The Korean Society For Biotechnology And Bioengineering

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Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 35 , No. 3

[ Review Paper ]
Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 35, No. 3, pp.208-220
Abbreviation: KSBB J
ISSN: 1225-7117 (Print) 2288-8268 (Online)
Print publication date 30 Sep 2020
Received 01 Sep 2020 Revised 18 Sep 2020 Accepted 21 Sep 2020
DOI: https://doi.org/10.7841/ksbbj.2020.35.3.208

세포 내 단백질 전달 기술과 의학적 응용의 최신 연구 동향
박주현*
강원대학교 생물의소재공학과

Recent Advances in Intracellular Protein Delivery and Its Therapeutic Applications
Ju Hyun Park*
Department of Medical Biomaterials Engineering, Kangwon National University, Chuncheon 24341, Korea
Correspondence to : Department of Medical Biomaterials Engineering, Kangwon National University, Chuncheon 24341, Korea Tel: +82-33-6566; Fax: +82-33-259-5645 E-mail: juhyunpark@kangwon.ac.kr


© 2020 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering
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Abstract

Therapeutic protein drugs are extensively successful in the treatment of several diseases including cancers, autoimmune, and infectious diseases. However, the failure of proteins to penetrate cell and tissue barriers due to the low cellular membrane permeability limits their potentials as therapeutics. Recently, cell-penetrating peptides (CPPs), a group of small amino acids sequences capable of penetrating into the plasma membrane, have been emerged as important tools for delivering molecular cargos such as nucleic acids, synthetic drugs, and therapeutic proteins to living cells. Although the exact molecular mechanisms of cellular uptake remain still unclear, numerous studies have reported that CPPs facilitate the intracellular delivery of macromolecules with superior efficacy as well as low toxicity compared to other drug carriers. These preclinical investigations showing promising results have encouraged clinician trials for a variety of therapeutic applications. Furthermore, other approaches are utilizing CPPs in stem cell manipulation, reprogramming, and genome editing to establish efficient virus-free delivery strategies. This review summarizes recent advances in intracellular protein delivery using CPPs, as well as the types and uptake mechanisms of CPPs.


Keywords: cell-penetrating peptides (CPPs), therapeutic proteins, uptake mechanism, drug delivery

1. INTRODUCTION

단백질은 체내에서 각종 생화학적 반응의 촉매 작용, 유전자 발현의 조절, 세포 혹은 조직 간 신호 전달, 세포 골격 및 세포 외 기질 구성 등 생체 현상 유지에 필요한 수많은 생리활성 조절에 관여한다. 그런 이유로, 지난 30여년간 체외에서 취득한 단백질을 체내에 투여하여 생리 활성을 조절함으로써 질병을 치료하려는 기술이 개발되었고 임상으로의 응용이 이뤄져왔다 [1]. 1982년 미국 FDA (Food and Drug Administration)로부터 승인된 인간 인슐린 (insulin)은 상업화에 성공한 최초의 유전자 재조합 기술 기반 단백질 의약품으로 선천적인 제1형 당뇨에 더하여 후천적인 제2형 당뇨의 치료에도 사용되고 있다. 최근에는 단일 클론 항체 (monoclonal antibody, mAb) 기반 단백질 의약품이 각광받고 있는데 종양괴사인자 (TNF, tumor necrosis factor)의 기능을 억제하여 류마티스 관절염 (rheumatoid arthritis), 크론병 (Crohn’s disease)과 같은 자가면역질환 치료에 활용되는 Infliximab, Adalimumab 등이 대표적이다 [2]. 기존 저분자 화합물 기반의 약물들과 비교하여 이러한 단백질 의약품들은 체내에서 높은 표적 특이성과 함께 부작용의 위험도가 낮다는 장점을 가지는 반면, 복잡하고 거대한 분자구조 때문에 혈액 내에서 쉽게 응집되거나 효소에 의해 변성 혹은 분해되어 활성을 잃어버릴 수 있고 면역반응을 유발하여 약리학적 활성이 저해되거나 나아가 심각한 부작용을 초래할 가능성이 있다는 단점도 가진다.

특히, 단백질은 세포막의 비투과성 때문에 세포 내부까지 전달되기가 어렵다고 알려져 있다. 최근에는 세포 내 효소의 기능이 원활하지 못해 발생된 질병을 효소의 세포 내 전달을 통해 치료하려는 효소보충요법 (Enzyme Replacement Therapy, ERT)에 대한 연구 및 개발이 이뤄지고 있는데 미국 Genzyme사의 파브리병 (Fabry disease) 치료제인 Fabrazyme (agalactosidase beta), 고셔병 (Gaucher disease) 치료제인 Cerezyme (imiglucerase)이나 미국 Merck사의 췌장 부전증 (pancreatic insufficiency) 치료제인 Cotazym (pancrelipase) 등이 ERT에 활용되는 대표적인 단백질 의약품들이다 [3]. 그러나, ERT를 위한 효소 기반 단백질 의약품들과는 별개로 현존하는 단백질 의약품들은 제한적인 세포 내 전달로 인해 단일 클론 항체와 같이 혈액 내 수용성 인자나 세포막에 위치한 외부 표적을 대상으로 하는 경우가 대부분이다. 그런 이유로 단백질을 세포 내부로 전달하는 기술의 개발은 그동안 세포 외부 표적에 제한적으로 적용되어 왔던 단백질 의약품의 활용 범위를 확장하는데 크게 기여할 것으로 기대된다. 이에 따라 지금까지 단백질의 세포 내 전달을 위해 다양한 기술들이 개발되어 왔는데 각종 유·무기 합성물을 이용한 나노 입자 (nanoparticle) 혹은 세포 투과 펩타이드 (cell-penetrating peptide, CPP) 등을 이용한 것들이 대표적이다.

CPP는 8개에서 30개 사이의 아미노산으로 구성된 펩타이드로 그 물리화학적 성질에 따라 양이온성 (cationic), 양친매성 (amphipathic), 혹은 소수성 (hydrophobic)의 특징을 갖는 CPP로 구분된다. 1988년, 인간면역결핍 바이러스 (human immunodeficiency virus, HIV)에 포함된 단백질인 Tat (transactivator of transcription)의 세포 투과 기능이 관찰되고 여기서 아미노산 11개로 구성된 protein transduction domain (PTD)이 규명된 이래 자연계에 존재하는 단백질로부터 유래하거나 인공적으로 디자인되어 합성한 다양한 CPP들이 보고되어 왔다 [4]. 이에 따라 단백질, 핵산과 같이 세포 투과성이 없는 생물학적 거대 분자들을 CPP를 이용하여 세포 내부로 전달하는 기술이 개발되어 왔는데 (Fig. 1), 본 총설에서는 CPP를 활용한 세포 내 단백질 전달 기술들과 이를 통한 세포의 생리학적 특성 조절의 사례를 소개하고 이들의 의학적 응용 가능성에 대해 논의하고자 한다.


Fig. 1. 
Schemes representing CPP-mediated delivery of bioactive molecules [27].


2. CPP의 종류와 특성

HIV-1 (human immunodeficiency virus type 1) Tat 단백질 유래 PTD와 여기서 유래한 최초의 CPP (이하 TAT peptide, pTAT)가 규명된 이후, 현재까지 다수의 CPP들이 보고되었다 [5]. 초기 연구에 활용된 CPP들은 주로 자연계에 존재하는 단백질로부터 찾아낸 것들이 많았으나 이들 CPP들의 물리화학적 특성이 규명되면서 이를 모방한 인공 합성 CPP들도 개발되었다. 그리고 이들 CPP를 이용하여 단백질, 핵산, 또는 나노 입자와 같이 세포 투과성이 없는 거대 분자를 표적 세포에 전달한 수많은 in vitroin vivo 연구 결과들이 보고되었다. 그동안 보고된 대표적 CPP들의 아미노산 서열과 특성을 Table 1에 정리하였다.

Table 1. 
Various CPPs and their origins, and sequences
CPPs Origin Amino acid sequence Refs
pTAT HIV-1 Tat protein YGRKKRRQRRR [10]
VP22 HSV-1 structural protein DAATATRGRSAASRPTERPRAPAR-SASRPRRPVD [11]
Penetratin Drosophila melanogaster
Antennapedia
RQIKIWFQNRRMKWKK [12]
Transportan Chimeric galanin-mastoparan GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL [22]
Poly-arginine Chemically synthesized Rn [106]
Pep-1 Chimeric SV40 T antigen sequence-
Tryptophan-rich cluster
KETWWETWWTEWSQPKKKRKV [26]
p28 Azurin LSTAADMQGVVTDGMASGLDKDYLKPDD [67]
Low molecular weight
protamine (LMWP)
Chemically synthesized VSRRRRRRGGRRRR [107]
Pep-c19 Bombyx mori 30Kc19 VVNKLI RNNKMNC [16]

