The Korean Society For Biotechnology And Bioengineering

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Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 35 , No. 1

[ Review Paper ]
Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 35, No. 1, pp.10-22
Abbreviation: KSBB J
ISSN: 1225-7117 (Print) 2288-8268 (Online)
Print publication date 31 Mar 2020
Received 29 Nov 2019 Revised 24 Jan 2020 Accepted 05 Feb 2020
DOI: https://doi.org/10.7841/ksbbj.2020.35.1.10

단백질 나노입자를 이용한 약물전달 시스템
홍세영 ; 박희호*
강원대학교 생물공학과

Drug Delivery System Using Protein Nanoparticles
Seyoung Hong ; Hee Ho Park*
Department of Biotechnology and Bioengineering, Kangwon National University, Chuncheon 24341, Korea
Correspondence to : Department of Biotechnology and Bioengineering, Kangwon National University, Chuncheon 24341, Korea Tel: +82-33-250-6271, Fax: +82-33-259-5546 e-mail: hhpark@kangwon.ac.kr


© 2020 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering
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Abstract

Nanoparticles have various advantages as drug carriers, so they have been widely used to deliver various chemical and biomolecule drugs, such as anti-cancer drugs and therapeutic proteins. Among nanoparticles, protein nanoparticles are non-cytotoxic and biodegradable, with high potential as drug carriers. Protein nanoparticles can be synthesized using proteins such as silk protein fibroin, albumin, gelatin, gliadin, legumin, 30Kc19 protein derived from silkworm hemolymph, and are manufactured using methods such as emulsion/solvent extension, desolvation, electrospray technology, complexification, and etc. The characterization parameters of protein nanoparticles are particle size, particle morphology and structure, surface charge, drug loading and release, which vary the drug delivery efficiency according to these parameters. Thus, the synthesis of protein nanoparticles using various materials and manufacturing techniques is being actively studied to improve drug delivery efficiency.


Keywords: protein nanoparticle, drug delivery, biodegradable, therapeutic

1. INTRODUCTION

신약개발 못지않게 중요한 과제가 개발된 약물들을 질병 부위에 전달하는 기술이다. 또한 약물의 혈중농도가 적정선에서 유지되며 생리활성물질이 일정 속도로 방출될 수 있어야 성공적인 치료 효과를 기대할 수 있다. 따라서 약물 전달 시스템은 점점 더 중요해져가고 있다. 그 중 리포솜 (liposome), 고분자, 덴드리머 (dendrimer) 및 자성 나노입자와 같은 여러 나노 소재들이 약물전달의 운반체로서 이용되고 있다. 나노입자들에 의해 난용성 약제들의 운반이 개선되고 있는데, 이는 작은 입자크기 때문에 혈류 속에서 빠르게 용해되어 세포 혹은 조직-특정적으로 표적에 다가갈 수 있기 때문이다 [1].

최근 단백질 나노입자를 포함한 바이오폴리머 (biopolymer) 기반 나노입자는 낮은 독성과 생분해성으로 인해 제약 및 기능 식품에 활발히 사용되고 있으며 많은 연구가 진행되고 있다. 단백질은 생물학적 물질과 제조 분야에서 고유한 기능과 특성을 나타내며 알부민 (albumin) 및 젤라틴 (gelatin) 등 여러 단백질을 이용한 나노입자들이 존재한다. 단백질 나노입자는 생분해성, 비항원성, 안정성, 입자의 표면 개질 및 입자의 크기 조절 용이성 등 약물 전달 시스템으로서의 여러 장점을 가지고 있다. 따라서 단백질 나노입자는 다양한 표적화된 요법, 즉 폐 전달, 암 요법, 종양 요법 및 백신에 사용될 수 있으며, 여기서 단백질 나노입자는 제어되고 지속 방출을 위해 미세 구체 형태로 생분해성 중합체에 혼입될 수 있다. 약물 전달 시스템으로서 나노입자를 설계하는 주요 목적은 입자 크기, 표면적 및 표면 특성을 제어하여 필요한 양의 약물을 운반하는 나노입자가 부위-특이적 작용을 달성하기 위해 활성제를 방출함으로써 원하는 약리학적 활성을 나타내도록 하는 것이다. 이를 위해 많은 접근법이 개발되었다 [2].


2. 단백질 나노입자 제조에 사용되는 단백질 종류
2.1. 실크 단백질 피브로인 (Silk protein fibroin)

총 실크 단백질의 65-85%를 구성하는 fibroin은 silk 섬유에 존재하는 주요 단백질이다. 실크 피브로인은 실크에 유연성, 기계적 강도, 자기 조립 능력, 낮은 면역 원성, 생분해성 및 생체 적합성과 같은 탁월한 물리적 및 화학적 특성을 제공하는 단백질이다 [3]. 실크 피브로인은 다양한 가공 조건에 적합하며 생체 적합성 및 우수한 안정성, 기계적 특성을 유지하고 많은 양과 적은 비용으로 인해 나노 캐리어 개발을 위한 단백질로 많이 찾는다. 일반적으로 Bombyx mori 누에에 의해 생성된 실크에서 흔히 추출되는 피브로인은 탄산나트륨 처리를 통해 외부 세리신 (sericin) 단백질 코팅 제거 후 쉽게 분리할 수 있다 [4]. 생성된 피브로인 단백질은 경쇄 (light chain) 및 중쇄 (heavy chain)로 구성된 반결정성 (semi-crystalline) 구조로 만들어진다 [5]. 실크 피브로인은 pH 7 이하의 등전점 (IEP)과 83 kDa의 분자량이 보고된 바 있지만, 후자는 추출 과정과 처리 기간에 따라 달라질 수 있다. (Gly-Ser-Gly-Ala-Gly-Ala)n 패턴의 아미노산 반복은 결정성 베타 병풍구조 (crystalline beta-sheets)로 이어지고, 이는 반평행 구성 (antiparallel configuration)으로 적층된다. 이 구조는 실크 피브로인에 견고한 기계적 물성과 높은 인장 강도를 제공한다 [6,7]. 실크 피브로인의 결정성 및 형태는 약제 활성을 유지하면서 약물의 높은 캡슐화를 허용하도록 조절될 수 있다. 실크 기반의 나노입자는 강한 음전하 (negative charge)를 띄는 제타 전위 때문에 매우 안정하며 다양한 분자량의 인도메타신 (indomethacin, IDM) 및 아스피린 (aspirin)과 같은 소수성 및 친수성 약물과 독소루비신 (doxorubicin)과 같은 항암 치료제뿐만 아니라 다양한 성장 인자와 생체 활성 분자의 전달에 효과적이라는 것이 입증되었다. 또한 인간 혈액내 유동적 조건 그리고 준 정적 조건 하에서 무시할 수 있을 정도의 염증 및 응고 반응이 나타나 실크 피브로인 나노입자가 국소 약물 전달과 마찬가지로 전신 약물 전달에서도 적합 할 것으로 보고되었다 (Fig. 1) [8-11].


