The Korean Society For Biotechnology And Bioengineering

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Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 35 , No. 1

[ Review Paper ]
Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 35, No. 1, pp.1-9
Abbreviation: KSBB J
ISSN: 1225-7117 (Print) 2288-8268 (Online)
Print publication date 31 Mar 2020
Received 05 Nov 2019 Revised 29 Dec 2019 Accepted 09 Jan 2020
DOI: https://doi.org/10.7841/ksbbj.2020.35.1.1

재조합 하이드로포빈의 생산과 응용
임호동1, 3 ; 신현재2 ; 김근중1, *
1전남대학교 자연과학대학 생물학과
2조선대학교 공과대학 생명화학고분자공학과
3(재)농축산용미생물산업육성지원센터

Recombinant Hydrophobins: Production and Applications
Ho-Dong Lim1, 3 ; Hyun-Jae Shin2 ; Geun-Joong Kim1, *
1Department of Biological Sciences, Chonnam National University, Gwangju 61186, Korea
2Department of biochemical and Polymer engineering, Chosun University, Gwangju 61452, Korea
3Center for Industrialization of Agricultural and Livestock Microorganisms (CIALM), Jeongeup 56212, Korea
Correspondence to : Department of Biological Sciences, Chonnam National University, Gwangju 61186, Korea Tel: +82-62-530-3403, Fax: +82-62-530-3409 e-mail: gjkim@chonnam.ac.kr


© 2020 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering
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Abstract

Hydrophobin, a functional protein produced by filamentous fungi, is a kind of bio-surfactant with no catalytic function. It is self-assembled without auxiliary additives to form various hydrophobic-hydrophilic interfaces. The unique chemical and biological properties of hydrophobin provide the possibilities to create versatile biomaterial for specific applications through protein engineering and combinatorial approaches. In particular, it is known to avoid immune reactions and thus can be used in a wide range of bio-compatible and medical application areas including an emulsification and surface modification, a protein purification tag, a cell immobilization tool, an antibacterial coating agent and a biosensor. However, hydrophobins secreted from wild-type organisms (typically filamentous fungi, ascomycetes and basidiomycetes) have some hurdles to apply for commercial use because of low productivity and difficult to scale up. This review examines the up-to-date reports on the structural characteristics, production and application examples of recombinant hydrophobins.


Keywords: hydrophobin, coating agent, self-assembly, surface modification, recombinant protein, soluble expression

1. INTRODUCTION

사상균 (filamentous fungi)은 서식처의 환경변화에 대한 적응과 생식을 위하여 하이드로포빈 (hydrophobin)이라고 하는 5-20 kDa 크기의 작은 양친매성 단백질 (amphipathic protein) 을 분비 발현하여, 성장하는 과정에서 유성생식과 무성생식과 관련된 구조형성을 용이하게 해준다 (Fig. 1) [1]. 균사가 공기층으로 자라면서 영양체 (vegetative body), 자실체 (fruiting body), 분생자 (conidia) 등을 형성할 때 물의 표면장력은 습기가 있는 부착표면과 공기 사이에서 장벽이 된다. 세포 외부로 분비된 하이드로포빈은 사상균 외부를 포장하듯 감싸서 주변 환경변화로 유발된 스트레스를 줄여준다 [2]. 이러한 구조물은 자실체의 가스 (gas)교환을 유지시켜 외부 물의 유입을 막아주고, 소수성 (hydrophobic) 표면 특성을 부여 받은 포자는 공기 중으로 분산이 용이해져, 생물 표면부착을 통해 이동을 가능하게 하거나 감염(infection)을 가능하게 한다 [3,4]. 경우에 따라서는, 다른 세포나 바이러스에 의한 감염을 방지하는 효과도 지니게 되는 것으로 추정된다. 이러한 단백질의 기능은 친수성과 소수성 계면 사이에서 높은 표면 활성능으로 인해 단층의 필름형태로 자가 조립되는 특성으로부터 기인한다 (Fig. 2) [5].


Fig. 1. 
X-ray crystal structure of the amphiphilic protein HFBII (PDB ID 1R2M) from Trichoderma reesei. The hydrophobic patch is formed at the side-chain locations marked in yellow.


