The Korean Society For Biotechnology And Bioengineering

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Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 35 , No. 3

[ Review Paper ]
Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 35, No. 3, pp.199-207
Abbreviation: KSBB J
ISSN: 1225-7117 (Print) 2288-8268 (Online)
Print publication date 30 Sep 2020
Received 26 Aug 2020 Revised 16 Sep 2020 Accepted 17 Sep 2020
DOI: https://doi.org/10.7841/ksbbj.2020.35.3.199

피브린 Zymographic Gel에서 Bacillus amyloliquefaciens G-13으로부터 혈전용해효소의 생성에 영향을 미치는 물리화학적 요인들의 비교
이현호 ; 차민지 ; 오계헌*
순천향대학교 생명시스템학과

Comparison of Physicochemical Factors Influencing the Production of Fibrinolytic Enzymes from Bacillus amyloliquefaciens G-13 in Fibrin Zymographic Gel
Hyun-Ho Lee ; Min-Ji Cha ; Kye-Heon Oh*
Department of Life Science and Biotechnology, Soonchunhyang University, Asan 31538, Korea
Correspondence to : Department of Life Science and Biotechnology, Soonchunhyang University, Asan 31538 Korea Tel: +82-41-530-1353, Fax: +82-41-530-1350 E-mail: kyeheon@sch.ac.kr


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Abstract

Our previous research demonstrated the characteristics and fibrinolytic activities of NaCl- and capsaicin-resistant bacterium Bacillus amyloliquefaciens G-13, isolated from mustard leaf kimchi [1]. In this study, we extended the work to the comparison of various physicochemical factors (e.g., temperature, pH, NaCl, capsaicin, metal ions, and inhibitors) influencing the production of fibrinolytic enzyme by strain G-13. Initially, a time course of the fibrinolytic activity of strain G-13 was measured by the fibrin plate assay, and after 84 hours of incubation, the maximum fibrinolytic activity was about 3.42 times that of plasmin used as the standard. Through a fibrin zymographic assay, four bands (23, 34, 45, and 67 kDa) of fibrinolytic enzyme from strain G-13 were compared in fibrin zymographic gels. The strain could grow and produce the fibrinolytic enzyme in the presence of NaCl (1-10%) or capsaicin (0-300 μg/mL), respectively. The optimum pH and temperature for the enzymatic activity were 8 and 35oC. In the study of the effects of metal ions on fibrinolytic activity, K+, Ca2+, and Mg2+ ions increased the activity and maintained it overall, but Fe3+, Zn2+, Ba2+, and Hg2+ ions rapidly decreased the activity of the fibrinolytic enzyme. The enzyme was completely inhibited by phenylmethanesulfonyl fluroide (PMSF), suggesting that it was a serine protease. These results provide important clues for understanding the characteristics of fibrinolytic bacteria by confirming the effects of B. amyloliquefaciens G-13 on various physicochemical factors influencing the production of fibrinolytic enzymes through fibrin zymography.


Keywords: Bacillus amyloliqeufaciens G-13, fibrinolytic enzyme, fibrin zymograpy

1. INTRODUCTION

혈전 (血栓)은 혈관에 상처가 생기면서 활성화되는 트롬빈 (thrombin)이 피브리노겐(fibrinogen)을 피브린 (fibrin)으로 전환하여 생성된다 [2]. 혈전은 일반적으로 지혈과정에서 중요한 역할을 담당하지만, 혈전이 빠르게 제거되지 않으면 혈관 벽에 점착하거나 미세혈관을 막아 혈류를 차단하게 되어, 뇌와 같은 중요조직에 산소를 포함하는 필수영양분의 공급을 막아 혈전증 (thrombosis)을 유발할 수 있다 [3]. 따라서 혈전증의 예방 및 치료에 대한 연구가 진행되고 있으며, 혈전 생성을 억제하거나 생성된 혈전을 제거하는 혈전용해제의 개발이 이루어지고 있다.

오늘날 사용되는 헐전용해제로는 tissue plaminogen activator (tPA), streptokinase, urokinase 등이 알려져 있으나, 가격이 높으며 체내 반감기가 짧거나 전신 출혈을 일으키는 등의 부작용들이 있는 것으로 알려져 있다 [4]. 이와 아울러 혈전용해능을 가지는 물질을 천연물질로부터 얻으려는 연구가 버섯, 부추, 지렁이 등으로부터 진행되어왔으며 [4-6], 우리나라의 전통식품인 된장, 청국장, 간장, 김치 등에서 분리된 미생물로 부터 혈전용해효소를 생성하는 것이 보고되면서 많은 주목을 받고 있다 [7-10]. 혈전용해효소를 생성하는 미생물에는 BacillusMicrococcus 등의 세균과 PichiaSaccharomyces 등의 효모가 보고되었으며, 그 중에서도 특히 Bacillus spp.에 의한 혈전용해효소의 생산 및 특성에 관한 연구들은 비교적 활발히 진행되고 있다. Bacillus spp.에서 유래하는 혈전용해효소는 serine protease, metalloprotease, esterase 등의 여러 종류의 단백질 분해효소들(proteases)이 알려져 있다 [11-12].

