The Korean Society For Biotechnology And Bioengineering

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Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 36, No. 1

[ Review Paper ]
Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 35, No. 4, pp.294-302
Abbreviation: KSBB J
ISSN: 1225-7117 (Print) 2288-8268 (Online)
Print publication date 31 Dec 2020
Received 18 Dec 2020 Revised 28 Dec 2020 Accepted 29 Dec 2020
DOI: https://doi.org/10.7841/ksbbj.2020.35.4.294

괭생이모자반으로부터 미백과 주름개선 생리활성물질 생산을 위한 초음파 추출공정 개발
감다혜 ; 홍지우 ; 전성진 ; 백동호 ; 김진우*
선문대학교 식품과학과

Development of Ultrasound-assisted Extraction for Production of Bioactive Compounds with Whitening and Anti-wrinkle Effects from Sargassum horneri
Da Hye Gam ; Ji Woo Hong ; Seong Jin Jeon ; Dong Ho Baek ; Jin Woo Kim*
Department of Food Science, Sunmoon University, Asan 31460, Korea
Correspondence to : Department of Food Science, Sunmoon University, Asan 31460, Korea Tel: +82-41-530-2114; E-mail: biochem.jk@gmail.com


© 2020 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering

Abstract

Statistically-based optimization using response surface methodology was performed to derive optimal extraction conditions for the extraction of bioactive compounds with antioxidant activity, skin whitening, and anti-wrinkle effects from Sargassum horneri, marine waste, using the ultrasoundassisted extraction (UAE). The main UAE process variables, extraction time (5.3~18.7 min, X1), extraction temperature (22.4~79.6°C, X2), and ethanol concentration (0~99.5% v/v, X3), were selected through preliminary experiments and optimized using central composite design at five levels. Total phenolic content (TPC), total flavonoid content (TPC), DPPH radical scavenging activity (RSA), tyrosinase activity inhibition (TAI), and collagenase activity inhibition (CAI) were analyzed and second-order polynomial models were generated for predicting the responses. The optimum UAE conditions for enhancing antioxidants, skin whitening, and antiwrinkle effects were extraction time of 11.7 min, extraction temperature of 54.8°C, and ethanol concentration of 73.0%, under which RSA, TAI, and CAI were 29.1%, 78.5%, and 83.6%, respectively. In this study, we proposed an extraction process for the production of cosmetic materials that have a combination of antioxidant, whitening, and wrinkle effects from S.horneri, which are marine waste.


Keywords: Sargassum horneri, ultrasound -assisted extraction, optimization, antioxidant, skin whitening, anti-wrinkle

1. INTRODUCTION

최근 현대인들의 미용과 건강에 대한 관심 증가로 화장품과 식품의 기능성 향상을 목적으로 하는 합성 및 천연물 소재에 대한 개발 연구가 활발해져 항균, 항산화, 피부 노화 억제, 보습 및 미백 효과 등을 가지는 신규 기능성 소재에 대한 수요가 증가하고 있다 [1]. 특히 피부 미백 효과와 관련하여 멜라닌 생성을 억제하는 화장용 소재 개발이 활발히 진행되고 있는데, 이는 표피 기저층의 멜라닌의 생성 정도에 따라 피부색 결정과 함께 기미, 주근깨와 검버섯과 같은 색소 침착이 발생하기 때문이다 [2,3]. 멜라닌은 동·식물과 미생물에 널리 존재하는 페놀류 고분자물질로 자외선으로부터 피부세포를 보호하는 역할을 수행하나 과잉생성 시에는 피부의 탈색과 기미, 주근깨와 같은 색소침착 현상을 유발하고 피부노화를 촉진시킨다 [4,5]. 멜라닌은 자외선, 염증 등의 외부조건, α-melanocyte stimulating hormone (α-MSH)등의 많은 인자의 영향을 받는데, 이들 중 피부 진피층까지 침투가 가능한 자외선에 의해 활성산소종 (reactive oxygen species, ROS)이 생성되면 타이로시네이즈가 매개하는 타이로신의 산화가 촉진되어 멜라닌 형성이 가속화된다는 기작이 밝혀지면서 ROS를 제거하는 것이 멜라닌색소 형성 억제에 효과적이라 보고되고 있다 [6,7]. 피부 진피층에 존재하는 콜라겐은 엘라스틴과의 결합을 통해 피부에 가해지는 압력이나 외부의 자극으로부터 피부를 보호하는 역할과 함께 주름과 피부노화를 방지하는 중요한 세포 내 기질로 알려져 있으나 체내 ROS가 과도하게 생성 될 경우 matrix metalloproteinase (MMPs)의 일종인 콜라게네이즈의 활성이 증가하여 콜라겐 분해가 촉진됨에 따라 피부주름 및 탄성저하가 발생한다 [8-10].

ROS는 진피층 세포의 항산화 연쇄반응을 교란하여 피부세포의 구성물질인 단백질, 지질 및 DNA에 비가역적인 손상을 초래하여 색소침착과 피부 노화를 일으키는 공통된 원인으로 알려져 ROS 제거를 위해 항산화제를 사용하여 멜라닌 생성방지와 피부 구성 단백질 분해를 방지할 필요성이 있다 [11]. 이에 butylated hydroxytoluene (BHT)와 butylated hydroxyanisole (BHA) 등의 합성 항산화제를 널리 사용하고 있지만 암 유발, 지방 변이 및 간 비대 등과 같이 인체 안전성에 문제를 발생시켜 보다 안전하고 활성이 높은 신규 항산화제 개발이 요구되고 있으며, 최근 합성 항산화제의 대체제로서 천연물 유래의 폴리페놀이 주목받고 있다 [12]. 폴리페놀은 식물체가 생산하는 2차 대사산물로 다수의 수산기를 가지며 수산기의 치환을 통해 ROS를 소거시켜 체내에서 효과적으로 산화적 손상을 예방할 수 있다고 알려져 있다. 이에 따라 육상식물에서부터 폴리페놀을 추출하여 상업적으로 이용하는 연구가 활발히 이루어지고 있으나, 원료 수급과 효과에 한계가 있어 다양한 생물종과 색소물질을 가진 해조류를 이용한 천연 항산화제 생산에 대한 수요가 높아지는 현실이다 [13].