Fig. 2. 
Schematic representation of the biological role of hydrophobin during growth and development of filamentous fungi.

하이드로포빈의 최초 발견은 Schizophyllum commune의 생장과 발달과정에서 풍부하게 발현되는 특정 단백질에 대한 연구에서부터 시작되었다 [5]. 실제 S. commune은 3일째까지 담자병 (basidium)에서 형성되는 균사체가 표면장력의 영향으로 촉촉한 표면에서만 자라다가 4일째에 발현되는 SC3(Schizophyllum commune hydrophobin 3)에 의해 낮아진 표면장력 (72 mJ·m-2에서 24 mJ·m-2로 변화)에 의해 공기층으로 균사의 생장을 가능하게 하는 것으로 알려져 있다 [6]. SC3 유전자를 결손시킨 재조합 균은 표면 장력을 감소시킬 수 없기 때문에 공기층으로 균사의 생장이 이루어지지 못한다 [7]. 이와 관련된 최초의 하이드로포빈 연구는 일반적인 단백질보다 상대적으로 높은 소수성 아미노산 비율에 초점이 맞춰졌으며, 연구과정에서 스스로 응집되어 다량체를 형성하는 특성이 발견됨에 따라 생물유래 계면활성제 (표면 활성제) 로서의 활용이 기대되어, 자연적 역할 규명을 기반으로 잠재적 응용 가능성에 대한 탐색으로 연구영역이 확대되었다 [8].

자연계에서는 일반적으로, 한 종의 사상균에 여러 종의 하이드로포빈이 존재하여 각기 다른 상황에서 서로 다른 역할을 위해 발현되는 것으로 보고되었다. S. commune 에서는 4종의 하이드로포빈, 즉 SC1, SC3, SC4, 그리고 SC6 발현이 보고되었다. 현재까지 SC1과 SC6의 생리적 기능은 알려져 있지 않지만, SC3는 일핵상 (monokaryon) 과 이핵상 (dikaryon)에서 균사의 성장과정 중 물의 표면장력에 대응하고 표면에 대한 접착을 용이하게 하고, 이핵상에서만 발현되는 SC4는 섭식 환경에서 자실체의 가스채널이 물로 채워지는 것을 방지한다고 보고되었다 [6,9]. 옥수수 감염균인 Fusarium verticillioides에서는 class I 3종 (HYD1, HYD2, 그리고 HYD3)과 class II 2종 (HYD4, HYD5) 의 존재가 밝혀졌다 [10]. Trichoderma 는 다양한 class의 하이드로포빈이 한 종에서 발현되는 대표적인 속 (genus) 이다. 예를 들어, T. reesei, T. virens 그리고 T. atroviridis 는 각각 6, 9, 그리고 10개의 하이드로포빈 유전자를 가지고 있다 [11]. T. reesei 에서 생산된 class I과 II 하이드로포빈은 성공적으로 분리된 후, 특성 분석이 이루어져 많은 산업분야에 대한 적용이 검토되고 있다.


2. 하이드로포빈의 구조적 특성

하이드로포빈은 8개의 보전적인 시스테인 잔기로부터 4개의 이황화 결합을 이루는 공통점을 지니며, 이들 시스테인 잔기의 배열(간격)과 소수성 잔기의 위치, 친수도 도표(hydropathy plot), 용매에 녹는 특성, 그리고 자가 조립되는 구조적 특성에 근거하여 크게 두 가지 분류군으로 나뉜다 [12,13]. Class I 하이드로포빈은 100-150개의 아미노산으로 구성되어 있으며 당화 (glycosylation)되는 아미노산 서열을 갖는다. 자낭균 (ascomycota fungi)과 담자균 (basidiomycota fungi) 모두에서 발견되며, 매우 낮은 수용성을 지녀 강산인 trifluoroacetic acid (TFA) 혹은 포름산 (formic acid)에만 용해되고, 자가조립에 의해 100-200 nm 크기의 막대모양의 견고한 단일층 (amyloid-like rodlet) 을 형성한다 [14,15]. 이와는 달리 Class II 하이드로포빈은 상대적으로 적은 50-100개의 아미노산으로 구성되고 자낭균에서만 발견된다. 계면활성제나 유기용매, 혹은 고압에서 쉽게 용해된다 [16]. Class I과 달리 상대적으로 높은 용해도를 지녀 60% 에탄올과 같은 유기용매와 고온의 2% sodium dodecyl sulfate와 같은 계면활성제에 용해되고, 막대모양 보다는 불안정한 구형구조(regularly-packed amphiphilic monolayer)로 자가 조립된다 [17].

