The Korean Society For Biotechnology And Bioengineering

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Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 35 , No. 3

[ Review Paper ]
Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 35, No. 3, pp.192-198
Abbreviation: KSBB J
ISSN: 1225-7117 (Print) 2288-8268 (Online)
Print publication date 30 Sep 2020
Received 31 Jul 2020 Revised 21 Aug 2020 Accepted 22 Aug 2020
DOI: https://doi.org/10.7841/ksbbj.2020.35.3.192

미생물 대사체 분석을 위한 샘플 준비 방법 연구
김수아*
전주대학교 환경생명과학과

The Sample Preparation Method for Microbial Metabolomics
Sooah Kim*
Department of Environment Science & Biotechnology, Jeonju University, Jeonju, Korea
Correspondence to : Department of Environment Science & Biotechnology, Jeonju University, Jeonju, Korea Tel: +82-63-220-2384, Fax: +82-63-220-2054 E-mail: skim366@jj.ac.kr


© 2020 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering

Abstract

Metabolomics is a research filed for the study of global change of metabolome, which are intermediates or the end products of cellular metabolism from a living organism. It has been used a powerful tool for metabolic or physiological study and strain improvement in microbiological research. In metabolomics, the reproducible, efficient, reliable, and accurate recovery of all existing metabolite are essential prerequisites to obtain reliable biological data at specific time point. Therefore, the sample preparation including sampling and extraction are critical steps in microbial metabolomics. The optimization and development of sample preparation steps have been studied in last decade using various organisms. This study is reviewed the sample preparation method of various organisms for microbial metabolomics.


Keywords: microbial metabolomics, sample preparation, sampling, quenching, extraction

1. INTRODUCTION

대사체학 (metabolomics)은 다양한 유전적 또는 환경적 등의 변화에 반응하는 생물 내에 있는 가능한 대사체군 (metabolome)의 전반적인 변화를 분석하고 해석함으로써 그 변화와 원인을 규명 하는 연구분야이다 [1]. 대사체군은 세포의 대사 경로 및 신호전달물질에 있는 저분량의 대사체 산물의 집단을 의미하며, 세포 내 대사체 (intracellular metabolome)와 세포 외 대사체 (extracellular metabolome)로 나눌 수 있다. 일반적으로 대사체학이라 함은 세포 내 대사체의 변화를 연구하는 학문을 지칭하며, 세포 외 대사체의 변화를 연구하는 학문을 엑소-메타볼로믹스 (exo-metabolomics)라 지칭한다. 대사체군의 변화는 세포의 생리적인 상태 및 대사 상태를 직접적으로 나타낸다. 실제로 표현형을 가장 잘 나타내며, 유전 및 환경 요인을 내포하고 있기 때문에 대사체군을 분석하고 해석하는 대사체학은 유전 및 환경 등의 변화에 의한 세포의 생리학적 현상 및 대사 상태, 메커니즘, 생체 지표 (biomarker) 등 매우 유용한 정보를 제공한다. 대사체학은 이런 중요한 정보를 제공함으로 인해 매해 그 연구가 꾸준히 증가하고 있으며, 2020년 현재까지 8만 여건의 논문이 발행되었다 (Fig. 1). 2004년에 Metabolomics Society가 설립되었으며 (http://metabolomicssociety.org/), 2005년에 대사체학에 관한 연구를 게재 할 수 있은 Metabolomics Journal이 SCI에 등록되었으며 (https://www.springer.com/journal/11306), MIT Technology Review가 선정하는 떠오르는 10대 유망 기술로써 선정 되었다. 뿐만 아니라 2013년에는 한국대사체학회가 설립 되었다. 대사체학은 동물 [2-4], 식물 [5-7], 미생물 [8-12] 뿐 아니라 식품 [13-15], 농업 [16], 환경 및 독성 모니터링 [17], 의약품 [18,19]에 이르기까지 다양한 분야에 적용이 가능하다. 예를 들어, 질병의 바이오마커 발굴이나 진단기술 구축 [20], 유전자 변형 식물 개발 (transgenic plant) [21], 식물의 스트레스 메커니즘 규명 [22], 식품 원산지 판별이나 품질 평가 [23] 등에 이용할 수 있다. 특히, 미생물 대사체학을 이용하여 미생물 대사 경로 규명 [24,25], 미생물 균주 개발 [26,27], 장내 미생물 대사산물 분석 [28,29] 등의 다양한 연구를 수행할 수 있다. 세포 내 대사체의 변화를 연구 하기 위한 미생물 대사체학은 미생물 세포 내의 대사과정이나 효소활성을 억제하는 퀜칭을 포함하는 신속한 샘플링 과정, 대사체를 추출하는 추출 과정, 분석 기기를 이용하여 추출된 대사체를 분석하는 과정, 분석 기기를 통해 얻어진 데이터의 통계 및 생물학적 해석하는 과정으로 구성된다 (Fig. 2). 대사체 분석을 통한 정확한 생물학적 해석을 위해 생물학적 반복 수 (biological replicates)는 5-6 개 이상을 권장하며, 적어도 3개 이상은 되야 한다 [30,31]. 대사체 분석을 위한 샘플링 및 추출 과정인 샘플 준비 방법 에 따라 대사체 분석 효율이 달라 질 수 있으며, 이에 따라 생물학적 해석 과정에 영향을 줄 수 있다. 따라서, 재현성 있고, 신뢰할 수 있는 대사체 데이터를 얻기 위한 샘플 준비 방법의 확립은 매우 중요하다. 미생물에 따라 미생물의 세포 구조 및 특징 등이 상이 하기 때문에 각 미생물의 특성에 맞는 대사체 샘플링 및 추출 과정을 최적화한 연구들이 필요하다 [32,40]. 본 논문에서는 미생물 대사체 분석을 위한 각 미생물의 샘플 준비 방법인 대사체 샘플링 및 추출 방법에 대해 기술하였다.


