The Korean Society For Biotechnology And Bioengineering

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Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 35 , No. 2

[ Review Paper ]
Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 35, No. 2, pp.95-104
Abbreviation: KSBB J
ISSN: 1225-7117 (Print) 2288-8268 (Online)
Print publication date 30 Jun 2020
Received 24 Feb 2020 Revised 12 Mar 2020 Accepted 19 Mar 2020
DOI: https://doi.org/10.7841/ksbbj.2020.35.2.95

고형암을 표적으로 한 CAR-T 치료법
권미지 ; 박희호*
강원대학교 생물공학과

CAR-T Therapy Targeting Solid Tumor
Miji Kwon ; Hee Ho Park*
Department of Biotechnology and Bioengineering, Kangwon National University, Chuncheon 24341, Korea
Correspondence to : *Department of Biotechnology and Bioengineering, Kangwon National University, Chuncheon 24341, Korea Tel: +82-33-250-6271; Fax: +82-33-259-5546 E-mail: hhpark@kangwon.ac.kr


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Abstract

The chimeric antigen receptor (CAR) is a receptor that introduces the specificity of the immune cell to the tumor. CAR was first developed in the mid-1980s. CARs have evolved from first-generation CARs to fourth-generation CARs. Generally, CAR-T is made by separating and activating T cells from the patient's blood and then using virus vectors to form CARs. CAR-T has successful clinical results in the treatment of hematologic malignancies, and there are U.S. FDA-approved drugs. Although solid tumor research is being actively conducted, the results of clinical trials on solid tumor are still not as expected. Therefore, it is necessary to study CAR-T therapy, especially efficacy and stability of CAR-T cells against solid tumors.


Keywords: chimeric antigen receptor (CAR), CAR-T cell, hematologic malignancy, solid tumor, clinical trial

1. INTRODUCTION

키메라 항원 수용체 (chimeric antigen receptor, CAR)는 항체에서 파생된 세포 외 항원 인식 도메인인 scFv와 막횡단영역, 세포 내 T 세포 활성화 도메인인 CD3ζ가 포함되어 CAR의 구조를 이루고 있는 것을 의미하며, 1980년대 중반에 처음 개발되었다 [1,2]. 이러한 scFv는 T 세포가 종양 항원에 결합할 수 있도록 하고, CD3ζ 타이로신기반면역수용체활성화모티프 (immunoreceptor tyrosine-based activation motifs, ITAM) 도메인으로부터 파생된 세포 내 도메인을 통해 T 세포가 활성화된다. CAR의 유전적 구조를 완성하기 위해 일반적으로 CD8α와 면역글로불린으로부터 나온 힌지(hinge)와 막횡단 영역을 이용하여 세포 외 scFv와 세포 내 CD3ζ ITAM 도메인으로 연결된다 [3].

CAR의 구조는 TCR (T cell receptor)과 유사하지만, CAR의 scFv는 MHC (major histocompatibility complex)와 무관하게 TAA (tumor associated antigen)를 인식하고 단백질, 탄수화물 등을 포함하여 종양 세포 표면에 발현되는 다양한 항원을 표적으로 한다. 암에 의한 주요 면역 기피 메커니즘이 종양 세포에 의한 MHC-관련 항원 제시의 상실이기 때문에, MHC 제한으로부터 독립적인 CAR 인식은 근본적인 항암효과에 이점을 부여한다 [4,5]. 또한 종양 항원 인식 시 TCR에만 의존하는 기존 T 세포와는 달리, CAR-T 세포는 MHC 비의존적 방법으로 세포 표면 종양 항원을 인식하여 항원 특이적 T 세포 활성화, 증식, 사이토카인 생성, 종양 제거로 이어지는 능력을 가진다 [6,7].

CAR를 이용한 항원 표적화는 CAR 설계에서 중요한 문제이다. 일반적으로 CAR에 의한 표적 인식은 단일클론항체로 부터 조립된 scFv를 이용한다. CAR에 의한 종양 사멸은 악성 세포에서만 발현되며 종양 세포 생존에 중요한 항원에 대한 인식을 필요로 한다. 이러한 항원은 종양 생존에 중요하기 때문에 면역 반응에서 벗어날 수 없다. 그러나 대부분의 항원의 경우 발현이 종양 세포에만 국한되지 않고 정상 조직에서도 발현된다. CAR로 변형된 T세포는 표적 세포 표면에서 발현되는 항원만을 인식할 수 있다 [8,9].

CAR-T 세포 치료법은 환자 또는 기증자의 T 세포를 특정하게 표적화하고 종양 세포를 파괴하도록 설계되어 있다. CAR-T에 대한 연구가 활발하게 이루어지고 있는데, 항암치료를 위한 CAR-T 세포 치료법의 임상시험은 대부분 B세포 급성 림프구성 백혈병 (acute lymphocytic leukemia, B-ALL), 만성 림프구성 백혈병 (chronic lymphocytic leukemia, CLL), 소포림프종 (follicular lymphoma), 미만성 거대 B세포 림프종 (diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL), 외투세포림프종 (mantle cell lymphoma, MCL)과 같은 CD19 양성 혈액암 환자들을 대상으로 이루어졌다 [10].