괭생이모자반은 갈조식물 모자반목에 속하는 해조류로 우리나라 서해와 남해 및 중국 연안에 폭넓게 분포하고 있다 [14]. 최근에는 동중국해 연안의 부영양화로 인해 급속히 성장하여 편서해류를 따라 한반도의 서해와 남해의 얕은 해안 지역으로 대량 유입되고 있으며 태풍이 잦은 여름과 가을에 남해와 제주 해안에 밀려와 김 및 어패류 양식에 큰 피해를 주고 해류가 약한 해안가에 쌓여 부패에 의해 악취를 풍기는 등 심각한 환경문제와 처리비용을 발생시키는 해양 유해 해조류로 분류되고 있다 [15-17]. 현재, 괭생이모자반은 식용 또는 비료로 극히 제한적으로 사용되고 있으며, 비타민 K, 후코이단, 페놀 화합물 등의 생리활성물질을 추출하여 의약품 원료로서 사용하고자 하는 연구가 일부 진행되었으나 추출기술의 미확보로 대량생산과 상업화의 사례는 전무한 상태이다 [18,19].

따라서 본 연구에서는 해양폐기물로 인식되고 있는 괭생이모자반으로부터 생리활성물질의 효과적인 추출을 위해 초음파 추출 (ultrasound-assisted extraction, UAE)을 도입하고 추출물의 폴리페놀, 플라보노이드 함량과 항산화 활성을 측정하고 타이로시네즈와 콜라게네이즈 저해 활성을 평가하여 피부미백 및 주름개선의 화장품 소재로서의 적합성을 확인하였다. 또한, 반응표면분석법 (response surface methodology, RSM)을 이용한 UAE 공정 조건 최적화를 수행하여 해조류로부터 생리활성물질 추출에 있어 보다 효과적인 공정을 제시하고자 하였다.


2. MATERIALS AND METHODS
2.1. 실험재료

본 연구에 사용된 괭생이모자반 (Sargassum horneri)은 2020년 제주도에서 채취한 것을 파라제주 (ParaJeJu. Ltd., Juju, Korea)에서 구입하여 60°C 열풍건조기 (FC49, Lab house, Korea)에서 24시간 건조하였으며, 실험을 위해 식품분쇄기 (HMF-3000S, Hanil, Korea)로 분쇄 후 40~100 mesh 이하를 분리하여 밀봉상태에서 데시케이터에 보관하였다. 분말화된 시료는 1:10의 고액비로 초음파 추출기를 이용하여 추출하고 원심분리 상등액을 회수하여 −20°C 냉동고에 보관하여 필요에 따라 희석하여 실험에 사용하였다.

2.2. 통계학적 최적화 실험 설계

본 실험에서는 괭생이모자반으로부터 생리활성물질 추출조건 최적화를 위하여 반응표면법중 가장 널리 사용되는 중심 합성계획 (central composite design, CCD)을 이용하여 최적화를 수행하였으며 통계 소프트웨어인 Design-expert® 8.0 (State-Ease, Minneapolis, USA)를 사용하였다. 추출 공정에서 중요한 독립변수 (Xi)로 추출 시간 (X1, 5.30~18.7 분), 추출 온도 (X2, 22.4~79.6°C)와 에탄올 농도 (X3, 0.0~99.5%)에 대한 실험 범위를 설정하여 각각을 5단계로 부호화하였으며, CCD에 의해 설정된 17개 조건에 따라 실험을 진행하였다 (Table 1). 독립변수에 영향을 받는 종속변수로는 총 폴리페놀 (Y1, total phenolics content, TPC), 총 플라보노이드 (Y2, total flavonoid content, TFC), DPPH 라디칼 소거 활성 (Y3, radical scavenging activity, RSA), 타이로시네이즈 저해활성 (Y4, tyrosinase activity inhibition, TAI)과 콜라게네이즈 저해활성 (Y5, collagenase activity inhibition, CAI)를 사용하였으며 CCD에 따라 설계된 추출 조건의 각 실험값을 기반으로 도출 된 회귀방정식은 다음과 같다.

Table 1. 
The central composite design for the optimization of UAE condition of S. horneri
Xi Independent variables Coded levels
−1.68 −1 0 1 +1.68
X1 Extraction time (min) 5.3 8.0 12.0 16.0 18.7
X2 Extraction temperature (°C) 22.4 34.0 51.0 68.0 79.6
X3 Ethanol concentration (% v/v) 0.0 20.0 50.0 80.0 99.5
Level of each variable was established based on preliminary experiments by on one factor at a time method. The distance of the axial points from the center point was ±1.68.

Y = b0+ b1X1+ b2X2+ b3X3+ b11X12 + b22X22 + b33X32 + b12X1X2b13X1X3 + b23X2X3

본 회귀식에서 Y는 종속변수인 TPC, TFC, RSA, TAI과 CAI을 나타내며, X의 값은 독립변수인 추출 시간, 추출 온도와 에탄올 농도를 나타낸다. b11, b22, b33은 제곱계수를 b12, b13, b23은 상호작용 계수를 나타낸다.