미생물에 의한 혈전용해효소의 생성은 여러 가지 물리적 또는 화학적인 요인들에 의해 영향을 받는 것으로 알려져 왔다. 특히 Bacillus에서 많은 연구가 진행되었는데, 청국장에서 분리한 Bacillus licheniformis HK-12의 혈전용해효소 생성에 대한 온도와 pH의 영향 [10]Bacillus subtilis IIQDB32의 혈전용해효소 생성에 대한 탄소원과 질소원과 같은 배지 조성, 용존 산소, 중금속 이온의 영향 [13], 그리고 Bacillus amyloliquefaciens DJ-4와 Bacillus subtilis에서 혈전용해효소의 생성에 대한 NaCl과 고분자 전해질에 대한 영향 [12,14] 등이 보고된 바 있다.

피브린 zymography는 전기영동의 원리를 이용하여 gel 상에서 혈전용해활성을 가지는 단백질 분해효소를 탐색 (screening)할 수 있는 기법이며, 더 나아가 혈전용해효소의 분자량을 확인할 수 있을 뿐만 아니라, 아주 적은 양의 혈전용해효소도 정량 및 측정할 수 있다 [15]. 피브린 zymography는 혈전용해효소의 생성의 최적화 조사 [16], 특정 시료에서 혈전용해효소의 종류 확인 [12], 혈전용해효소의 최적 반응 온도 및 pH 측정 [12], 혈전용해효소가 분해하는 단백질 기질들에 대한 조사 [17] 등을 위하여 사용되었다.

본 연구에서는 가정에서 담근 숙성된 갓김치로부터 분리한 B. amyloliquefaciens G-13의 혈전용해효소에 대한 물리적 요인과 화학적 요인들의 영향을 피브린 zymography를 통하여 비교 분석하였다.


2. MATERIALS AND METHODS
2.1. 분리 세균과 배양 조건

본 연구에 사용된 균주는 가정에서 담근 숙성된 갓김치에서 농화 분리한 Bacillus amyloliquefaciens G-13 [GenBank MN249498]을 사용하였다 [1]. 이 균주는 Luria-Bertani (LB) (Difco, Detroit, MI. USA) 액체 배지에 접종 한 후, 진탕배양기(37oC, 160 rpm)에서 배양하며 실험에 사용하였다.

2.2. 피브린 평판법을 통한 혈전용해활성 측정

분리 세균 G-13의 혈전용해활성은 피브린 평판법(fibrin plate assay)을 이용하여 측정하였다. 피브린 평판법은 Astrup 등 [18]의 방법을 따랐다. 피브린 평판은 fibrinogen (Sigma. St. Louis, MO, USA)을 5 mL의 멸균된 증류수에 0.6% 농도가 되도록 용해시킨 후, 1.5% agarose 5 mL와 thrombin (100 NIH units) 100 μL을 넣고 혼합하여 페트리 접시에 붓고, 실온에서 1시간 동안 방치하여 굳혔다. 피브린 평판에 Pasteur pipette을 이용하여 3 mm 지름의 well을 만들었고, 각 well에 시료 10 μL를 채운 후, 18시간동안 37oC의 배양기에서 반응시켰다. 시료에 대한 대조구는 정제된 혈전용해효소인 plasmin (Sigma. St. Louis, MO, USA) 1 unit을 이용하였다. 반응이 진행된 후, 생성된 투명대(clear zone)의 면적은 Image J 프로그램을 이용하여 측정하였다. 혈전용해활성은 다음의 식과 같이 계산하였다.

