The Korean Society For Biotechnology And Bioengineering

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Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 36, No. 1

[ Research Paper ]
Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 36, No. 1, pp.36-41
Abbreviation: KSBB J
ISSN: 1225-7117 (Print) 2288-8268 (Online)
Print publication date 31 Mar 2021
Received 30 Dec 2020 Revised 14 Jan 2021 Accepted 15 Jan 2021
DOI: https://doi.org/10.7841/ksbbj.2021.36.1.36

Biorenovation 생물 전환 기법을 적용한 유채 추출물이 B16F10 흑색종 세포의 Melanin과 Tyrosinase 활성에 미치는 영향
최병민 ; 박태진 ; 김정환 ; 김승영*
선문대학교 제약생명공학과

The Effect of Brassica napus Biorenovated Extract on the Production of Melanin Production and Tyrosinase Activity in B16F10 Melanoma Cells
Byeong Min Choi ; Taejin Park ; Jung Hwan Kim ; Seung-Young Kim*
Department of Pharmaceutical Engineering & Biotechnology, Sunmoon University, Asan 31460, Korea
Correspondence to : Department of Pharmaceutical Engineering & Biotechnology, Sunmoon University, Asan 31460, Korea Tel: +82-41-530-2390, Fax: +82-41-530-2939, Email: sykim01@sunmoon.ac.kr
Contributed by footnote: These two authors contributed equally.


© 2021 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering
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Abstract

Brassica napus (BN) has been reported to have various drug efficacies such as cancer, aging, but there is research on the scientific efficacy of whitening effect. Biorenovation is a method of modifying the structure of a broad range of substrates such as chemical compounds and plant extract by microbial enzymes with the potential benefits of reduced cytotoxicities and enhanced biological activities relative to its parent substrates. we generated BN extract using biorenovation technology and tested the whitening effect properties of its biorenovation product (BNBR) in α-MSH stimulated B16F10 melanoma cells. Our results showed that BNBR significantly inhibited enzymes of melanogenesis such as TRP-1, TRP-2, MITF, tyrosinase in a concentration dependent manner without no noticeable toxicities. Therefore, it suggests that maybe various components that converted by biorenovation contained in the BNBR affect multiple factors involved in α-MSH-induced melanogenesis in B16F10 cells. And our results indicate that BNBR could be a new source for the ingredients of functional cosmetics.


Keywords: Brassica napus, Tyrosinase, Melanin, Biorenovation, Whitening agent

1. INTRODUCTION

멜라닌은 tyrosine의 산화에서 나온 인돌과 다른 중간 생성물들을 함유한 폴리머로 동식물계에 널리 분포되어 있으며 척추동물의 피부 구조에 중요하게 존재하는 색소로 상피세포로 전이되어 머리카락과 표피의 색에 관여한다 [1,2]. 또한, 멜라닌은 표피 기저층에 존재하는 melanocyte의 melanosome에서 생성되어 melanocytic dendrites를 통해 각질 세포로 전달되며 자외선으로부터 피부를 보호하고, 활성산소 제거, 체온조절, 위장기능 등의 다양한 생물학적 기능을 하지만, α-melanocyte-stimulating hormone (α-MSH), adrenocorticotropic hormone (ACTH)과 같은 호르몬이나 외부 자극에 의해 멜라닌이 과도하게 합성되면 기미, 모반, 검버섯과 같은 색소 이상증을 유발한다 [3-5]. 때문에 melanogenesis 조절을 통해 멜라닌의 합성을 조절할 필요가 있다. 멜라닌의 합성에 매우 중요한 enzyme인 tyrosinase는 L-tyrosine으로부터 3,4-dihydroxyphenylalanine(L-DOPA)을 거쳐 DOPA-quinone으로 산화시키며, DOPA-quinone이 효소 반응을 통해 자동 산화되어 5,6-dihydroxyindole을 거치면서 indole-5,6-quinone으로 변환되어 흑갈색의 멜라닌을 합성하게 된다 [6,7]. 이러한 tyrosinase는 신호전달기전에 의해 microphthalmia-associated transcription factor (MITF) 뿐만 아니라 tyrosinase related protein-1 (TRP-1)과 tyrosinase related protein-2 (TRP-2)의 전사활성을 조절하여 melanogenesis를 조절하는 것이 가능하다 [8,9].

