The Korean Society For Biotechnology And Bioengineering

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Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 35 , No. 4

[ Research Paper ]
Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 35, No. 4, pp.288-293
Abbreviation: KSBB J
ISSN: 1225-7117 (Print) 2288-8268 (Online)
Print publication date 31 Dec 2020
Received 19 Oct 2020 Revised 06 Nov 2020 Accepted 07 Nov 2020
DOI: https://doi.org/10.7841/ksbbj.2020.35.4.288

Bacillus licheniformis TK3-Y를 이용한 150 L 반응기에서의 고염분 함유 수산폐기물 생분해 및 분해 산물의 액비 이용 가능성 평가
강경환1, ; 이희진2, ; 박태진3 ; 심지한3 ; 김승영3, *
1제주사랑농수산
2한국식품안전관리인증원
3선문대학교 제약생명공학과

Biodegradation of High Salinity Fishery Wastes in a 150-L Reactor by Bacillus licheniformis TK3-Y for Reutilization as Liquid Fertilizer
Kyeong Hwan Kang1, ; Heejin Lee2, ; Taejin Park3 ; Ji Han Sim3 ; Seung-Young Kim3, *
1Jeju Love Co., Ltd., Jeju 63358, Korea
2Korea Agency of HACCP Accreditation and Service, Cheongju 28160, Korea
3Department of Pharmaceutical Engineering & Biotechnology, Sunmoon University, Asan 31460, Korea
Correspondence to : Department of Pharmaceutical Engineering & Biotechnology, Sunmoon University, Asan 31460, Korea Tel: +82-41-530-2390; Fax: +82-41-530-2939 E-mail: sykim01@sunmoon.ac.kr
Contributed by footnote: † These two authors contributed equally.


© 2020 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering

Abstract

High salinity fishery wastes (HFW) containing seaweed and fish waste cause great influence on the local environment. However, the fishery wastes contain biodegradable components such as carbohydrates, proteins and lipids that are able to be converted to useful bioactive substances by useful bacterium. Therefore, we evaluated large scale biodegradation property of 17.5% of salinity HWF containing green seaweed and anchovy waste by Bacillus licheniformis TK3-Y in 150-L fermenter and utilization of HFW biodegraded product as liquid fertilizer. During 7-day biodegradation, the pH increased with increasing cell density. The decrease in DO (dissolved oxygen) and ORP (oxidation-reduction potential) meant that the HFW was actively biodegraded. CODcr (chemical oxygen demand) and T-N (total nitrogen) were also removed by 87.3 and 87.1%, respectively. In addtion, B.licheniformis TK3-Y showed 0.45 U/mL cellulolytic, 1,016 U/mL proteolytic, and 5.92 U/mL lipolytic activities. The 500- and 1000- fold diluted supernatant from the culture of HFW had no phytotoxicity. In barley hydroponic culture, the 1,000-fold diluted culture supernatant showed a good fertilizing ability. This study indicates the large-scale treatment of HFW and the biodegraded products are sufficient for agricultural value.


Keywords: high salinity fishery waste, Bacillus licheniformis TK3-Y, biodegradation, reutilization, liquid fertilizer

1. INTRODUCTION

인구의 증가와 함께 어패류 및 해조류를 포함한 수산물의 소비가 점차 증가하고 있으나, 수산가공 부산물, 음식점 및 해변의 어패류 사체 등의 수산 폐기물은 현재까지 효율적으로 처리되지 않고 있다. 수산 폐기물을 처리하더라도 악취가 발생하여 재사용이 제한되고 있어 연안 환경에 큰 영향을 미치고 있는 실정이다 [1-2]. 이러한 폐기물의 일부는 수거되어 작물의 생장을 촉진하기 위한 비료로 이용되기도 하지만, 많은 양의 폐기물들은 악취를 방출하고, 연안 해변의 경관을 악화시키고 있다. 2012년 런던 협약 이후 수산 폐기물을 포함한 유기 폐수의 해양 투기는 금지되었으며 [3], 폐기물의 재사용에 중점을 두고 수산폐기물을 재가공하여 어분, 동물 사료 또는 퇴비로 이용할 수 있는 연구를 진행하고 있다 [4-6].

