The Korean Society For Biotechnology And Bioengineering

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Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 36, No. 1

[ Review Paper ]
Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 35, No. 4, pp.310-318
Abbreviation: KSBB J
ISSN: 1225-7117 (Print) 2288-8268 (Online)
Print publication date 31 Dec 2020
Received 09 Dec 2020 Revised 16 Dec 2020 Accepted 17 Dec 2020
DOI: https://doi.org/10.7841/ksbbj.2020.35.4.310

추출 방법에 따른 후박나무 잎과 가지 추출물의 항산화 및 항염증 효과
김나인 ; 최문희 ; 신현재*
조선대학교 대학원 화학공학과

Antioxidant and Anti-inflammatory Effects of Machilus thunbergii Leaves and Branch Extracts with Different Extraction Methods
Nain Kim ; Moon-Hee Choi ; Hyun-Jae Shin*
Department of Chemical Engineering, Graduate School of Chosun University, Gwangju 61452, Korea
Correspondence to : Department of Chemical Engineering, Graduate School of Chosun University, Gwangju 61452, Korea Tel: +82-62-230-7518; Fax: +82-62-230-7226 E-mail: shinhj@chosun.ac.kr


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Abstract

An ethnic plant of Machilus thunbergii (MT), belonging to the family Lauracecae, grows in warm areas of South Korea and Japan, China, and Philippines. In this study, we investigated the possible utilization of MT extracts from leaves and branch with different extraction methods for the investigation of antioxidant and anti-inflammatory activities. The leaves and branch of MT were treated with hot water, ultra-sonic cold water, 70% ethanol, and 100% ethanol to prepare the extracts. The extracts were analyzed for total phenolic and flavonoid contents as well as antioxidant properties such as DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) free radical scavenging activity and 2,2-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline- 6-sulfonic acid)diammonium salt (ABTS) radical scavenging activity. The highest total phenolic and flavonoid contents were found in the 100% ethanol fraction in branch and 70% ethanol fraction in leaves (311.38 ± 7.94 mg gallic acid equivalent (GAE)/g extract and 20.02 ± 2.45 mg Quercetin equivalent (QE)/g extract respectively). The 70% ethanol fraction and 100% ethanol fraction showed the strongest antioxidant activities in DPPH and ABTS assays. These results suggest that MT extract provides promising antioxidant and anti-inflammatory effects, and can be used as natural cosmetic substances in cosmetic industries in near future.


Keywords: Machilus thunbergii, ethnic plant, extraction methods, ethanol extracts, polyphenol, antioxidant activity, antiinflammatory effect

1. INTRODUCTION

후박나무 (Machilus thunbergii)는 녹나무과 (Lauracecae)에 속하는 상록활엽 교목으로서 한국, 중국 남부, 일본, 타이완 등 따뜻한 지역에서 서식하며 국내에서는 전라도, 경상도를 비롯하여 남쪽 섬 지방에 주로 분포한다. 예로부터 후박나무의 변종인 목련과 (Magnoliaceae)에 속하는 낙엽교목인 중국 유래의 후박나무 (Magnolia officinalis Rehd. et Wils) 및 일본 유래의 후박나무 (Magnolia obovata Thunb.)의 가지껍질 및 줄기는 화후박으로 불리며 복통, 천식과 위장병의 치료제로 오래전부터 중국과 일본에서 사용되었다 [1]. 우리나라에는 고유의 항약으로 한후박이라는 생약이 있는데 이는 녹나무과에 속하는 후박나무의 가지껍질 및 줄기를 뜻하는 말로, 화후박과 같은 목적의 치료제로 이용된다. 그 유효성분으로는 미백효과를 지닌 meso-monomethyl dihydroguaiaretic acid, machilin A, nectandrin A와 nectandrin B 같은 lignan계 화합물 [2] 및 sesquiterpene이 보고되어 있으며, 후박나무의 잎은 quercetin, afzelin, rutin 및 trifolin 등의 flavonoid 류가 함유되어 있음이 보고되고 있다 [3]. 또한 후박나무에서 분리된 licarin A와 meso-dihydroguaiaretic acid (MDGA)는 glutamate 유도에 의해 신경독성을 억제하는 신경보호활성을 연구한 결과에서 항산화 활성을 통해 배양한 신경세포를 뚜렷하게 보호한다고 보고되고 있다 [4]. 기존연구에서 보고되는 것과 같이 높은 항산화 활성을 나타내는 폴리페놀류의 특성은 superoxide anion radical (•O2), hydrogen peroxide (H2O2), hydroxyl radical (•OH), alkoxy radical (RO•) 등의 유리기를 제거하여 세포를 산화적 손상으로부터 보호할 수 있다는 것인데, 이러한 장점으로 인해 폴리페놀류를 함유하고 있는 유용한 천연 항산화제에 대한 관심이 증대되고 있으며 천연소재를 발굴하기 위한 연구 또한 꾸준히 진행되고 있다 [5]. 지금까지 후박나무 추출물의 선행 연구결과를 살펴보면 주로 중국과 일본 등 동남아시아에서 자생하는 후박나무 종의 항산화 및 항염, 항암 활성이 일부 보고되어 있으며, 우리나라 난대성 수종인 후박나무의 다양한 생리활성은 거의 보고가 되어 있지 않다. 따라서 본 연구에서는 우리나라 난대성 수종인 후박나무를 물과 에탄올을 추출용매로 하여 추출방법에 따른 후박나무 잎 추출물 (MTL)과 가지 추출물 (MTB)을 제조하고, 항산화 활성 (DPPH 라디칼 소거능, ABTS라디칼소거능, Ferrous ion chelating 효과, 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량 측정)을 평가하였으며, NO assay 와 MTT assay를 통해 항염증 효과를 확인하고, HPLC 분석을 통해 추출방법에 따른 페놀성분을 비교 분석함으로써 후박나무의 식품 및 화장품의 기능성 소재로서의 활용 가능성을 알아보고자 하였다.


