The Korean Society For Biotechnology And Bioengineering

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Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 35 , No. 2

[ Review Paper ]
Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 34, No. 4, pp.233-242
Abbreviation: KSBB J
ISSN: 1225-7117 (Print) 2288-8268 (Online)
Print publication date 31 Dec 2019
Received 28 Sep 2019 Revised 04 Oct 2019 Accepted 05 Oct 2019
DOI: https://doi.org/10.7841/ksbbj.2019.34.4.233

메탈로티오네인 단백질의 약학적 효능과 이의 응용
유한진 ; 이지현 ; 임광석*
강원대학교 생물공학과

Pharmaceutical Efficacy of Metallothionein Protein and Its Application
HanJin Yu ; Jihyeon Lee ; Kwang Suk Lim*
Department of Biotechnology and Bioengineering, Kangwon National University, Chuncheon, 24341, Korea
Correspondence to : *Department of Biotechnology and Bioengineering, Kangwon National University, Chuncheon, 24341, Korea Tel: +82-33-250-6279, Fax: +82-33-243-6350 e-mail: kslim@kangwon.ac.kr


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Abstract

Metallothionein (MT) protein consists of about 60 amino acids including 20 cysteine residues. MT as a low-molecular weight intra-cellular protein is over-expressed in the cell exposed stressful conditions such as in the presence of heavy metals, starvation, heat, or inflammation. Recently, MT has been reported as an antioxidant proteins having an antioxidant effect to protect cells from oxidative stress by reactive oxygen species (ROS). Oxidative stress has been known as a cause of various diseases such as diabetes, diabetic complications and myocardial disease and has been also found to be associated with cancer. MT has potential as a therapeutic agent due to its excellent antioxidant effect and control of cell growth. Recombinant fusion metallothionein, which is fused a protein transduction domain or mitochondrial targeted domain into metallothionein, showed enhanced therapeutic effect. In addition, the expression of metallothionein was related anticancer drug sensitivity in the cancer cells and resistance. Because MT could control cell growth and survival, it is necessary to develop a therapeutic agent targeting MT. Therefore, we discussed the characteristics and therapeutic efficacy of metallothionein.


Keywords: Metallothionein, anti-oxidant, reactive oxygen species, recombinant protein, protein transduction domain

1. INTRODUCTION

메탈로티오네인 (Metallothionein, MT) 단백질은 세포 내 저분자 단백질로 시스테인이 매우 많은 특징을 갖고 있으며, 진핵 세포의 메탈로티오네인 단백질은 매우 높은 유사성을 갖고 있다 [1]. 메탈로티오네인 단백질은 세포가 중금속, 기아, 열 또는 염증 같은 스트레스 환경에 노출되었을 때 과발현 되어 세포를 보호하는 단백질로 잘 알려져 있다 [2]. 특히, 산화 스트레스 (Reactive Oxygen Species, ROS)로부터 세포를 보호하는 항산화 효능이 있는 항산화 단백질로 메탈리티오네인 단백질이 보고되고 있다 [3-5] (Fig. 1). 최근 산화 스트레스는 당뇨병, 당뇨합병증 및 심근 질환 등 다양한 질병의 원인으로 알려져 있으며 암 발병에도 연관이 있음이 밝혀지고 있다 [6-9]. 이에 산화 스트레스로부터 세포 및 조직을 보호하는 것이 중요하며, 메탈로티오네인은 우수한 항산화 효과로 인해 치료제로 관심이 높아지고 있다. 이에 본 총설에서는 메탈로티오네인 단백질의 특성, 구조 및 주요 기능을 살펴보고 메탈로티오네인의 바이오 의약품으로의 응용 가능성에 대해 논의하고자 한다.


Fig. 1. 
Overview of metallothionein function [5].

1.1. 메탈로티오네인 (Metallothionein, MT)란?