2.3. 초음파 추출 (Ultrasound-assisted extraction, UAE)

괭생이모자반으로부터 생리활성물질 추출을 위해 최대 초음파 출력이 150 W인 탁상형 초음파 추출장치 (SD-D250H, SD-ultra, Korea)를 사용하였다. 각 시료의 건조중량 1 g에 추출 용매 10 mL를 혼합하여 1:10의 고액비로 추출을 진행하였으며 에탄올 농도와 추출 온도, 추출 시간을 실험계획에 따라 변화시켜 UAE를 진행하였다. 추출물은 4°C에서 5 분간 10,000 rpm으로 원심분리 후 필요에 따라 동일 농도의 에탄올로 희석하여 분석실험에 사용하였다.

2.4. 라디칼 소거 활성 (DPPH radical scavenging activity, RSA) 측정

괭생이모자반 추출물의 RSA는 Kim [20] 등의 방법을 변형하여 측정하였다. 시료 추출액 0.25 mL에 0.1 M DPPH (diphenyl-2-picrylhydrazyl) 1.25 mL를 첨가하여 실온 암실에서 20 분간 정치 반응 후, 분광광도계 (UV-1650PC, Shimadzu, Japan)를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 ascrobic acid (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)을 사용하였고, RSA는 다음 식으로 산출하였다.

RSA%=1-  ×100
2.5. 총 폴리페놀 함량 분석 (total phenolic content, TPC)

TPC는 Folin-ciocalteu의 방법을 일부 변형하여 사용하였다 [21]. 괭생이모자반 추출물 0.14 mL에 0.2 N Folin-ciocalteu's phenol reagent를 0.7 mL를 첨가하고 8 분간 상온 반응 후, 7.5% Na2CO3를 0.56 mL 첨가하여 60 분 동안 상온에서 반응시켜 분광광도계 (UV-1650PC, Shimadzu, Japan)를 이용하여 765 nm에서 흡광도를 측정하였다. TPC는 표준물질인 gallic acid을 이용하여 표준곡선에 의한 검량식에 의거하여 계산되었으며 mg gallic acid equivalents (GAE)/g dry material (DM)으로 나타내었다.

2.6. 총 플라보노이드 함량 분석 (total flavonoid content, TFC)

괭생이모자반 추출물의 TFC는 aluminium chloride 발색법을 일부 변형하여 측정하였다 [22]. 표준물질인 quercetin용액과 각 조건별로 추출한 괭생이모자반 추출물 0.1 mL에 0.56 mL의 증류수와 0.3 mL의 95% 에탄올을 첨가한 후, 1 M potassium acetate와 10% aluminium chloride를 차례로 혼합하였다. 상온에서 30 분 정치 반응 후 분광광도계 (UV-1650PC, Shimadzu, Japan)를 사용하여 415 nm에서 흡광도를 측정하였으며, TFC 함량은 quercetin 농도별 (0-0.8 μg/mL)로 희석된 표준용액을 제조하고 검량선을 작성한 후 mg quercetin equivalents (QE)/g dry material (DM)으로 나타내었다.

2.7. 타이로시네이즈 저해 활성 측정 (tyrosinase activity inhibition, TAI)

괭생이모자반 추출물의 TAI는 Yang [23] 등의 방법을 일부 변형하여 사용하였다. Monobasic anhydrous와 dibasic anhydrous를 혼합하여 7 mM sodium phosphate buffer (pH 6.8)를 제조하였으며 괭생이모자반 추출물 0.2 mL과 L-3,4-dihydroxyphenylalanine (2 mg/mL)에 mushroom tyrosinase (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)를 가하여 25°C에서 30 분간 반응하였다. 반응액 중에 생성된 DOPA chrome은 분광광도계 (UV-1650PC, Shimadzu, Japan)를 사용하여 475 nm 파장에서 측정하였다. 양성 대조군으로는 kojic acid (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) 을 사용하였으며 TAI는 시료 용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.

TAI%=1-  ×100
2.8. 콜라게네이즈 저해 활성 측정 (collagenase activity inhibition, CAI)

괭생이모자반 추출물의 CAI는 Wünsch와 Heindrich의 방법을 변형하여 측정하였다 [24]. Tris buffer는 0.1M tris (hydroxylmetyl) aminomethane 와 4 mM CaCl2혼합액에 1 M HCl을 첨가하여 pH 7.5로 제조하였다. 시료에 콜라게네이즈와 기질 (4-phenylazobenzyloxycarbonyl-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg) 1.2 mg/mL을 혼합하여 37°C에서 30 분간 반응시킨 후 20%의 citric acid를 첨가하여 반응을 종료하였다. 이후 ethyl acetate를 혼합하여 120 rpm 으로 교반한 뒤 상등액을 취하여 320 nm에서 분광광도계 (UV-1650PC, Shimadzu, Japan)로 흡광도를 측정하였다. 양성대조군으로는 ascorbic acid (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)를 사용하였으며, 아래의 식에 대입하여 계산하였다.

CAI%=1-  ×100

3. RESULTS AND DISCUSSION
3.1. RSA 최적 추출 조건 탐색

괭생이모자반 추출물의 최적 추출 조건 예측을 위해 CCD를 이용하여 독립변수인 추출 시간 (X1), 추출 온도 (X2)와 에탄올 농도 (X3)의 17개의 실험 조건을 설정하여 UAE를 진행하여 각 조건에 따른 RSA를 측정하였다 (Table 2). RSA는 15번 실험 조건 (X1: 12.0 분, X2: 51.0°C, X3: 50.0%)에서 최대값 36.5%를 나타내었으며, 실험 조건 14번 (X1: 12.0 분, X2: 51.0°C, X3: 99.5%)에서 최소값 0.0%를 나타내어 괭생이모자반의 UAE 추출에 있어 에탄올 농도의 영향이 가장 큰 것을 확인할 수 있었다. 17개 추출 조건에 따른 실험값을 기반으로 CCD를 이용해 도출 된 2차 회귀함수를 Table 4에 나타냈으며 분산분석 (ANOVA) 결과 2차 회귀함수의 p값이 0.0363 \으로 나타나 p < 0.05 수준에서 유의성이 검증되었으며, R2이 0.8432으로 나타나 종속변수가 갖는 정보 중 84.3%를 독립변수의 변동으로 설명할 수 있음이 확인되어 회귀모델의 적합성이 인정되었다.