Fig. 1. 
(a) Reconstituted silk fibroin gels. Fibroin can be easily isolated after removal of the external sericin protein coating through treatment with sodium carbonate [16], (b) Structure of silk fibroin. The repetition of amino acids in the pattern (Gly-Ser-Gly-Ala-Gly-Ala)n leads to crystalline beta-sheets that are then stacked in an antiparallel configuration [17], (c) Morphology of silk fibroin nanoparticles [18]

최근 실크 피브로인 나노입자를 이용한 연구들이 진행되고 있다. 예를 들어 Zhao와 공동연구자들이 초임계 유체 CO2에 의한 solution-enhanced dispersion (SEDS) 방법으로 평균 직경이 50 nm인 실크 피브로인 나노입자를 제조하여 항염증제인 IDM을 전달하는데 사용했다 [12]. Kundu 와 공동연구자들은 DMSO에서 실크 나노입자를 합성하기 위해 간단한 탈용매화 방법 (desolvation method)을 사용했고 Antheraea mylittaBombyx mori 유래 피브로인을 사용하여 평균 크기 157 nm, 177 nm를 가지는 나노입자를 합성했다. 이 연구는 나노입자로부터 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)의 시험 관내 방출을 평가했으며, 최대 방출은 5 일째에 35% 인 것으로 밝혀졌다 [13]. Lozano-Perez와 공동연구자들은 실크 피브로인 나노입자를 이용해 활성산소 제거제로 사용되는 천연 항산화제 퀘르세틴 (quercetin)을 캡슐화하고 방출하는 연구를 진행했다. 나노입자는 70%의 상당한 캡슐화 효율을 나타냈고 실크 피브로인 로딩 입자의 크기는 171 nm로 퀘르세틴를 로딩하지 않은 나노입자 (139 nm)의 크기보다 약간 더 높았다 [14]. 또한 초 임계 CO2에 의한 현탁액 강화 분산과 같은 방법에 의한 실크 피브로인 자성 나노입자의 제조하는 연구도 진행되었다. 제조된 자성 피브로인 나노입자는 경피 전달 및 전신 약물 전달에 대해 평가되었다 [15].

2.2. 알부민 (Albumin)

알부민은 다양한 단백질의 운반체로서 생물학적으로 기능하는 주요 혈장 단백질이기 때문에 나노입자의 제조를 위한 다른 생체 물질에 비해 명백한 우위를 가지고 있다 [19]. 주요 운반체 단백질인 알부민은 비공유 상호 작용을 통해 다양한 약물과 펩타이드 화합물에 결합할 수 있다. 나노입자 표면에 존재하는 아미노 (amino), 싸이올 (thiol), 카복실 (carboxyl) 같은 반응성 집단은 공유 리간드 결합과 표면 수정을 용이하게 한다 [20]. 또한 알부민은 pH 7.4에서 최대 40% (w/v)의 용해성으로 희석된 염 용액에 용해되고 pH 4.0-9.0에서 안정적이며 최대 60oC에서 10 시간 동안 열적 안정성을 나타내고 해로운 영향을 미치지 않는다 [21]. 알부민은 높은 안정성, 생리적 유체에서의 높은 용해도, 생분해성, 비면역성, 비독성, 순수한 형태의 가용성 및 준비 용이성과 같은 이유로 나노 구체 및 나노 캡슐의 제조를 위해 사용된다. 알부민은 인간, 소, 쥐 및 닭을 포함한 많은 수의 출처에서 분리될 수 있다 [22].

2.2.1. 소 혈청 알부민 (Bovine serum albumin, BSA)

BSA는 무독성이며 생분해성이기 때문에 가능한 식품 용도로 나노입자를 제조할 수 있는 잠재력이 큰 단백질이다 [23]. 많은 연구에서 일반적으로 글루타르알데하이드 (glutaraldehyde, GA) 가교 결합을 갖고 아세톤 (acetone)을 사용하는 탈용매화 방법에 의한 BSA 나노입자의 생산을 다루었다. Sailaja와 Amareshwar는 간헐적으로 아세톤을 첨가하면 BSA 나노입자의 크기 조절이 가능하다는 것을 밝혀냈다 [24]. Jun와 공동연구자들은 단백질 농도, pH 및 NaCl 함량을 변화시킴으로써 BSA 나노입자의 크기와 표면적 대 부피 비율을 조절할 수 있다고 보고했다 [25]. 위장관의 효소에 의한 단백질 기반 나노입자 분해는 나노입자의 효율에 영향을 미치는 주요 요인이다. Singh 과 공동연구자들은 에탄올을 이용한 탈용매화 방법으로 생성된 BSA 나노입자를 in vitro에서 효소 분해에 대한 저항성을 증가시키기 위해 폴리-L-라이신 (poly-L-lysine, PLL)을 사용하여 코팅했다. 그들은 코팅을 위한 저분자 PLL의 사용이 트립신 (trypsin) 분해에 대한 저항성을 증가시키고 BSA 나노입자의 안정성을 향상시켰다는 것을 밝혀냈다 [26]. Noorani와 공동연구자들은 난소 암 이종 이식편 모델에서 알벤다졸 (albendazole)의 항암 효능 증가를 위해 알부민 나노입자를 제형화 했다.이 연구에서, 알벤다졸이 로딩된 소 혈청 알부민 나노입자는 7-10 nm의 입자 크기 범위로 제제화 했다. In vitro에서 세포 증식 연구는 독성이 가장 적은 난소 암 세포의 가장 높은 사멸 효능을 나타냈다 [27].

2.2.2. 인간 혈청 알부민 (Human serum albumin, HSA)

BSA와 유사하게, HSA는 생분해성, 안전성, 정제 용이성 및 수용성인 것으로 나타났으며, 따라서 나노입자 제조를 위한 이상적인 단백질로 밝혀졌다. 이들 나노입자는 일반적으로 탈용매제 (desolvating agent)로서 에탄올을 사용하여 탈용매화 방법에 의해 제조되었다. 가교제로서 GA의 첨가 또는 열변성에 의해 나노입자가 안정화되었다 [28]. 다른 경우에서와 같이, HSA 나노입자는 침강 속도 분석, 동적 광산란, 크기 배제 크로마토 그래피 및 전자 현미경으로 특징 지어졌다. 탈용매화 공정의 매개변수에 대해 여러 연구가 수행되었다. 결과들은 입자 크기가 첨가된 탈용매제의 양 및 HSA 용액의 pH 값에 의존한다는 것을 보여주었다, 그러나 가교 과정에서의 가교제 양(GA 또는 열)과는 관련이 없다 [29,30]. pH 값이 8 이상이면 평균 직경이 200-300 nm인 나노입자를 생성할 수 있고 pH가 높을수록 나노입자가 작아진다. GA 농도의 증가는 나노입자의 제타 전위를 감소시키는 표면 아미노기를 감소시킨다 [31]. 이러한 종류의 입자는 낮은 pH에서 펩신 (pepsin) 및 카텝신 B (cathepsin B)와 같은 다른 단백분해효소 (proteinase)와 중성 pH에서 트립신 및 단백분해효소 K의 존재 하에서 분해된다. Lomis와 공동연구자들은 유방암에서 약물의 수용성, 서방성 및 표적 요법을 증가시키는 것을 목적으로 인간 혈청 알부민을 탈용매화 기술을 사용하여 나노입자를 제제화 했다 [32]. Ex vivo 연구는 알부민 나노입자가 약물 방출을 개선시키고, 생체 이용률을 향상시키며, 약동학 특성을 증가시키고, 약물의 조직 표적 능력을 개선시키는 것을 돕는다는 것을 확인했다 [33].