메탈로티오네인 단백질은 그 명칭에서 나타나는 것처럼 금속과 결합을 하며 티오네인이 특징인 단백질임을 알 수 있다 [10,11]. 메탈로티오네인은 세포 내에서 금속과 결합하는 단백질로 금속의 양을 조절하는 기능을 갖고 있으며 이를 통해 세포를 보호하게 된다. 주로 신장, 간 및 소장에서 많이 발견되며, 척추 동물에서 메탈로티오네인은 공통적으로 발현되는 단백질 중 하나이다 [12]. 메탈로티오네인의 가장 큰 특징은 분자량이 7000 달톤 이하로 작으며 구성 아미노산 중 시스테인 (Cysteine)이 18~23개로 많고 아로마틱 아미노산과 히스티딘이 없다는 점이다. 또한 Zn, Cu 또는 Cd과의 높은 결합력을 갖고 있다 [13-15].

1.2. 메탈로티오네인의 구조 및 특성

메탈로티오네인은 저분자 단백질로 61개에서 68개의 아미노산으로 구성되어 단일 사슬로 연결되어 있다. 시스테인 아미노산이 전체 아미노산의 30% 이상을 차지하고 있으며, 시스테인의 티올기 (thiol group)는 비결합상태로 존재하지 않는다. 이가 금속양이온들이 이 시스테인의 티올기의 황 원자에 결합하여 메탈로티오네인 단백질의 형태를 갖게 되는데 구리(Cu, 1019-1017)가 가장 큰 결합력을 갖고 있으며 카드늄 (Cd, 1017-1015)과 아연(Zn, 1014-1011) 순이다 [13,16,17] (Fig. 2). 이외에도 18종의 금속이 메탈로티오네인과 결합할 수 있으나 금속들 중에서 구리(Cu+), 카드늄(Cd2+), 납(Pb2+), 은 (Ag+)과 수은(Hg2+) 만이 아연을 대체할 수 있다.


Fig. 2. 
Schematic representation of metallothionein (MT) structures [17].

메탈로티오네인에는 보통 7개의 이가양이온이 결합하고, 구리(Cu+) 이온 만이 12개가 결합한다 [16-18]. 메탈로티오네인은 알파 도메인(α-doamin)과 베타 도메인(β-domain)으로 두 개의 소단위로 구성되어 있다 [19,20]. 알파 도메인은 안정성이 높으며 4개의 이가 양이온과 결합을 하고, 베타 도메인은 반응성이 높으며 3개의 이가 양이온과 결합한다. 메탈로티오네인의 4차 구조는 유동성이 있으며 아연과 카드늄은 베타 도메인에서 빠르게 변화하여 알파 도메인에서는 상대적으로 느리게 반응한다. 이러한 유동성 덕분에 메탈로티오네인은 다른 단백질로 메탈 이온을 전달할 수 있으며, 메탈이온의 항상성 유지 및 독성 조절의 효능을 갖게 된다.

1.3. 메탈로티오네인 발현

세포 내에서 발현하여 세포 보호효과를 보이는 메탈로티오네인은 크게 4가지 형태의 동형체(protein isoforms)을 가지고 있다 [10,21] (Fig. 3). 사람에서 발현되는 메탈로티오네인 (human metallothionein, hMT) 중 메탈로티오네인 1 (hMT-a)은 7가지의 다양한 동형체를 가지고 있다 [22, 23]. 메탈로티오네인 2a(hMT-2a)는 하나의 동형체가 있으며, 메탈로티오네인 3과 4는 1개의 유전자 형만 존재한다. 이러한 발현의 차이는 번역 후 과정의 아세틸레이션 또는 금속결합의 차이에 의해 나타나며 각각의 동형체들은 각각의 발현율 및 분해를 차이를 갖게 된다. 메탈로티오네인 1과 2는 체내 전체에서 폭넓게 발현하며 특히 메탈로티오네인 2a (MT-2a)는 MT-1과 비교하여 사람의 조직에서 더 많이 발현된다. 메탈로티오네인 3(MT-3)는 뇌에서 주로 발견되며, MT-4는 편평 상피 (Squamous epithelia)에서만 관찰된다 [24-26].


Fig. 3. 
Structure and amino acid sequence of various metallothionein proteins [10] .