2.1. CPP의 종류

초기 CPP들은 대부분 자연계에 존재하는 단백질 중 세포 투과성을 가지는 것들로부터 주로 규명되었다. HIV-1 Tat 단백질은 바이러스 유전체의 특정 염기 서열을 인식하는 약 14 kDa의 크기의 RNA-결합 단백질로써 숙주 세포에 침입한 HIV-1 유전자의 전사를 촉진하는 기능을 한다 [6-8]. 또한 HIV-1 Tat은 양이온성의 짧은 도메인을 가지는데 이것이 이 단백질의 막 수용체 비매개 (non-membrane receptor-mediated) 내포 작용 (endocytosis)을 가능하게 하는데 이후 연구들을 통해 이 도메인의 펩타이드 서열이 규명되었다(pTAT, YGRKKRRQRRR) [9,10]. 아울러 pTAT을 구성하는 아미노산들 중 일부를 lysine 혹은 arginine으로 대체함으로써 세포 투과성을 더 높인 CPP들도 보고되었다. pTAT 외에 몇몇 CPP들이 바이러스로부터 규명되었는데 HSV-1 (herpes simplex virus type 1)을 구성하는 단백질 중 하나인 VP22에서 35개 아미노산으로 구성된 도메인이 PTD 역할을 하며 이를 세포 투과성이 없는 녹색 형광 단백질 (green fluorescent protein, GFP)와 융합하였을 때 세포 투과성이 부여되었다 [11]. 또한 노랑초파리 (fruit fly)의 신경 발달 과정에 관여하는 antennapedia (Antp) 단백질의 homeodomain 중 3번째 나선 구조에 위치한 16개의 아미노산 서열 역시 세포 투과성이 확인되었고 이 CPP는 penetratin이라는 이름으로 각종 거대 분자의 세포내 전달에 사용되고 있다 [12-14]. 30Kc19 단백질은 또다른 곤충 유래 세포 투과 단백질로 누에 (silkworm)의 체액에서 발견되었으며 약 28 kDa의 크기를 가진다 [15]. 30Kc19으로부터 세번째 나선 요소로부터 아미노산 13개로 구성된 CPP를 찾아내었고 (Pep-c19) 다양한 크기의 단백질들이 전체 30Kc19 단백질 혹은 Pep-c19과의 결합을 통해 생체 내 조직 및 세포 내부로 전달될 수 있다는 사실을 규명하였다 [16, 17]. 한편 30Kc19 단백질은 세포 투과성 외에 다른 단백질을 안정화하는 기능을 동시에 가지고 있는데 [18,19] 그로 인해 일반적인 CPP와 달리, 30Kc19을 결합한 경우에는 해당 단백질을 세포 내부로 전달할 수 있음은 물론 이를 안정화하는 결과까지 관찰되었다 [20,21].

한편, 자연계에서 유래한 CPP들의 물리화학적 특성을 참고하여 인공적으로 디자인되어 합성된 CPP들도 보고되었다. Transportan은 뇌, 척수, 장 등에서 광범위하게 발현되는 신경 신호전달 펩타이드인 galanin 뉴로펩타이드의 12개 아미노산 서열과 G-단백질 활성화 기능을 갖는 mastoparan 펩타이드의 14개 아미노산 서열을 인공적으로 연결하여 만든 키메라 펩타이드로 여타 CPP들과 같이 세포 투과성이 확인되었다 [22,23]. Poly-arginine은 8개에서 11개의 arginine으로 이뤄진 양이온성 펩타이드로써 높은 세포 투과성을 가져 세포 투과성이 없는 단백질들을 다양한 세포에 전달하는데 사용된다. 또한 단백질 외에 DNA 혹은 짧은 간섭 RNA (small interfering RNA, siRNA)와 같은 핵산을 전달하는 리포좀 (liposome)의 표면에 poly-arginine을 접합하여 유전자 전달의 효율을 증가시킨 연구 결과도 보고되었다 [24,25]. 한편, Divita와 공동연구원은 21개 아미노산 서열을 가진 양친매성 CPP를 디자인하고 이를 Pep-1으로 명명하였다. Pep-1은 3개의 서로 다른 도메인으로 구성되었는데 첫번째, tryptophan이 다수 포함된 소수성 도메인 (KETWWETWWTEW)은 소수성을 띠는 세포막과의 상호작용을 촉진하고 두번째, lysine이 다수 포함된 양이온성 도메인 (KKKRKV)은 세포 내부로의 전달 기능을 수행하며 마지막 도메인(SQP)은 앞의 두 도메인 사이를 이어주는 고리 역할을 하도록 디자인되었다. 그 결과 Pep-1은 매우 높은 효율로 다양한 단백질들을 여러 종류의 세포 내부로 전달할 수 있음이 증명되었다 [26].

2.2. CPP의 세포 투과 기전

CPP의 세포 투과 기전에 대한 수많은 연구가 수행되어 왔으나, 아직까지 그 경로는 완벽하게 규명되지 않았다. 같은 물리화학적 특성을 공유하는 CPP들 조차도 서로 다른 세포 투과 기전을 보인다는 사실이 알려져 있다. 현재까지 밝혀진 바로는, CPP들의 세포 투과 경로는 크게 두가지로 나뉘는데 첫번째는 ATP를 사용하지 않고 직접 세포막을 투과하는 경로이고 다른 하나는 ATP가 요구되는 내포 작용이다 (Fig. 2) [27-29]. 특정한 CPP의 경우 높은 농도로 처리했을 때 직접 투과되어 세포 내부로 전달되었다는 결과들도 있으나 [30,31], 보다 많은 경우에서 CPP와 CPP에 결합된 거대 분자들의 세포 투과는 내포 작용 경로를 통한다는 것이 일반적으로 받아들여지고 있다 [32,33].


Fig. 2. 
Mechanisms for intracellular penetration of CPPs [108].

CPP의 세포막 직접 투과 기전에 따르면 ATP가 필요하지 않기 때문에 세포의 생리 활동이 제한되는 저온에서도 세포 투과가 일어날 수 있고 다양한 내포 작용 저해제도 그 과정에 영향을 끼치지 않는다는 특징이 있다. 초기 pTAT에 대한 연구에서, 4oC에서도 pTAT의 세포 투과가 관찰되어 직접 투과의 가능성이 제기되었으나 이는 상당 부분 세포막에 결합한 상태였거나 세포 고정 과정에서 내부로 유입된 것으로 밝혀졌다. 그럼에도 불구하고 여러 연구에서 CPP의 세포막 직접 투과의 증거가 보고되었는데 대부분 강한 양이온성을 띠는 동시에 소수성 부위를 가지는 CPP가 고농도로 존재할 때 이러한 형태의 세포 투과가 관찰되었다. 이에 따라 몇가지 세포막 직접 투과 기전이 제안되었는데, 그 중 “뒤집힌 미셀(inverted micelle)” 모델이 대표적이다. 이 모델에 따르면 강한 양이온성을 가진 고농도의 CPP가 음이온성을 띠는 세포막의 인지질에 결합하면 소수성 부위와 함께 세포막 구조를 부분적으로 불안정화하여 뒤집힌 미셀의 형성을 유도하는데 이때 CPP는 미셀의 내부에 함입되었다가 세포막의 재안정화 과정에서 미셀이 다시 한 번 뒤집힐 때 세포 내부로 침투하게 된다 [31,34]. 미셀 형성 대신 CPP가 결합한 부위에서 세포막 인지질의 유동성이 일시적으로 증진되어 그 사이 CPP가 침투한다는 “카펫 유사 (carpet-like)” 모델도 있으나 [35] 넓은 의미에서 정전기적 인력에 의해 세포막에 결합된 CPP에 의해 세포막이 불안정해진 사이 세포 내부로 직접 투과하는 것이라는 공통점을 가진다. 최근 Futaki의 연구팀에서는 12개의 arginine으로 구성된 CPP에 소수성 태그를 결합하였을 때 뒤집힌 미셀이 형성되며 이 CPP가 세포막을 직접 투과한다는 것을 관찰하였는데 이때 arginine 숫자에 따른 양이온성의 증가와 태그에 의한 소수성이 이 투과 기전에 중요한 역할을 한다는 것을 규명하였다 [36]. 또한 Cardoso 등은 인지질로 구성된 인공 세포막을 이용한 실험을 통해 CPP와 이중 지질막 사이의 강력한 전기적 인력이 세포막 구조에 국지적인 변형을 일으켜 CPP의 세포막 직접 투과를 가능하게 한다는 이론을 제안한 바 있다 [37].