하이드로포빈은 시스테인 잔기의 분포패턴 (X2-38-C1-X5-9-C2-C3-X11-44-C4-X8-23-C5-X5-9-C6-C7-X6-18-C8-X2-14)에 따라서도 분류할 수 있다 [18]. 예를 들어, 시스테인 잔기들 사이에 존재하는 아미노산의 수는 class II 보다 class I 이 더 다양하다. 게다가 3번째와 4번째 시스테인 잔기 사이의 거리는 class I에서 더 길다. 하지만, 두 번째와 세 번째 시스테인 잔기와 여섯 번째 및 일곱 번째 시스테인 잔기가 항상 이웃하는 것은 두 class 모두에서 공통적으로 발견된다. Class I 하이드로포빈의 아미노산 서열 유사도는 매우 낮지만, class II 하이드로포빈은 이보다 좀 더 관련성이 높은 양상을 보여준다 [19]. 최근에는 구조적, 기능적으로 두 분류군의 특성을 함께 갖는 중간 형태의 하이드로포빈이 발견되었다 [20,21]. 일례로, 약 74종이 보고된 Aspergillus 유래의 하이드로포빈은 대부분 class I으로 분류되었으나, A. terreus 유래의 class II 하이드로포빈과 A. clavitus 유래의 class I과 class II의 중간 형태의 하이드로포빈이 보고된 바 있다 [22].

전술한 바와 같이 서열유사도(homology)는 class II에서 상대적으로 높은 관련성을 보이지만, 하이드로포빈 유전자 서열은 class I과 II 모두에서 낮은 유사도를 지녀 상동적인 특징은 보존되어 있지 않다. 그럼에도 불구하고 하이드로포빈의 구조적 특성은 특정한 형태를 갖는 것으로 알려져 왔다 [23,24]. 특히, 이들 단백질은 소수성, 친수성 및 중성 아미노산의 특정한 공간 배열을 지닌다. 또한, C1(첫 번째 시스테인) -C6, C2-C5, C3-C4, 그리고 C7-C8의 4가지 이황화 결합을 형성하는 8개의 보존된 시스테인 잔기를 가진다 (Fig. 3) [24].


Fig. 3. 
Schematic representation of the secondary structure of class I and class II hydrophobins. Hydrophobins have a β-barrel core from antiparallel β-sheets formed through disulfide bonds. C1-8 shows the position of cysteine residue on the secondary structure, and the red line represents the disulfide bonds.

4개의 이황화 결합이 지닌 구조/기능적 역할도 두 분류군에서 다르게 나타나는 것으로 알려져 있다. T. reesei 유래의 class II 하이드로포빈 HFBI 에서는 단백질의 구조적 안정성은 물론 소수성-친수성 계면형성을 위하여 이황화 결합이 매우 중요한 것으로 보고되었다 [25]. 상대적으로 Class I 하이드로포빈의 경우 시스테인 잔기를 결손시켜도 양친매적 성향은 유지되는 것으로 알려졌지만, 이황화 결합 형성은 안정적인 구조유지에는 필수적인 것으로 관찰된다 [26]. 실제로 S. commune 유래 SC3의 시스테인 잔기는 단백질을 가용성 형태로 유지하는데 중요한 역할을 한다. 시스테인 잔기를 치환 시킬 경우 수용성 환경에서 불용성 응집체를 형성하기 때문이다 [27]. Magnaporthe grisea 유래의 class I 하이드로포빈 MPG1에서도 시스테인을 알라닌으로 치환하면 분비되는 하이드로포빈의 양이 급격히 감소한다. 이는 MPG1이 정확한 이황화 결합을 이루지 못해 발생한, 불안정한 구조적 접힘이 원인인 것으로 보고되었다. 두 가지 연구 결과를 토대로 시스테인 잔기가 자가조립 되는 과정에서 친수성-소수성 경계형성에 중요한 역할을 수행하는 것을 예상할 수 있다 [26]. 이러한 예측은 소수성 부분을 형성하는 두 개의 β-hairpin 2차 구조가, 항상 C3-C4와 C7-C8 사이에 위치하는 것과도 관련이 있다 [28].

