The Korean Society For Biotechnology And Bioengineering

Current Issues

Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 36, No. 2

[ Research Paper ]
Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 36, No. 2, pp.154-164
Abbreviation: KSBB J
ISSN: 1225-7117 (Print) 2288-8268 (Online)
Print publication date 30 Jun 2021
Received 23 Mar 2021 Revised 03 May 2021 Accepted 24 May 2021
DOI: https://doi.org/10.7841/ksbbj.2021.36.2.154

토착 담수미세조류 메탄올 추출물의 항산화 및 항암효과
장현진1, 2, ; 임경준3, ; 조복연3 ; 남승원3 ; 남영호3 ; 황병수4 ; 이창수3 ; 정지영3 ; 우성환5 ; 이순6 ; 홍은미6 ; 김지훈3, *
1한국생명공학연구원 유전자교정연구센터
2성균관대학교 생명과학과
3국립낙동강생물자원관 미생물연구실
4국립낙동강생물자원관 동식물연구실
5인하대학교 생명공학과
6한국기초과학지원연구원 소재분석연구부

Antioxidant and Anticancer Activities of Methanolic Extracts from Indigenous Freshwater Green Microalgae
Hyun-Jin Jang1, 2, ; Kyung June Yim3, ; Bok Yeon Jo3 ; Seung Won Nam3 ; Young Ho Nam3 ; Byung Su Hwang4 ; Chang Soo Lee3 ; Ji Young Jung3 ; Sung Hwan Woo5 ; Soon Lee6 ; Eunmi Hong6 ; Z-Hun Kim3, *
1Laboratory of Chemical Biology and Genomics, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, Daejeon 34141, Korea
2Department of Biological Sciences, Sungkyunkwan University, Suwon 16419, Korea
3Microbial Research Department, Nakdonggang National Institute of Biological Resources, Sangju 37242, Korea
4Animal & Plant Research Department, Nakdonggang National Institute of Biological Resources, Sangju 37242, Korea
5Department of Biological Engineering, Inha University, Incheon 22212, Korea
6Division of Analytical Science, Korea Basic Science Institute, Daejeon 34133, Korea
Correspondence to : Microbial Research Department, Nakdonggang National Institute of Biological Resources, Sangju 37242, Korea Tel: +82-54-530-0841, Fax: +82-54-530-0849 E-mail: kimzhun@nnibr.re.kr
Contributed by footnote: These authors contributed equally to this work


© 2021 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering
Funding Information ▼

Abstract

In this study, antioxidant and anticancer activities of methanolic extracts from newly isolated freshwater microalgae were investigated. First, four microalgal strains in Korea were identified as Mychonastes sp. 246, Mychonastes sp. 247, Mychonastes pushpae 248, and Mychonastes sp. 249 through 5.8S-ITS2 gene sequencing and their carotenoid contents were analyzed. Then, we accessed antioxidant, cytotoxic, and anticancer activities of microalgal methanolic extracts. We found that the genus Mychonastes contained 226~2,607 μg/g, 138~1,594 μg/g, and 126~339 μg/g of β-carotene, lutein, and zeaxanthin, respectively. All of the microalgal extracts showed increased antioxidant and anticancer activities in a dose-dependent manner. Antioxidant activities of the extracts were 31 ± 7%, 27 ± 8%, 23 ± 7%, and 17 ± 8%, respectively, when treated with 50 mg/mL. From the results of cytotoxicity test, we did not find any serious growth inhibition of human mesenchymal stem cells treated at 10 μg/mL to 200 μg/mL. In addition, the microalgal extracts could effectively inhibit growth of all tested A549, BxPC-3, HepG2, and SKOV-3 cancer cells ranged from 16% to 62% when treated with 200 μg/mL. These results indicate the methanolic extract of four strain of genus Mychonastes could be used as a potential natural material as pharmaceutical ingredients.


Keywords: green microalgae, Mychonastes, anticancer, antioxidant, carotenoids

1. INTRODUCTION

미세조류는 수서환경에서 이산화탄소와 태양에너지를 이용하여 단백질, 지질, 색소 등을 합성하는 독립영양생물이다. 현재 지구상에는 20~30만종이 넘을 정도로 미세조류의 다양성이 높아 생물자원으로서의 가치가 무궁무진하다. 특히 서식환경에 따라 같은 종에서도 산업적 활용성이 높은 유용물질 (e.g., 단백질, 지방산, 색소 등)의 조성과 함량이 달라 조류자원의 생장특성 및 생리활성에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다 [1-5]. 이러한 특성에 기인하여, 미세조류를 이용하여 건강기능성 식품, 생리활성 물질, 의약품 생산뿐만 아니라, 바이오에너지, 바이오플라스틱 등의 소재 생산 생물자원으로 큰 주목을 받고 있다 [6-8].