Fig. 1. 
Number of publications related to metabolomics from 1965 to July 2020.

Search terms are “metabolomic or metabolomics or metabolic profiling or metabolite profiling or metabonomic or metabonomics” in PubMed DB.




Fig. 2. 
The overall workflow for microbial metabolomics.

The common steps are involved in microbial sampling, metabolite extraction, instrumental analysis, and biological interpretations. Sample preparation step consists of microbial sampling and metabolite extraction.




2. MATERIALS AND METHODS
2.1. 미생물 대사체학을 위한 샘플링 방법

미생물 샘플링 방법은 미생물 세포의 수집, 분리, 퀜칭 과정을 포함한다. 퀜칭 과정은 미생물 세포 내 대사 활동을 정지시키거나 효소 작용을 억제하는 과정이다. 퀜칭 방법으로 콜드 메탄올 (cold methanol; 60% v/v, −40℃)을 사용한 방법이 가장 많이 사용되고 있다 [32]. 하지만, 이 과정은 콜드 샥 (cold shock)에 의한 세포막 또는 세포벽의 손상으로 인해 세포 내 대사체의 손실을 초래할 수 있다. 따라서, 세포막 또는 세포벽의 손상을 최소화 할 수 있는 다양한 샘플링 방법을 비교 분석 하여 대안 방법으로 패스트 필트레이션 (fast filtration) [34], 필터 컬쳐 (filter culture) [41], 매스 밸런스 접근 (mass balance approach) [36], glycerol-saline과 같은 용매를 사용하는 퀜칭 방법 [42] 등을 제시하였다. 많은 연구들을 통해 각 미생물의 샘플링 방법을 최적화 하였다 (Table 1).

Table 1. 
Quenching methods widely used in microbial metabolomics
Quenching method Microorganism Reference
60% MeOH at −40℃ S. cerevisiae [32,36]
60% MeOH at −35℃ L. lactis [43]
60% MeOH at −45℃ A. niger [51]
60% MeOH with 70 mM HEPES at −50℃ E. coli [44]
60% MeOH with 70 mM HEPES at −80℃ E. coli [45,69]
60% MeOH with 70 mM HEPES at −40℃ L. plantarum [35]
60% MeOH with 0.85% (w/v) ammonium carbonate (pH 5.5) at −40℃ L. plantarum [35]
Liquid nitrogen (-196℃) E. coli [70]
S. cerevisiae [46]
Fast filtration A. niger [53]
B. subtilis, E. coli, G. oxydans, P. putida, Z. mobilis [34]
C. glutamicum [34,47]
M. alpina [56]
S. degradans [37]
S. cerevisiae [50]