초기 pTAT을 이용한 연구에서는 능동 수송이 불가능한 저온 환경에서 관찰된 세포 투과를 근거로 CPP의 세포막 직접 투과가 주요한 세포 투과 기전으로 먼저 제안되었으나 [10], 앞서 기술한 바와 같이 이 중 많은 실험 결과가 세포막에 결합되어 있던 CPP들이 고정 과정에서 재배치된 것을 세포 투과의 증거로 잘못 해석한데 기인한다라는 것이 알려졌다 [38,39]. 여전히 세포막 직접 투과의 증거들이 보고되고 있지만, 이 후 연구들을 통해 다수의 CPP들의 경우 내포 작용이 주요한 세포 투과 경로임이 규명되었다 [28]. 내포 작용은 ATP를 사용하는 능동 수송 중 하나이며 일반적으로 수용체 연관 내포 작용과 대음세포작용 (micropinocytosis), 그리고 caveolae 내포 작용으로 구분된다 [40]. 대음세포작용은 대식 세포 (macrophage) 작용과 유사하게 액틴 필라멘트 (actin filament)의 성장으로 세포막에 생성된 주름 구조가 다시 세포막과 융합하며 소포의 형성을 유도하고, 이 과정에서 세포 외 분자들이 세포 외액과 함께 무작위로 소포에 함입되어 전달되는 과정이다 [41,42]. 한편, 수용체 매개 내포 작용 (receptor-mediated endocytosis)에서는 세포막 수용체에 결합한 세포 외 분자가 clathrin 단백질의 기능으로 생성된 소포체 (endosome) 내부에 탑재되어 세포 내부로 전달되게 된다 [43]. Caveolae 내포 작용은 clathrin 단백질이 관여하지 않으며 대신 caveolin이라는 코트 단백질에 의해 생성된 caveolae라는 50-60 nm 크기의 세포막 유래 침윤에 의해 세포 외 분자가 내부로 전달되는 과정이다 [44]. CPP 혹은 CPP-거대 분자 복합체 (이하 CPP 복합체)가 이 중 어떤 내포 작용 경로를 주로 따를 것인지는 각각의 크기 및 전기화학적 특성에 의존하게 된다 [45]. 경우에 따라 같은 CPP를 이용한 세포 투과 실험 모델에서도 하나 이상의 내포 작용 경로가 관찰되기도 하는데 이는 내포 작용을 통한 CPP의 세포 투과가 아직까지 명확히 알 수 없는 생리 현상에 의해 제어된다는 점을 시사한다 [46]. 이에 따라, CPP의 세포 투과 기전을 명확히 규명하기 위해서는 아직도 많은 연구들이 필요할 것으로 여겨진다. 한편, 어떤 경로를 따르게 되었든 내포 작용으로 세포 내부로 전달된 CPP 혹은 CPP 복합체는 일단 엔도솜 (endosome)에 갇힌 상태가 되는데 이후 리소좀 (lysosome)에서 분해되지 않기 위해서는 엔도솜에서의 탈출이 요구된다 [47]. 엔도솜에 갇힌 CPP 복합체의 탈출 기전을 설명하기 위해 다양한 가설들이 제기되었는데 양이온성의 CPP가 음이온성의 엔도솜 막과 강하게 결합하여 이를 불안정화함으로써 탈출한다는 이론과 엔도솜 성숙 과정에서 일어나는 내부의 산성화 (acidification)가 CPP와 엔도솜 막과의 결합을 촉진하여 탈출을 유도한다는 이론이 대표적이다 [48,49]. 엔도솜으로부터의 탈출은 CPP 복합체의 세포 내 전달 효율을 결정짓는 주요 인자인 만큼 효과적인 엔도솜 탈출을 위해 다양한 방법들이 개발되어왔다. 그 중 엔도솜 성숙에 따른 산성화 현상에 착안하여 pH에 따라 구조가 변하는 펩타이드를 CPP 복합체와 함께 전달하는 방법이 대표적이다 [50,51]. 예를 들어, 인플루엔자 바이러스 유래 haemagglutinin (HA) 단백질의 HA2 소단위체로부터 유래한 HA-2 펩타이드가 여러 CPP 복합체의 전달에서 엔도솜 탈출을 촉진함으로써 복합체의 세포 내 기능을 향상시킨다는 연구 결과들이 보고된 바 있다 [52,53]. 한편, 엔도솜 탈출을 위해서 다양한 화학 물질들도 사용되고 있다. 말라리아 치료제로 사용되고 있는 클로로퀸 (chroloquine)은 리소좀으로의 성숙에 따른 pH 강하를 억제하여 리소좀 효소들의 기능 저하를 유발하는 동시에 삼투압을 증가시켜 막 구조를 불안정화하는 원리로 세포막을 투과한 CPP 복합체의 엔도솜 탈출을 촉진한다 [49,54].


3. CPP를 이용한 단백질의 세포 내 전달 및 의학적 응용

그동안 약물로써 기능을 하는 거대 분자를 CPP를 이용하여 세포에 전달함으로써 이를 의학적으로 활용하려는 시도가 있어왔고, 이를 바탕으로 세포를 이용한 in vitro 연구 외에 다수의 전임상 및 임상 시험 결과가 보고되었다 (Fig. 3). DNA와 단백질과 같은 거대 분자를 세포에 전달하기 위해 리포좀 (liposome) 기반의 시약이나 전기천공법 (electroporation)과 같은 물리적인 방법들이 개발되었으나 이 경우 세포에 독성을 초래하거나 임상에 적용하기 어렵다는 한계가 있다는 단점으로 인해, 독성 및 세포 종류별 편차가 적고 다양한 범위의 약물들을 제한없이 전달할 수 있는 CPP가 많은 주목을 받고 있다. 세포 내부로의 전달이 제한적이기 때문에 질병 치료를 위한 약물로의 단백질은 그동안 세포막 수용체나 사이토카인과 같은 혈액 내 분자를 목표로 하는 경우가 대부분이었는데, 범용적인 세포 투과성을 지닌 CPP를 활용하면 단백질의 세포 투과를 가능하게 하여 단백질 의약품의 적용 범위를 훨씬 더 확장시킬 수 있을 것이다. 이에 따라 여기서는 CPP를 이용한 약물 전달 시스템 및 이를 통한 의학적 응용 사례에 대해 알아보고자 한다 (Table 2).


Fig. 3. 
CPP-driven protein delivery: Applications.

Table 2. 
Examples of application for peptide and protein delivery using CPPs
CPPs Cargos Applications Refs
pTAT Bcl-XL Ischemic brain injury and neuronal apoptosis [55]
Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) [56]
neurogenin-2 Ischemia-reperfusion injury [57]
NBD peptide Hypoxic–ischemic brain injury [58]
FGF1 Alzheimer’s disease [62]
Hsp70 Parkinson’s disease [63]
P53C’ peptide Terminal peritoneal carcinomatosis [71]
LAD Lipoamide dehydrogenase (LAD) deficiency [72]
Frataxin Friedreich’s ataxia [77]
SOD Ischemic brain injury [82]
UVB-induced skin damage [83]
Penetratin Cytotoxic T lymphocyte peptide of ovalbumin Anti-tumor T cell responses [66]
Pep-1 SOD, CAT Ischemia-reperfusion injury [84]
Poly-arginine TALEN Genome editing [86,87]
Cas9 Genome editing [90]
Oct4, Sox2, cMyc, Klf4 Reprogramming of somatic cells to iPSCs [97,98]
30Kc19 Cbf β Osteogenic programming of human MSCs [96]
Ascl1 Direct conversion of somatic cells into neurons [104]

3.1. 신경계 질환 치료를 위한 단백질 전달

동맥혈 흐름의 차단으로 대뇌 산소 공급이 원활하지 못해 일어나는 대뇌 허혈증 (cerebral ischemia)은 대표적인 신경 질환 중 하나이며 이에 대한 치료와 관련해 많은 연구들이 수행되어 왔다. Cao와 공동연구자들은 세포 사멸 (apoptosis) 억제 인자인 Bcl-XL에 CPP인 pTAT과 엔도솜 탈출을 위한 HA-2 펩타이드까지 결합한 재조합 단백질을 생산하여 이를 허혈증 생쥐 모델에 복강 투여 방식으로 적용한 결과, 대조군에 비해 뉴런의 세포 사멸이 억제되었고 이에 따라 뇌의 경색 부위가 감소한 것을 확인하였다 [55]. Bcl-XL의 전달은 운동신경세포의 소멸로 인해 유발되는 질병인 근위축성 측삭 경화증 (amyotrophic lateral sclerosis, ALS)의 치료에도 적용되었다. Martorana와 공동연구자들은 Bcl-XL의 상동 영역 (homology domain)인 BH4에 pTAT을 결합한 재조합 펩타이드를 ALS 형질변환 생쥐에 투여했을 때 성상세포 (astrocyte)의 소멸이 억제되고 그 결과 운동능력 소실 과정이 어느정도 지연되었음을 확인하였다 [56]. 한편 CPP를 이용하여 신경 세포의 생존 및 분화 조절에 관여하는 전사 인자 (transcription factor)를 직접 전달하는 연구들도 수행되었다. Deng과 공동연구자들은 신경전구세포 (neural precursor cells)의 생존과 분화를 촉진하는 전사 인자인 neurogenin-2에 CPP가 결합된 재조합 단백질을 생산하여 이를 동물 모델에 적용했을 때 대뇌의 허혈성 재관류 손상 (ischemia-reperfusion injury)이 개선된 것을 확인하였다 [57]. 다른 연구에서는 전사 인자인 nuclear factor kappa B (NF-κB)에 대해 저해 기능을 갖는 펩타이드를 CPP와 결합하여 전달한 경우 허혈성 뇌 손상 개선 효과가 관찰되기도 하였다 [58].

CPP를 이용한 단백질 전달은 알츠하이머 병 (Alzheimer’s disease)이나 파킨슨 병 (Parkinson’s disease)과 같은 퇴행성 신경질환 치료에도 적용되고 있다. Human acidic fibroblast growth factor (FGF1)는 다양한 세포에서 증식 효과가 알려진 성장 인자로 여러 연구에서 신경세포 보호 효과가 보고된 바 있다 [59-61]. Lou와 공동연구자들은 CPP인 pTAT을 FGF1에 결합하여 만든 재조합 단백질을 알츠하이머 병 생쥐 모델에 비강을 통해 투여한 결과, 병변의 진행 속도가 유의미하게 지연되는 것을 확인하였다 [62]. 한편 Nagel과 공동연구자들은 파킨슨 병의 치료를 위해 heat shock protein 70 (Hsp70)을 중뇌 조직에 전달하고자 하였다 [63]. Hsp70은 단백질의 접힘을 도와주고 비특이적 응집을 차단하는 chaperone의 일종인데 세포 사멸 과정 중에 일어나는 caspase의 활성화를 억제한다 [64]. 이 연구에서는 신경 독소인 MPTP를 처리하여 파킨슨 병을 유발한 생쥐에 pTAT이 결합된 Hsp70을 투여한 결과, 중뇌 도파민 (dopamine) 분비 뉴런의 사멸이 유의미하게 감소하고 전체 도파민 분비량이 일정 부분 회복되었음을 확인하였다. 이렇듯 많은 연구에서 CPP가 결합된 단백질을 혈액에 투여하여 뇌 조직의 손상과 질병을 제어한 결과가 확인되었는데 이는 CPP가 세포막을 투과할 뿐만 아니라 뇌 조직과 혈액을 보다 격리시키는 혈관 장벽인 혈액-뇌-장벽 (blood-brain barrier, BBB)도 투과하여 결합된 단백질을 효과적으로 전달할 수 있음을 보여준다.