Table 2. 
Experimental data on radical scavenging activity (RSA), total phenol content, total phenol content (TPC), total flavonoid content (TFC), tyrosinase activity inhibition (TAI), and collagenase inhibition activity (CAI) of S. horneri
Run
No
Extraction condition TPC
(mg GAE/g DM)
TFC
(mg QE/g DM)
RSA (%) TAI (%) CAI (%)
X1 X2 X3
1 8.0 34.0 20.0 3.37 0.45 28.9 49.1 68.3
2 16.0 34.0 20.0 2.30 0.22 12.4 47.1 59.3
3 8.0 68.0 20.0 2.71 0.34 21.9 44.7 81.2
4 16.0 68.0 20.0 3.55 0.51 24.8 53.0 64.3
5 8.0 34.0 80.0 0.84 0.38 6.79 84.9 89.6
6 16.0 34.0 80.0 0.51 0.22 1.24 76.8 82.5
7 8.0 68.0 80.0 0.99 0.49 8.52 77.4 76.4
8 16.0 68.0 80.0 1.53 0.58 10.8 76.4 83.3
9 5.3 51.0 50.0 2.29 0.22 16.8 72.7 86.0
10 18.7 51.0 50.0 4.32 0.36 22.1 75.9 78.5
11 12.0 22.4 50.0 2.87 0.14 23.1 77.7 84.4
12 12.0 79.6 50.0 4.98 0.60 28.4 78.0 89.5
13 12.0 51.0 0.0 2.67 0.45 7.41 5.00 30.0
14 12.0 51.0 99.5 0.02 0.30 0.00 81.5 95.4
15 12.0 51.0 50.0 4.03 0.83 36.5 76.5 88.0
16 12.0 51.0 50.0 2.61 0.63 21.2 70.2 81.8
17 12.0 51.0 50.0 3.65 0.63 28.4 74.3 79.7
X1: Extraction time, X2: Extraction temperature, X3: Ethanol concentration.

Table 3. 
Analysis of variance (ANOVA) of the experimental results of central composite design for full quadratic model
Sum of squares F value p value Sum of squares F value p value Sum of squares F value p value Sum of squares F value p value Sum of squares F value p value
Model 1525.52 4.18 0.0363 25.91 3.71 0.0488 0.47 4.42 0.0314 6907.18 17.36 0.0005 3176.21 4.05 0.0393
X1 4.74 0.12 0.7424 0.84 1.09 0.3312 5.99×10-4 0.051 0.8280 0.19 4.3 x103 0.9492 109.29 1.25 0.2996
X2 48.11 1.19 0.3121 2.07 2.67 0.1462 0.15 12.34 0.0098 3.49 0.079 0.7868 14.26 0.16 0.6978
X3 383.48 9.46 0.0179 11.29 14.57 0.0066 3.94×103 0.033 0.8601 4968.44 112.36 < 0.0001 2097.69 24.09 0.0017
X1X2 93.05 2.30 0.1735 0.97 1.25 0.2998 0.054 4.58 0.0697 34.18 0.77 0.4085 4.90 0.056 0.8192
X1X3 13.12 0.32 0.5871 0.025 0.032 0.8631 7.13×103 6.05×103 0.9811 27.00 0.61 0.4601 81.66 0.94 0.3652
X2X3 4.21 0.10 0.7567 0.042 0.054 0.8233 0.010 0.86 0.3837 8.82 0.20 0.6687 114.16 1.31 0.2899
X12 139.80 3.45 0.1057 0.60 0.77 0.4094 0.19 15.71 0.0054 0.58 0.013 0.9119 3.69 0.042 0.8428
X22 18.58 0.46 0.5202 1.41×10-3 1.82×103 0.9671 0.11 9.33 0.0185 24.71 0.56 0.4791 13.50 0.16 0.7055
X32 926.80 22.86 0.0020 9.63 12.43 0.0097 0.11 9.03 0.0198 1536.28 34.74 0.0006 632.04 7.26 0.0309
X1: Extraction time, X2: Extraction temperature, X3: Ethanol concentration.

Table 4. 
Second-order regression model calculated by RSM for prediction of UAE conditions
Response Second order polynomials *R2 **p
RSA (%) YRSA=+5.89312+2.04024X1-−0.10975X2+0.63690X3−0.21996X12+0.050154X1X2− 4.43932E-003X22+0.010674X1X3+1.42217E−003X2X3-0.010145X32 0.8432 0.0363
TPC
(mg GAE/g DM)
YTPC=+2.10678+0.12248X1−0.041736X2+0.060271X3−0.014372X12+5.12592E− 003X1X2−3.87134E−005X22+4.64062E-004X1X3+1.41544E−004X2X3−1.03429E− 003X32 0.8268 0.0488
TFC
(mg QE/g DM)
YTFC=−1.02887+0.13257X1+0.022916X2+7.22103E-003X3−8.00414E−003X12+1.20746E− 003X1X2−3.41488E−004X22+1.20746E−003X1X3+6.99227E−005X2X3−1.08721E-004X32 0.8504 0.0314
TAI (%) YTAI=+29.79955−1.09550X1−0.81385X2+2.23184X3+0.014189X12+0.030396X1X2 +5.12031E−003X22 −0.015311X1X3−2.05857E−003X2X3−0.013061X32 0.9571 0.0005
CAI (%) YCAI=+55.75041−1.76779X1−0.093726X2+1.30995X−3-0.035741X12+0.011513X1X2 +3.78453E-003X22+0.026624X1X3−7.40706E-003X2X3−8.37771E-003X32 0.8390 0.0393
*R2 (coefficient of determination), **p (probability value); RSA (radical scavenging activity); TPC (total phenol content); TFC (total flavonoid content); TAI (tyrosinase activity inhibition); CAI (collagenase activity inhibition); Y is the predicted response.