폐수 혹은 폐기물 내 여러 형태의 기질이 존재할 때에는 multi-strain cell culture를 이용하여 여러 균주가 가진 효소를 통해 다양한 고분자 물질을 저분자 물질로 분해하는 방식이 적합할 수 있다 [7]. 그러나 이러한 multi-strain cell culture 처리 시스템을 운영할 때에는 폐수 내 유기물의 특성, 각 균주의 성장 및 경쟁에 따른 기질의 이용 및 분해 속도, 배양 온도 및 pH 등과 같은 조건에 따라 폐수 내 미생물 성장과 처리 효율이 달라질 수 있다 [8]. 반면에, 다양한 분해 효소를 갖는 단일 미생물 (single-strain cell culture)의 사용은 multi-strain cell culture에서 문제가 될 수 있는 균주의 다양성으로 인한 배양 조건의 제어가 용이하고 및 미생물 간 경쟁에 의한 기질의 생분해율 저해를 방지할 수 있다는 이점을 갖고 있다.

국내에서 발생하는 수산폐기물의 양은 매년 증가하고 있어 대규모 공정을 통해 이를 친환경적으로 분해하고 재이용하기 위한 산업화 방안 마련이 필요하다 [9]. 이러한 이유로 수산폐기물 처리, 부산물의 재이용 및 산업화를 위해 대규모생물 반응기 (1 m3)에서의 어폐수의 분해 및 재이용에 관한 연구가 진행기도 하였다 [10-11]. 그러나 산업화 규모로의 대규모화 (scale-up) 이전에, 기초 연구의 수행 및 대규모화를 위한 시스템 제어에 대한 정보 제공, 규모가 커짐으로써 발생되는 위험을 줄이기 위해 실험실 규모와 파일럿 규모의 연구가 수행되어야 한다. 실험실 규모 연구 이후 진행되는 파일럿 규모 연구를 통해, 산업화 규모로의 대규모화에서 전체 공정 동안 발생할 수 있는 주요 변수를 이해하고 파악하는 것이 중요하다 [12]. 이러한 파일럿 규모의 폐수 처리에서 시스템의 물질 전달 현상과 수리학적 특성은 대규모 시스템 운영에 반영될 수 있다 [13].

따라서 본 연구에서는 수산폐기물의 대량 처리를 통한 산업화 가능성을 평가하기 위해 Bacillus licheniformis TK3-Y (농업생명공학연구원 수탁번호 KACC 91709P)를 이용하여 150 L 파일럿 규모 생물반응기에서 녹조류(파래 분말)와 멸치박이 혼합된 고염분 함유 수산폐기물 (High-salinity Fishery Wastes, HFW)을 처리하였다. 또한 수산폐기물 처리 분해산물을 이용하여 보리의 수경재배를 통해 액비로서의 재이용 가능성을 평가하였다.