최근에는 사람들의 생활 수준의 향상과 수명의 연장으로 미적 욕구와 건강에 관한 관심이 증가하면서 건강식품과 화장품에 대한 소비가 증가하였으며, 피부 미용과 관련된 기능성 화장품 소재 개발에 관한 연구가 지속해서 진행되고 있다[10,11]. 대표적인 미백제인 arbutin, kojic acid, nicotinamide 등은 tyrosinase을 저해시키는 강력한 미백 활성을 가진 것으로 보고되고 있지만, 피부에 적용 시 일부 부작용이 있으며, 안정성 등으로 문제가 되고 있다 [12]. 이에 따라 최근에는 melanin의 합성을 감소시킴과 동시에 부작용을 유발하지 않는 천연소재의 개발이 주목을 받고 있다.

쌍떡잎식물 양귀비목 십자화과에 속하는 두해살이풀인 유채 (Brassica napus)는 스칸디나비아반도부터 시베리아, 코카커스 지역이 원산지로 [13], 많은 양의 지방을 함유한 식물로 세계 5대 유지자원 작물 중 하나로써 [14,15], 토코페롤, 피토스테롤, 폴리페놀과 같은 항산화 물질뿐만 아니라 다양한 플라보노이드, 불포화 지방산인 올레산 등 여러 기능성 성분을 함유하고 있다고 보고되었다 [16-18]. 최근 미생물을 활용하거나 다양한 기술을 적용하여 활용 가치가 낮은 소재들을 변환시켜 재활용하는 연구가 활발하게 이루어지고 있다 [19]. Biorenavation 기법은 미생물이 가지는 효소적 기능을 이용하여 전통적인 합성 방법으로는 합성 될 가능성이 낮은 다양한 전구물질, 혹은 비활성 화합물이나 생리활성이 없는 천연추출물로부터 생리활성이 우수한 유도체 산물의 제조가 가능한 생물전환 기법이다 [20,21]. 생물전환된 유채 추출물의 B16F10 melanoma 세포에 대한 독성뿐만 아니라 TRP-1, TRP-2, Tyrosinase, MITF 단백질 발현에 미치는 영향을 조사하였고, 생물전환을 통한 유채 추출물의 미백 기능성 화장품 소재로서의 활용 가능성을 증명하고자 한다.


2. MATERIALS AND METHODS
2.1. 재료 및 추출

유채 [Brassica napus L.]는 2018년 02월 20일에 제주특별자치도 제주시 애월읍 봉성리에서 채집되었으며, 농업회사법인제주생물자원(주)에서 구입하였다. 유채의 건조 시료를 분쇄한 후, 500 g을 취해 70% Ethanol 1 L를 첨가하여 상온에서 24시간 동안 2회 반복하여 추출하였다. 추출액은 paper filter로 여과하여 감압 농축한 뒤, 동결건조하여 시료화하였다.

2.2. 미생물 배양 및 Biorenovaion 반응

Biorenovation을 위한 Bacillus amyloliquefaciens (KCTC43033)균주는 한국생명공학연구원 (KCTC)에서 분양 받았으며, nutrient broth (peptone 5 g/L, beef extract 3 g/L)를 이용하여 30oC, 200 rpm에서 18시간 동안 배양하였다. 이후 biorenovation 반응진행을 위하여 배양한 균을 원심분리하여 얻어진 pellet을 PG Buffer (50 mM Phosphate buffer, 2% Glycerin)으로 2회 세척한 후, 동일한 buffer에 현탁하여 반응액으로 사용하였다. 30oC, 200 rpm에서 72시간 반응시킨 후, 원심분리하여 얻은 상등액을 감압농축하여 시료화하였다.

