The Korean Society For Biotechnology And Bioengineering

Current Issues

Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 36, No. 1

[ Review Paper ]
Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 35, No. 4, pp.303-309
Abbreviation: KSBB J
ISSN: 1225-7117 (Print) 2288-8268 (Online)
Print publication date 31 Dec 2020
Received 08 Dec 2020 Revised 22 Dec 2020 Accepted 23 Dec 2020
DOI: https://doi.org/10.7841/ksbbj.2020.35.4.303

Biorenovation 생물 전환 기법을 적용한 주엽나무 잎 추출물이 B16F10 흑색종 세포에 대한 Melanogenesis 관련 유전자 발현에 미치는 영향
김지현 ; 박태진 ; 심지한 ; 김승영*
선문대학교 제약생명공학과

The Effects of Gleditsia japonica Extract Following Biorenovation on Melanogenesis-related genes in B16F10 Melanoma Cells
Ji-Hyeon Kim ; Taejin Park ; Ji Han Sim ; Seung-Young Kim*
Department of Pharmaceutical Engineering & Biotechnology, Sunmoon University, Asan 31460, Korea
Correspondence to : Department of Pharmaceutical Engineering & Biotechnology, Sunmoon University, Asan 31460, Korea Tel.: +82-41-530-2390, Fax: +82-41-530-2939 E-mail: sykim01@sunmoon.ac.kr


© 2020 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering
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Abstract

Biorenovation is a method of modifying the structure of a broad range of substrates such as chemical compounds and plant extract by microbial enzymes with the potential benefits of reduced cytotoxicities and enhanced biological activities relative to its parent substrates. The purpose of this study was to generated Gleditsia japonica Miquel leaf (GJ) extract using Biorenovation technology and tested the whitening properties of its Biorenovation product (GJBR) in α- melanocyte-stimulating hormone (α-MSH) stimulated B16F10 melanoma cells. As a result of in vitro tyrosinase activity assay, GJBR showed significant whitening effect than GJ. Especially in B16F10 cells, we found that pre-treatment of GJBR efficiently prevented extracellular secretion of melanin with dose-dependent manner. Therefore, it suggests that maybe various components that converted by biorenovation contained in the GJBR affect multiple factors involved in α-MSH-induced melanogenesis in B16F10 cells. Then together, our results indicate that GJBR could be a new source for the ingredients of cosmetics.


Keywords: Gleditsia japonica, biorenovation, tyrosinase, whitening agent, melanogenesis

1. INTRODUCTION

현대 과학의 발전으로 평균 수명이 늘어나고 국민 생활 수준의 향상으로 소비자들이 외모를 가꾸고 싶은 욕구가 증가하여 피부 미용에 관심이 높아져 이에 따라 기능성 화장품에도 관심도가 높아지고 있다 [1,2]. 멜라닌은 피부, 모발, 눈, 뼈, 뇌 등에 분포되어 있는 물질로 피부와 눈동자, 머리카락의 색을 결정한다 [3,4]. 또한, α-melanocyte-stimulating hormone (α-MSH)과 같은 호르몬에 의해 합성된 멜라닌은 일정량 이상의 자외선을 차단하는 기능이 있어 세포 손상을 억제하는 역할을 하지만 과도한 축적과 합성으로 인해 색소가 침착되어 기미, 잡티, 주근깨, 피부 반점 등이 일어나고 피부 노화 및 피부 암으로 이어지기도 한다 [5-7]. 따라서 멜라닌 생성 과정을 방해하여 과도한 멜라닌 생성을 저해시켜야 이러한 현상들을 예방할 수 있다. 멜라노사이트 (melanocyte)에 의해 생성되는 멜라닌은 생물고분자 (biopolymer)로서 세포로부터 멜라노좀 (melanosome)의 형태가 분비되어 표피를 구성하고 있는 각질세포 (kerationcyte)로 이동하게 된다 [8-11]. 표피 기저층에 존재하는 멜라노사이트 내의 멜라노좀에서 tyrosinase, TRP-1 (tyrosinase related protein-1)과 DCT (dopachrome tautomerase) 등의 효소에 의해 멜라닌이 생성되게 된다 [12-14]. 그중 tyrosinase 효소로부터 시작되는 멜라닌 생성은, tyrosinase 효소가 DOPA를 거쳐 DOPAquinone으로 변환되고, 이것이 효소반응과 자동 산화 반응으로 인해 DOPAchrome을 거쳐 멜라닌이 형성된다 [15-17]. 이는 검은색과 갈색을 띠는 eumelanin의 합성에 더 많은 관여를 하는 것으로 알려져 있는 TRP-1 (tyrosinase related protein-1)과 TRP-2 (tyrosinase related protein-2)의 작용에 의해 조절되며 [18-20], 이러한 신호전달 기전의 조절을 통해 melanogenesis를 조절하는 것이 가능하다 [21].