2. MATERIALS AND METHODS
2.1. 재료 및 균주 배양

본 연구에서는 고염분 함유 수산폐기물의 제조를 위하여 멸치박과 녹조류 (파래) 분말을 이용하였다. 멸치박과 녹조류 분말은 2017년 9월 각각 경상남도 고성군에 위치한 CJ 멸치액젓 가공공장에서 수거 및 부산광역시 수영구의 남천해변 시장에서 구입하였다. 본 연구에서 이용한 B.licheniformis TK3-Y 균주는 고염분 (17.5% NaCl) 하에서 높은 생장 속도뿐 아니라 다양한 유기물을 분해할 수 있으며, 높은 cellulolytic, proteolytic 및 lipolytic activity를 가지고 있어 본 연구에서 이를 이용하였다 [14]. B.licheniformis TK3-Y 균주의 배양을 위하여 5 g/L 카르복시메틸셀룰로오스 (carboxymethyl cellulose), 5 g/L 탈지유 (skim milk) 및 5 mL/L의 올리브 오일, 5 g/L yeast extract, 2 g/L peptone, 1 g/L of K2HPO4, 1 mL/L of mineral solution 및 1 mL/L of vitamin solution이 함유된 250mL 액체배지 (flask volume 500 mL)에서 배양하였다. 이후 150 L 생물반응기에서 배양하기 전 균주를 HFW에 적응시키기 위해 0.2 g/L의 멸치박과 파래분말이 함유된 0.6 L 및 2 L 액체 배지 (flask volume 각각 2 L 및 5 L) 플라스크로 순차적으로 inoculation 시켰다. 균주의 배양은 shaking incubator (50oC, 150 rpm)에서 배양되었으며, 균주는 세포의 성장이 가장 높은 late-log phase에 도달하였을 때 원심분리 (8000 rpm, 10 min)를 통해 wet cell을 획득하였다.

2.2. 150 L 생물반응기 실험

본 연구에서는 150 L 파일럿 규모 생물반응기에서 20 g/L 멸치박과 10 g/L 파래분말이 포함된 60 L HFW를 이용하여 수산폐기물 분해 연구를 진행하였다. 멸치박의 양은 사전 연구를 토대로 염분농도 17.5%로 설정하여 첨가하였다 [14]. 생물반응기의 멸균을 위해 반응기에 3 mg/L 클로로포름이 첨가된 수돗물을 채우고 하루 동안 방치하였고, 이후 클로로포름 용액을 제거한 후, 반응기에 수돗물을 채우고 6시간 동안 두어 남은 클로로포름을 세척하였으며 클로로포름 냄새가 제거될 때 까지 반복하였다. 반응기 멸균 후 20 g의 wet cell을 60 L의 HFW가 들어있는 반응기에 주입하고 50°C 및 150 rpm에서 진행하였다. 공기의 주입은 air compressor (최대 2 kgf/cm2)를 이용하여 멸균된 유리섬유로 채워진 공기 필터를 통해 2 vvm으로 반응기에 공급하였고 반응기 내부에 설치된 3개의 세라믹 디스크 타입 디퓨저 (직경 12 cm)에 의해 기포를 분배 하였다. 외부로부터의 오염을 방지하기 위해 공기 배출구에 멸균 공기 필터를 설치하였다. 반응기 내부에서 대량의 거품이 발생한 경우, 공기의 공급을 DO농도 1.0 mg/L 미만으로 제어하고, 안티폼 (antifoam)을 이용하여 거품을 감소시켰다. 실험이 진행되는 동안 세포의 농도 및 생성물의 상태를 분석하기 위해 반응기로부터 샘플을 24시간마다 샘플링 하였으며, 반응 파라미터 (pH, DO, ORP)의 변화를 측정하였다. 세포 농도는 적절한 희석 후 한천배지에 도말하여 형성된 콜로니 수(colony form unit, cfu/mL)로 분석하였고, CODcr 및 T-N은 수질분석기 (Humas Co., Ltd., Korea)를 통해 분석하여 유기물 및 질소원의 분해를 확인하였다. 또한 셀룰로오스, 단백질, 지질 분해효소 활성을 spectrophotometer 를 이용하여 각각 540, 660 및 420 nm에서 측정하였고, 각각 U/mL (enzyme to release 1 μmole of glucose, tyrosine 및 ρ-nitrophenol per minute per mL)로 나타내었다 [15-17].