2.3. 글라이아딘 (Gliadin)

밀 글루텐에 존재하는 주요 단백질인 글라이아딘은 수불용성 단백질로 에탄올을 이용해 글루텐에서 추출되는 경우가 많다 [23]. 생체 적합성, 생분해성, 비독성 및 안정성이 뛰어나 약물 전달 시스템으로 적합하다. 글라이아딘은 점막에 부착하는 특성을 가지고 있어 점막에 고정할 수 있는 구강 및 국부적 약물 전달체를 설계하는 데 적합한 중합체가 된다 [34]. 글라이아딘 나노입자 (GNP)는 상부위장관 부위에 친화력을 보이는 반면 다른 위장관부위로는 잘 고정되지 않아 표적 약물 전달에 적합한 중합체이다. 글라이아딘의 소수성과 낮은 용해도는 로딩된 약물을 보호하고 방출을 제어하는 나노입자를 제조할 수 있다 [35]. 글라이아딘은 중성 및 친유성 아미노산 잔기가 풍부하여, 중성 아미노산은 점막과 수소 결합을 촉진하고 친유성 아미노산은 소수성 상호 작용을 통해 생물학적 조직과 상호 작용한다 [36].

Ezpeleta와 공동연구자들은 상피 조직의 증식과 분화를 증가시키고 피지선의 크기를 줄임으로써 건선, 여드름, 어린선 (ichthyosis), 과각화증 (hyperkeratosis) 및 상피 종양의 치료에 사용되는 변형 레티노산 (trans-retinoic acid, RA)의 투여를 위한 글라이아딘 기반 나노 전달체 시스템을 제조했다. RA가 함유된 글라이아딘 나노입자는 탈용매화 방법으로 제조되었으며, 크기는 500 nm으로 나타났다. 이 방법은 초기 단백질의 90%의 수율로 글라이아딘 나노입자를 제조할 수 있다. 이러한 나노입자는 pH 7.4의 PBS에서 4일 동안 안정한 것을 확인했다. 그러나, 이들은 트립신을 함유하는 PBS 용액에서 3시간에 걸쳐 빠르게 분해되는 것으로 관찰되는데, 이는 GA와 나노입자의 화학적 가교에 의해 저항성을 높일 수 있다 [37]. Gulfam 등은 글라이아딘 나노입자를 이용해 유방암 세포의 사멸을 유도했다. 연구는 전기분사 (electrospraying) 시스템을 사용하여 항암제, 즉 사이클로포스파미드 (cyclophosphamide, CP)의 방출을 제어하기 위한 글라이아딘및 글라이아딘-젤라틴 복합 나노입자의 제형에 초점을 둔다. CP를 함유하는 글라이아딘 나노입자는 48 시간 내에 방출된다. 대조적으로, 글라이아딘-젤라틴으로 구성된 나노입자는 빠른 방출 방식을 나타낸다 [38].

2.4. 젤라틴 (Gelatin)

젤라틴은 알칼리 또는 산성 매개체에서 콜라겐을 가수 분해하거나 콜라겐의 열적 또는 효소적 분해에 의해 얻을 수 있는 천연 수용성 고분자로 나노입자의 제형에 사용되는 가장 오래된 단백질성 물질이다. 젤라틴은 돼지 및 소 피부에서 주로 공급된다. 젤라틴은 양이온성 그룹과 음이온성 그룹을 모두 포함하며 삼중 나선 구조를 갖는다 [19,39]. 이 제품은 생분해성, 생체 적합성, 가교 용이성 및 다기능 단백질로 널리 인식되어 의료 및 제약 산업에서 다양하게 응용된다. 젤라틴은 FDA가 승인한 “일반적으로 안전한 것으로 인정된” (GRAS) 단백질이다 [40]. 안전성의 확립된 증거로 인해, 이는 식품 보충제 및 혈장 팽창제로서 정맥 내 주입으로 사용되며, 상업적으로 이용 가능하다 [19].

젤라틴 나노입자는 DNA 및 RNA, 올리고뉴클레오타이드 (oligonucleotide)뿐만 아니라 BSA, BMP-2 및 bFGF 성장 인자와 같은 몇몇 생물학적 활성 분자를 캡슐화하는데 널리 사용된다 [19]. 젤라틴을 사용한 나노입자를 제조할 때는 기계적 강도를 증가시키고 수용액에서의 분해 속도 및 용해도를 낮추기 위해 GA, 글리세르알데하이드 (glyceraldehyde) 등과 같은 다양한 가교제에 의해 물리적, 생물학적 또는 화학적으로 가교되어야 한다 [1]. Li와 공동연구자들은 캡슐화 BSA가 모델 치료 단백질 분자로서 방출이 확산 제어되는 것을 확인하였다 [41]. BMP-2와 bFGF와 같은 다양한 성장인자의 in vitro (골형성을 억제하기 위해 사용됨)의 방출에 대한 연구는 젤라틴 유형보다는 젤라틴 가교 정도에 크게 의존한다는 것을 보여주었다 [42]. 또한, 제조 방법에 따라 다르게 나타났다. 콜라겐 분해 (알칼리성 가수분해 또는 산성 가수분해)로부터 얻은 젤라틴은 다양한 등전점이 나타났다. 특정 매체에서 특정 분자의 방출 프로파일은 해당 분자를 캡슐화하는데 사용된 젤라틴의 등전점에 의해 조절될 수 있다는 것을 확인했다. 젤라틴 나노입자는 이온 상호 작용을 통해 DNA 및 RNA 올리고뉴클레오타이드를 운반하도록 표면 변형될 수 있다는 것을 확인했다 [43]. 젤라틴 나노입자의 로딩 용량은 배양 배지 및 나노입자 제타 전위에 의존하는 것으로 관찰되었다. Lu와 공동연구자들은 인간 RT4 방광 전이 암 세포를 표적화하고 사멸시킬 수 있는 것으로 밝혀진 600-1000 nm 크기의 파클리탁셀 (paclitaxel)이 로딩된 젤라틴 나노입자를 제조했다 [44].