장미목 콩과의 낙엽교목에 속하는 주엽나무 (Gleditsia japonica)는 함경북도를 제외한 전국의 산기슭과 산골짜기의 개울가에서 서식하며, 보고된 주요 활성 성분은 글레디닌 (Gledinin), 글레딧신 (Gleditsin), 푸스틴 (Fustin), 노나코산 (Nonacosan) 등이 알려져 있으며 소염작용 및 항궤양 작용을 한다고 보고된 바 있다 [22]. 또한, 한방에서는 주엽나무의 가시를 조각자 또는 조구등, 열매는 조협자라 부르며 거담, 중풍, 두통, 기침, 기관지염에 좋아 예로부터 약재로 쓰이고 있지만 다량 복용하면 주엽나무 내 존재하는 사포닌이 위장 점막을 자극해 구토를 일으키고, 설사와 경련, 마비가 일어난다 [23]. 이러한 독성이 있거나 활용 가치가 낮은 소재들을 현재 시장에서는 다양한 친환경 기술을 사용하여 가치를 상승시키는 연구 개발이 활발하게 이루어지고 있다 [24]. 본 연구에서는 소재의 melanogenesis 신호전달 기전을 조절하여 소재의 가치를 상승시키고자 B16F10 세포를 이용하여 주엽나무 추출물과, Biorenovation 기법으로 생물전환 시킨 주엽나무 추출물의 세포 독성, Tyrosinase 저해 효과, Melanin 생합성 저해 효과, 멜라닌 합성에 관여하는 단백질인 TRP-1, TRP-2, Tyrosinase, microphthalmia-associated transcription factor (MITF)의 발현 저해 효과를 확인한 후 미백화장품 소재로서의 활용 가치를 모색하고자 한다.


2. MATERIALS AND METHODS
2.1. 재료 및 추출

본 연구에 사용된 주엽나무 (Gleditsia japonica)는 20년도 경북 경주에서 채취한 원물로 서현생약영농조합에서 구입하여 실험을 진행하였다. 건조된 주엽나무 잎 원물 300 g을 분쇄한 후 70% Ethanol 1 L를 첨가하여 60°C에서 3시간 동안 가열시킨다. 이후 상온에서 18시간 동안 추출하여 얻은 추출액을 여과하여 감압 농축한 뒤, 동결건조를 통해 시료를 제조하였다.

2.2. 실험재료 및 세포배양

본 실험에서 사용된 α-멜라닌세포 자극 호르몬 (α-melanocytestimulating hormone, α-MSH)과 L-3,4-dihydroxyphenylalanin (L-DOPA)는 Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구매하였다. B16F10 melanoma cell은 ATCC사 (American Type Cell Culture, USA)에서 분양을 받았으며 10% Fetal Bovine Serum (FBS, Gibco BRL Co., Grand Island, NY, USA), 1% penicillin/streptomycin을 함유한 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, Gibco BRL Co. Grand Island, NY, USA) 배지를 사용하여 37°C, 5% CO2 항온기에서 배양하였고, 3일에 한 번씩 계대배양을 하였다.