2.1.1. 박테리아

Lactobacillus lactis, Escherichia coli 등 원핵 미생물의 대사체 분석을 위한 퀜칭 방법으로써, 콜드 메탄올 방법을 사용하여 신속하고 정확하게 미생물 세포 내 대사 과정을 정지하였다. L. lactis 내 대사체를 분석하기 위해 콜드 메탄올 (60%, −35℃) 퀜칭 방법을 사용하고 있으나 아직까지 콜드-퀜칭 방법을 이용한 L. lactis 세포 내 대사체 손실에 관한 정량적인 연구가 보고 되지 않았다 [43]. E. coli의 경우 60% 콜드 메탄올 퀜칭 방법을 기반으로 하여 HEPES 등 다양한 버퍼의 함유 여부, 퀜칭 용매 온도 등을 변경하여 퀜칭 과정을 최적화 하였으나 세포 내 대사체 손실에 관한 언급이나 정량적 연구가 부족하다 [44,45]. 퀜칭의 다른 방법으로 액체 질소 (−196℃)를 이용한 동결-해동 (freezing-thawing) 과정을 제안하였다 [46]. 그러나 이 방법 또한 냉동 과정 중 빙정이 세포막에 손상을 입힘으로써 대사체의 손실을 초래하여 정확한 대사체 분석이 어렵다.

세포막 및 세포벽의 손상을 최소화 할 수 있는 퀜칭 방법의 대안으로 패스트 필트레이션 방법이 제안 되었다. 2000년 대 초반 Wittmann 등은 Corynebacterium glutamicum을 사용하여 콜드 메탄올 (60%, −58℃), 10mM HEPES 버퍼가 포함된 콜드 메탄올 (60%, −58℃), 콜드 염화나트륨 (0.9%), 패스트 필트레이션 방법 등을 비교 분석하였다 [47]. Bolten 등은 다양한 그람 음성과 양성균 (i.e, Bacillus subtilis, C. glutamicum, E. coli, Gluconobacter oxydans, Pseudomonas putida, and Zymononas mobilis) 을 이용하여 10 mM HEPES 버퍼가 혼합된 콜드 메탄올 (60%, −58℃) 방법과 패스트 필트레이션 방법을 비교 분석하였으며 [34], Shin 등은 Saccharophagus degradans를 이용하여 콜드 메탄올 (70%, −70℃) 퀜칭과 패스트필 트레이션 방법을 비교 분석하였다 [37]. 특히, 콜드 메탄올 방법을 사용하였을 때 콜드 샥의 결과로 세포막 안에 액체의 결정화에 의해 형성된 친수성 채널을 통해 아미노산, 당과 같은 친수성 대사체의 손실이 증가하는 것을 확인 할 수 있다 [48]. 많은 연구결과를 통해 콜드-퀜칭 방법은 세포막 및 세포벽의 손상으로 인한 세포 내 대사체의 손실을 초래함을 확인하였으며, 패스트 필트래이션 방법과 같은 새로운 샘플링 방법이 필요함을 제시하였다.

2.1.2. 효모

진핵 미생물과 원핵 미생물의 세포 구조의 차이 때문에 원핵 미생물에서 최적화한 샘플링 방법을 진핵 미생물에 직접적으로 이용할 수 없다. 따라서, 진핵미생물에 적합한 샘플링 방법을 찾아야 한다. 퀜칭 방법으로 효모 역시 콜드 메탄올을 광범위하게 사용해 왔다 [32]. 2000년 대 초반 Villas-Bôas 등은 메탄올의 농도, 버퍼 사용의 유무 등을 비교하여 효모의 샘플링 방법을 최적화 하였으며 [49], 2008년 Canelas 등은 버퍼의 종류, 버퍼의 농도, 메탄올 농도 등을 비교분석 하여 콜드 메탄올 퀜칭 방법의 효과성 및 적절성을 논의하였다. “Leakage-free rapid quenching technique”을 기술하며, 샘플과 콜드 메탄올 퀜칭 용매 (100%, −40℃ 혹은 그 이하)의 비율을 1:5 혹은 그 이하 (최종 메탄올 용액 농도 83% 이상)로 하는 것이 효모 대사체 분석에 있어 적절하다고 제안하였다 [36].