3.2. 항암 치료를 위한 단백질 전달

CPP를 이용한 단백질 전달 기술은 암세포의 발생과 성장을 억제하는 항암 치료에도 활용되고 있다. 대표적으로 백신 기능을 하는 펩타이드를 CPP와 결합하여 전달함으로써 세포 매개 면역 (cell-mediated immunity)을 강화시켜 항암 치료에 적용하는 기술이 있다. 여기에서는 CPP-백신 펩타이드 복합체를 혈액 내 항원 제시 세포 (antigen presenting cell, APC)의 세포질까지 전달하여 APC로 하여금 1형 주조직 적합성 복합체 (major histocompatibility complex I, MHC class I)를 통해 이를 표면에 표시하도록 한 뒤, 활성화된 세포 독성 T 세포 (cytotoxic T cell)가 같은 표적을 표시하고 있는 암세포를 선별적으로 공격하도록 유도한다 [65]. Pouniotis와 공동연구자들은 ovalbumin 유래 펩타이드를 penetratin과 결합시킨 복합체를 동물 모델에 적용한 결과, CD4+와 CD8+ T 세포가 활성화되었고 그 결과 종양의 성장이 유의미하게 감소하였음을 확인하였다 [66].

암세포의 발생 및 사멸 기전의 조절에 중대한 영향을 주는 세포주기 조절 인자인 p53은 항암 연구에 있어 주요 목표 중 하나이다. 그동안 p53의 기능을 조절하여 항암 효과를 유도하려는 시도들이 있었는데, azurin이라는 단백질에서 유래한 짧은 펩타이드로써, ubiquitination에 의한 p53의 분해를 억제하여 암세포의 성장을 저해하는 한편 신생혈관형성을 억제하여 종양에 필요한 영양분 공급을 차단하는 기능을 가지는 p28에 대한 연구가 많이 이뤄져왔다 [67,68]. p28은 26개의 아미노산으로 구성된 양친매성 CPP의 일종으로 그 자체가 가진 세포 투과 기능을 통해 임상 시험에 적용되어 유의미한 수준의 종양 크기 감소 및 환자의 생존 기간 연장 효과를 보였을 뿐만 아니라 [69], 세포 사멸을 유도하는 다른 펩타이드와 결합되어 세포에 처리되었을 때는 암세포에만 특이적으로 사멸 유도 효과를 보였다 [70]. 한편 Snyder와 공동연구자들은 정상적인 p53뿐 아니라 돌연변이 p53와도 상호 작용할 수 있는 펩타이드를 pTAT과 결합하여 합성한 후, 이를 말기 복막 암종증 (peritoneal carcinomatosis)과 림프종증 (lymphoma) 동물 모델에 적용한 결과, p53의 유전자 발현 조절 기능을 활성화하여 암세포의 사멸을 유도함으로써 유의미한 종양 크기 감소 및 생존 기간 증가를 유도하였다 [71].

3.3. 의학적 응용을 위한 효소의 전달

효소보충요법 (enzyme replacement therapy, ERT)은 특정 효소의 기능이 선천적 혹은 후천적으로 결여된 것에 따른 질병을 치료하기 위해 이들 효소를 체외에서 투여해주는 방법을 의미한다. 파브리 병 (Fabry disease)은 각종 당지질들을 리소좀(lysosome)에서 분해하는 데 필요한 alpha-galactosidase (α-gal)의 유전자에 돌연변이가 있는 경우, 혈관에 분해되지 못한 당지질이 축적되어 유발되는 질병인데, 다국적 제약사인 Sanofi Genzyme사에서 개발된 단백질 의약품인 Fabrazyme¢ç (성분명 α-gal beta)을 이용한 파브리 병의 치료가 ERT의 대표적인 사례 중 하나이다.

많은 경우에서 ERT는 대사 질환과 관련된 효소를 대상으로 하고 있다. Lipoamide dehydrogenase (LAD)는 미토콘드리아에서 아미노산, 탄수화물 등의 대사 과정에 관여하는 효소로써 LAD 유전자의 결손은 다양한 대사 질환들을 유발한다. Rapoport와 공동연구자들은 LAD에 pTAT을 결합한 재조합 단백질을 대장균 시스템을 이용하여 생산하였고 이를 LAD 결손 환자의 세포 및 생쥐 모델에 적용하였다 [72,73]. 세포를 이용한 실험에서, pTAT 결합 LAD는 세포 내부의 미토콘드리아에 전달되어 산화적 인산화 과정에서 중요한 역할을 하는 pyruvate dehydrogenase complex (PDHC)의 활성을 증가시켰다. 나아가, 동물 실험에서 pTAT 결합 LAD는 간, 심장, 뇌 등 다양한 조직까지 전달되어 조직 내 LAD 효소 활성을 회복시켰고 그 결과 PDHC의 활성도 증가하였다. 또한 NADH dehydrogenase complex의 구성 요소들을 각각 pTAT과 결합한 재조합 단백질은 미토콘드리아까지 전달되어 해당 효소들의 유전적 결손이 유도된 세포에서 산화적 인산화 기능을 일정 부분 회복시킨다는 것이 밝혀졌다 [74,75]. Fredreich ataxia는 상염색체 열성 운동 실조증으로 frataxin이라는 미토콘드리아 효소의 유전자에 생긴 돌연변이가 원인이며 아직까지 확실한 치료법이 개발되지 않은 유전성 대사 질환 중 하나이다. 최근에는 CPP가 결합된 재조합 frataxin 단백질을 유전자 결손 동물 모델에 적용한 결과 심장, 신경, 근육 조직에 전달되어 미토콘드리아 기능을 회복시켰고 생존 기간도 연장된 연구 결과도 보고되었다 [76,77].

활성 산소 (reactive oxygen species, ROS)는 세포 내 산소 대사 과정에서 발생하는 부산물로 단백질, 지질, 핵산과 같은 세포 구성물에 손상을 유발할 뿐 아니라 세포 신호 전달에도 영향을 끼쳐 암, 면역 체계 교란, 신경 질환 등을 유발하고 노화를 촉진한다고 알려져 있다 [78-80]. 그런 이유로 항산화를 위한 다양한 치료 전략이 개발되어 왔고 그 중에는 항산화 기능을 가지는 효소를 직접 전달하는 방법도 포함되어 있다. Superoxide dismutase (SOD)는 세포 내에서 초과산화물(superoxide)을 과산화수소 (H2O2)와 산소 (O2)로 전환시키는 효소로써 세포를 활성산소에 의한 산화스트레스로부터 보호하는 기능을 한다. 여기서 생성된 과산화수소는 또다른 항산화효소인 catalase (CAT) 혹은 glutathione peroxidase (GPX) 등의 효소에 의해 물과 산소로 전환되어 사라진다. 이에 따라, 다양한 CPP를 활용하여 이들 항산화 효소를 조직 또는 세포에 전달함으로써 세포 내 산화스트레스를 감소시키려는 연구들이 수행되었다. 한 연구진은 pTAT이 결합된 SOD 재조합 단백질을 세포에 처리하였을 때 산화스트레스에 의한 세포 사멸이 유의미하게 감소하였고 이를 생쥐 모델에 적용한 결과 허혈성 뇌 손상에 따른 뇌세포의 사멸이 억제되었음을 규명하였다 [81,82]. 자외선 노출에 따른 활성산소의 발생은 피부 노화에 대한 중요한 원인 중 하나로 여겨지는데, pTAT이 결합된 SOD는 피부 조직 내 전달되어 자외선 B (280-320 nm 파장) 조사에 의한 피부 세포의 사멸 및 조직 손상을 일정 부분 회복시킨다는 임상 연구 결과도 보고되었다 [83]. SOD 외에 다른 항산화 효소의 전달 연구도 수행되었는데, Huang과 공동연구자들의 연구에서는 CPP의 일종인 Pep-1이 결합된 SOD와 CAT을 동물 모델에 함께 복강 투여했을 때 이들 재조합 단백질들이 심근 조직까지 전달되었고 허혈 재관류 손상 (ischemia-reperfusion injury)으로부터 심근 세포를 보호한다는 것이 규명되었다 [84].

3.4. 유전체 교정을 위한 핵산 분해 효소 (nuclease) 전달

유전체 내 특정 부위의 DNA 서열을 교정할 수 있는 이른바 “유전체 교정 (genome editing)” 기술의 발전은 인간을 포함한 각종 동·식물 및 미생물 등 모든 생명체의 유전 정보를 연구자가 원하는 대로 편집할 수 있다는 점에서 큰 관심을 받고 있다. Zinc-finger nuclease (ZFN)와 transcription activator-like effector nuclease (TALEN)은 지금까지 널리 사용되어온 유전자-특이적 인공 nuclease로 FokI 제한 효소의 DNA 절단 부위와 표적 DNA 서열에 맞게 각각 디자인된 DNA 인지 부위를 융합하여 만들어진다 [85]. Ru와 공동연구자들은 각각 ZFN과 TALEN에 pTAT을 결합한 융합 단백질을 대장균 발현 시스템을 이용하여 생산하였고 이를 인간 암세포와 만능 줄기세포에 처리하였을 때 특정 유전자 부위에 돌연변이가 생성된 연구 결과를 보고하였다 [86]. Liu와 공동연구자들은 CPP와 nuclease를 유전자 수준에서 융합하여 재조합 단백질로 생산하기보다 따로 생산된 TALEN 재조합 단백질에 합성된 CPP인 poly-arginine을 이황화결합으로 연결하여 인간 세포에 처리한 결과, 유전체 내 표적 DNA 서열에만 특이적으로 돌연변이가 유발된 것을 확인하였다 [87].