구체적으로 미세조류는 체내에서 합성이 불가능하여 반드시 음식을 통해 섭취해야 할뿐만 아니라 동맥경화 및 심혈관질환에 생리활성이 탁월한 docosahexaenoic acid(DHA)나 eicosapentaenoic acid(EPA)와 같은 불포화 지방산을 함유하고 있다 [9,10]. 또한 astaxanthin, violaxanthin, neoxanthin, α-carotene, β-carotene, lutein 등의 carotenoid 계열의 색소를 다량 함유하고 있으며, 이러한 carotenoid는 인체 내에서 유해산소 소거작용과 암세포 증식 억제효과 있는 것으로 알려져 있다 [11]. 대표적으로 상업화에 성공한 미세조류인 Chlorella의 색소 중에는 동맥경화, 노화억제 등에 효과가 있다고 알려진 β−carotene이 2.6% 함유하고 있으며, 시각 퇴화를 지연시켜주는 zeaxanthin 이 1.3% 함유되어 있다 [12].

Kumar et al. [13]의 연구에 따르면 Chlorella의 엽록소의 수용성 성분인 클로로필린 (chlorophyllin)이 활성산소종 (reactive oxygen species)을 제거하는 것으로 알려져 있으며, Chlorella 함유된 당단백질인 ARS2는 helper-T cell을 자극하여 암세포의 생장을 억제하는 효과가 있는 것으로 밝혀졌다 [14]. 또한 와편모류인 Amphidinium carterae의 추출물에서는 항당뇨 효과와 간암세포 (HepG2)의 생장억제효과가 있었으며, A. carterae는 항진균 물질인 amphidinol과 carteraol E 등을 생합성하는 것으로 확인되었다 [15-19]. 해양 미세조류 Nannochloropsis oculata의 추출물은 대장암세포 (CT-26)에 대해 우수한 세포 성장 억제 효과를 보였다 [20]. 이러한 이유로 미세조류가 생산하는 지질, 당질, 색소 등과 같은 다양한 고부가가치 생리활성물질에 대한 연구에 관심이 증대되고 있다. 국내의 경우 공공 연구기관 및 대학을 중심으로 국내 해수 및 담수지역에서 토착 미세조류자원을 발굴과 확보에 대한 연구는 중점적으로 진행하고 있으나, 이에 대한 생장 특성 및 유용성에 대한 연구는 미미한 실정이다.

본 연구에서는 국내 담수 수계에서 신규 분리한 녹조류 Mychonastes 속 4종에 대한 특성과 carotenoid 계열의 색소함량을 분석하였고, 생리활성에 대한 가능성을 시험하고자 methanol을 이용한 추출물 제조하였다. 이를 이용하여 체내 정상세포를 공격하여 노화와 각종 질병의 원인으로 작용하는 활성산소 제거능 (항산화능)에 대한 평가를 진행하였다. 또한 항암물질로서의 활용가능성을 탐색하고자 위암, 췌장암, 간암, 난소암 세포주에 조류추출물을 처리하여 암세포 생장억제효과에 대한 가능성에 대해 시험 분석하여 생리활성 소재로서 활용가능성을 찾고자 하였다.