본 논문에서는 1세대부터 4세대까지 이르는 CAR-T 치료법에 대해 설명하고 CAR-T 제작 방법과 메커니즘, CAR-T 치료법의 한계점에 대해 집중적으로 기술하였다. 또한 임상 시험을 바탕으로 CAR-T 치료법의 동향에 대해 서술하고, 특히 고형암을 표적으로 하는 CAR-T에 대해 소개하였다.


2. RESULTS AND DISCUSSION
2.1. Evolution of CAR-T
2.1.1. Generation of CAR

CAR의 구조는 1세대에서 4세대로 발전하였다. 1세대 CAR는 CD3ζ 신호 전달 도메인 (signaling domain)만을 포함하고 2세대 CAR는 CD3ζ와 공동 자극 도메인 (costimulatory domain) 하나를 포함하며, 3세대 CAR는 CD3ζ와 공동 자극 도메인 2가지를 포함한다. 4세대 CAR의 경우 가장 최근 개발되었으며, 2세대 CAR에 IL-12를 추가한 구조이다 (Fig. 1).

1세대 CAR-T에 대한 일반적인 특성은 내인성 (endogenous) T 세포 수용체 (TCR)로부터의 신호에 대한 1차 트랜스미터인 CD3ζ로부터 나온 단일 구조이다 [11,12]. 초기 in vitro 연구는 CD3ζ로만 구성된 세포 내 신호 전달 도메인을 가지는 CAR를 이용한 연구로, CAR로 유전자 표적화된 T 세포가 활성화와 표적 사멸을 입증하였다 [2]. 그러나 1세대 CAR-T 세포는 충분한 인터루킨-2(IL-2)를 생산하지 못하므로, 종양 세포를 죽이기 위해서는 IL-2를 투여하는 과정을 필요로 하였다 [13]. 또한 1세대 CAR-T 세포는 생체 내 짧은 수명, 불충분한 사이토카인 분비의 단점을 가지고 있어 항암 효능이 제한적이었다 [14].


Fig. 1. 
Generation of CAR-T. The structurer of CAR has evolved from first to fourth generation. First-generation of CAR involved only the CD3ζ signaling domain. Second-generation of CAR has CD3ζ and 4-1BB or CD28 costimulatory domains. Third generation of CAR has CD3ζ plus 4-1BB, CD28 costimulatory domains. Fourth-generation of CAR by adding IL-12 to the second-generation of CAR [28].

2세대 CAR-T는 다양한 공동 자극 단백질 수용체로부터 CAR의 세포질 꼬리까지 세포 내 신호 전달 도메인 CD28, CD134 (OX40), 또는 CD137 (4-1BB)을 추가하여 생체 내에서 CAR-T 세포의 증식, 세포독성, 지속적인 반응, 수명 연장 등을 향상시켰다 [15]. 이 때, 2세대 CAR에서 가장 일반적으로 사용되는 공동 자극 수용체는 CD28로, CD28은 IL-2 분비를 촉진하고 T 세포 활성을 향상시키기 위한 목적으로 사용된다. CD28 매개 공동 자극은 림프구의 생존과 증식 규제에 중요하며, 기억 세포와 주효 세포의 확립에 중요한 역할을 한다. OX40의 경우 IL-2의 생산을 강화하고 증식을 지속시킬 수 있다. 4-1BB는 T세포의 반응 신호를 유지할 수 있으며, 이는 T 세포의 생존과 CD8+ 세포의 기억에 중요한 역할을 한다. 2세대 CAR-T를 이용한 임상시험에서 1세대 CAR-T를 이용하였을 때보다 더 좋은 결과를 달성하였다 [2,16].

3세대 CAR는 2세대 CAR 구조인 CD3ζ-공동 자극 도메인 (예를 들어, CD28)에다가 신호 전달 능력을 향상시키기 위해 OX40 또는 4-1BB와 같은 공동 자극 도메인을 결합시킨 형태이다. 이러한 3세대 CAR는 강력한 사이토카인 생산과 종양 사멸 능력을 증대시킴으로써 만들어졌다 [17]. 전임상 시험 연구에서 3세대 CAR-T 세포는 2세대 CAR-T 세포에 비해 우수한 항암 효과가 나타났다 [18,19]. 그러나 3세대 CAR-T보다는 2세대 CAR-T가 더 임상시험에 많이 이용된다. 이는 3세대 CAR-T의 활성화 역치가 감소함에 따라 정상 조직에 대해 부작용이 발생할 수 있으며 [20], 3세대 CAR-T를 이용한 임상시험에서 심각한 사이토카인 방출 신드롬 (cytokine release syndrome, CRS)이 관찰된 사례가 존재하기 때문이다 [32].