하이드로포빈은 보존된 8개 시스테인으로부터 형성된 이황화 결합을 통해 역평형 형태의 β-sheet가 나란히 놓이면서 β-barrel core를 갖는다. Class I 하이드로포빈은 시스테인 잔기 배열의 보존성이 다소 낮고 멀어 개방형의 half-barrel core를 구성한다. 이에 반하여 class II 하이드로포빈의 배열은 규칙적으로 짧은 간격을 유지하고, 짧은 α-helix로 연결된 폐쇄형의 β-barrel 형태를 형성한다 [26].

Class II 하이드로포빈은 조밀한 두 개의 짧은 L1 (loop 1), L3와 α-helix 구조를 포함하는 L2를 지닌다. 그러나 class I은 loop 길이와 형태가 각각의 하이드로포빈마다 다르다 (Fig. 3) [19]. 예를 들어, Neurospora crassa 유래의 Class I 하이드로포빈 EAS의 경우 L1과 L3에는 존재하지 않는 β-sheet 구조가 L2에 존재하는 반면, A. nidulans 유래의 DewA와 RodA, 그리고 MPG1은 N 말단 위치와 L1, L2에 α-helix 구조를 갖는다 [29,30]. SC3는 12개의 아미노산으로 구성된 L1에 양친매성 나선구조를 지니며 단백질의 소수성 표면에 결합하는 것으로 나타난다 [31]. 이렇게 β-barrel core를 중심으로 외부에 노출되는 loop 구조의 한 측면에 전하를 지닌 잔기가 위치하여 양친매적 특성을 부여하는 소수성 패치(hydrophobic patch)를 형성하여 하이드로포빈의 자가 조립되는 특성을 부여한다 [32]. 예를 들어, T. reesei 유래의 class II 하이드로포빈 HFBII의 3차 구조분석에서 두 개의 β-hairpin이 역평행 형태로 β-sheet 와 이웃하여 소수성 패치를 형성하는 것으로 알려졌다 [23]. EAS의 L1은 자가 조립에서 큰 역할을 차지 하지 않지만, C7-C8에 위치한 L3은 아밀로이드(amyloid) 형태를 이루는데 필수적이다 [33,34]. 흥미롭게도 N. crassa 유래의 class II 하이드로포빈 NC2에 EAS의 L3 일부를 도입(incorporation)하는 것만으로도 class I 특유의 정리된 선형구조로 자가 조립되는 현상이 관찰되었다 [33]. 하지만 하이드로포빈의 자가조립에 기여하는 loop의 위치는 구조적으로 매우 다양하다. DewA에서는 L2에서 발견되며, RodA는 EAS와 유사하게 L3에 위치한다고 알려졌다 (Fig. 3) [35].


3. 하이드로포빈의 응용

극단적으로 서로 다른 두 특성을 모두 갖는 하이드로포빈의 양친매성은 사상균에서 여러 기능적 역할을 수행한다. 자가 조립 및 소수성-친수성의 표면을 효과적으로 개질시킬 수 있는 이들의 특성은 생명공학분야에서 점차적으로 많은 적용점이 기대되고 있다. 예로 인체면역을 회피할 수 있는 능력을 통해 나노장치를 비롯한 의료 임플란트의 제조 및 코팅이 가능하며, 식품산업에서 요구되는 유화제로 사용할 수 있다. 게다가 효소활성이 없기 때문에 다른 단백질의 고정화 도구로 이용하는 경우에, 목적단백질의 활성에 영향을 주지 않으면서 융합시킬 수 있는 장점을 지닌다. 이러한 관점에서 최근에 보고된, 바이오필름(biofilm)의 외부 코팅층을 형성한다는 원핵미생물 Bacillus subtilis 유래의 하이드로포빈(BslA)의 존재는 새로운 응용가능성에 대한 단서들을 제공하고 있다 [36,37]. 이러한 응용가능성에 관해 좀더 자세히 살펴 보았다 (Fig. 4).


