The Korean Society For Biotechnology And Bioengineering

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Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 35 , No. 1

[ Research Paper ]
Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 35, No. 1, pp.34-43
Abbreviation: KSBB J
ISSN: 1225-7117 (Print) 2288-8268 (Online)
Print publication date 31 Mar 2020
Received 25 Aug 2019 Revised 06 Jan 2020 Accepted 09 Jan 2020
DOI: https://doi.org/10.7841/ksbbj.2020.35.1.34

Bifidobacterium sp. 고농도 성장을 위한 환경인자 및 세포활성도 최적화
윤효원 ; 이아현 ; 김지은 ; 김재한*
충남대학교 식품영양학과

Optimization of Cell Viability and Environmental Factor for the High Cell Density Cultivation of Bifidobacterium sp.
Hyowon Yun ; A Hyun Lee ; Jieun Kim ; Jaehan Kim*
Department of Food and Nutrition, Chungnam National University, Daejeon 34134, Korea
Correspondence to : Department of Food and Nutrition, Chungnam National University, Daejeon 34134, Korea Tel: +82-42-821-6834, Fax: +82-42-821-8887 E-mail: jaykim@cnu.ac.kr


© 2020 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering
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Abstract

For the industrial use of Bifidobacterium sp., maintaining cell viability is crucial along with the high cell concentration through fermentation optimization. The effects of initial glucose concentration, lactic acid concentration, pH and culture temperature on cell growth were investigated to optimize the environmental factors. In addition, the batch and fed-batch cultivation were performed to evaluate the correlation between the cell concentration based on the absorbance and the viable cell number. Both B. infantis and B. bifidum showed the highest cell growth rates at low glucose levels and the specific growth rate decreased with increasing glucose concentrations. The growth rate of B. bifidum was reduced with increasing glucose concentration, but the maximum cell concentration was increased. However, B. infantis showed lower maximum cell concentration in the higher glucose concentration. The impacts of lactic acid, pH and temperature of both B. infantis and B. bifidum were similar to those of most lactic acid bacteria. However, B. bifidum showed a more resilience within the same range of each environmental factor showing continuous growing at low specific growth rate even when B. infantis stopped growing. The number of viable cells of B. infantis was dramatically reduced even though the absorbance remained constant. In particular, the number of viable cells and the number of viable cells per absorbance decreased to 1/7 and 1/10 as the fed-batch culture progressed. Meantime, once the maximum viable cell number was reached, B. bifidum maintained the constant viable cell number and viable cell number per absorbance were maintained.


Keywords: Bifidobacterium, environmental effect, fermentation, cell viability, fed-batch culture

1. INTRODUCTION

Bifidobacterium sp.는 Lactobacillus acidophilus와 더불어 대표적인 probiotic bacteria이다 [1]. Bifidobacterium sp.는 30종으로 B. adolescentis, B. longum, B. catenulatum, B. pseudocatenulatum, B. breve, B. angulatum, B. bifidum, B. dentium, B. infantis 등이 있다 [2]. 이중에서 유아의 장에서 발견되는 bifidobacteria로는 B. breve, B. infantis, B. bifidum 이 있으며 B. adolescentis, B. longum은 어린이와 성인, 노인에게서 발견된다. 특이적으로 모유를 먹는 유아의 전체 장 내 균총의 약 90% 이상은 Bifidobacterium sp.로 이루어져 있다 [3].

인체 내 Bifidobacterium infantisBifidobacterium bifidum의 개체 수는 유아의 모유 수유 및 건강 상태와 관련이 있다. 모유 수유 중단 후 유아는 이유식을 섭취하게 되며 Bifidobacterium sp. 의 숫자는 점차 감소하여 전체 균총 중의 10~20% 수준을 유지하고 연령이 높아짐에 따라 더욱 감소하게 된다 [2]. 이에 장 내 균총의 변화로 유해균의 비율이 높아지면 장의 운동력이 줄어들고 장내 유해균에 의한 유해물질 생산이 늘어나게 된다 [4].

Bifidobacterium sp.는 포도당을 fructose-6-phosphate phosphoketolase (F6PPK)에 의해 분해하는 bifidus pathway를 가지고 그 결과로 초산 (acetic acid)과 젖산 (lactic acid)이 3:2로 생산된다 [5]. Bifidobacterium sp.에 의하여 생산되는 초산과 젖산은 항균 활성을 보유하여 장 내에서 유해세균의 정착을 억제하는데 관여하는데 [6], 특히 젖산은 장 내 환경을 산성으로 만들어주어 산성에서 생육하지 못하는 유해균을 억제한다 [7]. 또한 장내의 연동운동을 촉진하고 장내의 상피세포를 통하여 체내로 흡수되어 에너지원으로 작용한다 [2].