4세대 CAR는 2세대 CAR 구조에 IL-12를 추가하였는데, 이는 T세포에 보편적인 사이토카인 매개 사멸 (T cell redirected for universal cytokine-mediated killing, TRUCKs)을 위해 리디렉션(redirection)된 것으로 알려져 있다 [21]. TRUCK는 표적 질병에서 항원 음성 암세포를 제거하기 위해 T 세포 활성화를 강화하고 선천적 면역세포를 활성화한다 [22]. IL-12의 축적은 국소 종양 병변에서 NK 세포와 대식세포(macrophage)와 같은 선천적 면역세포를 활성화하기 위한 중요한 방법이다 [23,25]. IL-12는 heterodimeric 단백질로, 세포 내 병원균에 반응하여 대식세포와 수지상 세포(dendritic cell)에 의해 분비된다. 4세대 CAR로 인한 IL-12 분비는 종양 부위로의 NK 세포와 대식 세포의 침투로 이어지기 때문에 결과적으로, 항암 효과를 향상시킨다 [23,26,27].

2.1.2. CAR-T 임상시험

여러 연구에서 1세대 CAR-T 세포의 항암 효과에 대해 평가하였지만 1세대 CAR-T 세포를 이용한 초기 임상 시험의 경우 유의미한 결과가 보고되지 않았다. Lamer와 공동연구자들은 전이성(metastatic) 신장암 환자 11명을 대상으로 피하 IL-2 유무에 상관없이 CD3ζ 엔도도메인을 포함하는 1세대 anti-CAIX (carbonic anhydrase IX) CAR를 이용하여 임상시험을 진행하였다. 그 결과 8명의 환자 중 5명에게서 CAR-T 세포의 주입 후 간 독성의 부작용이 보고되었는데, 이는 CAR-T 세포를 통해 표적화된 담관 상피 세포에서의 낮은 CAIX 발현 수준이 원인이었다. 또한 CAR-T 세포 주입 전, anti-CAIX mAb를 투여받지 않은 3명의 환자에게서는 간 독성이 나타나지 않았다 [29]. 주입된 T 세포의 지속성은 모든 환자에 게서 제한적이었고, 객관적인 임상 반응이 관찰되지 않았다.

2010년에 개발된 2세대 CAR-T 세포의 응용에 기초한 초기 임상 시험은 B 세포 악성 종양에 초점을 두었다. Salvoldo와 공동연구자들은 유전적으로 변형된 anti-CD19 CAR-T 세포를 이용하여 6명의 재발 또는 난치성 비호지킨 림프종 (non-Hodgkin’s lymphoma) 환자를 대상으로 임상시험을 진행하였다. 환자는 림프구 제거 없이 1세대, 2세대 CAR-T의 혼합물로 치료를 진행하였다. 그 결과 2세대 CAR가 1세대 CAR에 비해 더 높은 지속성, 팽창을 보여주었다 [30]. Brentgens와 공동연구자들은 8명의 만성 림프구성 백혈병 (chronic lymphocytic leukemia) 환자와 1명의 급성 림프구성 백혈병 (acute lymphocytic leukemia) 환자를 대상으로 CAR-T 세포를 이용하여 치료를 진행하였다. T 세포 주입 전 사이클로포스파미드 (cyclophosphamide, CP)를 이용한 림프구 제거 화학요법 (lymphodepletion chemotherapy)을 받은 6명의 환자에게서 변형된 CAR-T 세포의 지속성이 향상된 것이 관찰되 었다. CLL 환자 4명 중 3명은 화학요법과 CP로 치료받은 후 변형된 CAR-T 세포 주입에 대한 반응이 나타났다. ALL 환자의 경우에는 B 세포 무형성증이 나타났다. 임상시험 결과, 변형된 CAR-T 세포는 질병 부위로의 효율적인 이동을 보였고 전달 이후에도 ex vivo에서 항암 기능을 유지하였다 [31].

Morgan과 공동연구자들은 대장암 환자 1명을 대상으로 CD28-과 4-1BB를 포함하는 3세대 CAR-T를 이용하여 ERBB2 (erb-b2 receptor tyrosine kinase 2)를 표적으로 임상시험을 진행하였다. 그 결과 환자는 변형된 T 세포 주입 5일 후 사망하였다. 종양 표적화된 T 세포가 폐 상피에 존재하는 ERBB2를 인식하여 궁극적으로 환자를 사망에 이르게 하였다 [32]. Till과 공동연구자들이 진행한 임상 연구에서는 외투세포림프종 (mantle cell lymphoma) 혹은 여포성 비호지킨 림프종 (follicular non-Hodgkin’s lymphoma) 환자 4명을 대상으로 CD20을 표적으로 하는 3세대 CAR-T (CD28, 4-1BB 포함)를 이용하여 치료하였다. 2명의 환자는 12개월과 24개월동안 아무런 진전이 일어나지 않았으며, 3번째 환자에게서 12개월 후 객관적인 부분 완화가 관찰되었다 [33].