2.3. 미생물 배양 및 Biorenovation 반응

Biorenovation 생물 전환 기법에 사용된 Bacillus amyloliquefaciens (KCTC 43033)는 미생물센터에서 분양받아 사용하였다. 본 균주의 배양은 Nutrient Broth (Peptone 5.0 g/L, Beef extract 3.0 g/L)를 이용하여 최적의 생육 조건에 맞추어 30°C, 200 rpm에서 18시간 동안 배양 후, 5,000 rpm에서 15분 동안 원심 분리하여 얻어진 pellet을 PG buffer (50 mM Phosphate buffer, 2% Glycerin)로 2회 세척하였다. 그 후 세척한 pellet을 동일한 PG buffer에 현탁하여 사용하였고, 30°C, 200 rpm에서 72시간 반응 후 원심분리를 통해 상등액을 감압 농축하여 사용하였다.

2.4. Biorenovation 전환물의 HPLC 분석

HPLC 분석을 위해 Shimadzu SpectroMonitor 3200 digital UV/Vis detector (Phenomenex 4 μm Hydro-RP 80 Å, 250 × 4.6 mm)를 사용하였다. 또한, 검출 파장은 254 nm를 사용하였으며, 용매의 조성은 H2O에 0.1% TFA (Trifluoroacetic acid, A)를 첨가하여, Acetonitrile (B)과 함께 사용하였다. 분석은 각 시료를 Ethanol에 녹여 10 μl씩 주입하였으며, 용매의 흐름 속도는 1.0mL/min, column 온도는 40°C로 하였고, 용매의 구배는 A: 90%, B: 10%로 시작하여 30 min에 A: 0%, B: 100%로 하여 30분간 Gradient 조건으로 분석하였다.

2.5. 세포 생존율 측정

주엽나무 잎 추출물과 생물 전환된 주엽나무 추출물, 생물 전환 기법에 사용된 B. amyloliquefaciens 추출물의 B16F10세포에 대한 생존율은 MTT assay를 통해 측정하였다. B16F10 melanoma cell을 24 well plate에 1.0 × 104 cells/well만큼 분주하여 37°C, 5% CO2 항온기에서 24시간 전 배양한 후 200 nM 농도의 α-MSH와 각 시료를 50, 100, 200 μg/mL의 농도로 처리하여 배양하였다. 이후 MTT (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 용액을 첨가하여 37°C, 5% CO2 항온기에서 4시간 동안 반응시킨 후 상등액을 제거하고 형성된 formazan 침전물을 DMSO (dimethyl sulfoxide)를 첨가하여 용해 시켜 주었다. 그 후 96 well plate에 옮겨 담아 ELISA reader를 사용하여 570 nm 파장으로 흡광도를 측정하였다.

2.6. B16F10 세포의 Melanin contents 측정

B16F10 melanoma 세포에 대한 각 시료의 미백 활성을 확인 하기 위해 B16F10 cell을 60 mm plate에 6.0 × 104 cells/well로 분주하여 37°C, 5% CO2 항온기에서 24시간 전 배양하였고, 200 nM 농도의 α-MSH와 sample을 농도별로 함께 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 이후 PBS (phosphate buffered saline, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)로 세척해 준 후 trypsin-EDTA (Gibco, Grand Island, NY, USA)를 처리하여 세포를 회수하고, 1%의 Protease inhibitor (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)가 함유된 RIPA buffer (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 넣어 세포를 lysis 해준 후 원심분리하여 pellet과 상등액을 분리하였다. 분리한 Pellet에 1N NaOH (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 넣어 90°C에 1시간 동안 반응시킨 후 ELISA를 이용하여 405 nm 파장으로 흡광도를 측정하였다.