1.4. 메탈로티오네인의 주요 기능

체내에서 메탈로티오네인은 간, 신장, 소장과 췌장에서 주로 높은 농도를 보인다 [13]. 메탈로티오네인은 빠르게 증식하는 세포의 세포질과 핵에서 높게 발현된다 [27,28]. 핵에서 메탈로티오네인이 높게 발현되는 것은 세포의 분열 시 아연이온의 공급을 조절함으로써 산화 스트레스로부터 DNA를 보호하는 것으로 예상된다. 또한 메탈로티오네인은 갓 태어난 쥐의 간세포, 간 재생 및 신장의 핵에서 그 발현이 증가 된다 [29]. 암세포에서도 핵에 존재하는 메탈로티오네인이 온도 및 에너지 의존적임이 밝혀졌는데 빠르게 증식하는 암세포의 DNA를 보호하기 위해 메탈로티오네인이 요구됨을 알수 있다 [30]. 평상시 세포와 비교하여 세포 분열과정에서 메탈로티오네인은 핵 내에서 발현이 2~3배 증가하게 된다 [31]. 핵 내에서 메탈로티오네인 발현이 S기와 G2기에 주로 높아지는 반면에 세포질에서의 발현은 G1기와 G1/S 전이기에 메탈로티오네인 발현이 증가한다.

메탈로티오네인은 세포 보호가 필요할 때 주로 발현이 증가하는데 대표적인 조건으로는 중금속, 아연이온 조절 및 산화스트레스가 있다 [1]. 카드늄(Cd) 같은 중금속에 세포가 노출이 되면 메탈로티오네인이 증가하여 카드늄과 결합하여 독성을 중화한다 [32]. 또한 세포 내에서 다양하게 이용되는 아연이온의 경우 그 양이 높아져도 독성을 유발하기에 메탈로티오네인은 아연이온의 양을 조절하여 세포 내에서 아연이온이 효과적으로 사용되게 해준다 [33-35]. 끝으로 산화스트레스는 다양한 질병과 연관이 되는데 메탈로티오네인은 항산화 단백질로 알려져 산화스트레스 하에서 발현이 증가하여 세포를 보호하는 효과를 갖고 있다.

이외에도 메탈로티오네인은 세포의 사멸 (Apoptosis, 세포자멸)을 조절하는 데도 관여하는 것으로 알려져 있다 [36,37]. 메탈로티오네인 결핍 마우스의 섬유아세포 (Fibroblast) 및 배아 세포 (Embryonic cell)에 시스플라틴을 처리한 연구에서 종양 억제 단백질 p53 (Tumor suppressor protein p53) 및 사멸 조절 단백질 BAX의 발현이 정상세포와 비교하여 높아졌음을 보여주었다 [38]. 이는 메탈로티오네인의 결핍이 세포 사멸의 민감도를 높여줌을 보여주며, 메탈로티오네인 결핍 폐 섬유세포에서도 구리에 대한 세포 사멸 민감도가 높아짐이 밝혀졌다. 반대로 메탈로티오네인의 과발현은 허혈성스트레스 및 독소루비신 (Doxorubicin)으로부터 심근 세포를 보호했으며, 인간 간암에서는 세포의 사멸을 억제하였다 [39,40]. 이처럼 메탈로티오네인은 세포가 스트레스 조건에 노출되었을 때 또는 증식으로 보호가 필요할 때 과발현 되는데 일반 세포 및 암세포에서도 동일하게 세포의 사멸에 영향을 주는 것을 알 수 있다. 따라서 다음 장에서는 메탈로티오네인의 효능을 활용해 치료제로의 응용을 살펴보고자 한다.


2. 메탈로티오네인 단백질 치료제
2.1. 산화스트레스와 질병

활성 산소종 (Reactive Oxygen Species, ROS)에 의해 유발되는 산화스트레스 (Oxidative Stress)는 심장 질환, 미토콘드리아 질환, 염증 질환, 암 및 대사증후군 등 다양한 질병의 원인이 되는 것으로 알려져 있으며 알츠하이머 및 파킨슨 병 같은 노화와 연관된 질병의 원인으로도 밝혀지고 있다 [37, 41,42]. 세포 내의 산소가 전자 반응에 의해 활성 산소종으로 바뀌게 되는데 이렇게 형성된 활성 산소종은 세포 내의 단백질, 지질 및 핵산 (Nucleic acid)의 변형을 유발하며, 세포 내 신호전달 체계에도 영향을 주는 것으로 밝혀졌다. 이런 활성 산소종에는 초산화물 (Super oxide, O2-), 과산화수소 (Hydrogen peroxide, H2O2) 및 산화질소 (Nitric oxide, NO)가 있다 [43,44]. 산화스트레스가 발생하면 세포 내 물질에 영향을 주는 것뿐만이 아니라 사이토카인 등과 반응하여 면역세포와 상호작용에 의해 염증을 유발하여 질병을 유발하고 아디포카인 (Adipokines)의 발현이상을 촉진하여 대사증후군 유발 및 만성 염증 반응을 촉진한다 [45].