젤라틴은 폴리에틸렌글리콜 (polyethylene glycol, PEG)와 같은 합성 중합체와 쉽게 결합될 수 있다. PEG화된 젤라틴 나노입자는 캡슐화 된 소수성 분자 및 항염증제의 혈장 반감기를 개선시키는 것을 확인했다. 이들 나노입자는 또한 항말라리아 약물인 인산클로로퀸 (chloroquine phosphate)를 캡슐화하여 전신 노출에 의해 야기되는 부작용을 감소시키기 위해 사용되었다. 젤라틴 나노입자로부터의 chloroquine phosphate 방출은 온도가 증가함에 따라 증가하는 방식으로 확산을 통해 나타나는데 pH 7.4 근처에서 최적의 방출 속도를 갖는 것이 밝혀졌다. 나노입자에 가교제 GA의 첨가는 약물 방출 속도를 감소시킨다 [45,46]. 젤라틴 나노입자의 주요 특성은 대식세포 및 대식세포가 풍부한 기관에 축적되고 기존의 혈액-뇌 장벽을 넘어설 수 있는 용이성이다. 이를 이용하여 다양한 항암제, 약초 추출물 및 치료용 생체 고분자를 전달하기위한 벡터로 광범위하게 사용된다 [19].

2.5. 레구민 (Legumin)

레구민은 콩 종자 (Pisum sativum L.)의 주요 저장 단백질 중 하나로, 11S 글로불린 (11s globulin) 단백질군에 속한다. 레구민은 300-400 kDa의 분자 질량을 갖고 황 함유 아미노산이 풍부하며 6개의 서브유닛 (subunit)으로 구성되어 있다. 레구민의 용해도는 코아세르베이션 (coacervation) 공정 동안 감소된다. 이는 상분리를 유도하여 나노입자를 형성한다. 레구민으로부터 유도된 나노입자는 생체 접착성이고 생물학적 표면과의 높은 상호작용 가능성을 나타내는 넓은 표면적을 갖는다 [47]. Mirshahi 와 공동연구자들은 약물의 지속적인 방출 및 표적화된 전달을 달성하기 위해 마이크로 및 나노입자 형태의 레구민 콜로이드 전달체 시스템 제조를 시도했다. 응집 후 GA를 이용한 화학적 가교를 통해 나노입자를 형성했다. 유기 용매의 사용을 피하면서 좋은 수율, 크기 및 표면 전하를 얻기 위해 pH-코아세르베이션 방법과 GA와의 화학적 가교 결합이 시도되었다. 그러나, 이 방법은 나노입자를 초기 단백질의 27%만큼 낮은 수율을 보였다. 이러한 나노입자들은 PBS (pH 7.4)에서 매우 안정하다 [48]. GA 농도는 나노입자의 크기, 백분율 산출, 표면 전하 등에 큰 영향을 미치지 않는 것으로 보고되고 있으나, GA 농도의 증가로 나노입자의 반감기가 길어질 수 있다. GA를 이용한 가교는 레구민의 항원 결정기를 감소시켜 단백질의 면역 원성을 감소시킨다 [49]. 레구민 기반 나노입자는 크기가 작고 안정성이 우수하며 항원성이 낮지만, 레구민 나노입자의 수율을 최적화하고 생체의학적 응용에 있어서 그 유용성을 확립하기 위한 후속 연구가 필요하다 [19].

2.6. 누에 체액 유래 30Kc19 단백질 (30Kc19 protein derived from silkworm hemolymph)

30K 단백질 패밀리 (30Kc6, 30Kc12, 30Kc19, 30Kc21 및 30Kc23) 누에, Bombyx mori의 체액에서 유래된 단백질로 유사한 구조를 가진다. 30K 단백질의 분자량은 약 30 kDa이며 다양한 세포에서 세포 성장 및 생존력을 증가시키고 효소 안정화 효과를 나타냈다. 30K 단백질 패밀리 중 가장 풍부한 단백질인 30Kc19는 세포-침투 효과를 가지고 있음이 밝혀졌다 [50, 51]. 30Kc19 단백질은 N-말단 도메인의 알파 나선 (α-helix) 6개와 C-말단 도메인의 베타 병풍구조 (β-sheet) 12개로 구성되어 있고 세포 침투 펩타이드 Pep-c19가 존재하며 α-helix 도메인에 위치한다 [53]. Hong Jai Lee와 공동연구자들은 30Kc19을 이용해 단백질 나노입자를 만든 후 α-갈락토시다아제 (α-galactosidase, α-gal)와 β-갈락토시다아제 (β-galactosidase, β-gal)를 세포 내로 전달하는 연구를 각각 진행했다. 나노입자는 탈용매화 방법을 이용하여 제조한 후 GA를 이용해 가교시켰다. 30Kc19-HSA 나노입자에서 30Kc19와 HSA의 wt%가 각각 50%일 때 가장 입자크기가 작고 약물의 활성이 높게 나타났고 용액의 pH가 높고 30Kc19의 농도가 낮을수록 입자의 크기가 작게 나타났다. 로딩 용량은 초기 단백질의 80-90%의 높은 수율을 보였다 [50,54]. 30Kc19 단백질 나노입자에서 β-gal은 24 시간 내 30-50% 이상이 방출되었고 60%까지 지속적인 방출이 관찰되었다 [50].

30Kc19 단백질의 α-helix 도메인 (30Kc19α 도메인)은 화물 단백질 (cargo protein)에 효소 안정화 효과를 제공하며 특히, 30Kc19α 서브 유닛의 세포-침투 능력은 전체 30Kc19 단백질의 것보다 높게 나타났다. 또한 30Kc19α의 세포 내화물 단백질 전달 효율은 Pep-c19 세포-침투 펩티드와 거의 유사하게 나타났다 [52]. 최근, α-helix 도메인 (30Kc19α)은 가용성 형태로, β-sheet 도메인 (30Kc19β)은 불용성 형태로 나타남이 확인되었다 [53]. Hee Ho Park와 공동연구자들은 30Kc19α를 이용해 단백질 나노입자를 만들어 β-gal을 세포 내로 전달하는 연구를 진행했다. 단백질 나노입자는 탈용매화 방법으로 만들었으며 pH가 높고 30Kc19α의 농도가 낮을수록 나노입자의 크기가 작게 나타났다. 로딩 용량은 30Kc19-HSA 나노입자보다 60-65% 적게 로딩되었다. β-gal은 10시간 내 30% 이상이 방출되었고 60%까지 지속적인 방출이 관찰되었다 (Fig. 2).


Fig. 2. 
Morphological and structural changes of 30Kc19–HSA nanoparticles containing 0–100 wt% of the 30Kc19 protein (magnification, ×2000) [50].