2. MATERIALS AND METHODS
2.1. 미세조류 분리 및 배양

본 연구에 사용된 담수 미세조류는 Mychonastes sp. 246, Mychonastes sp. 247, Mychonastes pushpae 248, Mychonastes sp. 249로 각각 장동제 (전라북도 남원시 운봉읍 장교리), 두모저수지 (제주도 제주시 한경면 두모리), 삼풍지 (경상북도 예천군 풍양면 풍신리), 초동지 (경상남도 밀양시 초동명 신호리)에서 담수시료를 채취하여 분리하였다 (Table 1). 채집한 담수 시료는 광학현미경 관찰 (Nikon Eclipse Ni-U, Nikon, Tokyo, Japan)을 통해 Pasteur pipette을 이용하여 단일 종을 분리하였다. 배양배지는 미세조류 배양에 널리 사용되는 BG11 배지를 사용하였다. 배지의 조성은 NaNO3 1.5 g/L, K2HPO4 0.04 g/L, MgSO4·7H2O 0.075 g/L, CaCl2·2H2O 0.036 g/L, Citric acid 0.006 g/L, Ferric ammonium citrate 0.006 g/L, Disodium magnesium salt 0.001 g/L, Na2CO3 0.02 g/L, Tracemetal mix A5 (H3BO3 2.86 g, MnCl2·4H2O 1.81 g, ZnSO4·7H2O 0.222 g, Na2MoO4·2H2O 0.39 g, CuSO2·5H2O 0.079 g, Co(NO3)2·6H2O 0.0494 g/L) 1 mL, 121oC, 1.5기압에서 15분간 멸균한 뒤 사용하였다. 분리된 미세조류는 형태적 관찰을 위해 광학현미경을 이용하였다. 정확한 종 동정을 위하여 5.8S와 ITS2 유전자를 분석하였으며, 계통수 분석을 위해 미국 국립생물공학정보센터 (National Center for Biotechnology Information; NCBI)의 nucleotide BLAST search를 이용하였다. 계통도는 MEGA6 소프트웨어를 사용하여 작성하였다 [21]. 본 연구에서 분리된 Mychonastes 속 4 종의 염기서열은 NCBI GenBank에 등록하였다 (Table 1). 동정된 4종의 녹조류는 2 L 원통형 광생물반응기 (bubble column photobioreactor)를 이용하여 온도 22 ± 1oC, 광도 300 μmol/m2/s를 연속적으로 공급하여 배양하였다. 가스의 경우 5% CO2를 반응기 하단부로부터 0.1 vvm속도로 공급하였다. 10일간 배양된 담수조류 4 종의 배양액에서 세포만을 회수하기 위해 2,000 × g에서 20분간 원심분리 (Combi 515, Hanil, Incheon, Korea)를 한 뒤 상등액을 제거하고 균체만을 회수하였다. 수확된 균체는 잔류 배지성분과 세포 조각 (cell debris)을 제거하기 위해 증류수로 2회 세척한 뒤 원심분리 하였다. 이 과정을 2회 반복한 뒤, 동결 건조기 (FD8512, lshinbiobase, Dongducheon, Korea)를 이용하여 수거된 균체를 동결건조하였다. 건조된 시료는 사용 전까지 자동습도조절장치 (KA33-73, Sanplatec, Osaka, Japan)에 보관하였다.

Table 1. 
Information of newly isolated four freshwater Microalgae from Korea
Strain Isolation site Latitude / Longitude
Mychonastes sp. 246 Janggyo-ri, Unbong-eup, Namwon-si, Jeollabuk-do 35°27'10.8"N / 127°29'49.1"E
Mychonastes sp. 247 Dumo-ri, Hangyeong-myeon, Jeju-si, Jeju-do 33°21'10.2"N / 126°11'34.7"E
Mychonastes pushpae 248 Pungsin-ri, Pungyang-myeon, Yecheon-gun, Gyeongsangbuk-do 36°29'25.5"N / 128°19'05.5"E
Mychonastes sp. 249 Sinho-ri, Chodong-myeon, Miryang-si, Gyeongsangnam-do 35°24'22.3"N / 128°40'59.8"E