이처럼 활성 산소종의 증가는 만성염증을 유발하고 이는 대사증후군 및 암 등 많은 질병의 원인이 된다. 하지만 세포내에서는 이들의 발생 및 제거를 통해 균형을 유지하는데 그 중 효소로는 초과산화물불균등화 효소 (Superoxide Dismutase, SOD), 과산화수소분해효소 (Catalase) 및 글루타티온과산화효소 (Glutathione peroxidase)이 있으며, 비효소군에는 요산 (Uric acid), 빌리루빈 (bilirubin) 및 메탈로티오네인 (Metallothionein)이 있다 [46,47]. 천연 항산화제로는 비타민 C(Ascorbic acid, Vitamin C)가 대표적이며, 카테킨 (Catachin), 커큐민 (Curcumin)과 레스베라트롤 (Resveratrol)이 있다 [48]. 합성 항산화제에는 글루타티온 유도체, 마이토퀴논, 초과산화물불균등화 효소 유도체와 과산화수소분해효소 유도체 등이 있다. 다양한 항산화 물질 중에서 메탈로티오네인 재조합 단백질 발현 및 이의 효능을 살펴보고자 한다.

2.2. 메탈로티오네인 재조합 단백질 발현 및 정제

메탈로티오네인은 세포 보호 효과가 널리 알려지면서 메탈로티오네인 단백질 결핍 동물 모델을 통해 질병과 메탈로티오네인의 연관성이 입증되었고, 메탈로티오네인 유전자를 통해 과발현 유도로 항산화 효과 등이 보고 되었다 [49,50]. 체내에 메탈로티오네인은 우수한 항산화 효과 및 이를 통한 세포 보호 기전이 알려지면서 단백질 치료제로 적용할 수 있는지에 대한 연구가 보고되었다 [51,52]. 메탈로티오네인 단백질은 대장균으로부터 발현 및 정제를 통해 단백질 효능을 확인 할 수 있다. 하지만 메탈로티오네인 단백질의 원래 형태로는 세포 내 투과가 어렵기 때문에 효과적인 전달을 위해 다양한 단백질 전달체가 필요하게 된다.

세포 투과를 높여주는 세포-침투 펩타이드 (Cellpenetrating peptide(CPP) 또는 Protein Transduction domain(PTD))는 치료용 단백질에 유전자 재조합을 통해 도입될 수 있다 [53,54]. 이 펩타이드들은 양이온성 특성을 갖고 있어 세포막과 이온 결합을 통해 빠르게 붙게 되고 세포 내 이입 (Endocytosis) 작용에 의해 치료용 단백질이 세포 내로 들어가 효능을 발휘하게 할 수 있다. 대표적인 세포-침투 펩타이드에는 아르기닌으로 구성된 폴리아르기닌(Poly-arginine)과바이러스에서 유래한 TAT이 있다. 이 펩타이드가 도입된 재조합 융합 메탈로티오네인은 대장균으로부터 발현을 하게되는데 단백질의 발현을 유도할 때 아연이온이 첨가되어 이의 안정성을 높여 준다 [51]. 재조합 융합 단백질이 세포-침투 펩타이드에 의해 세포 내로 잘 도입되는 것은 녹색형광단백질 (Green Fluorescence Protein, GFP)에 세포-침투 펩타이드를 융합시킨 세포-침투 펩타이드 녹색형광단백질이 세포내에 빠르게 들어가는 것을 통해 간접적으로 확인 할 수 있다 [55]. 또한 재조합 융합 단백질에 Fluorescein isothiocyanate (FITC) 또는 Cy5.5 같은 형광물질을 단백질에 결합시켜 이형광물질을 관찰하여 단백질 시스템의 세포 내 도입에 대한 확인이 가능하다.