균주의 생리학적 유용성으로 인해 Bifidobacterium sp.는 식품산업에서 다양하게 이용되고 있다. Bifidobacterium sp.는 일본 및 유럽국가와 미국, 영국 등 세계 여러 나라에서 유제품과 건강관리식품, 프로바이오틱스 효과가 있는 보충제에 사용된다 [8,9]. 식품에 인위적으로 Bifidobacterium sp.를 첨가하여 섭취할 경우, 장 내의 Bifidobacterium sp.가 증가하여 유해균이 억제되고 장 운동이 활발해져 소화력이 증가하는 것으로 보고되어 있으며 [1], 면역 체계를 강화시켜 염증 또는 알레르기의 발생을 감소시키고 [10] 항생제 복용 시 장내 균총의 정상화에도 기여한다고 알려져 있다 [11].

유산균 및 프로바이오틱스를 첨가한 식품 제조 시 가장 중요한 목표는 소비자들이 건강보조식품을 섭취했을 때, 고농도의 유산균이 최대의 활성을 유지한 상태로 장까지 전달되게 하는 것이다. 유산균을 통해 건강 개선 효과를 나타내기 위해서는 활성화된 Bifidobacterium sp.의 농도가 식품에 최소 106 CFU/mL 이상이어야 한다 [12]. 세포 농도뿐만 아니라 세포 활성도 (cell viability) 또한 Bifidobacterium sp. 의 상업적 이용 시 고려해야 하는 중요한 요소이다 [9]. 다양한 유산균 제품을 섭취하여 건강 개선 효과를 기대하기 위해서는 고농도의 유산균이 필요함과 동시에 첨가되는 유산균의 세포활성도가 높아야 한다.

이러한 세포 성장 및 세포 활성도는 다양한 환경인자들의 영향을 받아 발효 과정 중 점차 감소하는 것으로 알려져 있다 [9]. 세포의 성장과 세포 활성도에 영향을 주는 환경인자는 배지의 탄소원 농도와 젖산, 초산, pH, 수소 이온 농도, 온도, 산소의 양 등이 있다 [13]. 특히 Bifidobacterium sp. 는 혐기성 환경에서 자라고 pH에 민감하게 반응하는 등 생육 조건이 까다로우며 세포 활성이 환경인자의 변화에 매우 민감하게 반응하는 것으로 알려져 있다 [14].

본 연구에서는 유아의 중요한 장내 미생물인 B. infantisB. bifidum의 산업적 이용을 위하여 환경인자가 세포의 성장에 미치는 영향과 고농도의 장기간 유가배양 시 세포 활성도의 변화를 관찰하고, 두 균주의 산업적 생산을 위한 최적의 조건을 찾고자 하였다. 이를 위해 배지 내 포도당 농도, 젖산 농도, pH 그리고 배양 온도를 환경인자의 변수로 하여 각각의 환경인자들이 B. infantisB. bifidum의 성장에 미치는 영향을 확인하였다. 또한 단순히 세포 농도만 높기보다는 활성화된 고농도의 세포를 얻기 위해 장기간의 유가식 배양을 하며 세포 활성도 추이를 관측하여 세포활성도 대비 최적화 발효 전략의 기초 데이터를 확보하고자 하였다.


2. MATERIALS AND METHODS
2.1. 균주 및 배지

균주는 실험실에 보유하고 있는 Bifidobacterium infantis ATCC 15697과 Bifidobacterium bifidum PRL 2010을 사용하였다. 균주 성장에 필요한 배지로는 MRS 배지 (Difco, NJ, USA)를 사용하였으며, 탄소원으로는 포도당을 사용하였다.

2.2. 발효 조건

환경인자가 B. infantis ATCC 15697와 B. bifidum PRL 2010에 미치는 영향을 확인하기 위해 포도당 농도, 젖산 농도, pH 그리고 성장온도를 각각 다르게 하여 MRS 배지에서 균주를 배양하였다.