2.2. 미세조류의 색소 함량 분석

Mychonastes 속 4종의 각각 동결건조된 0.2 g 시료에 10 mL의 90% acetone (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) 을 50 mL 원통형의 유리관에 각각 혼합 후, 초음파추출기 (Powersonic 410, Hwashin Tech, Daegu, Korea)로 30분간 추출하였다. Mychonastes 속 4종의 색소 분석은 high performance liquid chromatograph (HPLC; Agilent, Santa Clara, USA)를 사용하여 수행하였다. 색소 추출물은 HPLC 분석용 유리병에 옮겨졌으며, HPLC 기기를 이용하여 분석하였다. 분석을 위하여 10 μL의 시료를 주입하였으며, 55분간 분리가 진행되었다. 이 때 사용된 컬럼은 Luna 3 μm C8(2) 100 Å 150 × 4.6 mm Analytical Column (Phenomenex, Torrance, USA)이 사용되었고 컬럼의 온도는 45oC로 설정하였다. 색소의 분석 용매는 methanol (Merck, Darmstadt, Germany)과 물을 70 : 30 (v/v)을 혼합하고 22 mM ammonium acetate (Merck)와 acetate buffer (Merck)를 함유한 pH 4.5의 용매(A)와 100% methanol (B)를 사용하였으며, 용매 기울기는 5% B-35% B(15분), 35% B(5분), 35% B-60% B(15분), 60% B-100% B(10분), 100% B(10분)를 흘려주었다. 그 후 6분간 처음 시작할 때의 용매와 동일한 용매를 사용하여 post-run하였다. 용매 유속은 분당 1 mL로 진행하였으며, 분리된 색소는 450 nm 단파장으로 분석하였다. 표준물질 β-carotene (Sigma-aldrich), lutein (Sigma-aldrich), zeaxanthin (Sigma-aldrich)의 정량곡선에 의해 Mychonastes 속 4종의 색소 함량을 분석하였다.

2.3. Methanol 추출물의 제조

신규 분리된 미세조류의 항산화 활성과 항암능을 평가하기 위해, Mychonastes 속 4종을 methanol을 이용하여 추출하였다. methanol 추출물 제조는 각각의 5 g의 건조시료에 99.5% methanol (Daejung, Busan, Korea) 1 L를 삼각플라스크에 혼합 후, 초음파추출기 (Hwashin Tech)로 20분간 처리하였다. 추출 후 상온에서 24시간 반응시켰으며, 각 추출물은 여과지 (Whatman No. 2, Whatman International, Kent, UK)로 여과한 다음 회전증발농축기 (N-2110, Eyela, Tokyo, Japan)로 감압 농축한 후 동결건조하였다. 제조된 시료는 사용할 때까지 −70oC 초저온냉동고에 보관하였다 (Fig. 1). 농축된 시료는 dimethy-lsulphoxide (DMSO; Sigma-Aldrich)에 녹여 제조하였으며, 일정농도로 희석하여 항암과 항산화 활성 평가에 사용하였다.


Fig. 1. 
Preparation of methanolic extract from the four freshwater microalgae.

2.4. DPPH 라디칼 소거능 측정

1,1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl(DPPH) free radical 소거능은 Kano et al. [22]의 방법을 변형하여 실시하였다. DPPH (Sigma-Aldrich)는 실험 시작 전 95% ethanol (Merk, Darmstadt, Germany)에 녹인 후 0.2 mM이 되도록 하여 사용하였다.

DPPH 용액과 희석된 미세조류 추출물 (1, 10, 25, 50 mg/mL)을 각각 1 : 1로 혼합하여 30분간 실온의 암실에서 반응시킨 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. DPPH 라디칼 소거활성은 시료 용액의 첨가구와 무첨가 사이의 흡광도 차이를 백분율로 나타내었으며, standard의 경우에는 미세조류 추출물과 95% ethanol 각각 1:1로 혼합하여 사용하였다(1).

Radical scavenging activity%=1-  OD517 nmsample-OD517 nmstandard  OD517 nmcontrol×100(1) 
2.5. 세포 배양

본 실험에 사용된 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포 (human bone marrow mesenchymal stem cells; hBM-MSC)는 Lonza (Lonza, Walkersville, USA)에서 구입하였으며, 위암세포 (A549, ATCC CCL-185), 췌장암세포 (BxPC-3, ATCC CRL-1687), 간암세포 (HepG2, ATCC HB-8065), 난소암세포 (SKOV-3, ATCC HTB-161)는 American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, USA)에서 분양 받아 사용하였다. hBM-MSC의 유지를 위해 mesenchymal stem cell 배양 배지 (MSC; StemMACSTM MSC Expansion Media, Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) 사용하였으며, 암세포의 유지를 위해 10% Fetal bovine serum (FBS; HyClone Laboratories, Logan, USA)와 1% antibiotic-antimycotics (Gibco, Langley, USA)가 함유된 RPMI 1640 (HyClone)을 사용하였다. 본실험에 사용된 세포는 37oC, 5% CO2 항온기(BB150, Thermo, Langenselbold, Germany)에서 배양하였다. 줄기세포와 암세포의 계대배양은 각각 7일과 2~3일마다 주기적으로 시행하였다.