한편, CRISPR (clustered, regularly interspaced, short palindromic repeat)-Cas9 시스템은 Cas9이라는 nuclease가 유전체 내 특정 DNA 서열을 인식할 수 있는 가이드 RNA의 도움을 받아 유전체 내 해당 서열에 double stranded break (DSB)를 유발함으로써 유전체 교정을 가능하게 하는 도구이다 [88,89]. Ramakrishna와 공동연구자들은 Cas9 재조합 단백질에 CPP인 poly-arginine을 thioether 결합으로 연결하는 한편, 음전하를 띠는 가이드 RNA는 양전하를 띠는 poly-arginine CPP와 혼합하여 복합체를 형성하게 한 후 각각을 세포에 처리하였을 때 유전체 내 특정 DNA 서열에 돌연변이가 유발되는 것을 확인하였다 [90]. 그리고 Kim과 공동연구자들은 Cas9에 양전하를 띠는 CPP의 일종인 low molecular weight protamine (LMWP)을 결합한 재조합 단백질과 가이드 RNA를 혼합해 음전하를 띠는 가이드 RNA가 양전하가 강한 LMWP 부분에 결합하도록 하였다. 이렇게 만들어진 Cas9-LMWP/가이드 RNA 복합체를 처리한 결과, in vitro 뿐만 아니라 in vivo에서도 특이적인 유전자 돌연변이가 유발되었다 [91]. 또한 Lostalé-Seijo와 공동연구자들은 arginine과 leucine으로 구성된 나선구조의 양친매성 펩타이드에 소수성의 알데이드를 결합하여 구조체를 제작한 후 이를 Cas9과 혼합하였을 때, 정전기적 인력에 의해 형성된 복합체가 세포 내부로 전달되어 유전자 특이적 돌연변이를 유발함을 확인하였다 [92]. 한편 Cas9을 세포 내 직접 전달한 많은 연구에서 CPP 뿐만 아니라 nucleus localizing sequence (NLS)도 함께 도입하여 세포막을 투과한 Cas9이 유전체가 위치하는 세포핵까지 도달할 수 있도록 도왔는데, Staahl과 공동연구자들은 Cas9의 N 말단과 C말단 부위에 각각 4개와 2개의 NLS를 반복하여 결합하였을 때 (4×NLS-Cas9-2×NLS) 이것이 세포 투과성을 가지게 된다는 사실을 발견하였고, 이 4×NLS-Cas9-2×NLS와 가이드 RNA를 혼합하여 생성한 복합체를 세포에 전달함으로써 유전자 특이적 돌연변이를 유발하였다 [93].

3.5. 전사 인자 전달을 통한 줄기세포 분화 조절 및 체세포의 Reprogramming

CPP를 이용한 단백질 전달 기술은 각종 전사 인자를 세포 핵에 전달하여 줄기세포의 분화 능력과 방향을 조절하는데 활용되고 있다. Jo와 공동연구자들은 만능성 (pluripotency) 관련 유전자들의 발현을 조절하는 전사 인자인 estrogen-related receptor β (ESRRB)에 poly-arginine CPP이 결합된 재조합 단백질을 생산하였고 이를 각종 줄기세포에 처리한 결과, 만능성 관련 유전자들의 발현이 증가하는 한편 세포 증식과 분화 능력이 향상되었음을 확인하였다 [94]. 골수 유래 중간엽 줄기세포 (bone marrow-derived mesenchymal stem cell, BM-MSC)는 주로 조골세포 (osteoblast), 연골세포 (chondrocyte), 지방세포 (adipocyte)로 분화하고 일부는 근세포 (myocyte), 뉴런 (neuron) 등으로도 분화할 수 있는 성체줄기세포이다. 전사 인자의 직접 전달을 통해 BM-MSC의 분화 방향을 조절하려는 시도들이 있었는데, Thiagarajan과 공동연구자들은 조골세포 성숙과 관련한 전사 인자인 Runx2에 세포막 결합을 촉진하는 GAG-결합 펩타이드와 poly-arginine CPP를 함께 결합하여 재조합 단백질로 만든 뒤 이를 BM-MSCs에 처리하였을 때, 조골세포로의 분화가 촉진된다는 것을 다양한 표현형 및 (예. 조골세포 기능에 따른 칼슘 기질 형성) 유전자 발현의 변화를 관찰하여 확인하였다 [95]. 또한 필자가 속한 연구진은 최근 연구에서 역시 조골세포 관련 전사 인자인 core-binding factor β (Cbf β)에 세포 투과 기능이 있는 30Kc19을 결합한 재조합 단백질을 BM-MSCs에 처리하여 조골세포로의 분화를 촉진하는 한편, 지방세포로의 분화는 억제한 결과를 확인함으로써 CPP를 이용한 전사 인자의 세포 내 전달을 통해 줄기세포의 분화 방향 제어가 가능하다는 것을 증명하였다 [96].

뿐만 아니라, CPP를 이용한 전사 인자의 직접 전달을 통해 분화가 끝난 체세포를 만능줄기세포나 다른 계통의 세포로 reprogramming하는 연구도 수행되고 있다. Zhou와 공동연구자들은 대장균 시스템을 이용하여 4개의 전사 인자 (Oct4, Sox2, cMyc, Klf4)에 poly-arginine CPP를 결합한 재조합 단백질을 생산하였고 이를 생쥐의 태아 섬유아세포에 처리하여 유도만능줄기세포 (induced pluripotent stem cells, iPSCs)로 reprogramming하였다 [97]. 같은 시기에 발표된 Kim과 공동연구자들의 연구에서는 같은 4개의 전사 인자에 arginine의 개수만 다른 poly-arginine CPP를 결합하였는데 이것들을 대장균이 아닌 동물 세포에서 생산하여 사용하였다. 이 CPP 결합 재조합 전사 인자들을 인간 피부 섬유아세포에 처리한 결과 iPSCs로의 reprogramming을 유도할 수 있었다 [98]. 이후에도 각기 다른 CPP들을 4종 전사 인자에 결합한 재조합 단백질을 이용하여 체세포를 iPSCs로 reprogramming한 연구들이 보고된 바 있다 [99-101]. 한편 최근에는 iPSCs로의 전환 외에 체세포를 다른 계통의 세포로 reprogramming하는, 이른바 직접 교차 분화 (direct conversion)에도 CPP를 이용한 전사 인자의 직접 전달 기술이 활용되었다. Islas와 공동연구자들은 각각 ETS2와 MESP1이라는 전사 인자에 pTAT을 결합한 융합 단백질을 인간 피부 섬유아세포에 전달하여 심근 전구세포 (cardiac progenitor)로 전환하고자 하였고 [102], Hu와 공동연구자들은 전사 인자인 Sox2에 근래 개발된 새로운 CPP인 C-end rule 펩타이드 (CendR)를 결합한 융합 단백질을 망막 색소 상피세포 (retinal pigmented epithelial cell)에 전달하여 뉴런으로의 직접 교차 분화를 유도하였다 [103]. 또한 Ryu와 공동연구자들은 뉴런과 관련된 전사 인자인 Ascl1에 30Kc19 단백질을 결합한 재조합 단백질을 생쥐 태아 섬유아세포에 처리하여 세포 투과를 확인한 후, 이를 성상 세포 (astrocyte)와 함께 배양하여 뉴런의 특징을 가지는 세포로 직접 교차 분화한 결과를 보고하였다 [104].


4. CONCLUSION

HIV-1 Tat 단백질의 세포 투과성 및 기전의 규명과 pTAT의 발견으로부터 시작된 많은 연구에서 일반적으로 세포 투과성이 없는 거대 분자인 단백질을 CPP를 이용하여 세포 및 조직 내부로 전달할 수 있다는 것이 규명되었다. 거대 분자의 세포 내 전달을 위한 다른 방법들에 비해, CPP를 이용한 전달은 세포에 유발하는 독성이 상대적으로 적고 세포의 종류에 따른 전달 효율의 변화가 크기 않다는 장점을 지니고 있다. 그러나 각 CPP의 물리적, 화학적 특성에 따른 세포 투과 기전의 차이가 아직 명확히 규명되지 않았고 상피 세포와 같이 세포 간에 강한 tight junction을 형성한 조직에서는 투과성이 크게 저하된다는 연구 결과도 보고된 만큼 [105] 아직 추가적인 연구들도 요구된다. 또한 세포막을 통과하여 엔도솜에 갇힌 CPP 복합체가 여기서 탈출하지 못하고 리소좀 작용에 의해 분해됨으로써 최종적인 전달 효율이 크게 감소하는 것도 CPP를 이용한 단백질 전달 기술의 주요 문제점으로 지적되고 있다. 이러한 문제점들을 극복해야 할 필요가 있음에도 불구하고 CPP를 이용한 단백질 전달은 기초 의학 연구부터 질병 치료를 위한 임상 적용에 이르는 다양한 분야에 활용될 핵심 기술이 될 것임이 자명해 보인다. 현재 다수의 CPP를 이용한 펩타이드 혹은 단백질 전달 치료법이 전임상 단계를 거쳐 임상 시험에 적용 중이라는 사실이 이를 증명한다 [27]. 이와 더불어, CPP를 이용한 단백질 전달 기술은 그동안 사용되어 온 단백질 의약품의 적용 범위를 세포 내부의 표적까지 크게 확장시키는 데 기여할 수 있을 것으로 기대된다.