2. MATERIALS AND METHODS
2.1. 후박나무 추출물 제조

본 연구에 사용된 후박나무의 잎과 가지는 2020년도 4월경에 채취되었으며, 전라남도 완도수목원 (Wando, Korea)으로 부터 공급받았다. 건조된 잎과 가지는 분쇄 후 시료로 사용하였다. 후박나무 잎과 가지의 추출 방법별로 활성을 확인하기 위해 열수, 초음파, 70% 에탄올, 100% 에탄올을 사용하여 추출을 진행하였다 (Figure 1). 건조된 후박나무 잎, 가지 시료 20 g에 증류수 200 mL를 가한 후, auto clave를 사용해 100°C에서 1시간 열수추출을 진행하였다. 추출액은 여과지 (Whatman No. 1, Whatman International Ltd., Maidstone, UK)로 여과 후 동결건조 하였다 (MTL1, MTB1). 후박나무 잎, 가지 시료 20 g에 증류수 200 mL를 가한 후, 초음파세척기를 사용해 25°C에서 4시간 동안 초음파추출을 진행하였다. 추출액은 여과 후 동결건조 하였다 (MTL2, MTB2). 후박나무 잎, 가지 시료 20 g에 70% 에탄올 200 mL를 가한 후, 7일동안 침지하여 추출을 진행하였다. 추출액은 여과 후 감압농축하였다 (MTL3, MTB3). 후박나무 잎, 가지 시료 20 g에 100% 에탄올 200 mL를 가한 후, 7일동안 침지하여 추출을 진행하였다. 추출액은 여과 후 감압농축 하였다 (MTL4, MTB4).


Fig. 1. 
Isolation diagram of leaves (MTL) and branch (MTB) extracts of M. thunbergii (MTL).

2.2. DPPH 라디칼 소거능 측정

DPPH 라디칼 소거능은 Blois의 방법을 변형하여 측정하였다 [6]. 각 농도 별 후박나무 잎, 가지 추출물 용액 200 μL에 0.5 mM DPPH 시약을 800 μL를 혼합하고, 암실에서 15분 동안 반응시킨 후 Biotek Synergy HT multi-detection microplate reader 장비를 활용하여 517 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 양성대조군으로 gallic acid를 사용하여 비교 실험하였다. 라디칼 소거능은 다음 식에 의해 계산하여 백분율로 나타내었다. 각 반응은 3회 반복하여 측정하였다.