4세대 CAR-T의 경우 가장 최근에 개발된 것으로, in vitro와 동물 모델에서 항암 기능을 밝혀내고 있다. Koneru와 공동연구자들은 난소 종양 세포의 표면에서 과발현하는 MUC-16ecto 항원을 표적으로 하는 4세대 CAR-T(4H11-28z/IL-12)를 디자인하였다. 이 연구에서 인간 난소암 이종이식을 진행한 SCID-Beige 쥐를 이용하여 IL-12가 분비되는 4H11-28z CAR-T 세포에 대한 항암 효과를 검사하였다. 4H11-28z/IL-12 CAR-T 세포와 4H11-28z CAR-T 세포를 비교하여 실험을 진행하였을 때, 4H11-28z/IL-12 CAR-T 세포가 IFNg 분비 증가 및 증식 속도가 향상된 것이 관찰되었다 [64]. 또한 Kerkar와 공동 연구자들은 항원 특이적 T 세포(pmel-1)를 이용하여 종양 부위로 murine IL-12의 국소 전달을 통해 B16 종양 치료를 향상시키는 것을 쥐 모델로 확인하였다. 그러나 발현된 IL-12의 항증식 효과로 인해 IL-12 transduced pmel-1 murine T 세포가 다수로 증식될 수 없었으며, 5 × 105 이상의 T 세포 투여는 심각한 독성과 동물의 사망을 유발하였다 [25,27].

2.2. CAR-T 제작

CAR-T 세포를 제작하기 위해서는 몇 가지 단계가 필요하다 (Fig. 2). 첫 번째, 백혈구분리반출법 (leukapheresis 또는 aphresis)을 이용하여 환자 혹은 기증자의 몸에서 백혈구를 분리한다. 두 번째, 충분한 수의 백혈구를 모은 후, T 세포를 농축하는 과정을 거친다. 이때, 백혈구분리반출법에서 사용한 완충액에 혈액응고 방지제가 들어있기 때문에 이를 제거하기 위하여 세포를 세척하는 과정을 거친다. 세 번째, T 세포는 CD4/CD8 구성 수준에서 특정 항체 비드 결합체나 마커를 사용하여 분리된다. 이 과정에서 환자나 기증자로부터의 항원제시세포 (antigen presenting cell, APC), anti-CD3/anti-CD28 단일 클론항체로 코팅된 비드 (bead)나 anti-CD3 항체 단독 또는 배양보조세포와 IL-2와 같은 성장인자가 조합된 비드를 정제하는 과정이 필요하다 [2].


Fig. 2. 
CAR manufacturing process. CAR-T is made by separating and activating T cells from the patient's blood. And then, transport cells to the laboratory for modification and manufacturing. Finally, T cells with engineered CAR are injected into the patient [38].

분리한 T 세포를 확보한 다음, CAR를 환자의 T 세포에 발현시킨다. CAR는 바이러스 벡터에 인코딩되어있다. 바이러스 벡터는 T 세포에 처리해서 세포 내 유전자 전달 과정을 거친다. 이 때, 바이러스 벡터는 환자 T 세포에 부착되어 들어갈 때, RNA의 형태로 CAR가 인코딩되어있는 유전물질을 도입한다. RNA는 DNA로 역전사효소 (reverse transcriptase)에 의해 역전사되고 환자 T 세포의 게놈에 통합되므로, 세포가 분열하면서 CAR 발현이 유지되고 늘어난다. 그 후 환자 세포에 의해 CAR가 전사, 번역되어 세포 표면에서 CAR가 발현된다 [34]. 이 때, 임상 시험에서 주로 감마 레트로바이러스 (gamma retrovirus)보다 렌티바이러스 (lentivirus) 벡터를 이용하는데, 이는 렌티바이러스 벡터의 안전한 통합 부위프로파일 (integration site profile) 때문이다 [35]. 그 다음, 제작한 CAR-T 세포를 배양한 후, 환자에게 주입한다. 이때 CAR-T 세포 주입 전, 환자는 백혈구 수치를 낮추기 위해 림프구 제거 조절 화학요법 (사이클로포스파미드, 플루다라빈 (fludarabine) 등을 이용)을 받는다.

외래 유전자를 인간 세포로 전달하는 방법으로는 바이러스 시스템과 비바이러스 시스템을 이용하는 방법이 있다. 기초 연구와 임상 연구에서 유전자 치료법의 주요 벡터는 바이러스이다. 이는 바이러스 시스템을 이용할 경우 높은 전달 효율, 배양된 T 세포가 필요한 수만큼 도달하는데 상대적으로 짧은 시간이 필요하다는 점, 다른 발현 특성을 가지는 다양한 바이러스의 가용성 등의 특징을 가지기 때문이다. 대부분의 바이러스 시스템은 유용한 세포의 유전자를 수용할 수 있고 벡터가 포함된 전염성 바이러스 입자의 생성을 위해 바이러스 구조적 효소와 단백질을 제공할 수 있다. 그러나 이러한 바이러스 벡터의 경우 잠재적인 위험을 초래할 수 있다. 면역반응을 유도하는데 사용되는 삽입 돌연변이의 경우 종양 형성과 독성을 유발할 수 있으며, 운반 능력이 제한되고 달성된 역가가 충분하지 않을 수 있다. 따라서 현재 바이러스 시스템 외에도, 비바이러스 시스템으로서 sleeping beauty transposon 시스템 또는 mRNA 형질주입 방법을 포함한 다른 유전자 전달 방법들이 연구되고 있다 [36,37].