Fig. 4. 
Summary diagram for applications of versatile hydrophobins.

Class I과 II 하이드로포빈은 두 분류군의 각 특성에 맞춰 다양한 생명공학 분야에서 활용이 가능하다. Class I 하이드로포빈은 자가조립 되기 전에 형태변화가 일어나고, 자가조립 후 온도, pH 등 다양한 조건에서도 안정적으로 형태를 유지하기 때문에 전기적 물질의 강한 산화가 발생되는 경우나 페인트 도료와 같이 장기간 오염물로부터 표면보호가 요구되는 경우 등에 보다 더 유용하다 [38,39]. Class II 하이드로포빈은 자가조립 후에도 형태변화가 일어나며 세제(detergent)나 유기용매 등에 쉽게 용해되기 때문에 유화제나 거품 증진제, 그리고 재조합 단백질의 분리 등의 분야에 활용이 적합하다 [19,40].

생물의학 분야에서 하이드로포빈은 소수성 약물제제 및 전달에 특히 유용하다. 소수성 약물은 흔히 Tween 80 또는 Chremophore EL과 같은 계면활성제를 이용하여 수용성 환경에서의 용해도를 향상시키는 제형과 공정을 거치는데 이들 물질이 인체에 유해하고, 암환자와 같이 면역저하 상태의 인체에서 독성이 유발되는 것으로 보고된다 [41]. 이러한 관점에서 고대로부터 식품으로 이용된 버섯을 비롯한 다양한 균체의 포자에서 막대 모양으로 소수성 층을 형성하는 하이드로포빈은 인간을 비롯한 고등생물의 면역반응을 유발하지 않는 것으로 알려져 있어, 약물 제제로의 활용을 극대화할 수 있는 요소를 지니고 있다 [42]. 일례로 계면에서의 높은 표면활성은 하이드로포빈을 약물 안정제로 적용할 수 있음을 보여준다. 하이드로포빈을 이용하여 200 nm 미만으로 코팅된 약물 나노입자는 현탁액 상태에서 동결건조하면 더 큰 안정성이 보장되며 [43], cellulose binding domain(CBD)과 융합 발현된 하이드로포빈은 셀룰로오스 기반 나노섬유 매트릭스에 약물입자의 안정화를 가능하게 하여 10개월 이상 보관이 가능하고 약물용해 속도도 향상된다는 보고가 있었다 [44]. 또한, 소수성 약물인 cyclosporine A와 nifedipine의 가용성 증진을 위해 하이드로포빈을 첨가물로 사용할 경우, 경구투여된 약물의 생체 이용률이 각각 2배, 6배 증가되는 효과도 보고되었다 [45].

하이드로포빈은 단백질은 물론 세포자체를 고정하는 목적으로 사용할 수 있다. 술 주조와 같은 산업에서는 발효 미생물의 밀도를 높여 생산효율을 높이는 방법으로 세포를 고체 표면에 고정시키는 방법으로 이용되기도 한다. 세포 외막에 고정되는 특성을 지닌 단백질을 하이드로포빈과 융합하여 발현을 유도한 효모는 비 이온성의 polyoxyethylene을 이용한 단순한 이상분리(aqueous two-phase system)를 통해 고밀도로 회수할 수 있고, 수득한 세포를 다시 소수성의 실리콘 표면에 고정하여 이용할 수 있다 [46]. 또한 TPS와 같이 내피 세포(endothelial cell) 특이적으로 반응하는 펩타이드를 하이드로포빈과 융합하여 발현시킨 후 세포 배양기 표면에 코팅하면 내피세포의 고정배양이 가능해져 세포밀도를 높여주는 효과를 얻을 수 있다 [47]. 단백질 표면 코팅에도 탁월하여 A. oryzae 유래의 RolA, Trichoderma spp. 유래의 HFB를 각각 poly butylene succinate-co-adipate(PBSA)와 polyethylene terephthalate(PET) 코팅한 후, cutinase 를 효과적으로 고정하여 활용한 연구가 보고되었고 [48,49], 바이오센서 제작을 목적으로 glucose oxidase(GOx)와 horseradish peroxidase(HRP)를 SC3를 이용하여 전극에 고정한 후, 90일 이상 안정적으로 구동시킨 연구결과도 있다 [50].