2.3. 종자 발아 테스트 (seed germination test)

생분해 된 HFW의 식물 독성 (phytotoxicity)을 평가하기 위해 Wong et al. [18]에 의해 보고된 방법을 사용하여 종자 발아 시험을 수행하였다. 150 L 생물반응기에서 6일간 생분해된 샘플을 8000 rpm에서 원심분리하여 상등액을 얻고, 0.45 μm 필터를 통해 여과한 후, 4°C에서 보관하였다. 발아된 종자 수 및 뿌리 길이 측정을 위해, 5 mL의 상등액을 Whatman #1 여과지(Sigma-Aldrich, St. Louis)로 나열된 멸균 페트리접시에 떨어트렸다. 발아 테스트는 영채 (Lepidium sativum)를 이용하여 진행되었으며, 25°C 항온 암실에서 12시간 동안 방치하였다. 이후 10개의 영채씨앗을 각 페트리접시 내 여과지 위에 골고루 놓아두었다. 대조군으로 증류수를 이용하였으며 상등액을 50, 100, 200, 500 및 1,000배 희석하여 실험을 진행하였고, 각 페트리 접시는 25°C에서 75% 습도를 유지하여 배양하였다. 배양 72시간 후, 각 페트리접시 내 종자의 발아 및 뿌리 길이를 측정하였으며, 모든 측정은 3회 수행되었다. 처리된 수산폐기물에 의한 상대 종자 발아율 (relative seed germination, RSG), 상대 뿌리 성장율 (relative root growth, RRG) 및 발아 지수 (germination index, GI)는 아래 식에 의해 계산되었다.

RSG%=      ×100RRG%=  ×100GI%= RSGRRG×100
2.3. 수경재배

생분해된 HFW의 액비 효능을 테스트하기 위해 수경재배 시스템을 사용하여 내부에 플라스틱 망으로 분리되어 있는 소형 수경재배포트 (5 × 12 × 8 cm3)에 보리씨앗 (Hordeum vulgare L.)을 대조군 증류수)과 함께 배양하였다. 각각의 포트에서, 25개의 보리씨앗을 플라스틱 망 위에 놓고, 500 및 1000배 희석 된 HFW 배양액 300 mL를 플라스틱 망 아래에 첨가 하였다. 각 씨앗은 플라스틱 망을 통해 뿌리가 내리도록 암실에서 25℃에서 2일간 방치하였다. 발아 후 각 포트를 창가에 두고 식물이 성장에 필요한 햇빛을 얻을 수 있도록 하였다. 자연 환경 그대로 낮과 밤의 공기 온도는 각각 22 ± 2°C 및 18 ± 2°C로 유지되었고, 수온은 15 ± 3°C, 실내의 상대 습도는 60 ± 5%로 유지되었다. 1,000배 희석한 각 배양액은 3일마다 교체해주었다. 총 15일간 배양하였으며, 식물의 성장을 3일 간격으로 관찰하였고, 각 식물의 높이, 줄기의 두께, 잎의 수 및 총 잎의 길이를 측정하였으며, 각 실험은 3회 반복하였다.