2.3. Biorenovation 전환물의 HPLC 분석

HPLC 분석을 위해 Shimadzu SpectroMonitor 3200 digital UV/Vis detector을 사용하였으며, 이동상은 0.1% trifluoroacetic acid (TFA)를 함유한 water (Solvent A)와 acetonitrile (Solvent B)를 사용하였다. 분석 조건은 column (Phenomenex 4 μm Hydro-RP 80Å, 250 × 4.6 mm) 온도 40oC, 유속 1 mL/min으로 30분동안 A: 90%, B: 10%에서 A: 0%, B: 100%로 하여 gradient 조건하에 분석하였으며, 시료는 10 μL를 주입하였고, detection 파장은 254nm로 설정하여 분석하였다.

2.4. 실험재료 및 세포배양

α-melanocyte stimulating hormone (α-MSH)과 L-3,4-dihydroxyphenylalanin (L-DOPA)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였으며, Murine B16F10 melanoma cell은 ATCC사 (American type cell culture, USA)로부터 분양받아 100 μg/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin 및 10% fetal bovine serum (FBS, Welgene, Gyeongsan, Korea)가 함유 된 Dulbecco’s Modified Eagle’s medium (DMEM, Welgene, Gyeongsan, Korea) 배지를 사용하여 37oC, 5% CO2 항온기에서 배양하였으며, 3일에 한 번씩 계대배양을 시행하였다.

2.5. 세포 생존율 측정

B16F10 melanoma cell을 24 well plate에 1.0 × 104 cells/well로 세포를 분주하고 37oC, 5% CO2 조건하에 24시간 동안 배양한 후 α-MSH (200 nM)와 시료를 동시에 처리하여 48시간 동안 배양하였다. 이후 thiazolyl blue tetrazolium bromide(MTT)을 첨가하여 37oC, 5% CO2 조건하에서 2시간 동안 반응시킨 다음 상등액을 제거하고 DMSO를 첨가하여 formazan blue를 용해시킨 후 96-well plate에 옮겨 담아 microplate reader를 이용해 570 nm에서 흡광도를 측정하였다 [22].

2.6. B16F10세포의 melanin contents 측정

B16F10 melanoma cell을 60 mm plate에 7.0 × 104 cells/well로 분주하고 37oC, 5% CO2 조건하에 24시간 동안 배양한 후, α-MSH (200 nM)와 시료를 동시에 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 이후 radioimmunoprecipitation assay buffer (RIPA buffer)를 처리하여 60분 동안 lysis 시킨 후, micro high speed centrifuge (12,000 rpm, 40min)를 사용하여 원심 분리하였다. 상등액을 제거하고 얻어진 pellet에 1N NaOH (10% DMSO)를 500 μL 첨가하여 90oC 항온수조에서 1시간 동안 반응시킨 후 microplate reader를 사용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.

2.7. B16F10 세포의 tyrosinase activity 측정

B16F10 melanoma cell을 6 well plate에 4.0 × 104 cells/well의 농도로 분주하여 37oC, 5% CO2 조건하에 24시간 동안 배양하였다. 이후, α-MSH (200 nM)와 시료를 동시에 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 이후 RIPA buffer를 처리하여 60분 동안 lysis한 후, 원심분리 (4oC, 12,000 rpm, 40 min)하여 상등액을 분리하였다. 이후, BCA protein assay kit (Thermo Scientific, USA)를 이용하여 단백질을 정량 후, 일정 농도의 단백질 20 μL에 2 mg/mL L-DOPA 80 μL [100 mM sodium phosphate buffer (pH 6.8)]를 첨가하여 2시간 동안 37oC shaking incubator에서 반응시킨 후 microplate reader를 사용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.