또 다른 연구에서는 콜드 메탄올 퀜칭 방법의 단점을 보완할 수 있는 패스트 필트레이션 방법을 제안하였다 [50]. 콜드 메탄올 퀜칭 방법을 사용하였을 때, 세포막의 손상을 확인하였으며, 이로 인해 세포 내 많은 대사체의 손실을 초래하였다. 또한, 패스트 필트레이션 방법을 이용하였을 때에는 세포 외 대사물질이나 배지 등의 제거를 위해 적절한 세척 과정이 수반 되어야 함을 보였다.

2.1.3. 곰팡이

Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum, Mortierella alpina 등의 곰팡이 대사체 분석을 위해 콜드 메탄올 퀜칭 방법을 사용하여 세포 내 대사 과정을 정지 시킨다. 콜드 메탄올 (60%, −45℃ 또는 40%, −20℃) 을 사용하여 A. niger의 대사체를 분석하였으나 [51; 52], 또 다른 연구에서는 콜드 메탄올 퀜칭 방법을 사용하는 것 보다는 패스트 필트레이션 방법을 사용하는 것이 대사체 손실을 줄일 수 있음을 제시하였다 [53]. P. chrysogenum의 해당과정 및 시트라산 회로 대사산물, 아데닌 뉴클레오타이드 등을 분석하기 위해 콜드 메탄올 퀜칭 (60%, −40℃) 방법을 사용하였다 [54]. 그러나 Jonge 등은 P. chrysogenum 세포 내 대사체 손실을 최소화 하기 위해 40%, −20℃의 콜드 메탄올 용매를 사용하는 것이 더 효과적임을 밝혔다 [55]. Liu 등은 액체 질소, 콜드 메탄올 퀜칭, 패스트 필트레이션 방법을 비교 분석하여 M. alpina의 대사체 손실을 최소화 할 수 있는 방법을 비교 분석하여 패스트 필트레이션 방법이 최적임을 확인하였다 [56].

미생물 대사체 분석 과정에서 중요한 샘플링 방법은 세포의 수집, 분리, 퀜칭 과정을 동반하며, 세포 외 대사 물질, 배지 등을 제거해야 하며, 세포 내 대사물질의 유출을 최소화해야 한다. 최근 연구 결과들은 각 미생물에 따라 적절한 샘플링 방법이 있음을 보여주고 있다. 각 미생물의 구조 및 특성에 적합하도록 콜드-퀜칭, 패스트 필트레이션 등 다양한 샘플링 방법을 비교 분석하여 최적화 한 후 미생물 대사체 분석 할 것을 제안한다.

2.2. 미생물 대사체학을 위한 추출 방법

샘플링 후 다음 과정은 추출 용매를 사용하여 세포 내 대사물질을 추출하는 것이다. 추출 용매는 분석하고자 하는 대사물질의 물리적으로 또는 화학적으로 변형을 시켜서는 안 되며, 최소한의 분해로 가능한 많은 대사물질을 추출해야 한다. 추출 방법, 용매의 종류, 용매의 농도, 용매의 온도 등에 따라 대사체 추출 효율이 달라져 분석에 영향을 미칠 수 있기 때문에 추출 과정은 매우 중요하며, 이 과정을 최적화 하는 것 또한 필요하다. 미생물 대사체 분석을 위해 에탄올 [57, 58] 메탄올 [59,60], 과염소산 [38,61], 혼합용매 [40,62,63] 등이 이용된다 (Table 2). 많은 연구결과를 통해 각 미생물에 적합한 추출 용매를 최적화 하였다.

Table 2. 
Extraction methods widely used in microbial metabolomics
Extraction method Microorganism Reference
MeOH at −40℃ or −48℃ E.coli [33,64]
S. cerevisiae [49]
MeOH at −80℃ L. plantarum [35]
MeOH at −20℃ C. acetobutylicum. [39]
Boiling ethanol E. coli [64]
M. alpina [56]
P. chrysogenum [55]
S. cerevisiae [36,65]
Chloroform L. lactis [43]
S. cerevisiae [32]
Perchloric acid S. cerevisiae, [49,71]
Acetonitrile/methanol/water mixture
(2:2:1)
S. degradans [37]
C. acetobutylicum. [62]
Water/isopropanol/methanol (2:2:5) S. degradans [37]
Acetonitrile/water (1:1) A. niger [53]
S. cerevisiae [50]
Methanol/water (1:1) M. alpina [68]