3. 단백질 나노입자 제조 방법
3.1. 에멀션/용매추출법 (Emulsion/solvent extraction)

에멀션/용매추출법은 통상적으로 고분자 나노입자에 적용되지만 단백질 나노입자를 생성하는데 사용될 수 있다. 유기용매(W) 중의 중합체 용액 또는 수성 단백질 용액을 피마자유, 참기름 또는 면씨유(O)와 같은 적절한 비용매에 기계적 교반 또는 초음파 처리를 이용해 흩뜨리는 방법으로 에멀션 시스템(O/W 또는 W/O)을 형성하고, 이어서 용매/비용매를 제거하여 나노입자를 수득한다 [19]. 이 방법에 의해 형성된 단백질 나노입자는 가교제를 첨가함으로써 화학적으로 안정화되거나 100oC 이상의 온도를 갖는 예열된 오일에 W/O 에멀션을 첨가함으로써 열적으로 안정화되고 정제될 수 있다 [55]. 이 기술은 코아세르베이션/탈용매화 등과 같은 다른 기술에 의해 얻어진 것보다 더 큰 크기의 입자를 생성한다. 폴리소르베이트 80 (polysorbate-80), 폴리비닐알코올 (poly(vinyl alcohol), PVOH)과 같은 특정 계면 활성제 및 클로로폼 (chloroform) 및 초산 에틸 (ethyl-acetate)과 같은 유기 용매는 단백질의 생체 활성을 변화시키는 경향이 있어 거의 사용하지 않는다 [19]. 입자 크기는 에멀션에서 더 작은 유체 입자의 형성을 위해 계면 활성제를 사용에 의해 최적화된다. 따라서 계면 활성제-나노입자 매트릭스 상호 작용에 의한 더 작은 고체 입자의 제조가 용이하다. 유화 동안 단백질 농도 및 물 및 유상의 상대적 부피 (W:O)는 단백질 나노입자의 제조에서 중요한 매개 변수이다 (Fig. 3) [55].


Fig. 3. 
Preparation of protein nanoparticles by emulsion/solvent extraction method. Protein solution in organic solvent (W) is made to dissipate in a pertinent non-solvent (O) to form an emulsion system (O/W or W/O) under the conditions of mechanical stirring or sonication and the solvent/nonsolvent is removed subsequently to yield nanoparticles [22].

3.2. 탈용매화 방법 (Desolvation method)

탈용매화 또는 코아세르베이션 공정는 단백질 기반 나노입자의 제조를 위한 방법이며, 그 이유는 제조가 단순하고 작은 크기의 나노입자를 얻는 이점 때문이다. 이 방법의 원리는 에탄올, 아세톤 등과 같은 탈용매제를 사용하여 단백질 용액의 용해도를 감소시켜 상 분리를 일으키는 것이다. 탈용매제의 첨가는 단백질 구조의 형질을 변화시키고 단백질의 용해도를 감소시켜 단백질 나노 침전물의 형태로 침전시킨다 [30,56]. 입자의 형성은 초기에 일정한 크기에 도달할 때까지 크기가 증가함에 따라 진행되는데, 이는 거의 동일한 크기의 입자 수의 점진적인 증가에 의해 달성된다 [56]. Lin과 공동연구자들은 1-100 nm 인간 혈청 알부민 (HSA) 나노입자를 제조하기위한 pH 제어 탈용매화 공정을 설명했다 [57]. pH 7-9에서 HSA 수용액에 대한 탈용매제로서 아세톤을 사용하여 입자를 제조한 후, GA와 같은 가교제에 의해 입자를 안정화시켰다. 다른 연구에서, 에탄올로 탈용매화하여 HSA 나노입자를 제조하기 위해, 에탄올 첨가 속도, 탈용매상의 pH, HSA 농도 및 정제 조건과 같은 매개 변수를 100-300 nm 사이의 크기의 입자를 수득하도록 최적화했다. 입자 크기는 단백질 농도, 단백질 용액 부피에 대한 탈용매제의 부피, pH 및 온도에 의존하는 것으로 밝혀졌다. 탈용매화 절차 전의 pH는 나노입자의 크기 및 안정성에 영향을 미치는 주요 인자이며, 높은 pH 값은 더 작은 나노입자를 생성한다 [29]. 탈용매화를 사용하여 얻은 단백질 나노입자는 높은 캡슐화 효율을 갖는 것으로 보고되었다 (Fig. 4) [19].


Fig. 4. 
Desolvation method using dropwise addition of ethanol. It consists of adding an organic precipitant or desolvating agent drop by drop to a protein solution while stirring, and subsequently crosslinking the particles to stabilize them, usually with glutaraldehyde [58].

탈용매화 된 나노입자에 의한 단백질 약물 전달의 몇 가지 예가 있다. BSA는 골 재생을 위해 BMP-2를 캡슐화하고 전달하는데 사용되었다. 탈용매화 전에 2.5 wt% BMP-2를 BSA 용액에 첨가했다. 가교 대신 생성된 입자를 양이온성 폴리에틸레니민 (polyethylenimine, PEI)으로 코팅하여 입자 안정성 제공 및 치료 단백질의 방출을 제어했다. 나노입자 크기는 50-400 nm 사이에서 제어될 수 있다. 높은 BMP-2 캡슐화 효율 (> 90%)이 보고되었고, 입자는 시험 관내에서 골 유도 활성에 의해 입증된 바와 같이 BMP-2 활성을 보존했다 [58]. 또한 Hong Jai Lee와 공동연구자들은 β-Gal을 HSA 및 재조합 30Kc19 단백질 나노입자에 캡슐화하여 전달했다. 30Kc19는 세포 침투 및 효소 안정화 효과를 갖는 누에 단백질이다. 입자는 4%의 β-gal을 함유하고 GA의 가교에 의해 안정화되었다. 나노입자 직경은 30Kc19 함량에 따라 170-350 nm의 범위였다. 시험 관내 세포 독성 연구는 이들 입자가 무시할 정도의 세포 독성을 유도하고, 세포에 의해 효과적으로 내재화되고, 세포로 전달된 후에 β-gal 활성을 유지한다는 것을 나타내었다 [50].

탈용매화된 입자는 자체 조립된 입자보다 더 큰 경향이 있지만, 정확한 제조 조건에 따라 광범위한 나노 규모 크기가 달성될 수 있고 고밀도 구조이므로 상당한 양의 단백질을 전달할 수 있다. 탈용매화된 단백질 입자는 밀도가 높은 구조를 고려할 때 상당한 세포 내 전달 가능성을 갖지만 탈용매화 과정 자체에 의해 최소한의 영향을 받거나 전달체 단백질에 의해 희석될 수 있는 단백질에 대해서만 가능하다 [59].

3.3. 코아세르베이션 공정 (Coacervation process)

비교적 간단한 조건으로 인해, 코아세르베이션 또는 탈용매화 공정은 단백질 기반 나노입자를 제조하는 모든 방법 중 가장 적절하고 빈번하게 사용된다. 나노입자 매트릭스를 용해시키기 위해 사용된 용매가 비용매 상으로 추출되어 콜로이드 성분 또는 코아세르베이트를 갖는 상 및 용매/비용매 혼합물을 갖는 제 2 상을 형성할 때 콜로이드 시스템이 형성된다. 입자 형성은 초기에 안정한 크기에 도달할 때까지 크기가 증가한 후 탈용매화가 증가함에 따라 입자의 수가 점차 증가한다. 용매 및 반 용매는 용매와 같은 물, 에탄올 또는 아세톤과 같은 혼용성이어야 하며, 아세톤은 2단계 탈용매화 기술로 GNP 입자를 생산하기 위해 사용되었다 (Fig. 5) [60].