2.3. 메탈로티오네인 재조합 단백질의 치료 효과

단백질 치료제가 표적 세포에 도달하기 위해서 다양한 방법들이 사용되었다 [56,57]. 대표적인 방법으로 단백질 투과 도메인 (Protein transduction domains, PTDs)를 이용한 방법이 있다 [51,54]. PTD는 양전하를 띤 arginine, lysine 아미노산잔기의 높은 함량을 특징으로 한다 (Fig. 4(a)). PTD 단백질과 펩타이드는 음전하를 띄는 동물 세포의 막을 효율적으로 관통한다. Arginine, lysine 잔기만을 함유하는 펩타이드는 P TD와 유사한 막 관통의 특징을 나타내며, 이 단백질들의 양전하가 막 관통에서 주요 필수적인 영역임을 시사한다. 따라서 단백질 치료제와 PTD의 융합을 통하여 세포 내 단백질 전달의 효율을 높일 수 있다.


Fig. 4. 
Protective effect of recombinant metallothionein proteins. (a) Construction of protein transduction domain(PTD) fused metallothionein (MT) protein, (b) Protective effect of PTD-MT against glucolipotoxicity and hyperglycemia, (c) Effect of Tat-MT on interstitial fibrosis and myocardial apoptosis in damaged rat hearts. (d) Immunohistochemical analysis of pancreas organ in normal and diabetic mice receiving Tat-MT-treated islets [51,58,59].

HIV-1 Tat 및 undeca-arginine(11R)과 같은 PTD를 단백질 전달 기술에 사용하여, 메탈로티오네인 재조합 융합 단백질 (Protein transduction domain fused metallothionein, PTD-MT)을 제작한 연구가 보고되었다 [51] (Fig. 4). PTD-MT 융합 단백질은 메탈로티오네인 단백질 보다 우수한 세포 내 도입을 통해 세포 보호 효과가 향상 되는 것을 보였다. PTD-MT 융합 단백질은 저산소증의 유무에 관계없이 산화 스트레스 및 세포 독성에 대해 췌장세포(Ins-1 β 세포)를 보호하고 고혈당의 의한 세포 사멸에 대해 H9c2 심근 세포를 보호하였다 (Fig. 4(b)). 쥐 심근경색 모델에서 PTD-MT 융합 단백질의 정맥 주사는 심장 기능을 효율적으로 회복시켰다고 보고 되었다 [58] (Fig. 4(c)). 또한 췌장 이식 실험에서 PTD-MT를 처리한 췌장을 이식한 동물에서 췌장이 더 오래 생존함이 보고 되어 항산화 단백질로의 메탈로티오네인의 효과가 입증되고 있다 [59] (Fig. 4(d)).

인간 중간엽 줄기세포에서 유래한 엑소좀 (Exosome)에 Tat-MT 융합 단백질을 봉입하여 그 효과를 입증한 연구가 보고 되었다 [60]. Tat-MT 융합 단백질을 포함한 exosome (Exo/Tat-MT)은 저산소 조건 하에서 Tat-MT 융합 단백질만 처리하였을 때보다 세포 사멸이 감소되었다고 보고하였다. 엑소좀을 통해 융합단백질을 보호하고 생체 내 이용률을 높임으로써 단백질만 사용하는 것보다 그 효과를 향상시켰다. 다른 연구에서는 PTD의 한 종류인 PEP-1을 사용하여, 재조합 PEP-1-MT3 단백질(PEP-1–metallothionein-III protein)을 제작했다 [61]. PEP-1이 융합된 메탈로티오네인 단백질은 in vitroin vivo 에서 효율적으로 세포 내로 전달되었고, 산화스트레스에 의한 세포 사멸 및 허혈성 발작 (ischemic insults)으로부터 보호 할 수 있음이 보고되었다.