 unit/mL=mm2   plasmin mm2   
2.3. 피브린 zymography

균주가 생성하는 혈전용해효소의 종류와 분자량을 측정하기 위하여 피브린 zymography를 실시하였다. 피브린 zymography는 0.12% fibrinogen과 10 NIH unit/mL thrombin이 포함된 12% SDS-PAGE gel을 사용하였다 [15]. 전기영동은 각 well에 준비된 시료를 넣고 12 mA의 조건으로 실시하였다. 전기 영동된 gel은 2.5% Triton X-100이 포함된 renaturation buffer (Tris 50 mM, pH 7.4)에 30분간 세척한 후, 증류수로 10분간 3회 세척하였다. 세척된 gel을 reaction buffer (30 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 0.02% NaN3)에 넣고 37oC에서 24시간 동안 반응시켰다. 이 후, Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad Co., Hercules, CA, USA)로 염색한 뒤, destaining solution (50% methanol, 10% acetic acid)으로 탈색과정을 거쳐 투명한 밴드의 형성 유무를 확인하였다. 분자량의 크기에 따라 생성된 각 밴드의 정량은 Image J 프로그램을 이용하여 실시하였다.

2.4. 배양 시간에 따른 혈전용해활성 조사

분리 세균 G-13의 배양 시간에 따른 혈전용해효소의 활성을 확인하기 위해 LB 액체 배지에 균주 1%를 접종한 후, 84시간 동안 12시간 간격으로 세균 배양액을 채취하였다. 세균 배양액을 원심분리한 후, 상등액은 0.2 μm syringe filter로 여과하였다. 상등액의 혈전용해활성을 측정하기 위해 피브린 평판법(fibrin plate assay)을 실시하였다. 이후 피브린 zymography의 시료는 아세톤 침전법(acetone precipitation)을 이용하여 준비하였다 [15]. 상등액에 100% iced cold acetone을 3배 부피로 넣은 후, −20oC에서 3시간 동안 방치하여 단백질 침전물을 얻었다. 침전된 단백질은 80% ice cold acetone으로 세척한 뒤, 5x sample buffer (pH 6.8, 0.5 M Tris–HCl, 10% SDS, 20% glycerol, and 0.1% bromophenol blue, pH 6.8)를 넣어 재현탁한 후, 각 시료에 대하여 피브린 zymography를 실시하였다.

2.5. 물리화학적 요인에 따른 혈전용해활성 변화
2.5.1. 온도에 따른 활성변화

LB 액체 배지에서 84시간 동안 배양한 세균 배양액의 상등액을 준비하여, 25oC에서 60oC까지 5oC간격으로 각 시료를 1시간씩 열처리하였다. 열처리한 시료의 혈전용해활성은 피브린 zymography를 통하여 확인하였다.

2.5.2. pH에 따른 활성변화

LB 액체 배지에서 84시간 배양된 세균의 상등액을 준비하여, 아세톤 침전법을 통하여 단백질을 침전시켰다. 단백질 침전물은 pH 4부터 pH 10까지 각각 다른 pH buffer [0.1 M sodium acetate buffer (pH 4-5), 0.1 M phosphate buffer (pH 6-7), 0.1 M Tris-acetate buffer (pH 8-10)]에서 24시간 반응시킨 후, 피브린 zymography를 통해 혈전용해활성을 측정하였다.

2.5.3. NaCl 농도에 따른 활성변화

다양한 농도 (1%, 2.5%, 5%, 7.5%, 10%)의 NaCl이 포함된 LB 액체 배지 100 mL에 균주를 1% 접종한 후, 12시간 간격으로 세균 배양액을 채취하였다. 채취한 세균 배양액을 원심분리하여 얻은 상등액은 아세톤 침전법을 하였으며, 각 시료에 대하여 피브린 zymography를 실시하였다.

2.5.4. 캡사이신 농도에 따른 활성변화

다양한 농도 (0, 50, 100, 150, 200, 250, 300 μg/mL)의 캡사이신을 포함한 LB 액체 배지 100 mL에 균주를 1% 접종한 후 12시간 간격으로 세균 배양액을 채취하였다. 이후 채취한 세균 배양액들은 NaCl 농도에 따른 활성에서 기술된 동일한 방법으로 실험을 진행하였다.

2.5.5. 금속이온에 따른 활성변화

LB 액체 배지에 84시간 배양한 분리 세균의 배양 상등액을 채취한 후, 아세톤 침전법을 통해 피브린 zymography 시료를 준비하였다. 각 시료는 위에서 언급한 방법대로 피브린이 포함된 SDS-PAGE gel에 전기영동을 실시하였다. 이후 전기영동이 끝난 gel은 renaturation buffer와 증류수로 세척하였으며, 세척된 gel은 각각 5 mM의 FeCl3, ZnCl2 MgSO4, BaCl2, HgCl2, KCl, CaCl2가 포함된 reaction buffer에 24시간 동안 반응시켜 밴드의 형성 유무를 관찰하였다.