추출 시간, 추출 온도와 에탄올 농도의 개별 변량에 따른 RSA의 증감을 확인하여 일변수곡선으로 표현하였다 (Fig. 1). RSA는 모든 독립변수의 수준이 증가함에 따라 중간값 부근에서 최대값을 가지며 이후에 다시 감소하는 경향을 보였다. 특히, 독립변수 중 에탄올 농도에 따라 RSA가 가장 큰 폭으로 변화함을 확인할 수 있었는데, 이는 분산분석 (ANOVA)에서 독립변수 중 에탄올 농도의 유의성 (p = 0.0179)이 가장 높다는 결과와 일치하였다. 한 개의 독립변수를 중간값에 고정하고 나머지 두 변수를 동시에 변화시켜 RSA에 미치는 변수의 상호영향을 3차원 반응표면곡선으로 시각화 하였다 (Fig. 2). 모든 독립변수의 수준이 증가함에 따라 RSA가 27~30%의 최대값에 도달하고 다시 감소하는 것이 확인되어 앞선 일변수곡선과 유사한 경향을 나타내었다. RSA에 대한 최적 추출 조건은 추출 시간 13.4 분, 추출 온도 68.0°C와 에탄올 농도 43.0%로 확인되었으며, 이 때 RSA는 30.4%로 예측되었다. 본 실험을 통해 UAE를 이용한 괭생이모자반으로부터 생리활성물질 추출 공정에 있어 에탄올 농도가 우선적으로 고려 되어야함을 확인하였는데 이는 병아리콩의 RSA 실험에서 추출 온도와 추출 시간에 비해 에탄올 농도의 영향이 크다고 보고한 Song 등의 연구결과와 유사한 경향을 나타내었다 [25,26].


Fig. 1. 
Perturbation plot for effect of extraction time (X1), extraction temperature (X2), and ethanol concentration (X3) on the RSA of S. horneri extract.


Fig. 2. 
Response surface plots demonstrating the interactive effects of (A) extraction time and ethanol concentration, (B) extraction temperature and ethanol concentration on RSA of S. horneri extract.

3.2. TPC와 TFC 최적 추출 조건 탐색

폴리페놀 화합물은 플라보노이드, 이소플라본, 안토시아닌, 탄닌, 카테킨, 레스베라트롤 등을 총칭하며 다수의 히드록실기를 가지는 구조로 히드록시기에 수소가 자유 라디칼에 전자를 제공함으로써 활성 산소와 자유 라디칼을 제거하는 것으로 알려져 항산화 및 항암, 항염 등의 효과가 높다고 알려져 있다. 특히 플라보노이드는 비타민 P라고 불리며, 체내에서 항산화와 항바이러스 등의 다양한 생리활성을 가진다고 알려져 있다 [27]. CCD에 따른 17개 실험 조건 별 TPC와 TFC의 함량을 측정하였을 때, TPC는 실험 12번 (X1: 12.0 분, X2: 79.6°C, X3: 50.0%)에서 최대값 4.98 mg GAE/g을 보인 반면, 실험 14번 (X1: 12.0 분, X2: 51.0°C, X3: 99.5%)에서 최소값 0.02 mg GAE/g으로 확인되었다 (Table 2). TFC는 실험 15번 (X1: 12.0 분, X2: 51.0°C, X3: 50.0%)에서 최대값 0.83 mg QE/g을 나타내었으며 실험 11번 (X1: 12.0 분, X2: 22.4℃, X3: 50.0%)에서 최소값 0.14 mg QE/g을 나타내었다. 각 실험 결과를 바탕으로 도출 된 2차 회귀함수를 Table 4에 표시하였으며, 분산분석 결과 p값이 각각 0.0488과 0.0314로 각 2차 회귀함수의 유의성이 검증되었다. 또한, R2이 각각 0.8268과 0.8504로 독립변수의 변량에 따라 종속변수의 변동이 82% 이상 설명이 가능하여 회귀모델의 적합성이 확인되었다.

도출 된 2차 회귀함수를 기반으로 추출 시간, 추출 온도와 에탄올 농도 중 하나의 변수의 변량에 따른 TPC와 TFC에 미치는 영향을 일변수곡선으로 시각화하였다. Fig. 3A과 같이 에탄올 농도가 증가함에 따라 TPC가 증가하다가 급격히 감소하는 경향을 나타났으며, 추출 온도가 증가함에 따라 TPC가 증가함을 확인하였다. 반면 Fig. 3B에서는 모든 독립변수가 중간범위에서 최대 TFC를 보이고 이후에 감소하는 경향을 보였다. 두 가지 독립변수의 상호작용에 따른 종속변수의 변화를 3차원 반응표면곡선에 나타내어 변수간의 상호작용을 시각화 하였을 때, Fig. 4A와 4B에서 에탄올 농도의 영향이 가장 큰 것으로 나타났으며, 에탄올 농도에 비례하여 TPC가 증가하다가 25% 부근에서 감소하는 모습을 확인하였다. 반면 Fig. 4C와 4D에서 TFC는 모든 독립변수의 변화에 따라 중간 지점에서 최대값을 보여 추출 시간, 추출 온도와 에탄올 농도의 조절이 공정상 중요한 변수로 작용할 수 있음을 확인하였다 (Fig. 4). TPC와 TFC에 대한 최적 추출 조건을 예측한 결과 각각 16.0 분, 68.0°C, 37%, 12.9 분, 61.8°C, 53.0%로 확인되었으며 이 때의 TPC는 4.39 mg GAE/g DM, TFC는 0.84 mg QE/g DM으로 예측되었다.