메탈로티오네인(MT)와 단백질 투과 도메인 (Protein transduction domains, PTDs)의 융합은 메탈로티오네인의 세포 내 전달을 향상 시켰다. 이와 함께 PTD-MT의 효능을 향상시키기 위해 특이적 세포 표적, 세포 내 소기관 표적 및 세포 내 체류 시간 증가에 대한 개선이 요구되었다. 이를 위해 mitochondria malate dehydrogenase(mMDH)에서 유래된 펩타이드(sMTS)를 사용하여 Tat–sMTS–MT(TMM) 재조합 융합 단백질이 보고 되었다 [52] (Fig. 5(a)). 이 펩타이드를 통해 메탈로티오네인의 세포 내 체류 시간이 향상 되었고, 저산소 상태에 노출된 세포를 보호 효과 및 streptozotocin (STZ) 유도 당뇨병 마우스 모델에서도 보호 효과가 개선되었다 (Fig. 5(b)).


Fig. 5. 
Protective effect of recombinant fusion metallothionein proteins with intracellular organelle targeting. (a) Construction of recombinant MT protein with PTD and sMTS from mitochondria malate degydrogenase (mMDH), (b) Protective effect of PTD-sMTS-MT against hyperglycemia and hypoxia, (c) Immunohistochemistry of tyrosine hydroxylase (TH) and relative number of TH positive cells in substantia nigra (d) Immunohistochemistry of TH and relative density of TH-positive fibers in the striatum [52,63].

기능성 펩타이드를 도입한 융합단백질은 그 효과가 향상되는데 세포 내 소기관으로 표적 전달을 통해서도 단백질의 효능을 개선할 수 있다 [56,62]. 미토콘드리아 표적 서열 (Mitochondria targeting sequence)와 TAT이 연결 된 재조합 cell-penetrating artificial mitochondria-targeting peptide(CAMP)가 보고되었는데 CAMP는 미토콘드리아만을 표적으로 하는 기능을 갖고 있다. 이 CAMP를 메탈로티오네인에 결합된 CAMP-MT 융합단백질은 미토콘드리아 내부 활성 산소종 (ROS)를 제거하고 미토콘드리아 활성을 회복 시켰다 [63]. Tat-hMT1A 및 hMT1A는 미토콘드리아 내부로 전달되지 않았으나, CAMP과 융합된 hMT1A는 미토콘드리아 내부로 표적 전달되었다. CAMP-hMT1A는 미토콘드리아의 활성을 증가시켰으며, 파킨슨 병(Parkinson’s disease, PD) models 쥐에서 CAMP-hMT1A 처리 시, 쥐의 평형감각이 상승하고 생존표지자로 알려진 Tryosine hydroxylase(TH) 발현량이 증가하였다 (Fig. 5(c),(d)). 메탈로티오네인 단백질에 단백질의 투과를 높여주고 세포 내 소기관을 표적으로 하는 도메인들의 융합은 메탈로티오네인의 세포 보호 효과를 높여주는 것이 입증되었다.


3. 메탈로티오네인 유전자 치료제
3.1. 시스플라틴

제 1세대 백금 착체 항암제인 시스플라틴이 1971년에 임상실험을 한 이후 1976년에 BMS에 의하여 상품화 되어 고환암, 방광암후 90% 이상이 혈장 단백질과 자궁경부암 치료에 임상적으로 사용되고 있다 [11,64]. 암세포의 핵 내에 존재하는 DNA 이중 나선 구조에 결합하여 DNA 복제를 저해하고 이를 통해 암세포의 생장 및 증식을 억제한다. 하지만 우수한 항암 효능에도 불구하고 시스플라틴은 신장독성 (Nephrotoxicity), 면역억제 (Immunosuppression), 신경독성 (Neurotoxicity), 구토 및 청강상실 등의 부작용이 나타나는 것으로 보고되었다 [65] (Fig. 6(a)). 또한 정맥주사 후 90% 이상이 혈장 단백질과 결합하여 활성 저하가 나타난다. 2세대 약물인 카보플라틴 (Carboplatin)이 Bristol Myers Squibb (BMS)에 의해 개발되었으며, 투여가 간편하고 혈장 단백질과 결합하는 시스플라틴의 단점을 개선하였다 [66,67]. 특히 신독성 및 신경계 독성을 크게 완화하였으나, 시스플라틴과 비교하여 항암효과가 1/3 밖에 되지 않고 또한 적용할 수 있는 대상 암이 난소암과 폐암환자로 제한되었다. 3세대 약물로 옥살리플라틴 (Oxaliplatin)이 개발되어 직장암 (Colorectal cancer)에 치료효과를 보였고, 시스플라틴 내성암에서도 효과를 나타냈으며 경구투여가 가능해졌다. 이처럼 지속적인 연구에도 불구하고 시스플라틴의 항암 효능을 높이고 부작용을 개선해야 하는 문제가 나타나는데 특히 시스플라틴 내성암에 대한 치료효과 개선이 요구되고 있다.