3. RESULTS AND DISCUSSION
3.1. 150 L 반응기 내 HFW parameter 변화

150 L 반응기 내에서 B.licheniformis TK3-Y의 총 세포 수는 HFW 생분해 시작 시점에 4.08 × 105에서 2일간의 lag phase 동안 8.11 × 106 cfu/mL로 증가하였고, 6일 후 2.23 × 108 cfu/mL로 가장 높았다 (Fig. 1). HFW의 생분해 동안 pH는 꾸준히 증가하였는데, 이는 B.licheniformis가 생산하는 분해효소가 알칼리성임을 나타내었다 [19-21]. B.licheniformis TK3-Y가 HFW에 있는 유기물을 생분해하기 시작하면서 DO 수준은 실험 시작 후 4일간 꾸준히 감소하여 4.4에서 1.5 mg/L으로 감소하였으며, 이후 1.8-2.2 mg/L 수준을 유지하였다. 반응 시작 시 ORP는 50.3 mV였으며 3일 후 까지 – 84.0 mV로 꾸준히 감소하였다. 이 시점 이후에 ORP는 다시 증가하였으며 7일 후 실험 종료 시점에 20.5 mV까지 증가하였다. DO와 ORP 수준은 미생물에 의한 HFW 생분해 정도를 알 수 있는 척도로 작용하였다. HFW 내 유기물이 활발히 분해되는 동안 산소를 소모하게 되어 DO 수준이 떨어지며, 이 때 유기물의 산화 및 분해로 인해 ORP 수준도 함께 감소하다, 배양 말기에 HFW 내 유기물의 분해 속도가 점차 감소함에 따라 용존산소량이 늘어나 ORP 수준도 증가하였다 [22]. HFW의 생분해 기간 동안 CODcr과 T-N 농도도 점차 감소하였는데, 이는 세포 성장의 결과이며 CO2 및 N2 생산과 관련이 있다. CODcr과 T-N의 제거율은 각각 87.3및 87.1%로 나타났으며, 실험 기간 동안 C/N비는 지속적으로 변화하였다 (Fig. 2). 일반적으로 높은 C/N비에서 대사산물의 농도는 증가하는데 반해 낮은 C/N비에서는 바이오매스의 양이 증가하는 것으로 알려져 있다 [22]. HFW내에 포함된 C-source로서 유기물은 cellulose, protein 및 lipid가 있으며, 이러한 유기물이 활발히 분해되는 동안 N-source의 소모 속도보다 C-source의 소모가 증가하여 C/N ratio가 실험 초기 6.7에서 5.3으로 감소하였고, 실험 종료 시점에 분해 속도가 감소함에 따라 C/N ratio가 6.5로 증가하였다 [11].


Fig. 1. 
1. Changes in cell density (●), pH (○), DO (△) and ORP (▼) during the biodegradation of HWF by B.licheniformis TK3- Y. Error bars are the mean ± S.D. of the three replicates.


Fig. 2. 
Changes in CODcr (●), T-N (△) and C/N ratio (□) during the biodegradation of HWF by B.licheniformis TK3-Y. Error bars are the mean ± S.D. of the three replicates.

3.2. HFW 생분해에 따른 B.licheniformis TK3-Y의 효소 활성

HFW의 생분해 기간 동안 셀룰로오스, 단백질 및 지질 분해 활성을 분석하였다. Fig. 3에 나타난 바와 같이, HFW 내 단백질의 분해가 가장 먼저 일어났고 이어 지질이 분해되었으며 셀룰로오스의 분해가 가장 늦게 일어났다. Proteolytic activity는 실험 6일 후 1,016 ± 39 U/mL로 최대였으며, lipolytic 및 cellulolytic activity는 7일 후에 5.92 ± 0.20 및 0.45 ± 0.02 U/mL로 나타났다. B.licheniformis TK3-Y의 HFW 내 셀룰로오스, 단백질 및 지질 분해 활성은 이전 연구에서 셀룰로오스원으로 carboxymethyl cellulose (CMC)를, 단백질과 지질 공급원으로 skim milk 및 olive oil을 혼합하여 기질로 이용하였을 때 보다 낮은 경향을 나타내었다 [14]. HFW 내의 유기물은 복잡한 구조의 다양한 물질로 둘러싸여 있으며, 이는B.licheniformis TK3-Y가 HFW 내 유기물을 기질로 이용하는데 있어서 단순한 형태인 CMC, skim milk 및 oilve oil 보다 상대적으로 어렵기 때문인 것으로 판단된다.


Fig. 3. 
Profiles of the cellulolytic (●), proteolytic (△) and lypolytic activity (□) for degradation of HWF by B. licheniformis TK3-Y in 150 L fermenter. Error bars are the mean ± S.D. of the three replicates.