배지 내 포도당의 영향을 관측하기 위한 실험을 위해 배지에 초기농도 20 g/L, 40 g/L, 50 g/L, 60 g/L, 70 g/L, 및 90 g/L의 포도당을 첨가하여 배양하며 균주의 성장을 관측하였다. 포도당의 농도가 세포의 성장 속도에 주는 영향은 각각의 서로 다른 초기 포도당 농도에서 10 g/L의 포도당이 소모되는 구간에서 비성장속도를 계산하여 비교하였다. 젖산의 영향은 배지에 젖산을 첨가하여 0 g/L, 5 g/L, 10 g/L, 20 g/L 농도로 조정한 후 균주를 배양하여 관측하였다. 발효는 포도당이 모두 소모될 때까지 진행하였으며, 젖산이 세포성장에 주는 영향을 관측하기 위한 비성장속도는 5 g/L의 젖산이 생산되는 구간에서 계산하였다. pH의 영향은 두 균주 모두 초기 pH를 각각 2.0, 4.0, 5.5, 6.5로 조절하여 관측하였다. 마지막으로 온도의 영향은 발효온도를 각각 25oC, 30oC, 33oC, 37oC, 40oC, 45oC로 설정한 배지에 균주를 배양하여 관측하였고, 두 조건 모두 비성장속도는 대수기 (exponential growth phase)에서 구하였다.

세포 배양은 혐기 배양기 (type A, Coy Laboratory Products, MI, USA)에서 혐기성 상태를 유지하며 배양하였다. 온도는 온도 변경 조건 외에는 37oC를 유지하였으며 세포성장은 3시간 간격으로 관측하였다. 3시간마다 배양액 1 mL를 14,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 cell pellet만 남기고 상등액은 제거하였다. Cell pellet에 멸균된 증류수 1 mL를 넣어 희석한 후 Optizen 2120 UV spectrophotometer (Mecasys, Daejeon, Korea)를 이용하여 600 nm에서의 흡광도를 측정하였다.

2.3. HPLC 분석

발효액 1 mL를 15,000 rpm으로 원심분리 (Hanil, Incheon, Korea)하여 상등액만 취한 후 10 배 희석하여 Rezex Roa-organic acid H+ (8%) column (Phenomenex, Torrance, USA)을 장착한 HPLC (Agilent Technologies, Santa Clara, USA)로 발효 대사산물을 분석하였다. 시료 주입량은 80 μL이고 검출기는 Refractive index detector (RID)를 사용하였다. 이동상으로는 0.005 N 황산을 사용하였고 0.6 mL/min의 유속으로 흘려주며 25분 동안 측정하였다.

2.4. 회분식 배양 및 고농도 유가식 배양

고농도 배양 시 세포활성도의 변화를 관찰하기 위해 발효기 (Hanil, Incheon, Korea)를 사용하여 실험하였다. 온도는 37oC로 유지시켜 주었으며 4 N NaOH과 4 N HCl을 이용해 pH 6.5를 유지하였고 75 rpm으로 교반 시켰다. 혼합가스 (H2 5% mol/mol, CO2 5% mol/mol, N2 90% mol/mol)를 이용해 발효기 내의 혐기성 상태를 유지하였다. 자외선 분광광도기를 통해 초기 cell optical density (O.D.) 값이 0.2가 되도록 접종량을 계산하여 멸균된 MRS 배지에 접종하여 실험을 진행하였다. 초기 포도당 농도는 40 g/L였으며 20 g/L 미만으로 떨어질 때 마다 최대 40 g/L를 유지하도록 포도당을 추가적으로 공급하였다. 유가 배양한 성장 곡선에 따라 구간별로 생균수를 측정하였다. 초기대수기 (early exponential phase), 후기대수기 (late exponential phase), 초기사멸기 (early death phase) 그리고 후기사멸기 (late death phase)의 두 부분 등 총 다섯 부분에서 측정하였다. 세포 활성도는 시간당 세포 O.D.값과-생균수/O.D. 값을 판단 지표로 사용하였다.

생균수 측정을 위해 배양액 1 mL를 채취 후 멸균 생리식염수를 이용하여 적절한 농도로 희석하였다. 다양한 농도로 희석된 균체는 MRS 배지에 접종하여 37oC에서 24시간 동안 혐기 배양기에서 배양 후 30~300개의 범위 내의 콜로니 수를 측정하였다.