Fig. 6. 
Mechanism of action of cisplatin. (a) Cisplatin structure and mechanism of action (b) Mechanisms involved in inhibiting the apoptotic signal in cisplatin-resistant tumor cells [65,11].

3.2. 시스플라틴 항암제 내성

백금 착체 항암제 중 하나인 시스플라틴은 구조 변경을 통한 부작용의 해결에 초점을 두고 연구가 진행되었으며, 많은 개선을 이루었으나 항암 효능 감소, 독성 문제 및 항암제 내성에 대한 해결이 필요하다 [67]. 항암제에 대한 내성은 암세포가 항암제에 대해 저항하는 방어기전으로 다중 약물 내성효과 (Multi Drug Resistance effect, MDR effect)에 의해 나타난다 [68,69] (Fig. 6(b)). 암세포의 MDR 효과를 유발하는 대표적인 기전은 다음과 같다. 1) 항암제의 유입 감소, 2) ATP 펌프에 의한 약물 유출 증가, 3) DNA 수선의 활성화, 4) 암 세포 내 대사기전 변화, 5) 항암제 불활성화 (Detoxification). 암세포 내에서 다중약물 내성효과를 일으키는 주요 단백질로는 ABC superfamily, Multi Drug Resistance Protein (MRPs/ABCC), Breast Cancer Resistance Proteins (BCRP/ABCG2) 등이 있다. 이러한 방어기전을 통해 암 세포 내에서 독성을 유발하는 내재성과 외인성 물질의 세포 내 농도를 낮춰준다.

암세포는 낮은 pH, 저산소 상태, 내피세포의 넓은 간격 등 특별한 미세 환경을 가지고 있음이 보고 되었다 [70,71]. 이중 저산소 상태에서 산화 스트레스에 저항하기 위해 암세포는 정상세포와 비교하여 메탈로티오네인을 과발현 시켜 세포 내 균형을 유지한다. 메탈로티오네인이 다양한 암 조직에서 발현이 증가함이 보고 되었으며 특히 암 환자에게서 혈중 메탈로티오네인의 양이 정상 상태와 비교하여 3배 이상 높게 나타났음이 알려졌다 [72]. 또한 메탈로티오네인 단백질은 세포의 사멸을 조절하는 역할을 하며, 메탈로티오네인에 결합하는 아연이온이 세포사멸 조절인자 중 하나인 Caspase-3 등과 결합하여 이들의 기능을 저해하는 것으로 보고되었다. 스트레스에 노출되는 암세포가 증식과 생존을 위해 더 많은 메탈로티오네인이 요구 됨을 알 수 있다 [30].

암세포 내에서 과발현 된 메탈로티오네인이 백금 착체 계열 약물 들과 결합하는 성질을 갖고 있다 [64,73] (Fig. 7). 이에 메탈로티오네인이 암세포 내로 유입된 백금 착체 항암제와 결합하여 항암제의 약효를 떨어뜨리고, 내성을 갖게 하여 암세포의 항암제에 대한 저항성을 높이게 된다. 따라서 암세포 내의 메탈로티오네인을 감소시키면 암세포의 성장을 저해함은 물론 항암제에 대한 내성도 개선할 수 있다.


Fig. 7. 
Binding mechanism of metallothionein (MT) with metal. MT can bind heavy metal based cytostatics e.g. cisplatin and its derivatives, and thus decrease the therapeutic concentration of these drugs [73].

3.3. 메탈로티오네인 유전자 치료제

암세포 내에서 메탈로티오네인의 과발현을 억제하기 위해서는 siRNA (small interfering Ribonucleic acid) 또는 shRNA (single hairpin RNA)를 투여하는 방법이 시도 될 수 있다 [74] (Fig. 8). siRNA는 표적 mRNA (Messenger RNA)를 분해하여 최종 산물인 단백질의 발현을 억제하게 되는데 메탈로티오네인의 mRNA을 표적으로 하는 shRNA (shMT)를 암세포에 도입하면 메탈로티오네인의 발현을 억제하고 항암제의 내성을 개선함과 동시에 백금 착체 항암제의 암세포 사멸 효과를 높일 수 있다.