2.7. B16F10 세포의 Tyrosinase activity 측정

Tyrosinase activity를 측정하기 위해 B16F10 세포를 60 mm plate에 6.0 × 104 cells/well로 분주하여 37°C, 5% CO2 항온기에서 24시간 배양하였고, 200 nM 농도의 α-MSH와 sample을 농도별로 함께 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 이후 trypsin-EDTA를 처리하여 세포를 회수하고 1%의 Protease inhibitor가 함유된 RIPA buffer를 넣어 lysis 한 후 원심 분리하여 얻은 상등액에 L-DOPA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 2 mg/mL를 첨가하여 1시간 동안 37°C에서 반응시킨다. 반응 후 490 nm에서 DOPA chrome 양을 측정하여 상대적 tyrosinase 활성을 측정하였다.

2.8. Western Blot

B16F10 세포를 60 mm plate에 6.0 × 104 cells/well로 분주하여 37°C, 5% CO2 항온기에서 24시간 배양한 후 α-MSH와 GJ, GJBR을 농도별로 함께 처리하여 48시간 동안 배양하였다. 이후 배양된 세포를 PBS를 이용해 세척하고 RIPA buffer를 첨가하여 lysis 한 후, 13,000 rpm에서 40분간 원심 분리하여 pellet과 단백질 상등액을 분리하였다. 분리한 단백질은 BCA protein assay kit (Thermo Scientific, USA)를 이용하여 정량하였고, 정량한 단백질을 10% SDS-PAGE에 전기영동한 후 poly-vinylidene difluoride (PVDF) membrane (Milipore, Burlington, MA, USA)으로 단백질을 전이시켰다. 그 후 5% skim milk를 포함한 0.05% Tween 20/Tris-buffered saline (0.05% T/TBS)에 넣고 상온에서 2시간 동안 Blocking 시킨 후, 1차 항체인 TRP-1, TRP-2, MITF, Tyrosinase (Santa cruz Biotechnology, USA)를 각각 처리하여 4°C에서 18시간 반응 시켰고, 0.05% T/TBS로 10분간 4회 세척 후 Horseradish peroxidase (HRP)가 결합된 anti-mouse IgG을 1 : 10,000으로 희석하여 상온에서 2시간 동안 반응한 뒤 0.05% T/TBS 용액으로 4회 세척하였다. 단백질은 Enhanced chemiluminescence kit (Biorad, USA)를 사용하여 Imaging densitometer (model GS-700, Bio-rad, USA)를 통해 결과를 측정하였다. 또한, imageJ program (NIH, Bethesda, MD, USA)을 이용하여 TRP-1, TRP-2, MITF, Tyrosinase 단백질 발현량의 면적을 수치화한 뒤 그래프로 나타내었다.

2.9. 통계처리

모든 실험은 3회 반복하여 측정하였고, 그 결과는 평균값 ± 표준편차로 나타냈으며 통계적 분석은 각 처리 구간의 유의성 (p < 0.05, p < 0.01, p < 0.005)을 검증을 위해 분산분석(analysis of variance, ANOVA) 후 student’s t-test로 다중 비교를 하였다.


3. RESULT AND DISCUSSION
3.1. Biorenovation 전환물의 HPLC 분석

주엽나무 잎 추출물을 B. amyloliquefaciens 균주를 이용하여 biorenovation 기법으로 생물 전환한 후, 원심분리를 통해 반응물의 상등액을 회수하여 HPLC를 통해 주엽나무 잎 추출물과 비교 분석을 진행한 결과, biorenovation 생물 전환 기법을 통해 전환된 추출물 시료에서 주엽나무 잎 추출물에 존재하지 않는 신규 peak와 기존에 존재하는 peak의 변화를 확인할 수 있었다 (Fig. 1). 이는 본 논문에서 사용된 biorenovation 생물전환 기법에 의해 주엽나무 잎 추출물에 존재하는 다수화합물이 B. amyloliquefaciens이 가진 효소적 특성에 의해 미지의 화합물 또는 기존에 존재하는 화합물로 생물전환되어 나타난 peak의 가능성을 시사했다. 향후, 미생물에 의해 전환되는 물질 및 미생물 대사에 관한 연구가 필요할 것으로 사료된다.