3. RESULTS AND DISCUSSION
3.1. 초기 포도당 농도가 세포의 성장에 미치는 영향

B. infantisB. bifidum의 탄소 공급원의 최적 농도를 알아보기 위해 초기 포도당 농도를 각각 20 g/L, 40 g/L, 50 g/L, 60 g/L, 70 g/L, 90 g/L로 하여 MRS 배지에서 배양 후 그 성장을 관찰하였다. B. infantis의 최대균체농도 (maximum cell O.D.)는 포도당의 농도에 비례하지 않았다. 최대균체농도는 각각 60 g/L 이상의 고농도와 그 이하의 농도끼리는 서로 유사한 값을 보였으나, 60 g/L 이상의 고농도 조건에서는 60 g/L 이하의 조건보다 75% 낮은 값을 보였다 (Fig. 1(a)). 비성장속도 (specific growth rate)는 초기 농도 20 g/L에서 가장 높았으며 포도당 농도가 높아짐에 따라 점점 감소하여 최대 농도인 90 g/L에서는 20 g/L 대비 50% 정도로 감소하였다 (Fig. 1(b)).


Fig. 1. 
The effect of initial glucose concentration on the maximum O.D. and specific growth rates of B. infantis ATCC 15697 and B. bifidum PRL 2010. Maximum O.D. of B. infantis ATCC 15697 (a), specific growth rate of B. infantis ATCC 15697 (b), maximum O.D. of B. bifidum PRL 2010 (c), specific growth rate of B. bifidum PRL 2010 (d).

B. bifidum의 초기 포도당 농도에 따른 최대균체농도의 변화는 B. infantis와는 다른 양상을 보였다. 20~40 g/L의 초기 농도까지는 최대균체농도가 비슷하였으나 40 g/L보다 농도가 높아짐에 따라 최대균체농도도 증가하는 모습을 보이며 70 g/L에서는 20 g/L 대비 2배 더 높은 균체농도에 도달하였다 (Fig. 1(c)). 비성장속도는 B. infantis와 마찬가지로 포도당 농도가 높아질수록 감소하였다. 90 g/L 농도에서의 비성장 속도는 20 g/L와 비교하여 70% 정도 감소하였다 (Fig. 1(d)).

B. infantisB. bifidum 모두 낮은 농도의 포도당에서 최고의 세포 성장속도를 보이며 포도당의 농도가 증가함에 따라 비성장속도가 포도당의 농도에 비례하게 감소하였다. 이는 두 균주 모두 배지의 포도당에 의한 삼투압에 민감하게 반응한 것으로 추정된다. A. Homayouni 등 (2008)은 아이스크림에서 프로바이오틱스로 이용될 수 있는 유산균으로서 Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum의 성장을 관찰하였다. 이들은 당 농도의 증가에 따른 균주의 성장률을 측정하기 위해 아이스크림의 주요 탄소원인 설탕의 농도를 각각 10, 15, 20, 25%로 높였을 때, 특히 bifidobacteria의 성장률이 당 농도가 높아질수록 삼투압에 의해 감소하는 것을 확인하였다 [15].

그러나 최대균체농도 도달에 B. infantisB. bifidum은 서로 다른 반응을 보였는데, B. bifidum은 포도당의 농도가 높아짐에 따라 비성장속도는 70% 수준으로 감소하였으나 잔류 포도당을 이용하여 최대균체농도는 2배 정도 증가하였다. 반면에, B. infantis는 포도당 농도 50 g/L를 기준으로 두 구간으로 나누어져 서로 다른 최대균체농도를 보였으며 B. bifidum과 다르게 포도당 농도가 높은 구간에서 더 낮은 최대균체농도 값을 보였다. B. infantis는 세포 안에서 탄소원을 분해하고 B. bifidum은 세포 안, 밖에서 당을 분해한다고 알려져 있다 [16,17]. B. infanis는 분해된 탄소원을 세포 안으로 받아들이는 과정에서 더 민감하게 반응하는 것으로 생각된다. S.-L Her 등 (2004)은 Bifidobacterium longum의 세포 성장 및 영양소 흡수를 관찰하기 위해 회분식, 유가식, 반복된 회분식 배양에서 산화-환원 전위 (oxidation-reduction potential, ORP)를 측정하였을 때, 포도당과 젖당과 같은 탄소원이 ORP 수치의 변화 및 영양소 흡수에 영향을 주는 것을 확인하였다 [18]. Reference와 실험 결과를 바탕으로 균체농도의 최대화가 목적인 유가식 배양에서 포도당 농도의 조절이 중요한 인자로 추정되며, 유가식 배양에서 B. infantisB. bifidum의 세포농도 및 세포 활성도를 최대화하기 위해서 20~40 g/L 수준의 포도당 농도가 유지되어야 할 것으로 사료된다.