3.3. HFW 분해물의 식물독성 (phytotocixity) 평가

B.licheniformis TK3-Y에 의해 분해된 HFW의 액비 사용 가능성을 평가하기 위하여, 다양한 희석 비율의 분해액을 이용하여 발아율 테스트 (GI test)를 수행하였다. 일반적으로 GI 값이 50% 이상인 경우 식물독성이 없음을 나타낸다. HFW분해액을 원심분리하여 얻은 상등액을 50, 100, 200, 500 및 1,000배 희석하여 GI test를 수행 한 결과 500 및 1000배 희석한 HFW 분해액이 57%, 78%로 각각 독성을 나타내지 않았다 (Fig. 4). 암모니아 및 저분자 유기산이 과량으로 존재할 경우 영채 씨앗의 발아와 성장에 영향을 줄 수 있다 [23]. 또한 본 연구에서 이용한 HFW의 높은 염도 역시 식물 성장에 영향을 준 것으로 보이며, 액비로 사용 할 경우 적절한 희석이 요구된다. Figueroa et al. [22]에 따르면, 상업용 액비의 GI 값은 약 70%로, 본 연구의 1,000배 희석 HFW 분해액과 비슷한 GI 값을 가지는 것으로 나타났다.


Fig. 4. 
The germination index (GI; %) for 50-, 100-, 200-, 500- and 1000-fold diluted solutions of HFW culture supernatants. Error bars are the mean ± SD (n = 3).

3.4. 수경재배를 통한 HFW 분해물의 액비 성능 분석

GI test 결과를 바탕으로 500배, 1,000배 희석한 HFW 분해 상등액과 대조군으로 증류수를 이용하여 보리를 수경재배하였다. Fig. 5에 나타난 바와 같이, 보리 새싹 줄기 길이 (Fig. 5(a)), 두께 (Fig. 5(b)), 잎의 수 (Fig. 5(c)) 및 잎의 길이 (Fig. 5(d)) 모두 1,000배 희석한 분해액을 이용하였을 때 성장이 가장 좋았다. 500배 희석한 분해액을 이용하였을 때 보다 오히려 대조군에서 더 높은 보리 새싹의 성장률이 나타났는데, 이는 HFW의 높은 염분에 의한 것으로 판단된다. 식물에 성장에 있어서 염분은 아주 미미한 양만 요구되며 과하게 유입될 경우 질소와 인의 대사에 영향을 미치는 것으로 보고되었다 [10]. 따라서 본 연구에서 이용된 1,000배 희석한 HFW 분해액의 경우 보리 새싹 발아를 촉진하기 위한 액비로 재이용 하기에 충분함을 시사하고 있다.


Fig. 5. 
The growth of barley stem height (a) and thickness (b) and leaves number (c) and length (d) in hydroponic cultures containing 500-( ) and 1000-fold ( ) dilutions of the HFW culture supernatant with a control (distilled water, ). Error bars are the mean ± SD (n = 3).


4. CONCLUSION

본 연구에서는 고농도 염분을 함유한 수산폐기물 (HFW)의 처리 및 산업화 가능성을 평가하기 위하여 B.licheniformis TK3-Y와 파래 및 멸치박 혼합 폐기물을 이용하여 대규모 파일럿 공정에서의 분해능과 분해 산물의 액비로서의 성능을 평가하였다. 본 연구에서 이용한 파래 및 멸치박 혼합 기질의 경우 B.licheniformis TK3-Y가 이용 및 분해할 수 있는 셀룰로오스, 단백질 및 지질이 포함되어 있다. HFW 분해 산물 상등액은 500배 이상의 희석 배율에서 식물독성을 나타내지않았고, 1,000배 희석 배율에서는 상업적으로 판매되고 있는 액비의 식물독성과 비슷한 결과를 나타내었다. HFW를 이용하여 보리씨앗을 수경재배 한 결과, 1,000배 희석한 HFW에서 보리새싹의 줄기 및 잎의 성장이 우수하였다. 따라서 B.licheniformis TK3-Y의 HFW 분해 산물은 액비로서 이용 가능성이 충분하며, 본 연구 결과와 마찬가지로 150 L 이상 배양을 통해 상업적으로 이용할 수 있을 것으로 사료된다.


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