Acknowledgments

This study was supported by the National Research Foundation of Korea (NRF), funded by the Ministry of Science and ICT (NRF- 2017M3A9C6031798 and 2018R1C1B6007644).


REFERENCES
1. Leader, B., Q. J. Baca, and D. E. Golan (2008) Protein therapeutics: a summary and pharmacological classification. Nat. Rev. Drug Discov. 7: 21-39.
2. Nelson, A. L., E. Dhimolea, and J. M. Reichert (2010) Development trends for human monoclonal antibody therapeutics. Nat. Rev. Drug Discov. 9: 767-774.
3. Brady, R. O., and R. Schiffmann (2004) Enzyme-replacement therapy for metabolic storage disorders. Lancet Neurol. 3: 752-756.
4. Frankel, A. D., and C. O. Pabo (1988) Cellular uptake of the tat protein from human immunodeficiency virus. Cell. 55: 1189-1193.
5. Liu, H., F. Zeng, M. Zhang, F. Huang, J. Wang, J. Guo, C. Liu, and H. Wang (2016) Emerging landscape of cell penetrating peptide in reprogramming and gene editing. J. Control. Release. 226: 124-137.
6. Feng, S., and E. C. Holland (1988) HIV-1 tat trans-activation requires the loop sequence within tar. Nature. 334: 165-167.
7. Kurnaeva, M. A., E. V. Sheval, Y. R. Musinova, and Y. S. Vassetzky (2019) Tat basic domain: A “Swiss army knife” of HIV-1 Tat? Rev. Med. Virol. 29: e2031.
8. Spector, C., A. R. Mele, B. Wigdahl, and M. R. Nonnemacher (2019) Genetic variation and function of the HIV-1 Tat protein. Med. Microbiol. Immunol. 208: 131-169.
9. Heitz, F., M. C. Morris, and G. Divita (2009) Twenty years of cell-penetrating peptides: from molecular mechanisms to therapeutics. Br. J. Pharmacol. 157: 195-206.
10. Vives, E., P. Brodin, and B. Lebleu (1997) A truncated HIV-1 Tat protein basic domain rapidly translocates through the plasma membrane and accumulates in the cell nucleus. J. Biol. Chem. 272: 16010-16017.
11. Elliott, G., and P. O'Hare (1997) Intercellular trafficking and protein delivery by a herpesvirus structural protein. Cell. 88: 223-233.
12. Derossi, D., A. H. Joliot, G. Chassaing, and A. Prochiantz (1994) The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes. J. Biol. Chem. 269: 10444-10450.
13. Sharma, G., S. Lakkadwala, A. Modgil, and J. Singh (2016) The role of cell-penetrating peptide and transferrin on enhanced delivery of drug to brain. Int. J. Mol. Sci. 17: 806.
14. Gehan, P., S. Kulifaj, P. Soule, J. Bodin, M. Amoura, A. Walrant, S. Sagan, A. Thiam, K. Ngo, and V. Vivier (2020) Penetratin translocation mechanism through asymmetric droplet interface bilayers. Biochim. Biophys. Acta Biomembr. 1862: 183415.
15. Park, J. H., J. H. Lee, H. H. Park, W. J. Rhee, S. S. Choi, and T. H. Park (2012) A protein delivery system using 30Kc19 cell-penetrating protein originating from silkworm. Biomaterials. 33: 9127-9134.
16. Park, H. H., Y. Sohn, J. W. Yeo, J. H. Park, H. J. Lee, J. Ryu, W. J. Rhee, and T. H. Park (2014) Identification and characterization of a novel cell-penetrating peptide of 30Kc19 protein derived from Bombyx mori. Process Biochem. 49: 1516-1526.
17. Ryu, J., H. Kim, H. H. Park, H. J. Lee, J. H. Park, W. J. Rhee, and T. H. Park (2016) Protein-stabilizing and cell-penetrating properties of α-helix domain of 30Kc19 protein. Biotechnol. J. 11: 1443-1451.
18. Park, J. H., H. H. Park, S. S. Choi, and T. H. Park (2012) Stabilization of enzymes by the recombinant 30Kc19 protein. Process Biochem. 47: 164-169.
19. Park, J. H., H. J. Lee, H. H. Park, W. J. Rhee, and T. H. Park (2015) Stabilization of cellular mitochondrial enzyme complex and sialyltransferase activity through supplementation of 30Kc19 protein. Appl. Microbiol. Biotechnol. 99: 2155-2163.
20. Ryu, J., H. H. Park, J. H. Park, H. J. Lee, W. J. Rhee, and T. H. Park (2016) Soluble expression and stability enhancement of transcription factors using 30Kc19 cell-penetrating protein. Appl. Microbiol. Biotechnol. 100: 3523-3532.
21. Lee, J., H. H. Park, and J. H. Park (2019) Efficient Production of Cell-permeable Oct4 Protein Using 30Kc19 Protein Originating from Silkworm. Biotechnol. Bioprocess Eng. 24: 964-971.
22. Pooga, M., M. Hällbrink, M. Zorko, and Ü. Langel (1998) Cell penetration by transportan. FASEB J. 12: 67-77.
23. Moghal, M. M. R., M. Z. Islam, F. Hossain, S. K. Saha, and M. Yamazaki (2020) Role of membrane potential on entry of cell-penetrating peptide transportan 10 into single vesicles. Biophys. J. 118: 57-69.
24. Opanasopit, P., J. Tragulpakseerojn, A. Apirakaramwong, T. Ngawhirunpat, T. Rojanarata, and U. Ruktanonchai (2011) The development of poly-L-arginine-coated liposomes for gene delivery. Int. J. Nanomedicine. 6: 2245.
25. Zhang, C., N. Tang, X. Liu, W. Liang, W. Xu, and V. P. Torchilin (2006) siRNA-containing liposomes modified with polyarginine effectively silence the targeted gene. J. Control. Release. 112: 229-239.
26. Morris, M. C., J. Depollier, J. Mery, F. Heitz, and G. Divita (2001) A peptide carrier for the delivery of biologically active proteins into mammalian cells. Nat. Biotechnol. 19: 1173-1176.
27. Guidotti, G., L. Brambilla, and D. Rossi (2017) Cell-penetrating peptides: from basic research to clinics. Trends Pharmacol. Sci. 38: 406-424.
28. Madani, F., S. Lindberg, Ü. Langel, S. Futaki, and A. Gräslund (2011) Mechanisms of cellular uptake of cell-penetrating peptides. J. Biophys. 2011: 414729.
29. Xu, J., A. R. Khan, M. Fu, R. Wang, J. Ji, and G. Zhai (2019) Cell-penetrating peptide: A means of breaking through the physiological barriers of different tissues and organs. J. Control. Release. 309: 106-124.
30. Fretz, M. M., N. A. Penning, S. Al-Taei, S. Futaki, T. Takeuchi, I. Nakase, G. Storm, and A. T. Jones (2007) Temperature-, concentration- and cholesterol-dependent translocation of L-and D-octaarginine across the plasma and nuclear membrane of CD34+ leukaemia cells. Biochem. J. 403: 335-342.
31. Kosuge, M., T. Takeuchi, I. Nakase, A. T. Jones, and S. Futaki (2008) Cellular internalization and distribution of arginine-rich peptides as a function of extracellular peptide concentration, serum, and plasma membrane associated proteoglycans. Bioconjug. Chem. 19: 656-664.
32. Lundberg, M., S. Wikström, and M. Johansson (2003) Cell surface adherence and endocytosis of protein transduction domains. Mol. Ther. 8: 143-150.
33. Palm-Apergi, C., P. Lönn, and S. F. Dowdy (2012) Do Cell-penetrating peptides actually “penetrate” cellular membranes? Mol. Ther. 20: 695-697.
34. Alves, I. D., N. Goasdoué, I. Correia, S. Aubry, C. Galanth, S. Sagan, S. Lavielle, and G. Chassaing (2008) Membrane interaction and perturbation mechanisms induced by two cationic cell penetrating peptides with distinct charge distribution. Biochim. Biophys. Acta Gen. Subj. 1780: 948-959.
35. Thennarasu, S., A. Tan, R. Penumatchu, C. E. Shelburne, D. L. Heyl, and A. Ramamoorthy (2010) Antimicrobial and membrane disrupting activities of a peptide derived from the human cathelicidin antimicrobial peptide LL37. Biophys. J. 98: 248-257.
36. Hirose, H., T. Takeuchi, H. Osakada, S. Pujals, S. Katayama, I. Nakase, S. Kobayashi, T. Haraguchi, and S. Futaki (2012) Transient focal membrane deformation induced by arginine-rich peptides leads to their direct penetration into cells. Mol. Ther. 20: 984-993.
37. Cardoso, A. M. S., S. Trabulo, A. L. Cardoso, A. Lorents, C. M. Morais, P. Gomes, C. Nunes, M. Lúcio, S. Reis, K. Padari, M. Pooga, M. C. Pedroso de Lima, and A. S. Jurado (2012) S4(13)-PV cell-penetrating peptide induces physical and morphological changes in membrane-mimetic lipid systems and cell membranes: Implications for cell internalization. Biochim. Biophys. Acta Biomembr. 1818: 877-888.
