitosan hydrogels by freezing/thawing and radiation crosslinking. J. Korean. Ind. Eng. Chem. 14: 505-510.
32. Lee, O. J., J. H. Kim, H. W. Ju, B. M. Moon, H. J. Park, F. A. Sheikh, and C. H. Park (2013) Fabrication and characterization of silk/PVA hydrogels by sonication and freezing-thawing technique. Polymer. 37: 717-721.
33. Lee, S. Y., C. M. Lee, M. C. Kim, J. Y. Kwak, S. W. Park, and Y. J. Lim (2014) Hydrogel of manufacture method thereofe, and pH sensor using the same. Korea Patent KR101576030B1.