% of scavenging activity = (Acontrol– A sample) / A control × 100

2.3. ABTS 라디칼 소거능 측정

ABTS 라디칼 소거능은 Re 등의 방법을 변형하여 측정하였다 [7]. 2,2-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS, 14 mM) 시약을 7 mM 농도로 제조하고, potassium presulfate (4.9 mM) 시약을 2.45 mM 농도로 제조하여 1:1 비율로 혼합한 후 실온에서 16시간동안 암실 반응시켜 ABTS 라디칼을 형성하여 준비하였다. 이 용액을 730 nm에서 흡광도 값이 0.9 ± 0.02가 될 수 있도록 phosphate buffered saline (0.1 M, pH 7.4)로 희석하여 사용하였다. 각 농도별 후박나무 잎, 가지 추출물 용액 200 μL에 ABTS 용액 1,000 μL를 혼합하고, 암실에서 15분 동안 반응시킨 후 Biotek Synergy HT multi-detection microplate reader 장비를 활용하여 730 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 양성대조군으로 quercetin을 사용하여 비교 실험하였다. 라디칼 소거능은 다음 식에 의해 계산하여 백분율로 나타내었다. 각 반응은 3회 반복하여 측정하였다.

% of scavenging activity = (A control – A sample) / A control × 100

2.4. Ferrous ion chelating 효과 측정

Ferrousion에 대한 chelating 효과는 Yen 등의 방법 [8]에 따라 각 농도 별 후박나무 잎, 가지 추출물 용액 1,000 μL, 2 mM FeCl2·4H2O (iron(II) chloride tetrahydrate) 용액 100 μL, 5 mM ferrozine 100 μL를 첨가한 다음 혼합하여 실온에서 10분 동안 반응시킨 후 Biotek Synergy HT multi-detection microplate reader 장비를 활용하여 562 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 양성대조군으로 EDTA를 사용하여 비교 실험하였다. chelating 효과는 다음 식에 의해 계산하여 백분율로 나타내었다. 각 반응은 3회 반복하여 측정하였다.

% of chelating activity = (A control – A sample) / A control × 100

2.5. 총 폴리페놀 함량 측정

총 폴리페놀 함량 측정은 Folin-Ciocalteu 방법을 변형하여 측정하였다 [9]. 각 농도별 후박나무 잎, 가지 추출물 용액 500 μL에 0.2 M Folin-Ciocalteu’s phenol 시약 500 μL, 2% sodium carbonate 수용액(w/v) 500 μL를 추가로 혼합하고, 암실에서 30분 동안 반응시킨 후 Biotek Synergy HT multidetection microplate reader 장비를 활용하여 750 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 추출물의 최종 농도는 500 μg/mL로 하여 총 폴리페놀 함량은 검정곡선에 기초해 gallic acid (GAE) mg/g 당량으로 표현하였다.

2.6. 총 플라보노이드 함량 측정

총 플라보노이드 함량 측정은 Park등의 방법을 변형하여 측정하였다 [10]. 각 농도별 후박나무 잎, 가지 추출물 용액 500 μL에 methanol 1.5 mL, 10% aluminium chloride 100 μL, 1 M potassium acetate 100 μL, 증류수 2.8 mL를 차례대로 첨가하고 상온에서 40분 동안 반응시킨 후 Biotek Synergy HT multi-detection microplate reader장비를 활용하여 415 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 추출물의 최종 농도는 500 μg/mL로 하여 총 플라보노이드 함량은 검량곡선에 기초해 quercetin (QUE) mg/g 당량으로 표현하였다.

2.7. HPLC에 의한 후박나무 잎과 가지 추출물의 페놀 성분 분석

후박나무 잎, 가지 추출물에 함유된 polyphenol류를 정량분석하기 위해 HPLC (SPD-20A, SHIMADZU CO., Japan) 분석을 진행하였다. HPLC 분석은 He등의 방법을 변형하여 측정하였다 [11]. column은 C18 column (Shimpack GIS-ODS, 4.6 × 250 mm, 5.0 μm, Shimadzu Co., Japan)를 사용하였고, 이동상으로는 water (2% acetic acid) (A), acetonitrile (B)를 사용하였고, 280 nm 파장으로 분석을 진행하였다. 이동상의 구배 조건은 이동상(B)를 기준으로 0 min: B (10%), 0~60 min: B (50%), 60~65 min: B (10%), 65~70 min: B (10%)와 같은 조건으로 분석하였다. 샘플의 주입 부피는 20 μL였으며, 표준물질로는 gallic acid, chlorogenic acid, epigallocatechin gallate, epicatechin, ethyl gallate, p-coumaric acid, naringin을 사용하였다.

2.8. 세포배양

실험에 사용된 RAW 264.7 대식세포는 한국세포주 은행에서 분양 받았다. DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지에 10% fecal bovine serum (FBS)과 1% streptomycin/penicillin을 첨가하여 5% CO2, 37°C 상태에서 배양하였으며, 세포가 바닥 면적의 90%까지 자란 상태에서 계대배양 하였다.