2.2.1. 박테리아

Maharjan와 Ferenci는 E. coli의 대사체 분석을 위해 콜드 메탄올 (−40℃), 비등 에탄올 (90℃), 과염소산 용매, 비등 메탄올 (70℃), 수산화칼륨 용매, 메탄올/클로로포름 혼합 용매 등을 이용하여 서로 다른 추출 과정을 비교하였다 [33]. 추출 방법 및 용매에 따라 대사체 추출 효율이 달라지는 것을 확인하였으며, 세포 외피의 투과성을 향상시키기 위해 동결-해동 과정 또는 비등 (boiling) 과정을 이용하는 것이 효과적임을 제안하였다. 특히, 대사체 추출을 위한 용매로 콜드 메탄올 (−40℃)을 사용하였을 때 E. coli의 세포 내 대사체 추출 효율이 다른 용매를 사용하였을 때 보다 높았음을 확인하였다. 다른 연구에서는 콜드 메탄올 (−48℃)을 사용하여 반복적 동결-해동 과정을 수행 할 때, 메탄올/클로로포름 (2:1) 혼합 용매, 과염소산 용매, 비등 에탄올, 비등 염화칼륨 용매를 사용하였을 때 보다 추출 효율이 높았음을 보여주었다 [64]. L. plantarum의 대사체 분석을 위한 용매를 최적화 하기 위해 콜드 메탄올, 과염소산 용매, 비등 에탄올 용매, 클로로포름/메탄올 혼합 용매 (1:1), 클로로포름/물 혼합 용매 (1:1) 를 비교 분석하였다. 콜드 메탄올, 과염소산 용매, 비등 에탄올 용매가 L. plantarum의 대사체 추출 용매로 적합함을 확인하였다 [35]. Shin 등은 S. degradans의 대사체 분석을 위해 패스트 필트레이션 방법 후 아세토나이트릴/메탄올/물 (2:2:1) 혼합 용매 또는 물/아이소프로파놀/메탄올 (2:2:5) 혼합 용매를 사용하는 것이 대사체 추출 효율, 대사체 분석의 재현성 등에서 효과적임을 밝혔다 [37]. 혐기성 균주인 Clostridium acetobutylicum의 대사체 샘플링 및 추출 과정은 혐기성 쳄버 (anaerobic chamber) 내에서 수행하지 않아도 세포 손상이 없어 세포 내 대사체 손실이 없으며, 최적 용매로 산생성 단계 (acidogenic phase)와 용매생성 단계 (solventogenic phase)에 관계없이 콜드 메탄올 (−20℃)이 적합함을 밝혔다 [39].

2.2.2. 효모

효모 대사체 추출 용매로 클로로포름 [32], 비등 에탄올 [65,66], 메탄올 [49], 아세토나이트릴 [50] 등을 사용하고 있다. Villas-Bôas 등은 콜드 메탄올 퀜칭 이후 클로로포름/메탄올/버퍼 혼합 용매, 비등 에탄올, 과염소산 용매, 수산화칼륨 용매, 메탄올/물 혼합 용매, 콜드 메탄올을 사용하여 효모 대사체 추출 용매를 최적화하였다 [49]. 콜드 메탄올을 사용하였을 경우, 다른 용매를 사용했을 때 보다 더 많은 수의 대사체를 검출 및 동정 할 수 있었으며, 뉴클레오타이드와 케토산류의 대사체의 추출율이 다른 용매에 비해 높았다. 이를 통해 콜드 메탄올 용매가 효모 대사체 추출에 적절함을 밝혔으나, 효모 세포 내 당인산류를 분석하고자 할 때 클로로포름/메탄올/버퍼 혼합 용매를 사용하여 추출 것을 제안하였다. 다른 연구에서는 패스트 필트레이션 방법 이후 추출 용매를 최적화 하였다. 메탄올, 아세토나이트릴/물 (1:1), 아세토나이트릴/메탄올/물 (2:2:1), 비등 에탄올을 사용하여 효모 대사체 추출 용매를 비교 분석하였다. 효모 대사체 추출 효율, 대사체 분석의 재현성 등에서 아세토나이트릴/물 (1:1)을 사용하였을 때 높았음을 확인하였으며, 리비톨, 아라비톨, 솔비톨과 같은 당알코올을 분석하기 위해서는 비등 에탄올을 사용할 것을 제안하였다 [50].