38. Lundberg, M., and M. Johansson (2001) Is VP22 nuclear homing an artifact? Nat. Biotechnol. 19: 713-713.
39. Richard, J. P., K. Melikov, E. Vives, C. Ramos, B. Verbeure, M. J. Gait, L. V. Chernomordik, and B. Lebleu (2003) Cell-penetrating peptides a reevaluation of the mechanism of cellular uptake. J. Biol. Chem. 278: 585-590.
40. Koren, E., and V. P. Torchilin (2012) Cell-penetrating peptides: breaking through to the other side. Trends Mol. Med. 18: 385-393.
41. Lim, J. P., and P. A. Gleeson (2011) Macropinocytosis: an endocytic pathway for internalising large gulps. Immunol. Cell Biol. 89: 836-843.
42. Jones, A. T. (2007) Macropinocytosis: searching for an endocytic identity and role in the uptake of cell penetrating peptides. J. Cell. Mol. Med. 11: 670-684.
43. Takei, K., and V. Haucke (2001) Clathrin-mediated endocytosis: membrane factors pull the trigger. Trends Cell Biol. 11: 385-391.
44. Kovtun, O., V. A. Tillu, N. Ariotti, R. G. Parton, and B. M. Collins (2015) Cavin family proteins and the assembly of caveolae. J. Cell Sci. 128: 1269-1278.
45. Maiolo, J. R., M. Ferrer, and E. A. Ottinger (2005) Effects of cargo molecules on the cellular uptake of arginine-rich cell-penetrating peptides. Biochim. Biophys. Acta Biomembr. 1712: 161-172.
46. Wang, F., Y. Wang, X. Zhang, W. Zhang, S. Guo, and F. Jin (2014) Recent progress of cell-penetrating peptides as new carriers for intracellular cargo delivery. J. Control. Release. 174: 126-136.
47. van den Berg, A., and S. F. Dowdy (2011) Protein transduction domain delivery of therapeutic macromolecules. Curr. Opin. Biotechnol. 22: 888-893.
48. Hitz, T., R. Iten, J. Gardiner, K. Namoto, P. Walde, and D. Seebach (2006) Interaction of α-and β-oligoarginine-acids and amides with anionic lipid vesicles: a mechanistic and thermodynamic study. Biochemistry. 45: 5817-5829.
49. Varkouhi, A. K., M. Scholte, G. Storm, and H. J. Haisma (2011) Endosomal escape pathways for delivery of biologicals. J. Control. Release. 151: 220-228.
50. Arafiles, J. V. V., H. Hirose, M. Akishiba, S. Tsuji, M. Imanishi, and S. Futaki (2020) Stimulating macropinocytosis for intracellular nucleic acid and protein delivery: A combined strategy with membrane-lytic peptides to facilitate endosomal escape. Bioconjug. Chem. 31: 547-553.
51. Li, C., X.-W. Cao, J. Zhao, and F.-J. Wang (2020) Effective therapeutic drug delivery by GALA3, an endosomal escape peptide with reduced hydrophobicity. J. Membr. Biol. 253: 139-152.
52. Plank, C., B. Oberhauser, K. Mechtler, C. Koch, and E. Wagner (1994) The influence of endosome-disruptive peptides on gene transfer using synthetic virus-like gene transfer systems. J. Biol. Chem. 269: 12918-12924.
53. Wadia, J. S., R. V. Stan, and S. F. Dowdy (2004) Transducible TAT-HA fusogenic peptide enhances escape of TAT-fusion proteins after lipid raft macropinocytosis. Nat. Med. 10: 310-315.
54. Ambudkar, S. V., C. Kimchi-Sarfaty, Z. E. Sauna, and M. M. Gottesman (2003) P-glycoprotein: from genomics to mechanism. Oncogene. 22: 7468-7485.
55. Cao, G., W. Pei, H. Ge, Q. Liang, Y. Luo, F. R. Sharp, A. Lu, R. Ran, S. H. Graham, and J. Chen (2002) In vivo delivery of a BclxL fusion protein containing the TAT protein transduction domain protects against ischemic brain injury and neuronal apoptosis. J. Neurosci. 22: 5423-5431.
56. Martorana, F., L. Brambilla, C. F. Valori, C. Bergamaschi, C. Roncoroni, E. Aronica, A. Volterra, P. Bezzi, and D. Rossi (2011) The BH4 domain of Bcl-XL rescues astrocyte degeneration in amyotrophic lateral sclerosis by modulating intracellular calcium signals. Hum. Mol. Genet. 21: 826-840.
57. Deng, B., X. Gou, H. Chen, L. Li, H. Zhong, H. Xu, F. Jiang, Z. Zhao, Q. Wang, and L. Xu (2013) Targeted delivery of Neurogenin-2 protein in the treatment for cerebral ischemia-reperfusion injury. Biomaterials. 34: 8786-8797.
58. Yang, D., Y.-Y. Sun, X. Lin, J. M. Baumann, R. S. Dunn, D. M. Lindquist, and C.-Y. Kuan (2013) Intranasal delivery of cell-penetrating anti-NF-κB peptides (Tat-NBD) alleviates infection-sensitized hypoxic–ischemic brain injury. Exp. Neurol. 247: 447-455.
59. Thorns, V., and E. Masliah (1999) Evidence for neuroprotective effects of acidic fibroblast growth factor in Alzheimer disease. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 58: 296-306.
60. Wang, Y., H. Lin, S. Lin, J. Qu, J. Xiao, Y. Huang, Y. Xiao, X. Fu, Y. Yang, and X. Li (2010) Cell-penetrating peptide TAT?mediated delivery of acidic FGF to retina and protection against ischemia–reperfusion injury in rats. J. Cell. Mol. Med. 14: 1998-2005.
61. Wu, J.-C., W.-C. Huang, Y.-C. Chen, T.-H. Tu, Y.-A. Tsai, S.-F. Huang, H.-C. Huang, and H. Cheng (2011) Acidic fibroblast growth factor for repair of human spinal cord injury: a clinical trial. J. Neurosurg. Spine. 15: 216-227.
62. Lou, G., Q. Zhang, F. Xiao, Q. Xiang, Z. Su, L. Zhang, P. Yang, Y. Yang, Q. Zheng, and Y. Huang (2012) Intranasal administration of TAT-haFGF14-154 attenuates disease progression in a mouse model of Alzheimer’s disease. Neuroscience. 223: 225-237.
63. Nagel, F., B. H. Falkenburger, L. Tönges, S. Kowsky, C. Pöppelmeyer, J. B. Schulz, M. Bähr, and G. P. Dietz (2008) Tat-Hsp70 protects dopaminergic neurons in midbrain cultures and in the substantia nigra in models of Parkinson’s disease. J. Neurochem. 105: 853-864.
64. Beere, H. M., B. B. Wolf, K. Cain, D. D. Mosser, A. Mahboubi, T. Kuwana, P. Tailor, R. I. Morimoto, G. M. Cohen, and D. R. Green (2000) Heat-shock protein 70 inhibits apoptosis by preventing recruitment of procaspase-9 to the Apaf-1 apoptosome. Nat. Cell Biol. 2: 469-475.
65. Jiang, Y., M. Li, Z. Zhang, T. Gong, and X. Sun (2014) Cell-penetrating peptides as delivery enhancers for vaccine. Curr. Pharm. Biotechnol. 15: 256-266.
66. Pouniotis, D. S., V. Apostolopoulos, and G. A. Pietersz (2006) Penetratin tandemly linked to a CTL peptide induces anti-tumour T-cell responses via a cross-presentation pathway. Immunology. 117: 329-339.
67. Taylor, B. N., R. R. Mehta, T. Yamada, F. Lekmine, K. Christov, A. M. Chakrabarty, A. Green, L. Bratescu, A. Shilkaitis, and C. W. Beattie (2009) Noncationic peptides obtained from azurin preferentially enter cancer cells. Cancer Res. 69: 537-546.
68. Yamada, T., R. R. Mehta, F. Lekmine, K. Christov, M. L. King, D. Majumdar, A. Shilkaitis, A. Green, L. Bratescu, and C. W. Beattie (2009) A peptide fragment of azurin induces a p53-mediated cell cycle arrest in human breast cancer cells. Mol. Cancer Ther. 8: 2947-2958.
69. Warso, M., J. Richards, D. Mehta, K. Christov, C. Schaeffer, L. R. Bressler, T. Yamada, D. Majumdar, S. Kennedy, and C. Beattie (2013) A first-in-class, first-in-human, phase I trial of p28, a non-HDM2-mediated peptide inhibitor of p53 ubiquitination in patients with advanced solid tumours. Br. J. Cancer. 108: 1061-1070.
70. Noei, A., A. Nili-Ahmadabadi, and M. Soleimani (2019) The enhanced cytotoxic effects of the p28-apoptin chimeric protein as a novel anti-cancer agent on breast cancer cell lines. Drug Res. 69: 144-150.
71. Snyder, E. L., B. R. Meade, C. C. Saenz, and S. F. Dowdy (2004) Treatment of terminal peritoneal carcinomatosis by a transducible p53-activating peptide. PLoS Biol. 2: e36.
72. Rapoport, M., A. Saada, O. Elpeleg, and H. Lorberboum-Galski (2008) TAT-mediated delivery of LAD restores pyruvate dehydrogenase complex activity in the mitochondria of patients with LAD deficiency. Mol. Ther. 16: 691-697.