2.9. MTT assay에 의한 세포 생존율 측정

RAW 264.7 대식세포주를 96 well plate에 각각 1 × 104 cells/well을 분주 후, 24시간 동안 배양하였다. 농도별로 시료를 처리하여 24시간 배양 한후 배양이 완료된 세포에 5 mg/mL MTT stock용액을 배양배지 부피의 1/10 이 되게 첨가하여 37°C 온도에서 4시간 동안 반응시켰다. 반응 후 배양 상등액을 제거한 다음 각각의 well에 DMSO 200 μL를 첨가해 세포에서 생성된 MTT-formazan 결정체를 용해시켜 ELISA reader 장비를 활용하여 570 nm파장에서 흡광도를 측정하였다.

2.10. NO assay에 의한 염증반응 측정

RAW 264.7 대식세포주를 1 × 104 cells/well의 농도로 96 well plate에 분주 후, 24시간 동안 배양하여 시료를 농도별로 처리하고 1시간 후 LPS 1 μg/mL 처리 후 18시간 배양하고 배양이 완료된 세포배양 상등액을 50 μL를 취하여 96 well plate에 옮겼다. Griess reagent (1% sulfanilamide in 5% phosphoric acid and 0.1% N-(1-naphthyl) ethylene-diamine (dihydrochloride in distilled water) 50 μL를 혼합하여 10분 동안 반응시킨 후 ELISA reader 장비를 활용하여 540 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. NO의 안정된 최종산물인 nitrite를 NO생성의 indicator로 사용하여 Park 등이 제시한 방법 [12]에 따라 측정하였다.

2.11. 통계처리

본 실험에서 얻어진 모든 결과값은 3회 이상의 반복 실험을 통하여 실험 결과값의 평균 ± 표준오차로 나타내었다. 실험 결과의 통계적 분석은 SPSS (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) program을 사용하여 Duncan의 방법으로 one-way ANOVA 분석을 통하여 통계분석을 실시하였으며, p < 0.05 이내가 되는 값을 선별하여 유의성이 있다고 판단하였다.


3. RESULTS AND DISCUSSION
3.1. 추출 방법에 따른 추출물의 수율

천연물 추출은 추출되는 용매와 추출 방법에 따라 성분들이 달라지기 때문에 추출 수율에 있어서도 차이를 보인다 [13]. 본 실험에서 후박나무 잎과 가지를 4가지 방법으로 추출하였으며, 추출된 후박나무 잎과 가지의 각 용매 및 추출방법에 따른 추출 수율은 Table 1에 나타내었다. 각 부위별 수율을 비교한 결과, 후박나무 잎 추출물의 함량 (34%)은 가지 추출물의 함량 (32.7%)보다 높은 것으로 확인되었다. 추출방법에 따른 잎과 가지 추출물의 수율은 70% EtOH을 사용했을 때 각각 14.00%, 10.40%로 가장 높은 것으로 확인되었으며, 열수를 사용하여 추출한 잎과 가지 추출물의 수율은 각각 3.95%, 7.15%로 확인되어 가장 낮은 수율을 나타내었다.

Table 1. 
Extraction yields of leaves (MTL) and branch (MTB) extracts of M. thunbergii
Sample Weight (g) Yield (%)
MTL1 0.79 3.95
MTL2 1.26 6.30
MTL3 2.80 14.00
MTL4 1.95 9.75
MTB1 1.43 7.15
MTB2 1.55 7.75
MTB3 2.08 10.40
MTB4 1.48 7.40

3.2. DPPH 라디칼 소거능 측정

DPPH라디칼 소거능 측정은 비교적 안정한 free radical인 DPPH를 이용함으로써 천연물의 항산화 활성을 간단히 측정 할 수 있고, 실제 항산화 활성과 연관성이 매우 높아 많이 이용되고 있는 실험법이다 [14]. 본 실험에서 후박나무 잎, 가지 추출물을 100 μg/mL-1000 μg/mL의 농도로 제조하여 DPPH 라디칼 소거능을 확인하고 IC50 값을 측정하였으며, 그 결과는 Figure 2Table 2에 나타내었다. 각 부위별 측정 결과 후 박나무 잎 추출물에 비해 후박나무 가지 추출물에서 높은 활성을 보이는 것을 확인할 수 있었다. 잎, 가지 추출물 모두 각각 148.83 μg/mL, 159.29 μg/mL으로 70% 에탄올 추출물에서 가장 높은 소거능을 보여주었으며, 열수 추출물과 초음파 추출물과 같은 정제수로 추출한 수용성 추출물들은 낮은 소거능을 나타내었다. Cho(2016)의 연구에서 후박나무와 같은 녹나무과에 속하는 녹나무 (C. camphora) 에탄올 추출물의 DPPH 소거능은 추출물 농도 1 mg/mL에서 39.96%의 소거능을 나타냈다는 보고가 있다 [15]. 본 연구에서 후박나무 잎과 가지의 100% 에탄올 추출물은 각각 90.65%, 91.04%의 소거활성을 보이며 Cho(2016)의 연구보다 더 높은 DPPH 소거능을 나타내었다.