2.8. Western Blot 분석

B16F10 melanoma cell을 6 well plate에 4.0 × 104 cells/well로 분주하여 48시간 동안 전 배양을 한 후, α-MSH (200 nM)와 시료를 동시에 처리하여 48시간 동안 배양하였다. RIPA buffer를 이용하여 배양한 세포를 60분 동안 lysis한 후, 원심분리 (4oC, 12,000 rpm, 40 min)하였다. 원심 분리하여 얻은 상등액을 취한 후, BCA protein assay kit (Thermo Scientific, USA)를 이용하여 단백질 농도를 정량하였으며 20 μg의 단백질을 10% SDS-PAGE에 전기영동하고, poly-vinylidene difluoride (PVDF) membrane (Bio-rad, USA)에 200 mA, 2시간 동안 전이시켰다. 5% skim milk가 함유된 TBST (0.1% Tween 20/Tris-buffered saline)에 넣어 상온에서 1시간 동안 blocking 시킨 후, TBST로 10분간 4회 세척하였다. 1차 항체반응은 TRP-1 antibody (1 : 5000, Santa curz biotechnology, USA), TRP-2 antibody (1 : 500, Santa curz biotechnology, USA), Tyrosinase antibody (1 : 500, Santa curz biotechnology, USA), MITF antibody (1 : 500, Santa curz biotechnology, USA)를 이용하여 4oC에서 18시간 동안 반응시켰으며, 이후 TBST로 4회 세척하였다. 2차 항체반응은 HRP (horseradish peroxidase)가 결합된 anti-mouse IgG을 1 : 10000 비율로 희석하여 상온에서 2시간 반응시킨 뒤 TBST로 10분간 4회 세척하였다. 단백질은 ECL kit (Bio-rad, USA)를 사용하여 imaging densitometer (model GS-700, Bio-rad, USA)을 통해 측정하였다. 또한, imageJ program (NIH, Bethesda, MD, USA)을 이용하여 β-actin 대비 MITF, TRP1, TRP2, Tyrosinase 단백질 발현량의 면적을 수치화한 후 그래프로 나타내었다.

2.9. 통계처리

모든 실험은 3회 반복하여 측정하였으며, 그 결과는 평균값 ± 표준편차로 나타내었다. 통계적 분석은 각 처리구간의 유의성 (*p < 0.05; **p < 0.01) 검증을 위해 분산분석 (analysis of variance, ANOVA)후 student’s t-test로 다중비교를 실시하였다.


3. RESULTS AND DISCUSSION
3.1. HPLC를 이용한 biorenovation 전환물 분석

Biorenovation 생물 전환 기법에 의해 전환된 유채 추출물(BNBR)과 유채 추출물 (BN), 생물 전환 기법에 사용된 B. amyloliquefaciens 추출물 (BA)을 HPLC를 통해 비교 분석한 결과, BNBR에서 BN과 BA에 존재하지 않는 새로운 peak를 확인할 수 있었으며, 기존에 BN 내 존재하는 성분들의 peak의 비율이 변경된 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 1). 이는 미생물을 이용한 생물 전환 기법을 통해 BN 내에 존재하는 여러 성분들이 전환되어 나타난 peak의 가능성을 시사했다. 향후 미생물 대사뿐만 아니라 전환된 성분에 대한 연구가 필요할 것으로 사료된다.


Fig. 1. 
HPLC analysis of Brassica napus extract (BN), Brassica napus Biorenovate Extract (BNBR) and Bacillusamyloliquefaciens (BA). The chromatogram showed BN, BNBR, and BA.

3.2. 세포 생존율 측정

B16F10 melanoma cell에 대한 생물 전환된 유채 추출물(BNBR)의 세포 생존율을 측정하기 위하여 세포의 대사 과정에서 미토콘드리아의 석시네이트 탈수소 효소와 tetrazolium이 반응하여 형성된 MTT formazan를 DMSO로 용해하여 측정한 흡광도 값을 Fig. 2에 나타내었다. 그 결과 유채 추출물(BN)은 처리 농도에서 모두 90% 이상의 생존율을 나타내었으며, BNBR 또한 처리 농도에서 모두 90% 이상의 생존율을 나타내어 두 추출물 모두 B16F10 melanoma cell에 대한 독성이 미미한 것으로 확인되었다. 또한, biorenovation 생물 전환기법에 사용된 B. amyloliquefaciens 추출물 (BA)도 측정 농도에서 독성이 보이지 않아 추가로 진행한 모든 실험에서 동일한 농도로 실험을 진행하였다.