3.2. 젖산 농도가 세포의 성장에 미치는 영향

배지의 젖산 농도 증가는 수소 이온 농도의 증가를 유발해 배지의 최적 pH 범위를 벗어나게 만들어 세포의 에너지 요구량을 증가시키며 전반적인 대사 상태와 성장 속도에 영향을 준다 [19,20]. 젖산 농도가 B. infantisB. bifidum의 성장에 미치는 영향을 알아보기 위해 초기 젖산 농도를 각각 0 g/L, 5 g/L, 10 g/L, 20 g/L로 조절한 MRS 배지에 두 균주를 배양하였다. B. infantis의 최대균체농도는 젖산 농도가 증가할수록 감소하였으며, 비성장속도 또한 같은 양상을 보였다 (Fig. 2(a), (b)). 특히 젖산 농도를 20 g/L로 조절한 배지에서는 B. infantis의 O.D.값의 변화가 0.5 이하로 다른 군에 비해 성장이 낮은 것을 볼 수 있었다 (Fig. 2(a)).


Fig. 2. 
The effect of initial lactic acid concentration on the maximum O.D. and specific growth rates of B. infantis ATCC 15697 and B. bifidum PRL 2010. Maximum O.D. of B. infantis ATCC 15697 (a), specific growth rate of B. infantis ATCC 15697 (b), maximum O.D. of B. bifidum PRL 2010 (c), specific growth rate of B. bifidum PRL 2010 (d).

B. bifidum의 경우에도 B. infantis와 유사한 변화를 보였는데, 최대균체농도와 비성장속도 모두 젖산농도에 비례하여 감소하는 경향을 보였다 (Fig. 2(c), (d)). 하지만 B. bifidum의 경우 젖산 농도가 20 g/L임에도 최대균체농도가 약 2.9 정도로 농도가 0 g/L일 때의 약 76% 수준으로 감소하였다 (Fig. 2(c)). 20 g/L 농도의 젖산이 함유된 배지에서 비성장속도는 최적 수준의 27%로 상당 수준 감소하였으나 성장이 멈추지는 않았다. 즉, B. infantis는 젖산의 농도가 증가함에 따라 성장을 멈추나, 동일한 농도의 젖산이 존재하는 환경에서 성장속도만 감소하고 꾸준히 세포의 성장을 유지하여 세포 활성도를 유지하고 있음을 알 수 있었다. 또한 B. infantis의 경우 젖산 농도가 5 g/L 이상일 때부터 최대균체농도가 급감하였지만 (Fig. 2(a)), B. bifidum의 경우에는 0~5 g/L부터 급격하게 감소하는 모습을 보였다 (Fig. 2(c)). B. infantisB. bifidum에 비해 상대적으로 낮은 젖산 농도에는 내성이 있으나, 20 g/L 이상의 높은 젖산 농도에서는 최대균체농도와 비성장속도가 각각 0.5 및 0.01 이하로 감소하며 성장이 멈춘 것으로 판단된다. 반면에 B. bifidum은 최대균체농도와 비성장속도가 각각 3.0 및 0.05 이하로 성장이 멈추진 않고 계속 진행되는 것을 볼 때, B. infantisB. bifidum보다 더 민감한 세포성장의 변화를 나타내는 것으로 사료된다. Matsumoto 등 (2005)은 17개의 Bifidobacterium sp.의 내산성을 평가한 결과, B. bifidum에 비해 B. infantis의 생균수가 감소하는 pH에 민감하게 반응하는 것을 확인하였다 [21]. 또한, Ahn 등 (1999)은 3종의 ATCC 균주 (B.bifidum ATCC 11863, B. longum ATCC 15707, B. infantis ATCC 15697)의 내산성을 비교하였을 때, pH 2.5에서 B. bifidum ATCC 11863의 생존력이 B. infantis ATCC 15697에 비해 더 높은 것을 확인하였다 [22].