Fig. 2. 
DPPH free radical scavenging activity of (A) leaves extracts of M. thunbergii (MTL) and (B) branch extracts of M.thunbergii (MTB). The appropriate amount of gallic acid was used as a positive control. The data showed the mean ± SD from three independent experiments.

Table 2. 
Summary of antioxidnat activity, total polyphenol (TPC) and total flavonoid contents (TFC) of extracts from M. thunbergii. The results are the mean ± SD from three independent experiments. Different letters meant significant by Duncan’s multiple range test (p < 0.05).
Sample DPPH IC50 (μg/mL) ABTS IC50 (μg/mL) Ferrous ion chelating IC50 (μg/mL) TPC TFC
GAE mg/g QUE mg/g
MTL1 424.78 ± 13.19f 274.32 ± 1.54b 8454.19 ± 236.13a 109.37 ± 2.40a 29.83 ± 0.25ab
MTL2 482.16 ± 3.80g 101.34 ± 0.27c 6022.56 ± 76.41a 113.49 ± 1.06a 35.84 ± 0.43b
MTL3 148.83 ± 9.92b 193.03 ± 8.94d 2215.07 ± 90.80a 156.59 ± 13.70b 88.75 ± 0.26c
MTL4 331.40 ± 22.90a 56.86 ± 1.89a 2221.21 ± 89.02a 311.38 ± 7.94e 84.87 ± 0.85c
MTB1 237.00 ± 5.27d 129.68 ± 5.34f 6228.87 ± 105.19a 217.64 ± 0.82d 13.97 ± 0.55ab
MTB2 236.47 ± 3.31d 77.83 ± 1.09b 4560.37 ± 19.13a 213.13 ± 0.07d 9.96 ± 1.05a
MTB3 159.29 ± 9.42e 159.37 ± 1.37e ≥ 10000b 184.94 ± 1.29c 14.60 ± 0.34ab
MTB4 178.80 ± 7.87c 57.52 ± 1.89a ≥ 10000c 336.39 ± 3.41f 5.15 ± 0.25a
STD (Gallic Acid) 8.30 ± 0.43 - - - -
STD (Quercetin) - 36.27 ± 5.51 - - -
STD (EDTA) - - 86.52 ± 1.21 - -

3.3. ABTS 라디칼 소거능 측정

후박나무 잎, 가지 추출물을 100 μg/mL-1000 μg/mL의 농도로 제조하여 ABTS 라디칼 소거능을 확인하고 IC50값을 측정하였으며, 그 결과는 Figure 3Table 2에 나타내었다. 측정 결과 잎, 가지 추출물 모두 각각 56.86 μg/mL, 57.52 μg/mL으로 100% 에탄올 추출물에서 가장 높은 소거능을 보여주었다. 후박나무 추출 부위 별 ABTS 활성에 대해 추출물의 ABTS라디칼 소거능 차이가 불분명하였는데, 이는 DPPH는 안정한 free radical이나 ABTS는 cation radical이라는 점에서 항산화물질에 따라 두 radical에 결합하여 제거하는 능력이 DPPH와 ABTS가 차이가 난다는 점이 있다 [16]. Shon(2007)의 연구에서 후박나무 껍질 추출물의 ABTS 라디칼 소거능을 측정하였는데, 추출물 농도 100 μg/assay에서 94.81%의 소거활성을 나타내었다 [17]. 본 연구에서 추출물 농도 100μg/mL에서 후박나무 가지 100% 에탄올 추출물의 ABTS 라디칼 소거능은 82.02%로 기존 연구결과와 차이가 있었지만 이는 추출 방법에 따른 차이로 여겨진다.