2.6. 세포 독성 평가

미세조류 4 종의 methanol 추출물의 세포 독성를 확인하기 위해 정상세포인 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포 (hBMMSC)에 추출물 처리 후 세포의 생존율을 계산하여 평가하였다. 세포 현탁액은 MSC 배지 (Miltenyi Biotec)를 이용하여 5 × 104 cells/mL의 농도로 조절한 후 96-well plate의 각 well에 100 μL씩 분주한 다음, 37oC로 설정된 5% CO2 배양기에서 24 시간 배양하였다. 24 시간 뒤 추출물 시료농도가 1 mg/mL가 되도록 MSC 배지를 사용하여 제조한 후, 이를 단계적 희석(10, 100, 200 μg/mL)을 하여 100 μL씩 처리하고 37°C로 설정된 5% CO2 배양기에서 48 시간 배양하였다. 배양 후 세포 생존율은 Cell Counting Kit-8 (CCK-8; Dojindo, Kumamoto, Japan)을 이용하여 측정하였다. 기존배지를 제거한 다음 PBS 100 μL로 세척한 후, 배지 100 μL에 CCK-8 solution 10 μL씩을 각각 첨가한 후, 37oC 암소에서 2 시간 반응시켰다. 96-well plate 분광광도계 (Sunrise, Tecan, Männedorf, Switzerland)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 정상세포에 대한 독성은 흡광도 측정결과를 식 (2)에 대입하여 세포 생존율로써 비교하였다. blank의 경우에는 배지만을 사용하였고, 대조군으로는 세포 생장 저해활성을 고려하고자 DMSO를 첨가하여 측정하였다.

Cell viability%=  OD450 nmsample-OD450 nmblank  OD450 nmcontrol-OD450 nmblank×100(2) 
2.7. 암세포 생장억제 평가

미세조류 4 종의 methanol 추출물의 암세포 생장억제효과는 추출물 처리 후 위암세포 (A549), 췌장암세포 (BxPC-3), 간암세포 (HepG2), 난소암세포 (SKOV-3)의 생존율을 계산하여 평가하였다. RPMI 1640 배지에 1% antibiotic-antimycotics (Gibco)와 10% FBS(HyClone) 첨가하여 조제하고, 세포 현탁과 배양배지를 사용하였다. 세포 현탁액은 RPMI 1640 배지를 이용하여 5 × 104 cells/mL의 농도로 조절한 후 96-well plate의 각 well에 100 μL씩 분주한 다음, 37oC로 설정된 5% CO2 배양기에서 24 시간 배양하였다. 24 시간 뒤 추출물 시료농도가 1 mg/mL가 되도록 RPMI 1640 배지를 사용하여 제조한 후, 이를 단계적 희석 (10, 100, 200 μg/mL)을 하여 100 μL씩 처리하고 37oC로 설정된 5% CO2 배양기에서 24시간 배양하였다. 배양 후 세포 생존율은 CCK-8을 이용하여 측정하였다. 기존배지를 제거한 다음 PBS 100 μL로 세척한 후, 배지 100 μL에 CCK-8 solution 100 μL씩을 각각 첨가한 후, 37oC 암소에서 2 시간 반응시켰다. 96-well plate 분광광도계 (Sunrise, Tecan, Männedorf, Switzerland)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 암세포 생장억제능은 흡광도 측정결과를 식 (2)에 대입하여 세포 생존율로써 비교하였다. blank의 경우에는 배지만을 사용하였고, 대조군으로는 세포 생장 저해활성을 고려하고자 DMSO를 첨가하여 측정하였다.

2.8. 통계분석

모든 분석 수치는 mean ± SEM으로 나타내었다. 수집된 결과는 Prizm 프로그램 (GraphPad Software, La Jolla, USA)을 이용하여 통계 분석하였으며, 각 실험군들의 평균치간의 유의성은 P < 0.05 수준에서 analysis of variance와 Tukey’s test에 의해 분석하였다 [23].