2.3. CAR-T 메커니즘과 지속성
2.3.1. CAR 메커니즘

CAR-T 세포는 MHC 독립적인 방법으로 특정 종양 항원을 인식한다 [39]. CAR가 특이적으로 TAA에 결합하면, T 세포는 ITAM의 인산화를 통해 활성화된다. 이후, T 세포의 증식과 세포독성, 사이토카인 분비를 유도하고, CD8+와 CD4+ T 세포를 포함한 원래의 T 세포는 환자의 말초 혈액 또는 종양조직으로부터 분리된다. 일반적으로 CD8+ T 세포는 종양에 대한 면역 반응에 중요한 역할을 하며, CD4+ T 세포는 CD8+ T 세포 매개 세포독성의 효율을 향상시키는 데 도움을 줄 수 있다 [40,42].

활성화된 CAR T 세포는 2개의 경로를 통해 세포 독성을 일으킨다. 1) Fas/Fas-ligand (Fas-L) 또는 TNF/TNF-R을 통한 사멸 수용체 신호의 활성화 2) 퍼포린 (perforin)과 그란자임 (granzyme) 과립 (granules)의 분비. CD8+ T 세포는 이러한 두 가지 경로를 통해 종양 세포를 사멸에 영향을 미친다 [43]. CAR-T 세포의 기능을 강화하기 위해 다양한 방법이 사용되어왔는데 이때, 다중 신호 수용체를 가진 CAR-T 세포는 in vitroin vivo에서 항원 유도성 세포 사멸 (AICD)의 감소뿐만 아니라 T 세포의 증폭, 사이토카인 생산, 세포독성을 향상시킬 수 있다는 것이 증명되었다 (Fig. 3) [44].


Fig. 3. 
Antitumor mechanism of CAR-T. CAR-T cells can recognize the tumor antigen. T cells were activated by cytokine secretion, cytotoxicity, and T cell proliferation. Then, T and CAR-T cells perform cytotoxicity through secretion of perforin, granzyme granules and activation of death receptor pathway Fas/Fas-ligand [42].

효과적인 종양 제거를 위해서 유전적으로 변형된 T 세포는 CAR-T 세포가 종양 세포를 표적으로 할 수 있는 종양 부위로 이동해야 한다. 실제로, 종양 부위로의 빈약한 T 세포의 이동은 CAR-T 세포에 기초한 입양 면역 요법의 효율 감소의 주된 원인이다. 반대로, 종양 부위로의 CAR-T 세포 축적과 CAR-T 세포의 지속성은 효과적인 종양 제거의 주요 원리이다.

2.3.2. CAR 지속성

CAR의 효능을 높이기 위해서는 지속성을 증가시켜야 한다. 주입된 T 세포의 열악한 생존은 입양 T 세포 면역요법의 효능을 제한한다. 유전적으로 변형된 T 세포는 완전하고 성공적인 종양 제거를 위해 충분한 시간 동안 생존해야만 한다. 따라서 항암 반응의 효능은 주입된 T 세포의 지속성과 관련 있을 수밖에 없다 [45].

여러 연구를 통해 1세대 CAR-T의 경우 지속성이 낮다는 것을 증명하였으며, 이를 극복하기 위해 2세대, 3세대 CAR가 개발되었다. 2개 이상의 공동 자극 도메인을 갖는 CAR-T 세포의 활성화는 주입된 T 세포의 지속성을 향상시킬 수 있다. 게다가 CAR-T 세포 주입 전 시행하는 림프구 제거 화학요법은 숙주 환경의 변형을 통해 CAR-T 세포의 지속성을 향상시킬 수 있다 [46]. 이러한 전처치 화학요법 (conditioning chemotherapy)은 조절 T 세포 (Treg)와 골수성 세포 (myeloid cell)와 같은 억제 세포를 제거하여, CAR-T 세포의 지속성을 향상시키고 환자의 종양 크기 (tumor burden)를 줄일 수 있다 [23]. 또한 환자의 종양 크기와 CAR-T 세포 지속성은 서로 상관관계가 있다는 것이 확인되었다. Park와 공동 연구자들은 6명의 신경모세포종 환자를 대상으로 L1-CAM (L1-cell adhesion molecule; CD171)을 표적으로 하는 1세대 CAR-T 세포를 이용하여 임상시험을 진행하였다. 그 결과, 종양 크기가 큰 환자에 비해 크기가 작은 환자에서 T 세포의 생존력이 더 증가한 것을 관찰하였다 [55]. 이 밖에도 변형된 T 세포의 지속성을 향상시키기 위한 또다른 접근법은 IL-2를 투여 하는 것이다. IL-2와 IL-15와 같은 일부 사이토카인의 생성은 수용체를 과발현시켜 CAR-T 세포의 지속성을 향상시킨다 [47]. 결론적으로 공동 자극 신호 전달, 전처치 화학요법, 환자의 종양 크기, 사이토카인 보충 등은 주입된 T 세포의 지속성을 향상시킬 수 있다.

2.4. 고형암을 표적으로 한 CAR-T
2.4.1. 혈액암과 고형암에서의 CAR-T 치료법

CAR-T 세포의 전이는 혈액암 치료에 놀라운 성공을 보여주었다. 특히 지난 몇 년 동안 B세포 급성 림프구성 백혈병(B-ALL), B세포 비호지킨 림프종(BNHL), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 호지킨 림프종(HL) 등 B세포 악성종양에 대한 CAR-T 치료법을 평가하기 위한 여러 기관의 임상시험이 진행되었다. CAR-T는 혈액암뿐만 아니라 고형암 치료에 대해서도 활발하게 연구되고 있으며, 다양한 병증에 적용가능하다 (Fig. 4).