Fig. 1. 
HPLC analysis of Gleditsia japonica extract (GJ), Gleditsia japonica Biorenovate Extract (GJBR) and Bacillus amyloliquefaciens (BA).

The chromatogram showed Gleditsia japonica Extract (GJ), Gleditsia japonica Biorenovate Extract (GJBR), and B. amyloliquefaciens extract (BA).



3.2. 세포 생존율 측정

주엽나무 추출물 (GJ)과 생물 전환된 주엽나무 추출물 (GJBR), biorenovation 생물 전환 기법에 사용된 B. amyloliquefaciens의 추출물 (BA)가 세포에 미치는 영향을 알아보기 위해 B16F10 melanoma 세포에 각 시료를 50, 100, 200 μg/mL의 농도로 처리하여 측정한 결과, GJ와 GJBR 모두 측정 농도에서 약 90% 이상의 세포 생존율을 보이며 두 시료 모두 B16F10 melanoma cell에 대한 독성이 미미하다는 것을 확인하였다. 또한, biorenovation 생물 전환 기법에 사용된 BA도 측정 농도에서 세포에 대한 독성을 전혀 보이지 않았다 (Fig. 2). 추후 실험에서 세포 독성을 보이지 않았던 동일한 조건으로 GJ와 GJBR의 melanin 합성 억제 실험을 진행하였다.


Fig. 2. 
Effects of GJ, GJBR and BA on the cell viability in B16F10 melanoma cell by the MTT assay.

The cytotoxicity was assayed of cells stimulated with α-MSH (200 nM) in the presence of sample (50, 100, and 200 μg/mL) for 72 h. Result is expressed as percentages compared to the respective values obtained for the control.



3.3. B16F10 세포의 Melanin 생합성 저해 효과

멜라닌의 합성 저해 효과를 확인하기 위해 세포에 대한 독성 결과를 토대로 GJ와 GJBR의 melanin contents를 진행하였다. 그 결과, GJ는 무처리 군과 비교하였을 때 α-MSH만 단독으로 처리한 경우에는 약 33%만큼의 멜라닌 생성량이 증가하였으며, α-MSH 처리 군 대비 각 농도 (50, 100, 200 μg/mL)별 멜라닌의 생성 억제는 약 6%, 7%, 17%로 농도 의존적으로 멜라닌의 합성을 저해하였으나 그 효과는 미미하였다. 반면에 Biorenovation 기법에 의해 전환된 주엽나무 추출물 (GJBR)의 경우에는 α-MSH 처리 군 대비 각 농도에서 약 13%, 23%, 37%로 농도 의존적으로 멜라닌의 생성을 억제하였으며, 최고 농도인 200 μg/mL에서 무처리 군과 유사하게 멜라닌 생성을 억제하는 것으로 나타났다 (Fig. 3). 이를 통해 Biorenovation 생물 전환 기법이 원료의 멜라닌 합성 저해 활성을 더욱 증가시키는 것을 확인할 수 있었다. 추가로 멜라닌 합성은 tyrosinase에 의해 생성되기 때문에 tyrosinase 저해 활성과 melanogenesis 활성을 조절하는 신호 전달 인자의 저해 효능을 통해 GJ와 GJBR의 미백 활성 기전을 규명하고자 하였다.


Fig. 3. 
Effects of GJ and GJBR on cellular melanin synthesis in B16F10 cells.

Cells were treated with α-MSH (200 nM) in presence or absence of sample at the indicated concentrations for 72 h. Melanin content was measured by absorbance at 405 nm. Data represent the means ±SD with three separate experiments. *p < 0.05; **p < 0.01.