2.5.6. 저해제에 따른 활성변화

LB 액체 배지에서 84시간 배양한 세균의 상등액을 준비한 후, 시료는 위에서 기술된 방법대로 피브린이 포함된 SDS-PAGE gel에 전기영동을 실시하였다. 이후 전기영동이 끝난 gel은 renaturation buffer와 증류수로 세척하였으며, 이 gel은 각각 ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 5 mM과 phenylmethanesulfonyl fluroide (PMSF) 5mM이 포함된 reaction buffer에 24시간 동안 반응시켜 밴드의 형성 유무를 관찰하였다.


3. RESULTS AND DISCUSSION
3.1. 분리 세균 G-13의 배양 시간에 따른 혈전용해효소 생성

분리 세균 G-13은 LB 액체배지에 접종한 후 96시간 동안 12시간 간격으로 배양액을 채취하였다. 배양액으로부터 조효소 (crude enzyme)를 얻기 위해 배양액을 원심분리 하였으며, 이후 배양 상등액은 피브린 평판법과 피브린 zymography의 시료로 사용하였다. 분리 세균의 혈전용해활성은 배양 시간이 지속됨에 따라 점차 증가하여 84시간에 최대 활성 (3.42 unit/mL)을 보여주었으며, 이후 감소하였다 (Fig. 1(A), Fig. 1(B)). Zymography를 이용하여 배양시간에 따른 분리 세균의 혈전용해활성의 변화를 측정하였으며, 그 결과 23, 34, 45, 67 kDa 크기의 4개의 밴드가 형성됨을 확인하였다 (Fig. 1(C)). 4개의 밴드 모두 배양 시간이 지남에 따라 점차 활성이 증가하였다. 34, 45, 67 kDa의 밴드는 24시간부터 형성되어 점차 활성이 증가하였으며, 이와 달리 23 kDa의 밴드는 48시간부터 생성되어 배양 시간에 따라 활성이 증가하였다. 이들 각 밴드들의 상대 활성은 다음과 같다 (Fig. 1(D)). Peng 등 [19]Bacillus sp. 유래 혈전용해효소의 분자량은 일반적으로 27.7-44 kDa의 범위를 갖는다고 보고하였다. B. subtilis var. natto가 생산하는 혈전용해효소의 분자량은 27.7 kDa [20], 젓갈에서 분리한 Bacillus sp. KA38 유래의 혈전용해효소의 분자량은 41 kDa [21], 대두발효식품에서 분리한 B. amyloliquefaciens HCD2 혈전용해효소의 분자량은 24 kDa와 36 kDa [22]을 나타내어 서로 상이하였다. 이들 결과는 Bacillus에 속하는 혈전용해효소를 생성하는 세균이라고 하더라도, zymography를 통해서 나타나는 밴드의 개수와 분자량에는 차이가 있는 것으로 생각되며, 본 실험에서 나타난 23 kDa와 67 kDa의 밴드의 분자량은 기존에 보고된 혈전용해효소의 분자량과는 다소 차이가 있는 것으로 판단된다.


Fig. 1. 
Time course of fibrinolytic activity from B. amyloliquefaciens G-13 in LB broth (A). Clear zones were measured during the incubation period - 1. 12 h, 2. 24 h, 3. 36 h, 4. 48 h, 5. 60 h, 6. 72 h, 7. 84 h, 8. 96 h (B). Zymography of relative activity of four fibrinolytic enzymes from B. amyloliquefaciens G-13 (C), and densitometric analysis (D), and (a)-(d) represents 67, 45, 34, and 23 kDa, respectively. Every bar is based on the relative value to maximum activity of each enzyme. These data represent the mean±SD based on triplicate studies.

3.2. 온도 변화에 따른 활성변화

B. aymloliquefaciens G-13가 생산하는 혈전용해효소에 대한 온도의 영향을 확인하기 위하여, 84시간이 경과한 배양으로부터 상등액을 준비하여 다양한 온도 (25oC-60oC)에서 1시간 동안 열처리한 후, 각 시료에 대한 혈전용해활성은 피브린 zymography를 통해 확인하였다. 피브린 zymography의 결과는 열처리 온도가 45oC에서부터 증가함에 따라 4개의 활성 밴드에서 모두 활성이 감소함을 보여주었다. 23 kDa 밴드는 60oC에서도 활성을 유지하였으며, 잔존 활성은 약 58%로 조사되었다 (Fig. 2). 34 kDa, 45 kDa, 67 kDa 밴드의 혈전용해활성은 45oC까지 높게 유지되었으나 50oC에서 급격히 감소하여, 밴드의 활성을 찾을 수 없었다. Fujita 등 [20]Bacillus subtilis var. natto의 nattokinase에 50oC에서 30분간 열처리하였을 경우에 효소의 활성이 모두 소실되었으며, Kim 등 [23]은 청국장으로부터 분리한 B. amyloliquefaciens 유래의 혈전용해효소에 55oC에서 30분간 열처리하였을 때, 효소의 상대적 활성은 12%로 감소하였음을 보고하였다. 이들 결과와 비교하였을 때, 본 실험에서 사용한 B. amyloliquefaciens G-13에서 유래하는 23 kDa의 혈전용해효소는 높은 온도에서 상대적으로 탁월한 열안전성을 갖는 것으로 사료된다.