Fig. 3. 
Perturbation plots for effects of extraction time (X1), extraction temperature (X2), and ethanol concentration (X3) on the TPC and TFC of S. horneri extract.


Fig. 4. 
Response surface plots demonstrating the interactive effects of (A) extraction time and ethanol concentration, (B) extraction temperature and ethanol concentration, (C) extraction time and ethanol concentration, and (D) extraction temperature and ethanol concentration on TPC and TFC of S. horneri extract.

3.3. TAI 최적 추출 조건 탐색

괭생이모자반의 최적 추출 조건을 탐색하기 위해 CCD에 의해 도출 된 17개 조건에 따라 UAE를 진행하여 실험값으로 측정된 TAI를 Table 2에 나타내었다. 실험 조건 중, 최대 TAI 는 실험 5번 (X1: 8.0 분, X2: 34.0°C, X3: 80.0%)에서 최대값인 84.9%를 나타내었으며 실험 13번 (X1: 12.0 분, X2: 51.0°C, X3: 0.0%)에서 최소값인 5.0%이 측정되어 TAI 변량에 에탄올 농도가 가장 큰 영향요인임을 예상할 수 있었다. 본 모델의 분산분석 수행하여 반응모델의 적합성과 각 항의 계수와 유의성에 대해 확인하였을 때, 모델의 p값이 0.0005로 모든 독립변수가 TAI에 유의한 영향을 줌이 확인되었으며 R2은 0.9571로 독립변수 조건에 따른 종속변수의 변동을 95% 이상 설명 가능함이 확인되어 2차 회귀함수의 적합성이 인정되었다 (Table 4).

개별 독립변수의 변화에 따른 종속변수인 TAI의 변량을 일변수곡선을 통해 확인하였을 때, 추출 온도와 추출 시간의 변화에 따라 TAI는 85% 수준에서 큰 변화가 없음이 확인된 반면, 에탄올 농도에 따라 TAI 변화의 폭이 크게 나타나 UAE 공정 조건 최적화에 있어 에탄올 농도가 중요한 변수로 작용될 것으로 예상되었다. 두 가지 독립변수에서의 상호작용을 통한 TAI의 변화를 3차원 반응표면 곡선으로 확인한 결과, 추출 온도와 추출 시간의 상호작용에 있어 TAI의 변화가 미미하여 일변수곡선에서 개별 독립변수의 영향이 크지 않음과 동일한 결과가 확인되었다. 에탄올 농도와 추출 시간 또는 추출 온도의 상호영향을 평가하였을 때, TAI는 추출 시간과 추출 온도에 비해 에탄올 농도에 의존성이 높은 경향을 확인할 수 있었다 (Fig. 6). 도출 된 2차 회귀함수를 이용한 TAI의 최적 조건은 8.40 분, 38.4°C와 73.0%로 예측되었으며, 이 때 TAI는 90.8%로 기존 겨우살이 추출물의 12%에 비해 높은 활성이 확인되어 타이로시네이즈 활성 억제를 통한 멜라닌 색소 생성 억제 효과의 피부 미백을 위한 화장품 소재로서 사용이 가능할 것으로 판단되었다 [28].


Fig. 5. 
Perturbation plot for effect of extraction time (X1), extraction temperature (X2), and ethanol (X3) on the TAI of S. horneri extract.


Fig. 6. 
Response surface plots demonstrating the interactive effects of (A) extraction time and ethanol concentration, (B) extraction temperature and ethanol concentration on TAI of S. horneri extract.

3.4. CAI 최적 추출 조건 탐색

괭생이모자반 추출물의 최적 추출 조건을 예측을 위해 CCD를 이용하여 설정된 17가지 조건에 따라 UAE를 진행하여 조건에 따라 실험으로 얻은 CAI을 Table 2에 나타내었다. 실험 14번 (X1: 12.0 분, X2: 51.0°C, X3: 99.5%)에서 95.4%의 최대값을 나타내었으며 실험 13번 (X1: 12.0 분, X2: 51.0°C, X3: 0.0%)에서 30.0%의 최소값을 나타내 UAE 조건의 변화에 따른 CAI의 변화량이 크다는 것을 알 수 있었다. 분산분석 결과 결정계수인 R2는 0.8390로 높게 나타났으며 유의확률 p가 0.0393으로 0.05보다 낮은 수준으로 모델의 적합성이 인정되었다.