Fig. 5. 
Coacervation process by varying temperature, solution pH, isonic strength. Thereby a phase separation occurs which results in a phase of solid colloid which is dispersed in a second phase consisting of an anti-solvent and the initial solvent [22].

Lin과 공동연구자들은 1-100 nm HSA 나노입자를 제조하기위한 pH 제어 코아세르베이션 방법을 보고했다. pH 7-9에서 HSA 수용액에 아세톤을 첨가한 후 GA 가교에 의해 입자를 안정화시켜 입자를 제조했다. 이것은 에탄올을 비용매로 사용하고 BSA를 매트릭스로 사용하여 실험실에서 독립적으로 확인되었다 [57]. Langer와 공동연구자들은 에탄올로 탈용매화하여 제조된 HSA 나노입자, HSA 농도, 비용매 (에탄올) 첨가 속도, 코아세르베이션상의 pH 및 정제 조건과 같은 공정 변수를 평가하고 100-300 nm의 입자 크기에 대해 최적화했다 [29]. Net-zero 표면 전하를 야기하는 조건이 입자 응집을 촉진하기 때문에 pH 및 삼투압은 입자의 안정성 (크기)을 유지하는데 중요하다 [60].

1차 NH2기 사이에 공유 결합을 설정함으로써 콜로이드성 나노입자를 안정화시키기 위해, 발암성 등 부작용이 알려져 사용 전에 완전히 제거할 필요가 있음에도 불구하고, GA과 같은 화학적 가교제가 널리 사용되었다 [30]. Segura와 공동연구자들은 입자 표면에서 -NH2기의 범위를 감소시키기 위해 GA 가교 결합을 관찰하여 생분해성 및 나노입자의 약물 방출에 영향을 미치는 것을 확인했다. GA 가교는 독소루비신 및 알드리아마이신 (Adriamycin)과 같은 소분자 약물에 문제가 될 수 있다. 또한 HSA 나노입자에 포획된 안티센스 올리고뉴클레오타이드 (antisense oligonucleotide)의 완전성에 영향을 미치지 않는 것으로 보였으며, 이는 부작용을 최소화하기 위해 GA 반응이 제어될 수 있음을 시사한다. 대안적인 접근법은 고온/저수분 가교를 사용하는 것이지만, 이는 약물 비활성화 또는 고온에서의 단백질 변성으로 인해 문제가 될 수 있다. 산화된 덱스트란 (dextran)과 같은 거대 분자가교제는 나노입자 매트릭스로 자유롭게 분산되고 나노입자 표면상의 작용기와 반응할 가능성이 적기 때문에 GA를 대체하기 위해 대안으로 사용될 수 있다. 나노입자 안정화를 위한 다른 접근법은 나노입자 표면의 비공유 코팅이다. BSA 나노입자는 수성 완충제 중에서 양이온성 중합체로 코팅되어 입자 안정성을 개선할 뿐만 아니라 단백질의 방출 속도를 제어하는 코팅을 생성할 수 있다. 이 접근법의 타당성은 BSA 나노입자에 포획되고 PEI로 코팅 된 BMP-2로 입증되었다 [61].

3.4. 전기분무 기술 (Electrospray technique)

전기 분무는 표면장력을 극복하기 위한 전력의 도움으로 스프레이의 동시 발생 및 하전에 의한 액체분자화 공정으로 서브마이크론 (submicron) 나노 크기의 단백질 입자를 제조하기위한 새롭고 다소 인기있는 기술이다. [38, 62]. 이 접근법에서, 단백질 용액의 흐름은 비교적 높은 전위로 유지되는 모세관 노즐로부터 방출된다. 전기장에 노출되어 메니스커스 (meniscus)가 길어져 제트 (jet)가 형성된다. 이것은 나중에 주로 정전기력으로 인해 반구형 에어로졸 방울로 변형된다. 추가적인 기계적 에너지는 없이 전기장만으로 액체 분무를 담당한다. 고도로 하전된 뉴클레오타이드와 다른 전하를 띠는 치료 분자는 높은 로딩 효율을 갖는 나노 구조에 쉽게 통합될 수 있다. 이 접근법으로 제조된 나노입자는 jet의 표면 장력이 전기력과 효과적으로 대응하기 때문에 유체 역학적 직경이 비교적 낮다. 이 공정으로 제조된 글라이아딘 나노입자의 평균 입자 크기는 220 nm이고 매우 높은 나노입자수율 (> 75%)을 가지며 약물 로딩 효율이 72% 이상으로 나타났다 [63]. 이 공정은 산업 수준에서 확장 가능하며 분말 의약품 제제를 얻기 위해 제약 산업에서 이미 사용되고 있다 (Fig. 6) [19].


Fig. 6. 
Electrospray technique using high voltage power supply and syringe for jet/aerosol formation. In this approach, a stream of protein solution is emitted out of a capillary nozzle that is maintained at a relatively high potential. It is subjected to an electric field, which results in an elongated meniscus to form a jet. This is later deformed into semispherical aerosolized droplets, mainly due to electrostatic force [1].

3.5. 고분자 전해질 착물화/복잡한 코아세르베이션 방법 (Polyelectrolyte complexation/Complex coacervation method)

활성 표면 전하를 갖는 단백질은 유화제로서 기능할 수 있다. 표면 전하는 정전기적 상호 작용 및 입체 장해 (steric hindrance)에 의해 높은 콜로이드 안정성을 나타낼 수 있다. pH에 크게 의존하는 정전기적 상호 작용이 안정화 메커니즘의 주요 요인이기 때문에 안정화된 단백질 용액은 pH에 대해 민감하지 않다. 단백질과 다른 거대 분자 사이의 pH 의존적 정전기적 상호 작용 현상은 생체 활성 치료제의 제어된 전달을 용이하게 하기 위해 안정한 생체 적합성 나노입자 및 코아세르베이트를 설계하기 위해 이용될 수 있다 [19]. 코아세르베이션 복합체는 수용성 조건 하에서 정전기력으로 인한 거대 분자 상호 작용의 결과로서 형성된다. 앞서 언급한 바와 같이, 배지의 pH와 같은 매개 변수는 단백질과 반대로 하전된 중합체 사이의 불용성 복합체의 형성에 크게 영향을 미친다. 나노입자 제조를 위한 다중 양이온의 사용은 단백질의 등전점보다 높은 pH를 요구하는 반면, 다중 음이온의 경우, 단백질의 등전점보다 낮은 pH가 요구된다 [64]. 양이온성 단백질 중합체는 일반적으로 올리고뉴클레오타이드의 포스포다이에스터 벡본 (phosphodiester backbone)에서 음이온성 산소 원자와의 복합체를 형성함으로써 긴 끈 형태의 DNA / RNA 치료 분자를 나노입자로 축소시키기 위해 사용된다 [65]. 이러한 유형의 관찰된 상호 작용은 작은 반대 이온이 이 과정에서 방출되는 것으로 밝혀지기 때문에 엔탈피보다 엔트로피적이다. 친수성 단백질 segment는 형성된 나노입자의 수용성을 용이하게 하기 때문에 (시스템적 적용에 매우 바람직한 특징) 조합형 고분자 전해질은 수용성 복합체의 제조에 특히 적합하다 [64,66]. Serefoglou와 공동연구자들은 BSA의 등전점보다 낮은 pH에서 BSA와 음이온성 중합체 사이의 Coulomb 상호 작용에 의한 수용성 나노입자를 형성했다 [65]. 이 복함체는 2개의 중합체 분자에 의해 13-14 BSA 분자를 함유하는 것으로 밝혀졌다. 정전 기적 상호 작용에 더하여, 소수성 상호 작용 또는 수소 결합은 또한 단백질/중합체 복합체화를 촉진할 수 있다. 이 경우, 중합체-단백질과 중합체-중합체 상호 작용 사이의 균형은 복합체 내의 단백질 및 중합체의 수를 지배한다 (Fig. 7) [67].