Fig. 2. 
Cell viability of BN, BNBR and BA on the α-MSHstimulated B16F10 melanoma cells. B16F10 cells (1.0 × 104cell/ mL) stimulated with α-MSH (200 nM) in the presence of BN, BNBR and BA(50, 100, 200 μg/mL) for 72 h.

3.3. B16F10 세포의 melanin contents 측정

B16F10 melanoma cell에서 BN과 BNBR의 미백 효과를 확인하기 위해 α-MSH를 처리하여 멜라닌의 합성을 유도한 후, 세포에 영향을 미치지 않는 농도의 시료를 처리하여 멜라닌의 생성량을 측정한 결과, BNBR 처리군이 BN 처리군보다 멜라닌의 생성을 농도 의존적으로 억제하였으며, 특히 200 μg/mL 농도에서는 α-MSH 처리군 대비 약 72%만큼 감소시키는 월등한 미백활성을 나타내었다 (Fig. 3). 이로써, BNBR은 농도 의존적으로 멜라닌의 합성을 억제하는 효능을 가졌다는 것을 확인할 수 있었으며, melanin contents 외에도 미백 기능성 소재로서의 가치를 더욱 명확히 판단하고자 melanogenesis의 활성을 조절하는 다양한 신호 전달 인자의 저해효능에 대한 실험을 추가적으로 진행하였다.


Fig. 3. 
Effects of BN, and BNBR on melanin synthesis in B16F10 melanoma cells. The cells were treated with BN, and BNBR (50, 100, 200 μg/mL) for 72 h. α-MSH (200 nM) was used as the positive control. Effects of BN, and BNBR on melanin production of B16F10 melanoma cells without treated of α-MSH. *P < 0.05; **P < 0.01.

3.4. B16F10 세포의 tyrosinase activity 측정

멜라닌 생성 초기반응에서 작용하는 효소인 tyrosinase의 촉매반응을 통하여 L-tyrosine이 L-DOPA로 변하며, L-DOPA는 TRP-1, TRP-2에 의해서 멜라닌으로 전환된다 [23]. 본 연구에서는 BN과 BNBR이 tyrosinase의 활성에 어떠한 영향을 미치는지에 대하여 조사하였다. B16F10 melanoma cell에 α-MSH를 처리하여 멜라닌의 합성을 유도한 후, 세포에 영향을 미치지 않는 농도의 시료를 처리하여 멜라닌의 생성량을 측정한 결과, BNBR이 BN 처리군보다 농도 의존적으로 tyrosinase의 활성을 억제하였으며, 특히 200 μg/mL 농도에서는 약 66%로 무처리군 보다 더 높은 저해 활성을 나타내어 melanin의 합성을 tyrosinase을 조절하여 저해한다는 것을 확인하였다 (Fig. 4).


Fig. 4. 
Effects of BN, and BNBR on tyrosinase activity in B16F10 melanoma cells. The cells were treated with BN, and BNBR (50, 100, 200 μg/mL) for 72 h. α-MSH (200 nM) was used as the positive control. Effects of BN, and BNBR on tyrosinase activity of B16F10 melanoma cells without treated of α-MSH. *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.005.