Fig. 3. 
ABTS radical scavenging activity of (A) leaves extracts of M. thunbergii (MTL) and (B) branch extracts of M. thunbergii (MTB). The appropriate amount of quercetin was used as a positive control. The data showed the mean ± SD from three independent experiments.

3.4. Ferrous ion chelating 효과 측정

Fe, Cu, Sn, Co, Ni 등과 같은 산화 환원이 용이한 금속 또는 이들의 금속 염은 지질 산화 과정에서 촉매로 작용될 수 있는 금속이다. 이러한 금속에 대한 킬레이팅 효과는 금속 촉매제로 인한 free radical의 생성을 억제함으로써 지질산화를 방지할 수 있는 능력을 측정하는 지표로 사용된다 [18]. 본 연구에서 ferrous ion chelating 효과는 후박나무 잎, 가지 추출물을 250 μg/mL-5000 μg/mL의 농도로 제조하여 IC50값을 측정하였으며, 그 결과는 Figure 4Table 2에 나타내었다. 추출방법을 달리한 후박나무 추출물의 ferrous ion chelating 효과는 위에서 언급한 다른 항산화 활성 실험보다 다소 낮은 활성을 나타내었다 (Table 2). 이는 ferrous ion chelating 효과는 금속이온을 제거하는 실험이며, 다른 항산화 실험들은 유리 라디칼 등을 제거하는 실험이기때문에 물질 간의 작용기작 차이에 의한 것으로 판단된다 [19].


Fig. 4. 
Ferrous ion chelating activity of (A) leaves extracts of M. thunbergii (MTL) and (B) branch extracts of M. thunbergii (MTB). The appropriate amount of EDTA was used as a positive control. The data showed the mean ± SD from three independent experiments.

3.5. 추출 방법에 따른 총 폴리페놀 함량 측정

페놀성 화합물은 식물계에 널리 분포되어 있는 2차 대사산물의 하나로서 다양한 구조와 분자량을 가지며, 이들은 phenolic hydroxyl(OH)기로 인해 단백질 및 기타 거대 분자들과 쉽게 결합하고, 대표적으로 항산화, 항암 등의 생리활성을 갖는다. 폴리페놀 함량이 증가함에 따라서 다양한 생리활성이 함량 의존적으로 증가함이 조사된 바 있다 [20,21]. 따라서 본 연구에서는 후박나무 잎, 가지 추출물의 총 폴리페놀 함량을 측정하였으며, 실험결과는 Table 2에 나타내었다. 각 부위별 측정 결과 후박나무 잎 추출물에 비해 가지 추출물에서 높은 폴리페놀 함량을 확인할 수 있었으며, 잎, 가지 추출물 모두 각각 311.38 GAE mg/g, 336.39 GAE mg/g으로 100% 에탄올 추출물에서 가장 높은 gallic acid 함량을 나타내었다. Moon(2010)의 연구에서 후박나무 잎 80% 에탄올 추출물의 phloroglucinol 함량은 254.3 phloroglucinol mg/g 으로 확인되었는데 [22], 이는 후박나무 잎에 phloroglucinol보다 gallic acid 함량이 많은 것을 나타낸다.

3.6. 추출 방법에 따른 총 플라보노이드 함량 측정

플라보노이드는 폴리페놀 화합물의 일종으로 대표적으로 카테킨, 퀘르세틴, 루틴 등이 있으며, 식물의 줄기, 잎, 뿌리, 꽃, 열매 등 다양한 부위에 함유되어 있다. 또한 페놀성 화합물과 마찬가지로 항산화 및 항암 등의 효과가 보고되고 있다 [23]. 따라서 본 연구에서는 후박나무 잎, 가지 추출물의 총 플라보노이드 함량을 측정하였으며, 실험결과는 Table 2에 나타내었다. 잎, 가지 추출물 모두 각각 88.75 QUE mg/g, 14.60 QUE mg/g으로 70% 에탄올 추출물에서 가장 높은 quercetin함량을 나타내었다. Kim(1993)등의 연구에 따르면 후박나무 잎에 다양한 종류의 flavonoid 류가 함유되어 있음이 보고되고 있다 [3]. 이는 후박나무 가지 추출물보다 잎 추출물에서 높은 플라보노이드 함량이 나타난 본 연구 결과와 일치한다. 또한 Cho(2016)의 연구에서 후박나무와 같은 녹나무과에 속하는 녹나무(C. camphora) 잎 메탄올-초음파 추출물의 플라보노이드 함량은 5.907 naringin mg/g의 함량을 나타냈다는 보고가 있다 [15]. 이는 본 연구 결과와 비교하였을 때 후박나무 잎, 가지 추출물의 플라보노이드 함량이 각각 약 15배, 2배 이상 높은 것으로 확인되었다.