Fig. 2. 
Themostability of four fibirnoyltic enzmyes from B. amyloliquefaciens G-13 on the fibrin zymogram gel (A), and densitometric analysis (B). (a)-(d) represents 67, 45, 34 and 23 kDa, respectively. Every bar is based on the relative value to maximum activity of each enzyme. These data represent the mean±SD based on triplicate studies.

3.3. pH 변화에 따른 활성변화

B. amyloliquefaciens G-13 유래 혈전용해효소에 대한 pH의 영향을 조사하기 위하여, 배양 상등액으로 부터 얻은 단백질 침전물을 다양한 pH (4-10)의 완충용액에 재현탁하여 24시간 방치한 뒤 잔존 활성을 측정하였다 (Fig. 3). Zymography의 결과는 혈전용해활성을 가지는 4개의 밴드(분자량: 23 kDa, 34 kDa, 45 kDa, 67 kDa)가 중성 및 약알칼리 조건 (pH 7, 8, 9)에서 높은 활성을 보였으며, 특히 pH 8에서 최대 활성을 나타냈다. 반면에 각 밴드에서의 활성은 산성 조건인 pH 4와 5에서 급격하게 감소하였다. B. amyloliquefaciens G-13 유래 혈전용해효소의 pH 활성패턴은 중성 pH와 알칼리 pH 범위에서 높은 활성을 보이는 alkaline protease 계열에 속하는 혈전용해효소의 특징과 일치하였다 [24]. Yossan 등 [25]은 발효된 fish sauce로부터 분리한 Bacilllus megaterium 유래 혈전용해효소에 대하여 pH의 영향을 조사하였으며, 최대 활성 pH를 10으로 보고하였다. Lee 등 [26]은 전통 재래 장류로부터 분리한 B. subtilis IDCC 9204로부터 유래한 혈전용해효소에 대한 pH의 영향을 조사하여, 알칼리 조건에서 혈전용해 활성이 우수하였으며, pH 8에서 최대 활성을 보여주는 것으로 발표하였다. 이러한 결과와 비교하였을 때, B. amyloliquefaciens G-13은 약알칼리 pH에서 활성이 뛰어난 특성을 가져 Bacillus에서 주로 발견되는 serine alkaline protease로 생각된다. 또한 이들 결과는 Bacillus에서 유래하는 serine protease 계열의 혈전용해효소들이 알칼리의 환경에서 우수한 활성을 가지는 것은 동일하나 최대 활성 pH에서는 서로 차이가 있을 수 있는 것으로 사료된다.


Fig. 3. 
Effect of various pH (4-10) on four fibrinolytic enzymes from B. amyloliquefaciens G-13 on the fibrin zymogram gel (A), and densitometric analysis (B). (a)-(d) represents 67, 45, 34 and 23 kDa, respectively. Every bar is based on the relative value to maximum activity of each protease. These data represent the mean±SD based on triplicate studies.