3.3. 배지의 pH가 세포의 성장에 미치는 영향

pH의 저하는 세포의 항상성 메커니즘에 영향을 주어 세포의 손상을 야기해 성장에 영향을 준다고 알려져 있다 [20]. 미생물 세포의 성장에 수소 이온 농도가 미치는 영향을 알아보기 위해서 초기 성장구간에서의 pH를 HCl 용액 (Sigma-Aldrich, USA)을 이용해 각각 pH 2.0, 4.0, 5.5, 6.5로 조절하여 세포 성장을 관측하였다. B. infantis의 경우 pH 변화에 따른 최대균체농도와 비성장속도는 pH 값이 산성화되며 낮아짐에 따라 기하급수적인 감소를 보였는데, pH 2.0~4.0 구간에서의 비성장속도는 약 0.01이었으며, pH 5.5에서 최대균체농도는 pH 6.5인 경우의 32% 수준, 비성장속도는 61% 수준으로 감소하였다 (Fig. 3(a), (b)).


Fig. 3. 
The effect of initial pH on the maximum O.D. and specific growth rates of B. infantis ATCC 15697 and B. bifidum PRL 2010. Maximum O.D. of B. infantis ATCC 15697 (a), specific growth rate of B. infantis ATCC 15697 (b), maximum O.D. of B. bifidum PRL 2010 (c), specific growth rate of B. bifidum PRL 2010 (d).

B. bifidumB. infantis와 다르게 pH 5.5 에서도 pH 6.5와 동일한 최대균체농도와 비성장속도를 유지하였다. 이후 pH 4.0과 pH 2.0에서는 최대균체농도가 동일하게 20% 수준으로 감소하였다. 비성장속도 또한 pH 4.0 보다 낮은 영역에서 급격하게 감소하였다. pH 4.0에서는 pH 6.5의 25% 수준으로 감소하였고 pH 2.0에서는 B. infantis와 동일하게 세포성장이 관찰되지 않았다 (Fig. 3(c), (d)). 즉, 최대균체농도와 비성장속도가 유지되는 범위는 pH 5.5~6.5인 것을 확인할 수 있었으며 2.0~4.0 수준의 낮은 pH 구간에서의 B. infantis의 성장은 B. bifidum보다 pH의 영향을 많이 받는 것을 알 수 있었다. 실험 결과를 바탕으로 유가식 배양에서 B. infantisB. bifidum의 세포활성도 및 성장을 최대화하기 위해서 pH는 6.5로 조절되는 것이 적절할 것으로 사료된다.

3.4. 온도의 변화가 세포의 성장에 미치는 영향

온도는 세포 내 대사활동에 영향을 주어 미생물의 성장과 발달에 영향을 주는 주요 환경인자로 [23,24] 온도가 B. infantisB. bifidum의 성장에 미치는 영향을 알아보기 위해 배양조건은 동일하게 유지하고 배양 온도를 각각 25oC, 30oC, 33oC, 37oC, 40oC, 45oC로 하여 배양하였다. 이때 B. infantis의 최적의 발효 온도는 37℃로 관측되었는데 37oC부터 25oC까지 온도가 감소할수록 최대균체농도와 비성장속도는 온도에 비례하여 감소하였다 (Fig. 4(a), (b)). 25oC에서 B. infantis를 배양한 경우 37oC에서와 비교하여 최대균체농도는 1% 수준, 비성장속도는 15% 수준으로 감소하였다. 온도를 증가시킨 경우 역시 세포의 성장은 감소하였는데, 40oC에서는 37oC보다 최대균체농도가 15.23에서 약 7% 정도 감소하여 유사한 수준의 세포 성장을 보였으나, 45oC에서 배양한 경우 비성장속도가 40% 수준으로 감소하였다.


Fig. 4. 
The effect of temperature on the maximum O.D. and specific growth rates of B. infantis ATCC 15697 and B. bifidum PRL 2010. Maximum O.D. of B. infantis ATCC 15697 (a), specific growth rate of B. infantis ATCC 15697 (b), maximum O.D. of B. bifidum PRL 2010 (c), specific growth rate of B. bifidum PRL 2010 (d).