재조합 단백질의 발현과 분리정제를 목적으로 하이드로포빈을 이용한 예를 살펴보면, T. reesei 유래의 HFBI을 endoglucanseI과 융합 발현하여 수율을 6배이상 향상시켰으며 [51], 곤충 세포에서 avidin 생산을 10배 이상 증진 시키기 위하여 하이드로포빈을 적용하기도 하였다 [52]. 하이드로포빈을 이용한 재조합 단백질 생산의 장점은 분리정제과정에서 단순한 이상분리법(two phase extraction)으로 수율을 높일 수 있다는 것에 있다.


4. 하이드로포빈의 생산

하이드로포빈의 구조와 기능적 특성에 기반한 다양한 적용 분야로의 실용화를 위하여 산업화 수준의 생산성 확보는 오랜 과제로 제시되어 왔다. 현재까지 많은 연구자들이 발현율과 수득율 향상을 목표로 다양한 발현과 정제방법을 연구 중이다. 하이드로포빈을 얻기 위한 가장 일반적인 방법은 원균주로부터 직접 분리하는 것이다. 사상균은 액상 및 대량 배양이 어려워 상용화 수준의 생산성을 기대하기 어렵지만, 단백질 특성분석을 위한 기초연구 목적으로 분리가 시도되었다. 일례로 흰느릅나무병의 독소를 탐색하는 과정에서 Ceratocystsis ulmi 유래의 하이드로포빈 ceratoulmin (CU)에 대한 순수분리가 시도되었으며, 탄소원과 질소원 및 복합배지 조성의 배양 최적화 과정을 통해 25-140 mg/L의 CU를 정제하였다 [53]. S. commune 유래의 SC3은 최소배지를 사용하여 액체 진탕배양에서 60 mg/L로 생산되었었으며 [55], Agaricus bisporus 유래의 하이드로포빈 ABH3는 앞선 SC3 생산배지와 동일한 조성으로 10일간 배양하여 2 mg/L 수준의 생산수율이 보고되었다 [55]. T. reesei 유래의 HFBII의 생산에 관한 연구는 좀더 효과적인 정제기술을 도입함으로써 공정 수율을 향상시켰다. 유장 (whey)과 복합질소 공급원을 이용하여 15 L 발효조에서 4 일 동안 배양하여 100 mg/L 발현율을 확보하였고, Berol 532 (C11EO2)를 사용하여 이상분리법을 실시한 결과, 71 mg/L의 HFBII를 획득할 수 있었다 [56]. 하지만, 원균주로부터 하이드로포빈을 직접 수득하는 방법은 대부분 낮은 수율의 난관을 극복하기 어려운 것으로 알려져 있다. 각각의 균주 마다 배지조성 및 배양조건의 최적화가 요구되기 때문이다. 수득율 향상을 위해 새로운 정제 조건을 도입해도, 원균주 배양액이 지닌 물성 (사상균 배양액의 점성이나 색소 등)으로 인한 어려움이 있다. 따라서 야생형 균주가 아닌 재조합 균주를 이용한 이종숙주에서의 하이드로포빈 유전자 발현이 시도되었다 (Table 1).

Table 1. 
Production yield of hydrophobin from wild type strains
  Hydrophobin Fungi source Class Yield (mg/L) Ref.
  ABH3 Agaricus bisporus I ~ 2 [55]
  SC3 Schizophyllum Commune I ~ 60 [54]
  HFBII Trichoderma reesei II ~ 71 [56]
  CU Ceratocystsis ulmi II ~ 140 [53]

재조합 균주를 이용해 하이드로포빈을 생산하는 기술은 야생형 균주에서 직접 얻는 것보다 생산성이나 공정개발에서 상대적으로 유리할 수 있다. 현재까지 하이드로포빈 생산 수율을 향상시키기 위하여 동종 및 이종을 재조합 균주로 사용하는 많은 연구가 시도되어왔다. 재조합 균주에서 하이드로포빈을 생산하기 위한 일반적인 접근은 다수의 유전자 카피를 유전체상에 삽입하거나 숙주에 최적화된 외분비 신호 서열을 이용하는 것이다. 또한 조작이 용이한 균주를 이종숙주로 선별하고 숙주에 특이적으로 발현이 잘 유도되는 융합 단백질을 함께 활용하기도 한다. 아래에 좀더 자세한 과정을 설명하기로 한다.