3.5. Western blot

멜라닌 생성 초기 반응에서 TRP-2 효소에 의해 Dopachrome이 DHICA (dihydroxyindole-2-carboxylic acid)로 산화되며, DHICA가 TRP-1 효소에 의해 최종적으로 eumelanin을 생성하게 된다. 이러한 여러 멜라닌 형성에 관여하는 효소 (TRP-1, TRP-2, Tyrosinase)를 조절하는 전사인자인 MITF는 세포의 분화, 이동, 종양 형성 등과 같은 세포 반응을 유도한다[24]. 본 연구에서는 BNBR이 α-MSH 자극으로 유도된B16F10 melanoma cell에서 멜라닌 생성을 억제하는 것을 확인하기 위해 멜라닌 형성에 관여하는 단백질인 TRP-1, TRP-2, Tyrosinase, MITF의 발현을 Western blot으로 조사한 결과, BNBR이 멜라닌 자극 호르몬인 α-MSH에 의해 증가된 TRP-1, TRP-2, MITF 단백질의 발현을 농도 의존적으로 억제시켰으며, 특히 최고 농도인 200 μg/mL에서 무처리군보다 더 낮을 정도로 단백질의 발현을 억제시켰다 (Fig. 5(a), Fig. 5(b) , Fig. 5(c)). 또한, Tyrosinase도 농도 의존적으로 단백질 발현을 억제시켰지만, 50 μg/mL 처리군에서 α-MSH보다 더 높은 양의 단백질 발현양을 보였다 (Fig. 5(d)). 이는 BNBR 내에 존재하는 성분 중 농도 의존적으로 tyrosinase 단백질 발현을 저해시키지만 저농도에서는 단백질 발현을 증가시키는 것으로 사료된다. 실험 결과를 통해 BNBR은 멜라닌 합성에 관여하는 TRP-1, TRP-2, tyrosinase, MITF의 단백질 발현을 억제하여 멜라닌 합성을 억제함을 확인하였고, 향후 천연 미백 화장품 소재로써 활용 가능할 것으로 판단된다.


Fig. 5. 
Effects of BNBR on Tyrosinase related protein(TRP)-1, TRP-2, Tyrosinase and MITF of B16F10 melanoma cells. Effect of BNBR on the protein level of TRP-1 (a), TRP-2 (b), MITF (c), and tyrosinase (d) in α-MSH-stimulated B16F10 melanoma cells. B16F10 melanoma cells (4.0 × 104cell/mL) stimulated with α-MSH (200nM) in the presence of BNBR (50, 100, 200 μg/mL) for 48 h. Whole-cell lysates (20 μg) were prepared and the protein level was subjected to 10% SDS-PAGE, and expression of TRP-1, TRP-2, MITF, tyrosinase and β-actin were determined by western blotting. *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.005.


4. CONCLUSION

본 연구에서는 유채 추출물의 미백 화장품 원로로서의 가치를 높이고자 생물전환 기법인 biorenovation 기법을 적용하였고 HPLC를 통해 전환 추출물을 분석한 결과, 유채추출물내 존재하지 않았던 다양한 성분들이 전환된 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 바탕으로 BNBR의 미백 효능 변화를 확인하기 위하여 B16F10 흑색종 세포에 독성을 보이지 않는 농도에서 멜라닌 억제 활성과 tyrosinase 억제 활성, 그리고 멜라닌의 합성에 관여하는 단백질 (TRP-1, TRP-2, Tyrosinase, MITF) 발현 억제량을 측정하였다. 그 결과, BNBR이 melanin 뿐만아니라 tyrosinase, 멜라닌 형성 관여 인자들을 농도 의존적으로 감소시키는 경향을 보였으며, 특히 측정 농도 중 가장 고농도인 200 μg/mL에서 TRP-1, TRP-2, 그리고 두 효소의 발현을 조절하는 MITF, Tyrosinase 단백질의 발현을 무처리군과 유사할 정도로 억제하였다. 이는 BNBR이 α-MSH에 의해 증가된 tyrosinase, TRP의 강력한 조절 인자인 MITF의 발현을 억제함으로써 하위기전인 tyrosinase와 TRP-1, TRP-2의 단백질 발현을 동일한 경향으로 억제하였고, 멜라닌 생성의 주효소의 활성을 직접적으로 조절함으로써 흑색의 eu-melanin의 합성을 저해하는 것으로 사료된다. 최종적으로 BNBR의 천연 미백 화장품 원료로서의 가치를 입증할 수 있었고, biorenovation 생물전환 기법을 통해 시료 내 존재하는 다양한 성분이 생물전환되어 미백효능을 더욱 증가시킨다는 것을 확인하였다. 앞으로 biorenovation 전환물의 유효성분 및 다양한 미생물을 이용한 생물전환 기법에 관한 연구가 추가로 진행되어야 할 것으로 판단된다.


Acknowledgments

본 연구는 중소벤처기업부와 중소기업기술정보진흥원이 지원하는 국가융복합단지 연계 지역기업 상용화 R&D 사업으로 수행된 연구결과입니다(P0009943).


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