3.7. HPLC에 의한 후박나무 잎과 가지 추출물의 페놀 성분 분석

후박나무 잎, 가지 추출물에 함유된 폴리페놀류를 확인하기 위해 HPLC 분석을 진행하였고, 그 결과는 Figure 5Table 3에 나타내었다. 표준물질로는 gallic acid, chlorogenic acid, epigallocatechin gallate, epicatechin, ethyl gallate, p-coumaric acid, naringin을 사용하였다. HPLC 분석결과 후박나무 가지 추출물보다 후박나무 잎 추출물에 폴리페놀류 표준물질 함량이 높은 것으로 확인되었으며, 특히 chlorogenic acid의 함량이 가지 추출물에 비해 월등히 높았다. 이러한 결과값은 항산화 활성과 총 폴리페놀 함량과 일치하지 않는데, 이는 후박나무 가지 추출물의 unknown peak를 고려할 때 표준물질에 포함되지 않은 폴리페놀류가 후박나무 가지 추출물에 포함되어 있는 것으로 판단된다. 또한 이들의 활성은 시료 중의 페놀 화합물에 대한 의존성이 높으나, 그 외 알려지지 않은 미지의 물질도 관여하는 것으로 추정된다.


Fig. 5. 
HPLC chromatograms of the extracts of M. thunbergii and standard mixture using diode array detection at 280 nm. Numbers indicate the following: (1) gallic acid; (2) chlorogenic acid; (3) epigallocatechin gallate; (4) epicatechin; (5) ethyl gallate; (6) p-coumaric acid; (7) naringin.

Table 3. 
Phenolic compounds in the extracts of M. thunbergii identified and quantified by HPLC using diode array detection at 280 nm. The results are the mean ± SD from three independent experiments (Unit: mg/g)
No. Sample MTL1 MTL2 MTL3 MTL4 MTB1 MTB2 MTB3 MTB4
1 gallic acid 0.40 ± 0.11 0.56 ± 0.09 0.22 ± 0.88 0.12 ± 0.42 0.29 ± 0.37 0.10 ± 0.57 0.19 ± 0.66 0.42 ± 0.02
2 chlorogenic acid 31.43 ± 0.02 40.30 ± 0.21 24.65 ± 0.71 27.87 ± 0.08 7.27 ± 1.22 5.49 ± 1.32 2.83 ± 0.94 2.42 ± 0.92
3 epigallocatechin gallate 8.43 ± 0.03 9.63 ± 0.07 1.06 ± 0.01 0.06 ± 0.01 13.18 ± 0.13 6.51 ± 0.04 8.40 ± 0.09 5.02 ± 0.01
4 epicatechin 6.31 ± 0.01 3.38 ± 0.03 1.74 ± 0.02 3.05 ± 0.03 13.13 ± 0.06 8.83 ± 0.07 4.47 ± 0.05 2.00 ± 0.00
5 ethyl gallate 2.07 ± 0.01 1.25 ± 0.35 0.84 ± 0.34 1.41 ± 0.72 1.41 ± 0.31 1.00 ± 0.09 0.87 ± 0.13 0.75 ± 0.01
6 p-coumaric acid 0.68 ± 0.02 - 1.34 ± 0.03 1.96 ± 0.05 1.00 ± 0.08 0.21 ± 0.02 0.06 ± 0.10 0.31 ± 0.00
7 naringin 4.12 ± 0.01 3.54 ± 0.02 5.61 ± 0.00 6.17 ± 0.01 0.13 ± 0.00 0.17 ± 0.01 0.42 ± 0.00 0.64 ± 0.00
Total 53.44 58.65 35.46 40.63 36.42 22.31 17.23 11.56