3.4. B16F10 세포의 Tyrosinase 저해 활성

Tyrosinase는 멜라닌 합성에서 가장 중요한 역할을 하는 효소로 melanosome에서 tyrosine을 산화시켜 L-DOPA로 전환하며, 전환된 L-DOPA를 DOPA quinone으로 전환하는 일련의 과정에서 촉매작용을 통해 멜라닌 합성에 관여하게 된다 [25]. 따라서 tyrosinase의 발현을 저해시켜 미백 활성을 확인 하고자, 본 실험에서 주엽나무 추출물 (GJ)과 생물 전환된 주엽나무 추출물 (GJBR)을 B16F10 melanoma cell를 이용하여 tyrosinase 발현의 저해 활성을 측정하였다. Melanin 저해 활성과 동일한 농도로 시료를 처리한 결과, GJ는 α-MSH 처리군과 비교하였을 때 각 처리 농도에서 약 22%, 25%, 32%만큼의 tyrosinase 발현을 저해시켰고, GJBR에서는 약 41%, 67%, 74%만큼 저해 활성을 보였다. 특히 200 μg/mL의 농도에서는 무처리군과 유사할 정도로 높은 저해 활성을 나타내었다 (Fig. 4). 이로써, GJ와 GJBR 추출물이 tyrosinase의 활성을 간접적으로 조절하여 melanin의 합성을 저해한다는 것을 확인하였다.


Fig. 4. 
Effects of GJ and GJBR on tyrosinase activity in B16F10 cells.

Cells were treated with α-MSH (200 nM) in presence or absence of sample at the indicated concentrations for 72 h. Tyrosinase activity was measured by absorbance at 490 nm. Data represent the means ±SD with three separate experiments. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.005.



3.5. Western Blot

B16F10 세포에 대한 주엽나무 추출물과 생물 전환된 주엽나무 추출물의 melanin 생합성 저해 효과와 tyrosinase 저해 활성을 확인하기 위하여 멜라닌 합성에 관여하는 TRP-1, TRP-2, MITF, Tyrosinase 단백질 발현을 Western Blot을 이용하여 조사하였다. 멜라닌 생성 초기 반응에서 작용하는 효소인 tyrosinase는 L-tyrosine을 L-DOPA로, L-DOPA는 TRP-1, TRP-2 등의 효소가 관여하여 멜라닌을 합성하게 된다. 또한, Tyrosinase, TRP-1, TRP-2의 발현을 조절하는 전사 인자인 MITF는 다양한 타겟 유전의 DNA 서열에 결합하여 분화, 증식, 세포 이동, 종양 형성과 같은 세포 반응을 유도하는 것으로 알려져 있다 [26]. Figure 5와 같이 멜라닌 자극 호르몬인 α-MSH를 처리하여 B16F10 세포의 흑화를 유도하였으며, 각 시료를 처리하여 TRP-1, TRP-2, Tyrosinase, MITF의 단백질 발현 양을 측정한 결과, TRP-1 단백질 발현을 두 시료 모두 농도 의존적으로 억제하였으며, GJBR의 경우 최고 농도인 200 μg/mL에서 대조군과 유사할 정도로 단백질 발현을 억제하였다 (Fig. 5a). TRP-2의 경우, GJ 추출물의 50 μg/mL 농도에서는 α-MSH 처리 군에 비해 더 많은 양의 단백질을 발현하였으나 100, 200 μg/mL에서는 농도 의존적으로 발현을 억제했으며, 특히 최고 농도에서는 약 77%의 뛰어난 저해 활성을 보였다. 반면, GJBR은 측정 농도에서 약 25%, 30%, 45%만큼의 단백질 발현 저해 활성을 보였다 (Fig. 5b). Tyrosinase 단백질 발현은 두 시료 모두 농도 의존적으로 발현을 억제하였지만, GJBR 추출물이 GJ 추출물보다 더 무처리 군과 유사할 정도로 월등하게 억제시켰다 (Fig. 5c). 추가적으로, GJ는 멜라닌 형성의 조절인자로 잘 알려진 MITF의 전사 활성은 50, 100 μg/mL 농도에서 α-MSH 처리 군보다 더 많이 발현시켰으나 200 μg/mL의 농도에서는 α-MSH 처리 군 대비 약 25%만큼 활성을 억제하였다. GJBR의 경우 측정 농도에서 뛰어난 MITF의 전사 억제 활성을 보였으며 특히 최고 농도인 200 μg/mL에서 대조군만큼 전사시키는 것을 확인하였다 (Fig. 5d). 이를 통해 GJBR 추출물이 GJ 추출물에 비해 더 우수하게 멜라닌 합성을 감소시킨다는 것을 확인할 수 있었다.