3.4. NaCl 농도에 따른 혈전용해효소 생성

분리 세균 G-13을 서로 다른 농도의 NaCl (1-10%)이 포함된 LB 액체 배지에 접종한 후, 다양한 NaCl 농도의 배양 84시간이 경과한 시료를 피브린 zymography에 이용하였다. 그 결과, NaCl의 농도가 높아짐에 따라 혈전용해활성을 갖는 4개의 밴드 (분자량: 23 kDa, 34 kDa, 45 kDa, 67 kDa) 모두에서 활성이 감소되는 경향을 보여주었다 (Fig. 4). 67 kDa인 밴드의 활성은 NaCl 농도 2.5%에서 급격히 감소하여 38%의 활성을 보였으며, NaCl 농도 5% 이상에서는 밴드의 활성은 관찰할 수 없었다. 45 kDa 밴드의 활성은 2.5%의 NaCl 농도에서 80%의 활성을 유지하였으나, 5%의 NaCl 농도에서 활성은 35%으로 급격히 감소하였다. 34 kDa의 밴드는 5%의 NaCl 농도에서 74%으로 높은 활성을 유지하였으나, 7.5%의 NaCl 농도에서 활성은 40%으로 감소하였고 10%의 NaCl 농도에서는 밴드의 활성은 관찰할 수 없었다. 23 kDa 밴드의 활성은 34 kDa와 유사하게 5%의 NaCl 농도까지 높은 활성을 유지하였으며, 7.5%의 NaCl 농도에서 급격히 감소하였다. 또한, 23 kDa 밴드는 본 실험에서 설정한 가장 높은 NaCl 농도인 10%에서의 혈전용해활성을 유지하였다. Thumar와 Singh [27]는 배양환경에서 NaCl의 농도(0-10%)에 따른 Streptomyces clavuligerus MIT-1의 혈전용해활성의 변화를 조사하였으며, 10% NaCl에서 혈전용해활성은 최대 활성 대비 85% 감소되었음을 보고하였다. 또한, Choi 등 [12]은 된장에서 분리한 B. amyloliquefaciens DJ-4의 피브린 zymography의 분석에서 NaCl의 농도에 따른 4개의 활성 밴드 (분자량: 29 kDa, 38 kDa, 53 kDa, 80 kDa)의 변화를 보고하였으며, 38 kDa과 53 kDa의 밴드 활성은 5% NaCl에서 완전히 저해되어 밴드를 관찰할 수 없었으며, 29 kDa의 밴드는 10% NaCl에서 활성이 완전히 저해되었음을 보고하였다. 본 실험의 결과와 비교했을 때, NaCl의 농도가 증가함에 따라 혈전용해활성의 감소는 동일하였으나, 본 실험에서 조사된 23 kDa의 혈전용해효소는 10%의 NaCl의 배양 환경에서 활성을 유지하였다. 이들 결과는 배양 환경에 있어서 특정 농도의 NaCl은 혈전용해효소 생성 세균의 혈전용해활성을 감소시키는 것으로 보이며, 혈전용해활성을 가지는 동일한 B. amyloliquefaciens이라고 하더라도 NaCl에 대한 영향의 차이가 있음을 보이는 것으로 생각된다.


Fig. 4. 
Zymography of relative activity of four fibrinoyltic enzymes from B. amyloliquefaciens G-13 cultured in the presence of various NaCl concentrations (1-10%) (A), and and densitometric analysis (B). (a)-(d) represents 67, 45, 34 and 23 kDa, respectively. Every bar is based on the relative value to maximum activity of each enzyme. These data represent the mean±SD based on triplicate studies.

3.5. 캡사이신 농도에 따른 혈전용해효소 생성

분리 세균 G-13을 서로 다른 농도의 캡사이신 (0-300 μg/mL)이 포함된 LB 액체 배지에 배양한 후, 배양액을 12시간 간격으로 채취하여 원심분리한 뒤 얻은 상등액에 대하여 피브린 zymography를 실시하였다 (Fig. 2). 피브린 zymography의 결과는 캡사이신 농도가 높아짐에 따라 혈전용해효소 (분자량 : 23 kDa, 34 kDa, 45 kDa, 67 kDa)의 활성은 감소하는 양상을 나타냈다 (Fig. 5). 45 kDa과 67 kDa 밴드의 활성은 캡사이신 농도 200 μg/mL부터 급격히 감소하였으며, 캡사이신 농도 300 μg/mL에서 45 kDa 밴드의 활성은 92%, 67 kDa 밴드의 활성은 79% 감소하였다. 34 kDa 밴드의 활성은 캡사이신 200 μg/mL 농도까지 점차 감소하여 60%의 활성을 유지하였으나, 250 μg/mL의 캡사이신 농도부터 급격히 감소하여 300 μg/mL에서 혈전용해활성은 74% 감소하였다. 23 kDa의 혈전용해활성은 캡사이신 농도가 높아짐에 따라 점차 감소하였으며, 가장 높은 캡사이신 농도인 300 μg/mL에서 40%의 잔존 활성을 보여 다른 단백질 효소보다 캡사이신 농도에 따른 감소폭은 적게 나타났다. 여러 연구자들에 의해서 캡사이신에 의한 Bacillus를 포함한 세균들에 대한 항균활성은 알려져 왔으나 [28], 캡사이신에 의한 혈전용해효소의 생성에 대한 영향에 대한 연구는 거의 보고된 바 없다. 따라서 향후 연구는 캡사이신이 어떻게 혈전용해효소의 생성을 저해하는가에 대한 메커니즘에 대해 조사할 필요가 있다고 사료된다.