각 독립변수에 따른 CAI의 변동을 확인하기 위한 일변수 곡선으로 두 가지의 독립변수를 중간값에 고정하고 한 가지의 독립변수가 CAI에 미치는 영향을 평가하였다 (Fig. 7). 앞선 TAI 결과와 유사하게 에탄올 농도에 따라 CAI가 크게 변화하지만 70% 이후에는 감소하는 경향이 확인되어 다른 두 독립변수에 비해 에탄올 농도가 CAI에 미치는 영향이 큼을 알 수 있었다. 독립변수의 상호작용에 따른 CAI의 변화를 3차원 반응표면 곡선으로 나타내었을 때 (Fig. 8), 앞선 일변수 곡선에서와 같이 추출 온도와 추출 시간에 따른 CAI의 변화율은 미미하지만 에탄올 농도에 크게 영향 받음이 확인되었다. 이는 TAI와 비슷한 추출 경향성으로 괭생이모자반으로 부터 미백 및 주름개선 생리활성물질 최대화에 있어 에탄올 농도가 중요한 공정변수로 작용함을 시사하며 CCD에 의해 예측 된 CAI의 최적 추출 조건은 10.4 분, 34.2°C, 80.0%이였으며, 이때, CAI는 91.9%로 확인되었다.


Fig. 7. 
Perturbation plot for effect of extraction time (X1), extraction temperature (X2), and ethanol concentration (X3) on the CAI of S. horneri extract.


Fig. 8. 
Response surface plots demonstrating the interactive effects of (A) extraction time and ethanol concentration, and (B) extraction temperature and ethanol concentration on CAI of S. horneri extract.

3.5. 초음파 추출의 최적 추출 조건 탐색

괭생이모자반 추출물의 생리활성물질 최적 추출 조건 설정을 위해 추출 조건에 따른 RSA, TAI, CAI의 등고선도를 중첩하여 종속변수를 모두 만족하는 최적 추출 조건을 예측하였다 (Fig. 9). 이 때, 독립변수 중 RSA, TAI와 CAI에 가장 높은 영향을 주었던 에탄올 농도를 우선 최적점인 73.0%에 고정하였고 추출 시간과 추출 온도의 최소화를 제한조건으로 설정하여 상업화 생산에 있어 보다 경제적인 조건을 도출하였다. 본 조건에서, 괭생이모자반의 UAE 최적 추출 조건은 에탄올 73.0%, 추출 온도 54.8°C, 추출 시간 11.7 분으로 예측되었고, 이 때 종속변수인 RSA 29.1%, TAI 78.5%와 CAI 83.6%로 예측되었다. 검증실험을 위해 반응표면분석법에 의해 예측된 값과 동일조건에서 실험을 진행하였을 때 RSA 32.1%, TAI 75.3%와 CAI 82.0%가 확인되어 2차 회귀함수를 이용한 예측값과 유사한 수준으로 확인되었다.


Fig. 9. 
Superimposing contour map at the optimized level of ethanol concentration of 73.0% for the simultaneous maximization of RSA (%), TAI (%), and CAI (%).


4. CONCLUSION

본 연구에서는 국내 전 연안에 분포하고 있는 유해 해양생물인 괭생이모자반으로부터 UAE를 통한 추출에 있어 항산화, 미백과 주름개선의 기능성 물질 추출 최대화를 위한 추출 조건을 확립하였다. 최적화를 위한 17개 실험을 통해 TPC, TFC, RSA, TAI와 CAI를 분석한 결과 모두 5% 이내의 유의성이 인정되었고 계량인자의 주효과도와 교호효과도를 모두 고려하였을 때 에탄올 농도의 영향이 가장 큰 것으로 확인되었다. 괭생이모자반 추출물의 RSA, TAI와 CAI 최대값의 반응표면을 중첩하여 얻어진 최적 추출 조건은 추출 시간 11.7 분, 추출 온도 54.8°C와 에탄올 73.0%였으며 이 조건에서 RSA, TAI와 CAI는 각각 29.1%, 78.5%와 83.6%로 예측되었다. 따라서 본 연구는 기존 육상생물 유래 천연 항산화제를 대체할 새로운 후보 물질을 제시를 위해 괭생이모자반으로부터 항산화, 미백과 주름개선 기능성 화장품의 원료로서 활용 가능성을 확인하였으며 해양 유해 해조류을 이용한 환경문제 해결과 함께 고부가가치 물질 생산에 적합한 UAE 공정확보와 조건 최적화를 수행했다는 점에서 연구의 의의가 있다고 하겠다.