Fig. 4. 
Tumor-associated antigens targeted in CAR-T therapy. CAR-T therapy is applicable to a variety of diseases. NSCLC, non-small-cell lung carcinoma; RCC, renal cell carcinoma [22].

혈액암 치료에 성공적인 임상시험이 보고되는 가운데, 고형암에 대한 임상시험 결과는 기대에 미치지 못했다. 현재까지 보고된 임상시험 중 결과가 긍정적이었던 실험으로는 GD2 CAR를 사용하여 신경모세포종 치료 (11명 중 3명 완전 완화) [48], HER2를 이용한 육종 치료 (17명 중 4명 안정) [49], HER1을 이용한 폐암 치료 (11명 중 2명 부분관해) [50]를 예로 들 수 있다 [51]. 다음과 같이 혈액암에 비해 고형암에서 CAR-T 치료법에 대한 임상시험이 기대에 미치지 못하는 이유는 고형암과 혈액암의 차이점에서 찾을 수 있다.

혈액암과 고형암의 차이는 다음과 같다. 고혈암은 혈액암과는 다르게, 높고 균일하게 발현되는 특정 종양 항원을 찾는 것이 어렵다. 이러한 종양 항원을 선택하는 것도 중요하지만, 충분한 수의 CAR-T 세포가 말초혈액에서 종양 조직까지 효율적으로 도달할 수 있도록 CAR-T 세포의 지속 기간을 증가시키는 것 역시 필요하다 [52]. 또한 혈액암과는 달리 CAR-T 세포는 잠재적인 T 세포의 케모카인 (chemokine, 백혈구유주작용, 활성화작용을 하는 염기성 헤파린 결합성 저분자 단백질) 수용체/종양 유래 케모카인 불일치에도 불구하고 혈액에서 고형 종양 부위로 이동해야 한다. 그 다음 항원 손실이나 이질성과 무관하게 TAA 특이적 세포독성을 이끌어내기 위해 고형 종양의 기조직의 요소에 들어가야한다.

이러한 침투 후에도, (1) 적대적인 종양 미세환경(TME)의 특징인 산화스트레스, 영양 고갈, 산성 pH, 저산소 (2) 조절 T 세포(Treg)로 명명된 억제 면역 세포, 골수유래 억제 세포 (MDSC), 종양 관련 대식세포(TAM) (3) 억제성 용해 인자와 사이토카인의 존재 (4) 세포질과 표면 억제 수용체의 상향 조절과 같은 T 세포 내 음성 조절 메커니즘으로 인해 T 세포는 빠르게 기능을 잃는다. 마지막으로 CAR-T 세포 자체가 잠재적인 면역원성과 독성을 가질 때 주변 면역 환경에 영향을 미칠 수 있다 [51].

또한 고형암에서 CAR-T의 임상 시험이 어려운 이유는 1) 대부분의 암에서 고유한 종양 관련 항원(TAA)의 부족, 2) 종양 부위에 대한 CAR-T 세포의 비효율적인 trafficking, 3) ex vivo에서 확장된 CAR-T 세포를 전달 이후 지속하거나 증식 불가, 4) 생존 인자와 성장 인자의 부족, 5) 면역억제 분자와 면역억제 세포의 존재, 6) 적대적인 종양 미세환경 등을 들 수 있다 [53].

고형암에서의 CAR-T 치료법의 단점을 극복하기 위해 많은 연구가 이루어지고 있다. 먼저 면역관문억제제(immune checkpoint inhibitor) 병용 요법이 있다. 고형암에서 면역관문 (immune checkpoint)의 발현은 CAR-T 세포의 효율을 상쇄시킨다 [62]. 일부 임상시험 (NCT03030001, NCT03182803-MSLN, NCT03182816, NCT02873390)에서는 CAR-T 치료법에서 PD-L1 (Programmed death-ligand 1)의 발현의 억제 효과를 극복하기 위해, CAR-T 세포에 PD-1 (Programmed cell death protein 1) 우성 음성 수용체 발현 유전자를 첨가하여 세포의 면역관문을 차단하고 항암효과를 증가시키는 연구를 진행하고 있다 [22]. 세포독성 T 림프구 항원 4 (cytotoxic T-lymphocyte antigen 4, CTLA-4), PD-1과 같은 면역관문억 제제의 출현은 흑색종 (melanoma), 폐암 등 많은 고형암 치료에 혁명을 일으켰다. 면역관문억제제 병용 요법의 목표는 임상 반응을 개선하고 독성을 최소화하는 것이다 [63].