Fig. 5. 
Zymography of relative activity of four fibrinolytic enzymes from B. amyloliquefaciens G-13 cultured in the presence of various capsaicin concentrations (0-300 μg/mL) (A), and densitometric analysis (B). (a)-(d) represents 67, 45, 34 and 23 kDa, respectively. Every bar is based on the relative value to maximum activity of each enzyme. These data represent the mean±SD based on triplicate studies.

3.6. 금속이온의 영향에 따른 활성변화

B. amyloliquefaciens G-13이 생성하는 혈전용해효소에 대한 금속이온의 영향을 확인하기 위하여, 각종 금속이온 (Fe3+, Zn2+, Mg2+, Ba2+, Hg2+, K+, Ca2+)이 포함된 reaction buffer를 이용하여 피브린 zymography를 실시하였다 (Fig. 6). 각 금속이온에 대한 효소활성의 변화는 금속이온이 첨가되지 않은 혈전용해활성을 가지는 밴드 (분자량: 23 kDa, 34 kDa, 45 kDa, 67 kDa)와 비교하여 분석하였다. K+, Ca2+, Mg2+은 밴드의 활성을 전반적으로 증가시켰으며, Fe3+, Zn2+, Hg2+, Ba2+은 모든 밴드의 활성을 감소시켰다. Cheng 등 [29]은 중국 전통음식인 douchi로부터 분리한 B. subtilis DC33의 혈전용해효소인 serine protease의 활성에 대한 여러 금속 이온의 영향을 조사하였으며, 그 결과로 Mg2+, Ca2+은 활성을 유지시켰으나 Fe3+과 Zn2+은 활성을 각각 74, 69% 억제하였음을 보고하였다. Kim 등 [23]은 청국장으로부터 분리한 B. amyloliquefaciens CH51로부터 얻은 혈전용해효소의 활성에 대한 금속 이온의 영향을 조사하여, K+, Ca2+, Mg2+은 혈전용해활성을 증가시켰으며, Zn2+은 활성을 급격히 감소시켰음을 보고하였다. 또한 Kim 등 [21]은 젓갈로부터 분리한 Bacillus sp. KA38로부터 유래한 혈전용해효소인 metalloprotease의 활성에 대한 금속 이온의 영향을 보고하여, Zn2+은 효소의 활성을 58% 증가시켰으나, Ca2+, Fe3+은 활성을 각각 98%, 23% 억제하였음을 발표하였다. 기존에 보고된 연구결과와 비교할 때, B. amyloliquefaciens G-13 유래 혈전용해효소의 활성은 metalloprotease의 활성의 중요한 요인으로 알려진 Zn2+에 의해 감소하였으며 serine protease의 활성을 증가시키는 Ca2+과 Mg2+에 의해 혈전용해활성이 전반적으로 증가하여, 기존에 보고된 serine protease에 대한 금속이온의 영향의 패턴과 유사한 것으로 판단된다.


Fig. 6. 
Effect of metal ions on activity of fibrinolytic enzymes from B. amyloliquefaciens G-13 on the fibrin zymogram gel (A), and densitometric analysis (B). This test was carried out in the presence of a reaction buffer containing one of various metal ions (Fe3+, Zn2+, Mg2+, Ba2+, Hg2+, Ca2+, K+). As a control, a reaction buffer containing no metal ions was used. (a)-(d) represents 67, 45, 34 and 23 kDa. Every bar means is on the relative value to maximum activity of each enzyme. These data represent the mean±SD based on triplicate studies.

3.7. 저해제의 영향에 따른 활성변화

분리 세균이 생성하는 혈전용해효소에 대한 저해제의 영향을 조사하기 위하여, metalloprotease 저해제인 EDTA와 serine protease 저해제인 PMSF에 의한 효소활성의 변화를 피브린 zymography를 통하여 조사하였다. Fig. 7에서 보는 바와 같이, Zymogram gel에서 보이는 모든 밴드(분자량 : 23 kDa, 34 kDa, 45 kDa, 67 kDa)는 저해제에 의해 감소하여, EDTA에 노출되었을 때 밴드의 활성은 72%의 잔존 활성을 유지하였으나, PMSF에 노출된 활성은 급격히 감소하여 모든 밴드를 거의 관찰할 수 없었다.