References
1. Kim, J. H., H. D. Cho, Y. S. Won, H. J. Min, S. H. Han, K. D. Moon, and K. l. Seo (2019) Antioxidant and α-glucosidaseactivity inhibition of solvent fractions from Prunus mume ethanol. Extract Journal of Life Science. 29: 1111-1119.
2. Kwon, D. H., Y. H. Choi, B. W. Kim, and H. K. Hwang (2019) Effects of ethanol extract of Sargassum horneri on adipocyte differentiation and adipogenesis in 3T3-L1 preadipocytes. Journal of Life Science. 29: 209-214.
3. Lee, C. W., H. A. Kim, H. R. Yoon, and T. Y. Jeon (2019) Establishment of seaweed fermentation process for cosmetic material research. Korea Academy Industrial Cooperation Society 20: 14- 19.
4. Seo, E. J., E. S. Hong, M. H. Choi, K. S. Kim, and S. J. Lee (2010) Antioxidant and skin whitening effects of Rhamnus yoshinoi extracts. Korean Journal of Food Science Technology. 42: 750- 754.
5. Kim, G. Y., S. J. Lee, M. J. Jeon, B. M. Kim, G. T. Kim, S. M. Kang, K. Y. Lee, E. J. Shin, S. Y. Kim, and Y. M. Kim (2018) The evaluation of niacinamide-dipeptide convergence as skin whitening materials. Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal. 33: 9-25.
6. Park, J. Y., H. N. Lee, M. Y. Hu, and J. H. Park (2019) Kojic acid derivatives have tyrosinase inhibitory activity to suppress the production of melanin in the biosynthetic pathway. Journal of Life Science. 29: 755-761.
7. Kim, M. J., S. Y. Kim, K. H. Hyun, D. S. Kim, S. Y. Kim, and C. G. Hyun (2017) Antimelanogenic of Artemisia fukudo makino extract in melanoma cells. Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal. 32: 233-237.
8. Kang, H., S. K. Lee, K. J. Song, and M. S. Jung (2010) Antioxidant and anti-aging activities of ethanol extracts from defatted Perilla frutescens. Journal of Naturopathy. 7: 70-74.
9. Cho, H. D (2017) The study of bulbil extract of chinese yam for anti-wrinkle effect. The Korean Society of Cosmetics and Cosmetology. 7: 31-38.
10. Gu, Y. R., J. H. Kim, and J. H. Hong (2018) The anti-oxidant, whitening and anti-wrinkle effects of Castanea crenata inner shell extracts processed by enzyme treatment and pressurized extraction. Korean Journal of Food Preservation. 25: 79-89.
11. Lim, S. B., M. U. Kim, E. H. Lee, Y. J. Kim, E. B. Cho, K. I. Park, I. K. Kang, and Y. J. Cho (2018) Anti-oxidant and Inhibitory activities on elastase, collagenase, hyaluronidase, and α-glucosidase of Cedrela sinensis fruits. Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition. 47: 1085-1092.
12. Min, B. R., Y. J. Han, D. K. LEE, J. M. Cho, H. J. Jung, and J. W. Kim (2017) Optimization of microwave-assisted extraction conditions for production of bioactive material from corn stover. Korean Journal of Chemical Engineering. 56: 66-72.
13. Lee, S. E., E. M. Ju, and J. H. Kim (2000) Natural medicinal plants against oxidative damage Induced by reactive oxygen species. Environmental Health and Toxicology. 15: 147-155.
14. Kim, Y. S., E. A. Yang, and K. W. Nam (2013) Benthic marine algal flora and community structure of eocheongdo in western coast of korea. Korean Journal of Environment Ecology. 27: 655- 665.
15. Sin, Y. S (2018) The research for cosmetic component about algae complex including of Sargassum horneri (Turner) C. Agardh and Enteromorpha prolifera extracts. Korean Society of Cosmetics and Cosmetology. 8: 135-147.
16. Moon, K. M., S. H. Park, and M. S. Heo (2018) Phylogenetic diversity and community structure of microbiome isolated from Sargassum horneri off the Jeju Island coast. Journal of Life Science. 28: 1179-1185.
17. Jun, J. Y., S. Y. Lee, B. M. Kim, and I. H. Jeong (2011) Effect of lactic acid extracts of Sargassum horneri on bone formation in female sprage-dawley rats. Korean Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 44: 25-30.
18. Sin, D. B., E. H. Han, and S. S. Park (2014) Cytoprotective effects of phaeophyta extracts from the coast of Jeju island in HT-22 mouse neuronal cells. Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition. 43: 224-230.
19. Hong, J. H., M. J. Lee, S. J. Moon, D. S. Kim, E. Y. Nho, J. Y. Choi, and S. Kim (2019) Analysis of monosaccharide composition of fucoidan from Sargassum horneri using UPLC-DAD-TOF/ MS combined with precolumn derivatization by 3-methyl-1-phenyl- 5-pyrazolone. Korean Journal of Food Preservation. 26: 219- 227.
20. Kim, M. J., W. M. Chu, and E. J. Park (2012) Antioxidant and antigenotoxic effects of shiitake mushrooms affected by different drying methods. Journal of Korean Society of Food science and Nutrition. 41: 1041-1048.
21. Kim, S. J., G. S. Lee, S. H. Moh, J. B. Park, J. G. Auh, Y. J. Chung, T. K. Ryu, and T. K. Lee (2013) Phenolic contents and antioxidant activities of six edible seaweeds. Korea Academy Industrial Cooperation Society. 14: 3081-3088.
22. Lee, J. H., Y. R. Son, B. W. Lee, H. J. Kim, J. Y. Park, H. S. Lee, J. S. Kim, H. H. Park, O. K. Han, S. I. Han, and Y. Y. Lee (2018) Analysis of total polyphenol content and antioxidant activity in puffed oats. Korean Journal of food science and technology. 50: 117-121.
23. Yang, J. H., S. H. Baek, D. W. Park, D. H. Jun, G. J. Kim, and M. J. Jang (2014) In vitro activities of grape pruning stems for application of cosmetic ingredients. Journal of Life Science. 24: 648- 654.
24. Wűnsch, E., and H. G. Heindrich (1963) Zur quantitativen bestimmung der kollagenase. Biological Chemistry Journal. 333: 149- 151.
25. Han, K. Y., J. Y. Choi (2016) Establishment of optimum extraction conditions for antioxidant activity of chickpea by response surface methodology. Food Service Industry Journal. 12: 25-34.
26. Lee, M. Y., M. S. Yoo, Y. J. Whang, Y. J. Jin, M. H. Hong, and Y. H. Pyo (2012) Vitamin C, total polyphenol, flavonoid contents and antioxidant capacity of several fruit peels. Korean Journal of Food Science and Technology. 44: 540-544.
27. Kim, S. Y., S. J. Kim, J. A. Kim, D. H. Kim, S. H. Kwak., C. H. Chung, I. H. Jeon, S.I. Jang, and S. I. Jeong (2014) Anti-oxidant and α-glucosidase inhibition activity of extracts or fractions from Diospyros lotus L. leaves and quantitative analysis of their flavonoid compounds. Journal of Life Science. 24: 935-945.
28. Lee, H. J., J. R. Do, J. H. Kwon, and H. K. Kim (2010) Antioxidant effects of Viscum album L. extracts by extraction conditions. Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition. 39: 14-19.