다른 방법에는 tumor trafficking 효율을 높여주는 방법이 있다. 종양 부위에 대한 CAR-T 세포의 불충분한 trafficking은 CAR-T 치료법에서 또다른 장애물이 된다. 고형암 부위에서 CAR-T 세포를 증가시키는 방법에는 일반적인 투여방식인 정맥주사가 아닌 종양 부위에 직접적으로 CAR-T 세포를 전달하는 방법과 종양 기질 (stroma)을 분해하는 방법 등이 있다 [53]. HSPCs (heparan sulfate proteoglycans)를 포함한 내피 밑 기저 막 (subendothelial basement membrane)과 세포 외 기질(extracellular matrix, ECM)의 주요 구성성분을 저하시키도록 CAR-T 세포를 변형시켜, CAR-T 세포가 종양 기질에 침투하는 것을 용이하도록 한다. 다음과 같이 변형된 CAR-T 세포는 세포외 기질을 저하시켜 T 세포의 침투 능력과 항암 효과를 증가시킨다는 것을 확인하였다 [66].

세포 내 변형을 통한 내인성 CAR-T 세포의 활성 증가, 종양 미세환경의 세포 및 분자 구성 요소의 표적화 등의 방법을 이용하여 고형암 종양 미세환경에서 CAR-T 세포의 활성을 증가시키는 방법이 있다. 많은 종양에서 T 세포의 활성, 증식, 세포독성을 억제하는 TGFβ (transformation growth factor beta)가 생산된다. 이러한 TGFβ의 세포 내 파괴 (cellintrinsic abrogation)가 T 세포의 지속성과 기능을 향상시킬 수 있음을 동물 모델을 이용하여 증명하였다 [53,65]. 또한 TRUCK를 이용하여 사이토카인을 분비함으로써 억제성 종양 미세환경을 리모델링하는 방법도 연구되고 있다 [22,25].

2.4.2. 고형암에 대한 CAR-T 치료법의 임상 시험

최근 고형암에 대한 임상시험이 활발하게 이루어지고 있다. CAR-T를 이용하여 다양한 고형암 치료법에 대해 연구되고 있으며, 그 중 가장 많이 연구된 고형암으로는 신경모세포종 (neuroblastoma, GD2를 이용), 교모세포종 (glioblastoma, EGFRvIII를 이용), 각종 상피암 (epithelial carcinoma, mesothelin을 이용) 등이 있다 [54].

비록 고형암을 표적으로 하는 CAR-T 치료법은 아직 연구 초기 단계에 있지만, 이미 임상 시험에서 신경모세포종과 같은 고형암에서 항암 효능 활성이 보고되었다. 재발성 신경모세포종 환자 8명과 진행성 신경모세포종 환자 11명을 대상으로 GD2 특이적 CAR-T의 효능을 평가하는 임상 시험이 진행되었다. 진행성 질환 환자의 경우 11명 중 3명은 완전 완화를 달성하였고, 이 임상 시험은 CAR-T 세포의 지속성을 관찰하기 위해 192주까지 관찰하였다 (NCT00085930) [48]. 다른 임상 시험에서는 L1-CAM을 표적으로 하는 CAR-T 세포를 이용하여 전이성 신경모세포종을 치료하였다. 그 결과, 등록된 환자 6명 중 한 명은 치료 후 질병이 안정되는 결과를 달성하였다 (NCT00006480) [55].

교모세포종은 가장 흔하고 악성인 뇌종양이다. 교모세포종은 중추신경계에서 공격적으로 성장하고 현재 치료법은 존재하지 않는다. CAR-T 세포 전임상 연구에서 치료에 대한 가능성이 보고되었으며, 현재 CAR-T를 이용한 교모세포종 임상 시험에서 EGFRvlll, HER2, IL13Rα2 (interleukin 13 receptor α 2)의 3가지 항원을 표적으로 연구가 이루어지고 있다 [56,57]. EGFRvlll CAR의 경우 동물 모델 치료에서 효과를 나타냈으며, 교모세포종 환자를 대상으로 효능을 시험하는 임상 시험이 진행 중이다 (NCT02209376, NCT01454596). 다른 임상 시험 (NCT01109095)에서 HER2 양성 교모세포종을 갖는 CMV 혈청 양성 환자 17명에게 HER2 CMV 이중특이성 CAR-T 세포를 주입하였다. 치료 결과, 심각한 부작용이나 사이토카인 분비 증후군 없었으며 환자 17명 중 7명이 안정되었다. 2015년에는 재발성 교모세포종 환자 3명을 대상으로 IL13Rα2를 표적으로 하는 CAR-T 세포를 이용한 임상 시험이 진행되었다 (NCT00730613). 이 임상시험의 결과로, 관리 가능한 일시적인 중추신경계 염증을 가진 환자 2명에게서 일시적인 항암 효과 활성에 대한 증거가 관찰되었다 [58].

Mesothelin을 표적으로 하는 CAR 임상시험은 중피종 (NCT01355965), 췌장암 (NCT01583686, NCT02465983, NCT02706782), 유방암 (NCT02792114)과 같은 서로 다른 유형의 고형암을 대상으로 이루어졌다. 임상 시험 중 하나 (NCT01355965)에서, 진행성 중피종 환자에게 mesothelin CAR가 암호화된 mRNA로 전기천공된 자가 T 세포를 투여하였다. 시험 결과 종양 부위에서 mesothelin 특이적 CAR-T 세포의 검출과 염증성 사이토카인의 일시적인 상승이 관찰되었다. Mesothelin CAR-T 세포 주입은 심각한 독성없이 진행되었지만, 연구 대상 중 한 명에게서 심각한 과민증과 심장 정지가 보고되었다 [36].