Fig. 7. 
Effect of Protease inhibitors assay on activity of fibrinolytic enzymes from B. amyloliquefaciens G-13 on the fibrin zymogram gel (A), and densitometric analysis (B). Protease inhibitor assay was carried out in enzyme reaction buffer containing 5 mM PMSF and 5 mM EDTA, respectively. (a)-(d) represents 67, 45, 34 and 23 kDa. Every bar is based on the relative value to maximum activity of each fibrinolytic enzymes. These data represent the mean±SD based on triplicate studies.

Fujita 등 [20]Bacillus subtilis var. natto가 생성하는 serine protease의 일종인 nattokinase에 PMSF를 노출시켰을 때 강력하게 활성이 억제되는 것을 보고하였다. Kim 등[11]은 청국장으로부터 분리한 Bacillus sp. CK 11-4에서 정제한 혈전용해효소 또한 PMSF에 의해 강하게 활성이 저해됨을 보고하였다. 따라서 B. amyloliquefaciens G-13이 생성하는 혈전용해활성을 가지는 4개의 밴드는 PMSF에 의해 강력하게 활성이 억제되기 때문에 serine alkaline protease로 사료된다.

오늘날 전통식품으로부터 유래한 균주들이 생산하는 혈전용해효소는 생체 내(in vivo) 혈전용해활성과 혈압 감소 효과가 입증됨에 따라 기능성 식품으로서 많은 관심을 받고 있다 [26,30]. 이에 따라, 혈전용해효소 생성 세균들과 이들이 생성하는 혈전용해효소에 대한 다양한 물리화학적 요인들에 대한 연구들이 진행되어오고 있다. 본 연구에서는 갓김치에서 분리한 혈전용해생성 세균인 B. amyloliquefaciens G-13을 이용하여, 혈전용해효소의 생성에 대한 NaCl과 캡사이신의 영향과 혈전용해효소에 대한 다양한 물리화학적 요인 (예, 온도, pH, 저해제, 금속 이온)의 영향을 확인하였다.

그 결과로 분리 세균으로부터 유래한 혈전용해효소를 통해 zymogram gel 상에서 4개의 밴드를 확인하였으며, 고농도의 NaCl과 캡사이신에서 각 효소들의 생성이 감소하는 것을 확인하였다. 또한, 이들 혈전용해효소들에 대한 온도, pH, 저해제, 금속 이온에 대한 영향을 조사하였다. 향후 연구는 해당 균주로부터 분리한 혈전용해효소들에 대한 N-terminal 아미노산 서열 분석을 통해 기존에 보고된 여러 혈전용해효소와 비교하는 연구가 진행되어야 할 것이다.


4. CONCLUSION

우리의 이전 연구에서 갓김치로부터 분리된 NaCl- 및 캡사이신-내성 세균인 Bacillus amyloliquefaciens G-13의 특성 및 혈전용해 활성을 보여주었다 [1]. 본 연구에서는 균주 G-13의 혈전용해효소에 대한 다양한 물리화학적 요인들이 미치는 영향을 조사하는 연구로 확대하였다. 먼저 G-13 균주의 혈전용해 활성의 시간 경로에 따른 혈전용해 활성의 패턴을 피브린 평판법에 의해 측정되었으며, 배양 84시간 후, 최대 혈전용해 활성은 표준으로 사용되는 plasmin의 활성보다 약 3.42배 높았다. Fibrin zymographic assay을 통해, G-13 균주로부터의 혈전용해 효소의 4개 밴드 (23, 34, 45, 67 kDa)를 fibrin zymographic gel에서 조사하였다. 이 균주는 각각 NaCl (1-10%) 또는 capsaicin (0-300 μg/mL)의 존재 하에서 생장하며, 혈전용해 효소를 생산할 수 있었다. 효소 활성을 위한 최적 pH와 온도는 8과 35oC였다. 금속 이온의 혈전용해 활성을 조사한 결과, K+, Ca2+, Mg2+ 이온은 전반적으로 증가하여 유지되었으나, Fe3+, Zn2+, Ba2+, Hg2+ 이온은 혈전용해효소의 활성을 급격히 감소시켰다. 이 효소는 phenylmethanesulfonyl fluroide (PMSF)에 의해 완전히 저해되어 serine protease인 것으로 조사되었다. 이들 결과는 B. amyloliquefaciens G-13의 혈전용해 효소에 대한 다양한 물리화학적 요인에 대한 영향을 fibrin zymographic assay를 통해 확인하여, 혈전용해효소 생성세균들의 특성을 이해하는데 중요한 단서를 제공할 것이다.


Acknowledgments

본 연구는 순천향대학교 학술연구비지원사업의 일부지원으로 수행되었음.


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