또한 온도는 B. bifidum의 성장에도 밀접한 영향을 주었는데, 37oC부터 25oC까지는 온도에 비례하여 최대균체농도 및 비성장속도가 감소하여 25oC에서의 최대균체농도는 37oC인 경우와 비교하여 25%, 비성장속도는 37% 수준에 그쳤다. 발효 온도를 상승시켜 40oC에서 B. bifidum을 배양한 경우 비성장속도와 최대균체농도가 감소하지 않고 약 10%의 증가를 보여 B. infantis 보다 열에 내성이 강한 모습이 관측되었다. 45oC에서 배양하였을 경우 최대균체농도와 비성장속도는 각각 37oC의 63%, 80%로 감소하였으나 역시 B. infantis 보다 감소 폭이 작음을 알 수 있었다. (Fig. 4 (c), (d)). 실험 결과를 바탕으로 유가식 배양의 온도는 37oC가 적절할 것으로 사료되며, 유사하게 P.H.P. Prasanna 등 (2012)은 B. infantis NCIMB 702205와 B. longum subsp. infantis CCUG 52486의 생균수에 대한 온도의 영향을 관찰하였을 때 두 균주 모두 37oC에서 최대 성장을 보였다고 보고하였다 [25].

3.5. 세포활성도 측정을 위한 회분식 및 유가식 배양

B. infantis의 회분식 배양 시 20 g/L의 포도당은 24시간에 모두 소모하였고 포도당의 소모 후 배지의 질소원 혹은 발효 산물인 에탄올, 초산들을 이용한 추가 성장은 관측되지 않았다 (Fig. 5(a)). 대수기에서 생균수 (viable cell count)는 흡광도를 이용하여 측정된 세포 농도에 비례하여 증가하여 후기 대수기에 5.0 × 108 CFU/mL에 이르렀다. 단위 세포농도 (단위 흡광도)당 생균수 (생균수/O.D.)는 초기 대수기에서 1.0 × 108 CFU/mL/O.D.였으나, 발효가 진행됨에 따라 0.8 × 108 CFU/mL로 감소한 후 대수기 구간에서 일정하게 유지되었다. 그러나, 포도당의 완전 소모 후 정체기 (stationary phase)에서 흡광도 기준 세포 농도는 O.D. 9.1로 일정하게 유지되었으나 생균수는 0.7 × 108 CFU/mL로 1/7 수준으로 감소하였고 흡광도 당 생균수 또한 0.08 × 108 CFU/mL/O.D.로 1/10 수준으로 감소하였다 (Fig. 5(a)). B. infantis의 유가식 배양에서도 이와 비슷한 양상이 나타났다. 대수기에서 O.D.값이 증가함에 따라 생균수도 증가하였으며 일차로 20 g/L의 포도당을 소모한 이후 추가로 포도당이 공급되었으나 세포 농도 (O.D.)는 증가하지 않았고 포도당의 소모도 관측되지 않는 정체기 (stationary phase)가 유지되었다. 이 구간에서 세포 농도는 증가하지 않았으나 젖산의 생성이 일시적으로 증가하였다. 발효 28시간 이후에는 균체 흡광도 및 젖산의 농도 또한 변화하지 않는 상태가 24시간 지속되어 B. infantis의 발효 후 활성 안정성이 관측되었다. 젖산의 생성이 일시적으로 증가한 구간과 젖산의 생성이 유지되는 구간 모두 생균수는 대수기의 1/3 이하인 1.5~1.8 × 108 CFU/mL로 감소하였고, 흡광도 당 생균수 또한 회분식 발효와 유사하게 0.08 × 108 CFU/mL/O.D.로 감소하였다 (Fig. 5(b)).


Fig. 5. 
Glucose utilization and substrate production (symbol: ●: glucose, ▽: acetate, ◇: lactate, △: ethanol, :optical density at 600nm) and viable-cell counts for each O.D. in the batch (a) and fed-batch fermentation (b) by B. infantis ATCC 15697.