Fig. 7. 
Complexity of coacervation method shown by requirement of many steps. Coacervation complexes are formed as a result of macromolecular interaction due to electrostatic forces under aqueous conditions [22].

3.6. 염 침전 (Salt precipitation)

탈용매화 기술과 매우 유사한 방법인 염 침전은 높은 염 농도의 존재하에서 소수성-소수성 단백질 상호 작용을 유도함으로써 단백질 코아세르베이트를 제조하는 것에 기초한다. 단백질 용액이 탈용매제 풀(pool)에 첨가되는 탈용매화 방법과 대조적으로, 염 침전은 단백질 용액에 염을 천천히 첨가 한다. 단백질의 형태적 구조 또는 생체 활성에 악영향을 미치지 않는 한, 이러한 접근법의 단순성과 비교적 높은 캡슐화 효율을 가진다. 수득된 나노입자로부터 높은 약물 캡슐화 효율 및 제어된 약물 방출뿐만 아니라, 나노입자의 물리 화학적 특성 및 형태의 조절이 가능하다. 인슐린 입자는 산성 매질의 단백질 용액에 0.5 M 이상의 농도의 NaCl 용액을 첨가함으로써 이 방법을 사용하여 설계된다. 100-1000 nm 범위의 입자가 수득되고 나노입자의 크기는 용액의 pH에 의해 크게 영향을 받는 것으로 밝혀졌다 [68]. 또 다른 예는 수용액에서 인산칼륨을 탈염제로 사용하여 제조된 실크 피브로인 나노입자의 합성이다 [69]. 일단 나노입자가 형성되면, 이들은 추가로 안정화될 필요가 종종 있다. 나노입자의 안정화는 이러한 미리 형성된 나노입자를 가교제로 코팅하거나 고분자 전해질 코팅 (단백질의 pI 및 순수 고분자 전해질 전하를 고려하여)에 의해 달성될 수 있다. 두 가지 방법 모두 매우 쉽고 나노입자의 안정화를 촉진하고 응집을 방지하는 데 도움이 된다 (Fig. 8) [68].


Fig. 8. 
Salt precipitation method using organic solution (containing polymer and drug) and aqueous solution (containing stabilizer and salting out reagent) [70].


4. 단백질 나노입자 특성
4.1. 입자 크기 (Particle Size)

입자 크기 및 크기 분포는 나노입자 시스템의 가장 중요한 특성이다 [71]. 많은 연구에서 나노입자는 약물 전달 시스템으로서 마이크로 입자에 비해 많은 장점을 가지고 있음이 입증되었다. 일반적으로 나노입자는 마이크로 입자에 비해 세포 내 흡수가 상대적으로 높으며, 크기가 작아 상대적 이동성이 크기 때문에 광범위한 생물학적 표적에 이용 가능하다.

예를 들어, 신체 분포 연구에 따르면 230 nm보다 큰 나노입자가 모세관 크기로 인해 비장에 축적되는 것으로 나타났다. 다른 in vitro에서의 연구는 나노입자의 입자 크기가 세포 흡수에도 영향을 미친다는 것을 보여주었다 [20]. 또한 Tween 80으로 코팅된 나노입자가 혈액-뇌 장벽을 통과하는 것을 확인하여 나노입자가 고삼투압성의 만니톨 (hyper osmotic mannitol)에 의해 단단한 접합부가 열린 후 혈액-뇌 장벽을 통과할 수 있다는 사실이 밝혀졌고, 이는 뇌종양과 같은 치료하기 어려운 질환에 대한 치료제의 지속적인 전달을 제공할 수 있을 것으로 기대되었다 [72]. 일부 세포주에서, 서브마이크론 (submicron) 나노입자는 효율적으로 흡수될 수 있지만 더 큰 크기의 미세 입자는 그렇지 않다.

약물 방출은 입자 크기에 영향을 받는다. 더 작은 입자는 더 큰 표면적을 가지므로, 입자 표면에 있거나 입자 표면에 근접한 대부분의 약물의 방출이 빠르다. 반면, 더 큰 입자는 더 많은 약물을 캡슐화하고 천천히 확산시킬 수 있다. 또한 더 작은 입자는 나노입자 분산액의 저장 및 운반 동안 입자의 응집 위험이 더 크다. 가능한 가장 작은 크기이지만 최대의 안정성을 갖는 나노입자를 제형화하는 것은 항상 도전과제이다 [73,74]. 중합체 분해도 입자 크기에 의해 영향을 받을 수 있다. 예를 들어, 폴리락틱코글리콜산 (poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA) 중합체 분해 속도는 in vitro 내에서 입자 크기가 증가함에 따라 증가하는 것으로 밝혀졌다 [75].

현재, 입자 크기를 측정하는 가장 빠르고 가장 일반적인 방법은 광자상관분광법 (PCS) 또는 동적 광산란 (DLS)을 이용한 측정이며 PCS는 산업적으로 서브마이크론 입도 분석시 선호되는 방법이다. PCS 장치에서 분석하는 샘플은 액체 매체에 잘 분산된 입자로 구성되어야 한다. 이러한 조건에서 입자는 브라운 운동 (Brownian motion)이라고하는 일정한 무작위 운동이 지속되고 PCS 레이저가 이를 통과하여 이 운동의 속도를 측정한다. PCS는 측정된 샘플 내에서 평균 입자 크기 및 다분산성 (polydispersity, PI)를 측정한다. 입자 크기의 정확한 측정 값은 0.7 (70%) 이하여야 한다 [76]. DLS 이론은 나노미터에서 마이크로의 크기 범위에서 입자 크기를 측정하기 위해 잘 확립된 기술이다. 이 개념은 서스펜션의 작은 입자들이 무작위 패턴으로 움직인다는 생각을 이용한다. 더 작은 입자와 비교하여 더 큰 입자의 관찰은 온도가 동일한 경우 더 큰 입자가 더 작은 입자보다 더 느리게 이동한다 [20].