2.1.3. 곰팡이

비등 에탄올 [55; 56], 메탄올 [51], 클로로포름 [51], 과염소산 용매 [67], 수산화나트륨 용매 [67] 등을 주로 사용하여 곰팡이 대사체 추출을 한다. Zheng 등은 A. niger 의 대사체 분석을 위한 최적 용매로 아세토나이트릴/물 (1:1) 혼합 용매가 적합함을 확인하였다 [53]. 최근 한 연구에서는 M. alpine의 대사체 분석을 위한 추출 용매를 최적화 하기 위해 메틸삼차부틸에테르/메탄올/물 (20:6:5) 혼합 용매, 메탄올/아세토나이트릴/물 (2:2:1) 혼합 용매, 메탄올/물 (8:2) 혼합 용매, 메탄올/물 (1:1) 혼합 용매, 에탄올/물 (3:1) 혼합 용매를 비교 분석하였다 [68]. 1-모노팔미틴, 1-모누레인, 라노스테롤, 지방산 등과 같은 비극성, 양친매성 대사체를 분석하기 위해 메틸삼차부틸에테르/메탄올/물 (20:6:5) 혼합 용매가 최적임을 확인하였으며, 당인산, 아미노산, 유기산 등과 같은 대사체를 분석하기 위해서는 메탄올/물 (1:1) 혼합 용매가 적합함을 밝혔다.

추출 과정 중 대사 물질이 분해되고, 물리·화학적 변화를 초래하기 때문에 대사체 추출 효율은 100% 미만일 수 밖에 없다 [49]. 모든 대사체가 고온 또는 산·염기 조건에서 안정한 것은 아니며, 어떤 방법은 대사체를 파괴시킬 수도 있다 [33]. 특히, 산·염기 용매의 사용은 중성화 과정을 요구하며, 이 과정으로 인해 대사체 추출 효율이 낮아질 수 있다. 또한, 대사체 분석을 위해 액체크로마토그래피-질량분석기, 기체크로마토그래피-질량분석기 등 어떠한 분석 기기를 사용하여 분석하는지, 연구에서 타겟으로 분석하고자 하는 대사체가 무엇인지에 따라 추출 과정이 달라질 수 있다. 따라서, 미생물 대사체 분석을 위한 적절한 추출 방법 및 용매의 선택은 매우 중요하다.


3. CONCLUSION

미생물 대사체학은 지난 몇 십년 동안 발전해왔으며, 미생물 균주 개발, 미생물 대사 경로 규명 등 미생물 분야에서 놀라운 성과를 나타냈다. 그러나 미생물 대사체학을 수행하기 위한 보편적이고 일반적인 샘플링 방법은 정해져 있지 않다. 이는 미생물의 세포 구조 및 특성이 상이하고, 대사 산물이 극성, 비극성 등 화학적으로 복잡하고, 다양한 범위를 가지고 있기 때문이다. 미생물 대사체를 분석하기 위한 샘플링과 추출 과정은 매우 중요하다. 효과적인 샘플링 과정은 신속하게 이뤄져야 하며, 세포 내 대사체의 손실을 최소화 해야 한다. 오늘날에도 새로운 미생물 대사체 분석을 위한 샘플링 방법이 최적화 되고 있으며, 샘플링 속도를 높이고, 휴먼 에러 (error) 를 줄이기 위한 효율적인 자동화 시스템이 개발 되고 있다. 샘플링 과정과 더불어 가능한 많은 대사체의 추출 효율을 높일 수 있는 추출 과정의 확립이 필요하다. 고려하고자 하는 대상 미생물의 대사체 분석을 위한 샘플링 방법 및 추출 과정의 최적화를 통해 미생물 대사체학을 이용하여 보다 정확한 생물학적 해석을 할 수 있다. 이를 통해 미생물 대사 경로 규명, 균주 개발, 장내 미생물 분석 등 다양한 미생물 산업 분야에 활용 될 수 있을 것이다.


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