Fig. 5. 
Effect of GJ and GJBR on the protein levels of TRP-1, TRP-2, MITF, and Tyrosinase in B16F10 melanoma cells.

Protein expression levels of TRP-1 (a), TRP-2 (b), tyrosinase (c), MITF (d) in α-MSH simulated B16F10 melanoma Cells. B16F10 melanoma Cells (6.0 × 104 cell/mL) were stimulated with α-MSH (200 nM) in the presence of GJ and GJBR (50, 100, 200 μg/ml) for 48 h. We use 10% SDS-PAGE gel and expressions of TRP-1, TRP-2, tyrosinase, MITF and β-actin were determined by western blotting. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001.




4. CONCLUSION

본 연구에서는 생체 및 생촉매의 기능을 활용하여 다양한 분야의 소재에 적용할 수 있는 생물 전환 기술 중 미생물의 효소적 특징을 이용한 biorenovation 전환기법을 주엽나무에 적용하였으며, 미백 화장품 원료로서의 가치를 B16F10 melanoma 세포를 이용하여 세포에 대한 독성, Melanin 합성 저해 효과, 멜라닌 합성에 관여하는 TRP-1, TRP-2, Tyrosinase, MITF의 발현 저해 효과 및 기전 연구를 통해 효용성을 확인 하고자 하였다. 그 결과, GJ와 GJBR의 tyrosineae 저해 활성은 MITF 전사 활성에 의한 것으로 확인할 수 있었고, 두 시료 모두 멜라닌 합성에 관여하는 인자의 단백질 발현을 억제하였지만, GJ는 TRP-2 단백질의 발현을, GJBR 추출물은 TRP-1과 tyrosinase, MITF 단백질 발현을 더 우수하게 억제하는 경향을 보였다 (Fig. 5). 이러한 결과를 통해 GJBR는 멜라닌 형성을 억제할 뿐만 아니라 멜라닌 생성 관련 인자들의 발현 또한 조절된다는 것을 입증하였으며, GJ는 eumelanin을 생성하는 과정에서 dopachrome이 DHICA (dihydroxyindole-2-carboxylic acid)로 분해하는 TRP-1 단백질 발현을 더 효과적으로 억제하는 결과를 보였다 [27]. 미생물을 이용한 생물 전환 기법인 biorenovtion은 생리 활성을 증대시키기 위한 매우 유용한 기술이라는 것을 입증하였으며, 추후 GJ 추출물 내 존재하는 어느 성분이 전환되어 미백 활성을 증가시켰는지 유효성분 분석에 관한 연구를 추가적으로 진행해야 할 것으로 판단된다. 또한, 가치가 낮거나 버려지는 다양한 소재에 biorenovation 생물전환 기법을 적용하여 화장품 원료뿐만 아니라 다양한 분야에 적용할 수 있는 소재를 개발 및 응용하고자 한다.


Acknowledgments

본 연구는 중소벤처기업부와 중소기업기술정보진흥원이 지원하는 전략형창업과제로 수행된 연구결과입니다(S2870640).


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