T. reesei는 하이드로포빈을 생산하는 원균주 (original strain)이면서 산업용 효소와 대사물질을 생산하기 위해 많은 연구가 진행된 중요한 산업용 숙주이기도 하다. 이 균주를 이용하여 이종의 하이드로포빈인 A. nidulans에서 유래의 DewA 생산 연구가 진행된바 있으며, Cel7A와 hfb2 프로모터 등 발현 기작 조율과 유당 (lactose)등의 유도물질 적용으로 성공적인 분비생산이 유도되었다. 분비 생산된 DewA를 배지에서 메탄올과 클로로포름, 그리고 TFA로 침전시켜, 전체 생산된 단백질 220 mg/L 중 33 mg/L를 얻을 수 있었다 [57].

맥주와 같은 술 제조를 위해 하이드로포빈 발현을 이종숙주에서 유도한 연구도 있었다. 이는 하이드로포빈 생산이 목적이 아닌 맥주의 거품을 풍성하게 하려는 시도였으며, T. ressei 유래의 하이드로포빈 HFB 1을 효모인 Saccharomyces cerevisiae 에서 발현시켜 세포 표면의 향상된 소수성으로 확인하였다. 이들은 효모에 의한 맥주 생산과 더불어 발효조에서 제조되는 맥주의 거품 향상에 목적을 둔 연구이기에 하이드로포빈 자체의 생산율은 매우 낮았다 [46]. 이와 유사한 방법으로 하이드로포빈 생산성 향상에 목적을 둔 연구도 있었다. 재조합 균주인 Pichia pastoris 에서 T. reesei 유래의 HFBI 유전자를 유전체의 여러 위치에 삽입한 후, 당 성분 등 배지 조성을 조절하여 원균주 자체를 이용하는 것보다 80% 가량 발현율을 증진시켰다. 과발현이 유도된 하이드로포빈은 배양액 거품을 형성하고, 이를 회수하여 정제한 결과 0.6 g/L라는 놀라운 수준의 수율을 확보할 수 있었다 [19]. 또 다른 접근법으로, 샤페론 단백질(Kar2p, Pdi1p, 그리고 Ero1p)의 동시발현을 유도하고 유전자 삽입개수(gene copy)를 최적화한 결과, 최대 30배까지 재조합 하이드로포빈의 생산수율을 향상시킬 수 있었다 [58]. 또한, Alcohol oxidase 1(AOX1) 프로모터 기반으로 Fusarium culmorum 유래의 class II 하이드로포빈 FcHyD5p의 생산이 P. pastoris 에서 이루어졌다 [59]. 생산 과정에서 배양배지에 형성된 거품의 안정성을 비교하였을 때, P. pastoris 단독으로 배양한 것에서는 거품이 2시간 내에 제거가 되었지만, 하이드로포빈 생산을 유도한 균주의 경우 72시간 동안 거품이 유지되었다. 이는 하이드로포빈의 양친매적 특성과 관련있는 현상으로, 기능적 발현이 이루어졌음을 보여주는 결과이다. 이외에 Grifola frontosa 유래의 HGFI의 생산을 위한 숙주로 P. pastoris 가 효과적임을 보여주는 결과가 존재한다. 4 K 크기의 다공성막을 필터로 이용하여 배양배지를 거른 후에 RP-HPLC를 활용한 결과, 86 mg/L 수준의 생산 수율을 얻을 수 있었다. 이를 토대로 배양조건 최적화와 정제방법을 확립한 연구결과로써, 친화성크로마토그래피와 이산화탄소 투과법을 통해 최대 360 mg/L의 수율로 재조합 하이드로포빈을 수득할 수 있었다 [60].