2.5. CAR-T 치료법의 한계

독성에 관한 문제는 CAR-T 세포 기반의 면역치료법에서의 주요 문제이다. 대부분의 CAR는 종양 비특이적 방법으로 종양 세포를 인식한다. 이는 다시 말해서, CAR의 표적은 정상 세포와 비교하여 종양 세포에서 과발현되는 종양 관련 항원 (TAA)이다. CAR-T 세포에 의한 정상 조직의 인식은 on-target/off-tumor 효과를 유발하여 생명을 위협하는 독성을 유발할 가능성이 있다 [6].

ERBB2를 이용한 3세대 CAR-T에 대한 임상시험에서 CART 세포 주입 후 5일만에 사망한 결과가 나타났다. 이는 유전적으로 변형된 CAR-T 세포와 ERBB2의 상호작용으로 인하여 전염증성(pro-inflammatory) 사이토카인이 방출되어, 폐독성, 다기관 기능 상실, 환자의 사망까지 관찰되었다 [32].

또 다른 임상시험에서는 MAGE-A3 특이적 CAR가 발현되도록 유전적으로 변형된 T 세포로 치료받은 8명의 환자 중 2명에게서 신경독성이 보고되었다. 이 결과는 일부 뉴런에서 발현되는 MAGE-12와 종양에서만 발현되는 MAGE-A3 사이의 교차 반응의 결과물로 신경독성이 나타났다고 결론지었다 [59]. 다음과 같은 임상시험의 결과를 통하여, 암세포에 만 발현되는 종양 항원을 표적으로 CAR를 디자인해야만 한다는 것을 증명하였다.

또한 CD19 특이적, BCMA 특이적, CD22 특이적 CAR-T 세포에서 심각한 사이토카인 방출 증후군(CRS)이 관찰되었다 (Fig. 5). CRS는 anti-CD19 CAR-T 세포를 이용하여 치료한 환자의 약 80%에서 발생하였으며 치명적이거나 생명을 위협할 수 있다 [60]. CRS는 T 세포 면역치료법에서 예상되는 독성이지만, 여러 임상 연구에서 다양한 종류의 예기치 않은 합병증 (섬망, 발작과 같은 가역적 신경 합병증, 저혈압, 열 등)이 보고되고 있다. CAR-T 세포와 관련된 CRS의 심각성은 종양 크기와 관련 있다. 주로 큰 종양 덩어리의 빠른 파괴를 위해 혈액 내 종양 세포 성분의 대량 방출과 CAR-T 세포, 혈관 내피 세포와 다른 세포들에 의해 방출되는 전-염증성 사이토카인의 대량 방출로 인해, 복합장기부전 (multiple organ failure)의 위험과 단세포와 대식세포의 활성화가 초래되기 때문이다. 가장 심각한 형태의 CRS는 혈구탐식성 림프조직구증식증 (Hemophagocytic lymphohistiocytosis, HLH)과 대식세포 활성화 증후군 (macrophage activation syndrome) 등의 많은 특징을 보인다 [5,61].


Fig. 5. 
CAR T cell therapy is associated with cytokine release syndrome (CRS) and neurotoxicity. CRS has occurred with CAR-T cells. CAR-T cells release a variety of cytokines and chemokines, after the CAR-T cells combine surrogate antigen. IFN, interferon; AST, aspartate aminotransferase; ALT, alanine aminotransferase [5].


3. CONCLUSION

CAR-T는 1세대부터 4세대에 이르기까지 개발되었다. 또한 현재 CAR-T 치료법은 다양한 병증에 적용하여 그에 대한 임상 시험 연구가 활발하게 일어나고 있다. 최근에는 FDA에서 anti-CD19 변형 T 세포를 이용한 면역치료제인 KYMRIAH (tisagenleclecucel, 2017년 8월)와 YESCARTA (axicabtagene ciloleuce, 2017년 10월)가 승인되었다.

신경모세포종, 교모세포종, 상피암과 같은 다양한 고형암에 대한 임상 시험이 활발하게 이루어지고 있다. 그러나 아직까지 고형암에 대한 연구는 기대에 미치지 못하고 있다. 이는 고형암과 혈액암과의 차이점 등 다양한 요소들이 영향을 끼치므로, 이를 해결하기 위해 고형암에 대한 연구가 더 필요할 것으로 예상된다.

CAR-T 세포 기반의 면역치료법에서의 독성은 주요 문제이다. CAR-T 세포는 암세포에서만 발현되는 것이 아닌, 신체의 중요한 기관에서도 발현될 수 있는 표적 항원으로 인해 심장, 간, 폐, 뇌에서 종양 외에도 정상적인 조직을 공격할 수 있다 [6]. 또한 CAR-T 세포에서 심각한 사이토카인 방출 증후군(CRS)이 관찰되었으며, 이는 심각한 합병증을 초래할 수 있다. 따라서 CAR-T의 안정성과 그 효능에 대한 검증을 위해 추가적인 연구가 필요하다.


Acknowledgments

This research was supported by Basic Science Research Program through the National Research Foundation of Korea (NRF) funded by the Ministry of Education (NRF-2018R1D1A1B07050422).


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