4.2. 입자 형태 (Particle Morphology)

나노 스케일에서 물질의 물리 화학적 특성을 조작하면 전자, 진단 및 치료 응용 분야에 혁신을 일으킬 수 있다. 나노 물질의 잠재적인 대규모 사용을 대비하기 위해, 대용량과 비교하여 나노 스케일 물질의 독특한 독성이 있는지를 결정하는 것이 중요하다. 세포 배양 및 동물 모델의 결과를 해석하기 위해서는 나노 물질이 철저하게 특성화되고 관찰된 독성 반응과 물질의 물리 화학적 특성 사이에 상관 관계가 있어야한다 [20].

나노입자의 형태는 두 가지 기술에 의해 측정된다. 원자힘현미경 (atomic force microscopy, AFM) 및 주사전자현미경 (scanning electron microscopy, SEM). AFM 또는 주사힘현미경 (scanning force microscope, SFM)은 매우 높은 해상도의 주사 탐침 (scanning probe) 현미경으로, 광학 회절 한계보다 1000배 이상 우수한 나노미터 분율의 분해능을 가진다. SEM은 raster 주사 패턴으로 고 에너지 전자빔을 시료 표면을 조사함으로써 시료 표면을 이미지화하는 전자 현미경의 한 유형이다. SEM은 서브마이크론 범위의 크기에 필요한 나노 미터 해상도를 가지며 입자 형태를 결정하는 데 매우 중요하다. 전자는 샘플의 표면 지형, 구성 및 전기 전도도와 같은 다른 특성에 대한 정보를 포함하는 신호를 생성하는 샘플을 구성하는 원자와 상호 작용한다 [77-79].

4.3. 표면 전하 (Surface Charge)

나노입자를 정맥 내로 투여하면, 신체 면역계에 의해 쉽게 인식되고, 그 후 순환 (circulation)으로부터 식세포 작용에 의해 제거된다. 나노입자의 크기 외에도, 표면 소수성은 흡착되는 혈액 성분, 주로 단백질의 양을 결정한다. 따라서 나노입자의 표면 개질을 연구하기 위해 많은 기술이 개발되었다. 표면 개질의 효율은 표면 전하, 작용기의 밀도 또는 표면 친수성의 증가를 측정함으로써 추정할 수 있다. 표면 개질을 측정하기 위해 사용되는 한가지 방법은 나노입자를 함유하는 수용성 현탁액의 제타 전위를 측정하는 것이다. 그것은 입자의 전위를 반영하며 입자의 구성과 입자가 분산된 매체의 영향을 받는다 [80]. 제타 전위를 측정하는 주된 이유는 콜로이드 안정성 예측이다. 입자들 사이의 상호 작용은 콜로이드 안정성에서 중요한 역할을 한다. 안정성을 예측하기 위해 제타 전위 측정을 사용하는 것은 이러한 상호 작용을 정량화 한다 [79]. 제타 전위는 입자 사이의 반발력의 척도로, 대부분의 수용성 콜로이드 시스템은 정전기 반발에 의해 안정화되기 때문에, 입자들 사이의 반발력이 클수록 이들이 서로 가까이 와서 응집체를 형성할 가능성이 줄어드는 것을 이용한다. 표면 전하가 입자의 응집을 막기 때문에 (+/−) 30 mV 이상의 제타 전위를 갖는 나노입자는 현탁액에서 안정한 것으로 보고된다. 제타 전위는 또한 충진된 활성 물질이 나노 캡슐의 중심 내에 캡슐화되었는지 또는 표면에 흡착되는지를 측정하는데 사용될 수 있다 [80].


5. 약물 로딩 및 방출

약물 투여를 위해 나노입자들의 수용성 현탁물은 높은 약물 로딩 능력을 가지고 매체의 양을 감소시켜야 한다. 약물은 나노입자에 두 가지 방법으로 다음 로딩 한다. 첫번째 방법은 나노입자 생산 시 약물에 통합(첨가)시켜 나노입자 합성 동시에 로딩하는 방법이다. 두번째 방법은 농축된 약물 용액을 나노입자에 붙이는 또는 넣는 방식으로 나노입자 합성 후 약물 흡수 등이 있다. 약물 로딩 효능은 매체 소재 혹은 고분자 내에서의 약물 용해도, 나노입자 크기 등에 따라 달라지며 이는 고분자의 성분, 분자량 및 약물-고분자 상호작용과 연계된다.

성공적인 약물전달을 위한 나노입자를 생산하려면 약물 방출 및 고분자 생분해성이 매우 중요하다. 약물이 방출되는 속도는 약물 용해도, 흡수된 약물의 방출, 나노입자 소재, 나노입자 크기로부터 약물의 분산, 나노입자 소재의 분해 및 분해/분산 과정의 조합에 따른다. 약물이 균일하게 분포된 구체형 나노입자의 경우 방출은 소재의 분해 혹은 분산에 의하여 일어난다. 또한 투약방법도 방출양상에 영향을 미친다. 보통 방출연구는 교반 및 원심분리 조절에 의하여 진행되며. 나노입자들의 방출매체로부터 분리 과정은 시간이 오래 걸리며 기술적으로 어려워 투석 기술이 보편적으로 이용되고 있다 [20].


6. CONCLUSION

단백질 나노입자는 벡터로서 단백질 나노입자가 항암제, 펩타이드 호르몬, 성장 인자, DNA 및 RNA와 같은 유전 물질의 전달에 있어서 다양한 장점 및 적용을 갖는다. 다른 콜로이드 운반체보다 안정성이 높고 제조가 쉽다는 장점이 있다. 또한 다른 소재의 나노입자보다 화학 물질을 덜 사용하면서 쉽고 비용 효율적이며 친환경적인 합성 공정을 사용하여 다양한 소스의 단백질을 나노입자로 제조할 수 있어 생체 내에서의 높은 잠재적 활용성이 기대된다. 단백질 나노입자는 여러 소재와 공정에 따라 각각의 장단점을 가지고 있고 크기, 형태, 표면 전하 등 특성을 조절하여 단백질 전달 효율을 높일 수 있다. 단백질 약물 로딩 및 방출 효능 또한 나노입자의 특성이나 약물의 농도, 종류에 따라 조절된다. 현재 단백질 나노입자 기술의 단점을 보완하기 위해 많은 연구가 진행중에 있다. 아직 상업적으로 이용되기 위해서는 더 많은 연구와 진보가 필요하지만 이러한 나노입자의 대규모 제조가 성공할 경우, 나노 바이오 테크놀로지에서의 이러한 전달 시스템의 적용은 현재 바이오 제약 제조의 병목 제거에 기여할 것으로 예상된다.


Acknowledgments

This research was supported by Basic Science Research Program through the National Research Foundation of Korea (NRF) funded by the Ministry of Education (NRF-2018R1D1A1B07050422) and 2019 Research Grant from Kangwon National University (No. 520190027).


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