3.8. 추출 방법에 따른 추출물의 항염증 활성

후박나무 추출물의 항염증 활성을 확인하기 위해 NO assay를 실시하였다. 사용한 세포주는 RAW 264.7 대식세포주이며, LPS (1 μg/mL)를 단독 그리고 4가지 방법으로 추출한 후박나무 추출물을 이용하여 실험을 진행하였다. 이때 후박나무 추출물의 실험 농도는 MTT assay에 의해 확인한 결과 Figure 6와 같았다. 후박나무 추출물은 추출 방법에 따라 세포 생존율의 농도 범위가 모두 다르게 나타났는데, 이러한 결과를 바탕으로 본 실험에서는 세포 생존율에 모두 안전한 범위내에서 각각 12.5 μg/mL, 25 μg/mL의 농도로 24시간 배양한 후 LPS를 처리하여 실험을 진행하였다. 활성산소종 중 하나이며 염증 유발에 주요원인으로 알려진 NO 생성에 대한 후박나무 추출물의 효과를 측정한 결과를 Figure 7에 나타내었다 [24]. 그 결과, LPS를 처리한 군은LPS 무처리군에 비해 높은 염증 생성량을 보였으며, 후박나무 추출물을 처리한 군은 약 20%-40% 정도 염증 발현을 감소시키는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 기존의 연구에서 후박나무 70% 에탄올 추출물을 골수세포에 처리하여 염증효과를 확인하였는데 LPS의해 과다 자극된 골수세포의 대사활성을 억제하였다고 보고 하였다 [25]. 또 다른 연구에서는 국외 후박나무메탄올 추출물 12.5 μg/mL-100 μg/mL으로 처리하였을 때 염증 수치가 50% 정도 감소하는 것을 확인하였다 [26]. 이와 같은 결과는 본 연구의 결과와 비슷하며, 실험 농도 범위가 상이한 것은 추출방법과 실험에 사용한 세포주의 종류가 다르기 때문으로 판단된다.


Fig. 6. 
Cell viability of RAW264.7 cells with the extracts M. thunbergii. RAW264.7 cells were treated with the extracts (50- 200 μg/mL) for 48 h. The results are the mean ± SD from three independent experiments. Different letters meant significant by Duncan’s multiple range test (p < 0.05).


Fig. 7. 
Nitric oxide production by the extract of M. thunbergii. RAW 264.7 cells were treated with LPS alone (1 μg/mL), or with LPS (1 μg/mL) and the extracts (12.5-25 μg/mL) for 48 h. The results are the mean ± SD from three independent experiments. Different letters meant significant by Duncan’s multiple range test (p < 0.05).


4. CONCLUSION

본 연구는 국내에서 자생하는 대표적인 난대성 수종인 후박나무 잎과 가지를 열수, 냉수 초음파, 70% 에탄올, 100% 에탄올 등 4가지 방법으로 추출하여 항산화 활성 및 성분을 측정하고, 항염증 효과를 비교 분석하였다. 추출물의 수율은 70% 에탄올을 사용하여 추출된 잎과 가지 추출물이 각각 14.00%, 10.40%로 가장 높은 것으로 확인되었다. 또한 추출물의 항산화 활성, 폴리페놀 및 플라보노이드 함량 측정 결과 후박나무 잎과 가지의 70% 에탄올과 100% 에탄올 추출물에서 가장 높았다. 각 부위별로는 가지 부위가 잎 부위에 비해 더 높은 항산화 활성과 폴리페놀 함량을 보였으며, 총 플라보노이드 함량은 잎 부위에서 더 높은 함량을 갖는 것을 확인할 수 있었다. HPLC 분석결과 후박나무 가지 추출물보다 후박나무 잎 추출물에 폴리페놀류 표준물질 함량이 높은 것으로 확인되었으며, 특히 chlorogenic acid의 함량이 가지추출물에 비해 월등히 높았다. 이러한 결과값은 항산화 활성과 총 폴리페놀 함량과 일치하지 않는데, 이는 후박나무 가지 추출물의 unknown peak를 고려할 때 표준물질에 포함되지 않은 폴리페놀류가 후박나무 가지 추출물에 포함되어 있는 것으로 판단된다. 본 연구에서 후박나무 추출물은 항산화 및 염증억제 활성이 높은 것으로 확인되었으며, HPLC 결과와 비교해 보았을 때 이들의 활성은 시료 중의 페놀 화합물에 대한 의존성이 높으나, 그 외 알려지지 않은 미지의 물질도 관여하는 것으로 추정된다. 따라서 후박나무는 추후 화장품 산업 및 식품 산업에 활용이 가능한 유용한 기능성 소재로서의 식물자원으로 판단되며, 향후 지속적인 추가 연구가 필요할 것으로 사료된다.


Acknowledgments

본 연구는 산림청(한국임업진흥원) 산림과학기술 연구개발사업(2020194B10-2022-BA01)의 지원에 의하여 수행되었습니다.


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