B. bifidumB. infantis와 다른 양상을 보였는데, 회분식 발효의 대수기에서 균체 흡광도가 증가함에 생균수도 증가하여 중간 대수기에서 최고 생균수인 34 × 108 CFU/mL를 나타냈으며, 흡광도 당 생균수도 8.0 × 108 CFU/mL/O.D.로 가장 많았다. 그러나 후기 대수기로 진행됨에 따라 균체 흡광도가 증가하여도 생균수는 감소하는 현상을 보였고 이에 따라 흡광도 당 생균수도 4.0 × 108 CFU/mL/O.D.로 약 50% 감소하였다. 그러나, 정체기 (stationary phase)에서 B. infantis와 달리 생균수 및 흡광도 당 생균수의 급격한 감소는 관측되지 않았다 (Fig. 6(a)). B. bifidum의 유가식 배양에서도 이와 유사한 현상이 관측되었다. 대수기에서 균체 흡광도의 증가에 따라 생균수 또한 증가하였으나 특정 생균수에 도달하면 배지의 포도당 농도 혹은 균체 흡광도에 상관없이 그 값을 유지하였다. 유가식 배양에서 관측한 최대 생균수는 50 × 108 CFU/mL였다. 배지의 포도당 농도가 10 g/L이하로 소모되어 추가로 포도당을 공급하여 20~40 g/L 농도를 유지하였고 24시간이 지난 발효 후반에 포도당을 추가로 공급하여 높은 포도당 농도를 유지하였다. 모든 경우 일차로 포도당을 공급한 경우 균체 흡광도는 증가하였고 젖산 및 초산도 원활하게 생산되었으나 발효 16시간 이후 젖산의 농도가 40 g/L 이상에 도달하며 포도당의 농도가 유지되어도 균체 흡광도는 감소하였다. 이 후의 구간에서는 균체 흡광도 증가는 회복되지 않았으나 젖산과 초산은 소량이지만 꾸준히 생성되었다. 생균수는 중간대수기 (mid-exponential phase)에서 최대값을 보인 이후 균체 흡광도가 증가함에도 생균수는 증가하지 않았다. 또한 이후 젖산의 영향으로 균체 흡광도가 감소하는 상황에서도 생균수는 42~48 × 108 CFU/mL로 중기 대수기 값의 90% 수준을 유지하였다. 흡광도 당 생균수 또한 동일한 경향을 보이며 최대 생균수에 도달한 발효 12시간 이후 5.0~8.0 × 108 CFU/mL/O.D.를 유지하여 안정된 세포 활성도를 보였다 (Fig. 6(b)).


Fig. 6. 
Glucose utilization and substrate production (symbol: ● :glucose, ▽ :acetate, ◇ :lactate, △ :ethanol, :optical density at 600 nm) and viable-cell counts for each O.D. in the batch (a) and fed-batch fermentation (b) by B. bifidum PRL 2010.

B. infantis의 경우 포도당의 농도가 감소하거나 다른 요인에 의하여 세포성장이 정체된 경우 에너지 대사는 이루어지더라도 생균수가 상당량 감소하였는데, 특히 유가식 배양이 후반으로 진행될수록 생균수 및 흡광도 당 생균수의 감소가 두드러져 적절한 시기에 발효를 중단하고 세포들을 회수하는 것이 생균수 유지에 중요한 공정변수임을 알 수 있었다. B. bifidum의 경우 대수기에 최대 생균수에 도달하면 흡광도에 의한 균체농도 변화에 상관없이 일정한 생균수와 흡광도당 생균수를 유지하여 발효에 의한 대량생산에 유리한 세포활성도를 가지는 것으로 나타났다. 그러나 유가식 배양을 지속적으로 유지해도 생균수 자체는 증가하지 않으므로 일정한 시간에 발효를 중단하는 것이 생산성 증대에 유리할 것으로 생각된다.


4. CONCLUSION

본 연구에서는 유아에게 중요한 장내 미생물인 B. infantisB. bifidum의 산업적 이용을 위한 최적의 조건을 찾기 위해서 환경인자가 세포의 성장에 미치는 영향과 고농도의 장기간 회분식 및 유가식 배양 시 세포 활성도의 변화를 관찰하였다. 성장률과 성장속도 모두를 만족시키는 초기 포도당의 농도는 20~40 g/L가 적절하였으며, 젖산은 0 g/L에 가까울수록 성장에 도움이 되었고, B. infantis의 경우 젖산 농도 증가에 세포 성장이 민감하게 반응하였다. 또한 pH 6.5이고 온도가 37oC일 때 두 균주 모두 높은 성장 활성을 나타냈다. 또한 세포 활성도를 확인하기 위한 회분식 및 유가식 배양을 통해서 B. infantis에 비해 B. bifidum이 최대 생균수에 도달하였을 때 균체농도의 변화에 상관 없이 일정한 생균수 및 흡광도 당 생균수를 유지하여 산업적으로 발효 대량생산에 유리한 세포 활성도를 가지는 것으로 판단된다. 결론적으로 Bifidobacterium sp.의 효율적인 성장과 활성도가 높은 세포를 얻기 위해서는 최적화된 조건 내에서 적절한 시기에 발효를 중단하고 세포들을 회수하여 생균수를 유지하는 것이 생산성 증대에 중요한 공정 변수로 사료된다.


Acknowledgments

본 연구는 충남대학교 학술연구지원사업 자체연구과제의 지원으로 진행되었습니다.


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