대장균을 숙주로 이용한 하이드로포빈 생산도 시도되었다. 대장균의 성장속도는 사상균과 비교하여 월등히 빨라 생산 시간을 크게 단축할 수 있다. 그러나 대장균에서 하이드로포빈을 생산하였을 경우, 대부분이 봉입체 (inclusion body)를 형성하였고, 가용성으로 발현된 드문 경우에도 대부분 구조 접힘 과정이 제대로 이루어지지 않은 형태였다. 따라서 후처리 과정으로 구조 재접힘 (re-folding) 의 절차가 요구되어 상용화 수준의 대량생산을 위해서는 시간과 비용이 추가로 발생되는 문제점이 보고되었다 [24,61,62]. 이는 하이드로포빈의 양친매적 특성이 견고한 이황화 결합으로부터 형성되기 때문에 정확한 구조접힘의 과정이 매우 중요하기 때문이다 [61,63]. 실례로, 대장균과 효모에서 생산된 재조합 하이드로포빈의 물리화학적 특성을 비교한 연구가 존재한다. 대장균 숙주의 유가식 배양 (fed-batch culture)을 통해 T. virens 유래의 HFB4와 HFB7을 건조 중량 1.9-3.0 mg/L 수준으로 생산했지만 대부분이 봉입체 형태였으며, 구조 재접힘 과정 후 특성을 비교하면 효모에서 생산된 것보다 표면개질 특성이 낮은 것으로 확인되었다 [64]. 최근에는 구조접힘 및 분비발현을 보조하는 융합 단백질을 이용하여 가용성의 하이드로포빈을 생산하는 연구가 보고되었다. 예를 들어 A. nidulans 유래 하이드로포빈(DewA, DewC, DewD, 그리고 DewE)과 T. ressei 유래의 HFBI 생산을 위해 대장균의 periplasm으로 유도발현을 도와주는 pelB 신호서열을 이용한 결과 (26-68 mg/L 수율보고)가 있으며 [65], B. subtilis 유래의 yaaD를 융합하여 DewA를 상용화 수준 (1 g/L)까지 수율을 올린 사례도 보고되었다 (Table 2) [66].

Table 2. 
Production yield of fungal hydrophobin from recombinant strains
  Hydrophobin Fungi source Host system Class Yield (mg/L) Ref.
  DewA A. nidulans T. reesei I ~ 33 [57]
  FcHyD5p F. poae T. reesei - ~ 18 [59]
  HGFI G. frondosa P. pastoris I ~ 86 [60]
  HFBI T. reesei P. pastoris II ~ 600 [19]
  DewA A. nidulans E. coli I 26 ~ 1,000 [66]


5. CONCLUSION

생물유래 계면활성제 하이드로포빈의 양친매적 특성은 바이오 소재관련 기업들의 관심을 끌기에 충분하다. 면역반응을 유발하지 않으면서 부수적인 효소적 활성도 없기 때문에 산의약 소재로서 활용이 용이하다는 특성을 지니고 있기 때문이다. 더불어 물과 오일에서 안정한 미셀 (micelle)을 형성하기 때문에 화장품 및 식품제조 산업의 유화 (emulsification) 공정에 적합한 소재이다. 또한 하이드로포빈은 강력한 자가 조립 능력이 있어 바이오 센서의 요소 및 나노구조의 기능성 입자 적용 연구 등, 다양한 산업분야에 활용 가능한 차세대 바이오 소재이다. 또한, 화장품 및 페인트 성분과 같이 시대적으로 나노기술이 적용되는 기술 응용분야에 대한 활용 기대치를 높일 수 있다. 그러나 하이드로포빈의 생합성이 현재까지 주로 야생형 균주가 생산하는 것을 그대로 이용하는 것에 머물러 있어 대량배양 및 정제방법에 대한 개선책이 필요하다. 또한 새로운 발현시스템의 개발을 통한 이종숙주에서의 발현율 향상연구도 병행되어야 할 것으로 판단된다.


Acknowledgments

본 총설은 2019년 과학기술정보통신부의 재원으로 (재)바이오합성연구단 (글로벌프론티어) (2014M3A6A8063669)과 정읍시 농·생명 유망특화 R&D 개발지원사업의 지원에 의해 이루어졌으며, 이에 감사드립니다.


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