Fig. 8. 
Inhibition of cisplatin-resistance by RNA interference targeting metallothionein (MT). (a) Schematic mechanism of reversal of cisplatin resistance, (b) Cell viability of cisplatin-sensitive cells and cisplatin-resistant cells, (c) Expression levels of metallothionein in cisplatin-sensitive cells and cisplatin-resistant cells, (d) Metallothionein silencing effect by delivery of shMT/rPOA oligo-peptoplex, (e) Tumor growth rate [74].

시스플라틴 내성 암세포에서 메탈로티오네인이 증가 되었음이 밝혀졌으며, shMT를 유전자 전달체를 통해 시스플라틴 내성 암세포에 처리하여 메탈로티오네인의 발현양이 감소되는 것이 보고 되었다 [74] (Fig. 8(b),(c)). 이와 함께 재조합 메탈로티오네인 단백질(TAT-MT)를 시스플라틴 민감 암세포에 처리하고 시스플라틴을 처리한 결과 재조합 메탈로 티오네인이 암세포내로 유입되어 시스플라틴 민감 암세포가 시스플라틴 내성암과 같은 양의 메탈로티오네인을 갖게 되어 시스플라틴에 대한 저항성을 갖게 되는 것이 보고되었다. 이처럼 메탈로티오네인의 증가는 암세포의 항암제 내성을 증가 시키며, 반대로 메탈로티오네인의 감소는 시스플라틴 항암제의 감수성이 향상 되어 항암제의 효과가 높아짐을 알 수 있다 (Fig. 8(d),(e)). 이처럼 메탈로티오네인은 정상 세포의 생존을 높여주는 것과 마찬가지로 암세포 내에서도 같은 효능을 나타냄을 알 수 있다. 따라서 메탈로티오네인을 표적으로 하여 발현을 조절할 수 있다면 항암 치료제 개발에 응용할 수 있을 것으로 예상된다.


4. CONCLUSION

메탈로티오네인 단백질은 약 60개의 아미노산으로 구성되어 있는 저분자 단백질로 전체 아미노산 중 약 20개의 아미노산이 시스테인으로 되어있다. 이 시스테인의 티올기에 중금속 이온이 결합하는 특성을 갖고 있으며 이를 통해 금속에 의한 세포 독성을 완화하며 세포 내 필수 금속 이온들의 항상성 유지에 기여하는 기능을 갖고 있다. 또한 세포가 다양한 스트레스 상황에 노출되었을 때 과발현되어 세포를 보호하는 기능이 있다. 세포가 노출되는 스트레스 중 산화스트레스는 당뇨병 및 당뇨합병증, 파킨슨 병, 알츠하이머 등 다양한 질병의 원인으로 주목 받고 있는데, 메탈로티오네인은 세포 보호 효과가 우수하고 특히 항산화 효과가 높음이 입증되고 있다. 이에 메탈로티오네인의 재조합 단백질 개발은 산화스트레스로 인해 나타나는 질환들의 치료제로 응용이 가능할 것으로 예상된다. 더욱이 메탈로티오네인이 암세포 내에서도 과발현되어 암세포의 생존 및 항암제 내성에도 관여하는 것으로 알려져 메탈로티오네인의 발현을 억제함으로써 암 치료 효능 향상 및 항암제 내성 암 치료 효과도 기대할 수 있다. 이처럼 메탈로티오네인 단백질은 세포의 생존에 많은 영향을 주는 주요한 단백질로 메탈로티오네인 단백질을 표적으로 하는 치료제의 개발을 통해 다양한 질병을 치료하기 위한 많은 연구가 이루어질 것으로 기대된다.


Acknowledgments

This study was supported by 2017 Research Grant from Kangwon National University. This study was also supported by National Research Foundation of Korea (NRF, 2017R1C1B5074521, 2018R1A6A1A03025582, 2019R1F1A1059737).


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