73. Rapoport, M., L. Salman, O. Sabag, M. S. Patel, and H. Lorberboum-Galski (2011) Successful TAT-mediated enzyme replacement therapy in a mouse model of mitochondrial E3 deficiency. J. Mol. Med. 89: 161-170.
74. Marcus, D., M. Lichtenstein, A. Saada, and H. Lorberboum-Galski (2013) Replacement of the C6ORF66 assembly factor (NDUFAF4) restores complex I activity in patient cells. Mol. Med. 19: 124-134.
75. Lin, B. Y., and M. C. Kao (2015) Therapeutic applications of the TAT?mediated protein transduction system for complex I deficiency and other mitochondrial diseases. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1350: 17-28.
76. Britti, E., F. Delaspre, A. Feldman, M. Osborne, H. Greif, J. Tamarit, and J. Ros (2018) Frataxin?deficient neurons and mice models of Friedreich ataxia are improved by TAT?MTS cs?FXN treatment. J. Cell. Mol. Med. 22: 834-848.
77. Vyas, P. M., W. J. Tomamichel, P. M. Pride, C. M. Babbey, Q. Wang, J. Mercier, E. M. Martin, and R. M. Payne (2012) A TAT–Frataxin fusion protein increases lifespan and cardiac function in a conditional Friedreich's ataxia mouse model. Hum. Mol. Genet. 21: 1230-1247.
78. Scherz-Shouval, R., and Z. Elazar (2007) ROS, mitochondria and the regulation of autophagy. Trends Cell Biol. 17: 422-427.
79. Liou, G.-Y., and P. Storz (2010) Reactive oxygen species in cancer. Free Radic. Res. 44: 479-496.
80. Patten, D. A., M. Germain, M. A. Kelly, and R. S. Slack (2010) Reactive oxygen species: stuck in the middle of neurodegeneration. J. Alzheimers Dis. 20: S357-S367.
81. Eum, W. S., S. H. Jang, D. W. Kim, H. S. Choi, S. H. Choi, S. Y. Kim, J. J. An, S. H. Lee, K. Han, and J. H. Kang (2005) Enhanced transduction of Cu, Zn-superoxide dismutase with HIV-1 Tat protein transduction domains at both termini. Mol. Cells. 19: 191-197.
82. Kim, D. W., W. S. Eum, S. H. Jang, S. Y. Kim, H. S. Choi, S. H. Choi, J. J. An, S. H. Lee, K. S. Lee, and K. Han (2005) Transduced Tat-SOD fusion protein protects against ischemic brain injury. Mol. Cells. 19: 88-96.
83. Chen, X., S. Liu, P. Rao, J. Bradshaw, and R. Weller (2016) Topical application of superoxide dismutase mediated by HIV-TAT peptide attenuates UVB-induced damages in human skin. Eur. J. Pharm. Biopharm. 107: 286-294.
84. Huang, G.-Q., J.-N. Wang, J.-M. Tang, L. Zhang, F. Zheng, J.-Y. Yang, L.-Y. Guo, X. Kong, Y.-Z. Huang, and Y. Liu (2011) The combined transduction of copper, zinc-superoxide dismutase and catalase mediated by cell-penetrating peptide, PEP-1, to protect myocardium from ischemia-reperfusion injury. J. Transl. Med. 9: 73.
85. Liu, J., T. Gaj, Y. Yang, N. Wang, S. Shui, S. Kim, C. N. Kanchiswamy, J.-S. Kim, and C. F. Barbas (2015) Efficient delivery of nuclease proteins for genome editing in human stem cells and primary cells. Nat. Protoc. 10: 1842-1859.
86. Ru, R., Y. Yao, S. Yu, B. Yin, W. Xu, S. Zhao, L. Qin, and X. Chen (2013) Targeted genome engineering in human induced pluripotent stem cells by penetrating TALENs. Cell Regen. 2: 1-8.
87. Liu, J., T. Gaj, J. T. Patterson, S. J. Sirk, and C. F. Barbas III (2014) Cell-penetrating peptide-mediated delivery of TALEN proteins via bioconjugation for genome engineering. PLoS One. 9: e85755.
88. Cong, L., F. A. Ran, D. Cox, S. Lin, R. Barretto, N. Habib, P. D. Hsu, X. Wu, W. Jiang, and L. A. Marraffini (2013) Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339: 819-823.
89. Jinek, M., K. Chylinski, I. Fonfara, M. Hauer, J. A. Doudna, and E. Charpentier (2012) A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337: 816-821.
90. Ramakrishna, S., A.-B. K. Dad, J. Beloor, R. Gopalappa, S.-K. Lee, and H. Kim (2014) Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA. Genome Res. 24: 1020-1027.
91. Kim, S. M., S. C. Shin, E. E. Kim, S.-H. Kim, K. Park, S. J. Oh, and M. Jang (2018) Simple in vivo gene editing via direct self-assembly of Cas9 ribonucleoprotein complexes for cancer treatment. ACS Nano. 12: 7750-7760.
92. Lostalé-Seijo, I., I. Louzao, M. Juanes, and J. Montenegro (2017) Peptide/Cas9 nanostructures for ribonucleoprotein cell membrane transport and gene edition. Chem. Sci. 8: 7923-7931.
93. Staahl, B. T., M. Benekareddy, C. Coulon-Bainier, A. A. Banfal, S. N. Floor, J. K. Sabo, C. Urnes, G. A. Munares, A. Ghosh, and J. A. Doudna (2017) Efficient genome editing in the mouse brain by local delivery of engineered Cas9 ribonucleoprotein complexes. Nat. Biotechnol. 35: 431-434.
94. Jo, J., S. Hong, W. Y. Choi, and D. R. Lee (2014) Cell-penetrating peptide (CPP)-conjugated proteins is an efficient tool for manipulation of human mesenchymal stromal cells. Sci. Rep. 4: 4378.
95. Thiagarajan, L., H. A. D. M. Abu-Awwad, and J. E. Dixon (2017) Osteogenic programming of human mesenchymal stem cells with highly efficient intracellular delivery of RUNX2. Stem Cells Transl. Med. 6: 2146-2159.
96. Lee, J., H. Cha, T. H. Park, and J. H. Park (2020) Enhanced osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells by direct delivery of Cbfβ protein. Biotechnol. Bioeng. 117: 2897-2910.
97. Zhou, H., S. Wu, J. Y. Joo, S. Zhu, D. W. Han, T. Lin, S. Trauger, G. Bien, S. Yao, and Y. Zhu (2009) Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins. Cell Stem Cell. 4: 381-384.
98. Kim, D., C.-H. Kim, J.-I. Moon, Y.-G. Chung, M.-Y. Chang, B.-S. Han, S. Ko, E. Yang, K. Y. Cha, and R. Lanza (2009) Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell Stem Cell. 4: 472-476.
99. Nemes, C., E. Varga, Z. Polgar, N. Klincumhom, M. K. Pirity, and A. Dinnyes (2014) Generation of mouse induced pluripotent stem cells by protein transduction. Tissue Eng. Part C Methods. 20: 383-392.
100. Lim, J., J. Kim, J. Kang, and D. Jo (2014) Partial somatic to stem cell transformations induced by cell-permeable reprogramming factors. Sci. Rep. 4: 4361.
101. Zhang, H., Y. Ma, J. Gu, B. Liao, J. Li, J. Wong, and Y. Jin (2012) Reprogramming of somatic cells via TAT-mediated protein transduction of recombinant factors. Biomaterials. 33: 5047-5055.
102. Islas, J. F., Y. Liu, K.-C. Weng, M. J. Robertson, S. Zhang, A. Prejusa, J. Harger, D. Tikhomirova, M. Chopra, and D. Iyer (2012) Transcription factors ETS2 and MESP1 transdifferentiate human dermal fibroblasts into cardiac progenitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109: 13016-13021.
103. Hu, Q., R. Chen, T. Teesalu, E. Ruoslahti, and D. O. Clegg (2014) Reprogramming human retinal pigmented epithelial cells to neurons using recombinant proteins. Stem Cells Transl. Med. 3: 1526-1534.
104. Ryu, J., N. S. Hwang, H. H. Park, and T. H. Park (2020) Protein-based direct reprogramming of fibroblasts to neuronal cells using 30Kc19 protein and transcription factor Ascl1. Int. J. Biochem. Cell Biol. 121: 105717.
105. Violini, S., V. Sharma, J. L. Prior, M. Dyszlewski, and D. Piwnica-Worms (2002) Evidence for a plasma membrane-mediated permeability barrier to Tat basic domain in well-differentiated epithelial cells: lack of correlation with heparan sulfate. Biochemistry. 41: 12652-12661.
106. Futaki, S., T. Suzuki, W. Ohashi, T. Yagami, S. Tanaka, K. Ueda, and Y. Sugiura (2001) Arginine-rich peptides An abundant source of membrane-permeable peptides having potential as carriers for intracellular protein delivery. J. Biol. Chem. 276: 5836-5840.
107. He, H., J. Ye, E. Liu, Q. Liang, Q. Liu, and V. C. Yang (2014) Low molecular weight protamine (LMWP): A nontoxic protamine substitute and an effective cell-penetrating peptide. J. Control. Release. 193: 63-73.
108. Habault, J., and J.-L. Poyet (2019) Recent advances in cell penetrating peptide-based anticancer therapies. Molecules. 24: 927.