3. RESULTS AND DISCUSSION
3.1. 미세조류 균주의 분리 및 동정

Mychonastes 속 4종은 장동제, 두모, 삼풍지, 초동지 저수지의 담수 시료로부터 Pasteur pipette을 이용하여 단일 종을 분리한 다음 광학현미경을 통해 형태학적 분류를 수행하였다. 형태를 관찰한 결과, Mychonastes sp. 246, Mychonastes sp. 247, M. pushpae 248, Mychonastes sp. 249는 각각 직경 약 3.1 ± 1.7 μm, 4.2 ± 2.1 μm, 6.2 ± 3.5 μm, 6.5 ± 2.0 μm의 구형의 형태로 관찰되었다 (Fig. 2(A)-Fig.2(D)). 또한 진핵 미세조류 분류의 신뢰성을 높이기 위해 5.8S와 ITS2 유전자의 염기서열을 통해 계통도 분석을 하였다. Fig. 2(E)와 같이 분리된 4종은 Mychonastes 속에 속하였으며, M. pushpae 248은 M. pushpae와 가장 높은 유사도를 나타냈다. 5.8S와 ITS2 유전자의 염기서열 분석을 통해 Mychonastes 속 4종은 Mychonastes sp. 246, Mychonastes sp. 247, M. pushpae 248, Mychonastes sp. 249로 각각 명명하였다 (Table 2).


Fig. 2. 
Microscope figures x1000 of Mychonastes sp. 246(A), Mychonastes sp. 247(B), M. pushpae 248(C), and Mychonastes sp. 249(D) isolated from freshwater in Korea. Scale bars indicate 5 μm. Phylogenetic analysis of the 5.8S-ITS2 gene of Mychonastes sp. 246, Mychonastes sp. 247, M. pushpae 248, and Mychonastes sp. 249 isolated from freshwater (E).

Table 2. 
List of strains of the Mychonastes species sequenced in this study
Taxon Strain Origin Accession number
M. afer CCAP 260/6 Lake Victoria, Dunga Beach, Kenya GQ477044
M. afer HSO3-1 Wastewater sample, Jinan, Shandong province, China JF930341.1
M. afer CCAP 211/406 Lake Victoria, Dunga Beach, Kenya GQ477049
M. homosphaera CAUP H6501 Lake Erken, Sweden GU799581
M. homosphaera CCAP 205/1 River Elbe, Germany GQ477054
M. homosphaera CCALA 380 Fishpond Smyslov near Blatna, Czech Rep. GU799582
M. ovahimbae CCAP 260/13 River Kunene, Angola GQ477052
M. pusillus CCAP 260/4 Lake Baringo, Kenya GQ477039
M. rotundus CCAP 260/14 Lake Stechlin, Germany GQ477053
M. pushpae CCAP 260/10 Gandhi Lake, Udaipur, India GQ477047
M. pushpae CCAP 260/7 Gandhi Lake, Udaipur, India GQ477045
M. pushpae CCAP 260/9 Pond near Amber Fort, Jaipur, India GQ477046
M. timauensis CCAP 205/2 Pond at Troutfarm Timau, Kenya GQ477055
M. racemosus CCAP 222/35 Fateh Sagar, Udaipur, India GQ477043
M. racemosus CCAP 222/34 Fateh Sagar, Udaipur, India GQ477042
M. racemosus CCAP 222/52 River Kunene, Angola GQ477051
M. huancayensis SAG 89.81 Lake Huancayo, Peru GQ477050
M. jurisii CCAP 260/1 Lake Stechlin, Germany GQ477038
M. afer 397_Hamo191105E Pond near Hamo beach, Seogwipo-si, Republic of Korea In this study
Mychonastes sp. 175_Chodong180227T Chodong reservoir, Miryang-si, Republic of Korea In this study
Mychonastes sp. 249_Chodong180227U Chodong reservoir, Miryang-si, Republic of Korea In this study
Mychonastes sp. 246_Jangdong160806F Jangdong Pond, Goheung-gun, Republic of Korea In this study
M. ovahimbae 253_Eulsukdo160818A River Nakdonggang, Busan, Republic of Korea In this study
M. rotundus 252_Chwisu160901B River Nakdonggang, Yangsan-si, Republic of Korea In this study
M. rotundus 251_Mulgeum170327D River Nakdonggang, Yangsan-si, Republic of Korea In this study
M. rotundus 362_Doguan190703C Doguan reservoir, Uiseong-gun, Republic of Korea In this study
M. pushpae 248_Sampung160901C Sampung Pond Yecheon-gun, Republic of Korea In this study
Mychonastes sp. 247_Dumo100311D Dumo reservoir Jeju-si, Republic of Korea In this study
Mychonastes sp. 69_Gonggum031712B Gonggum Pond, Sangju-si, Republic of Korea In this study

3.2. Carotenoid 분석

미세조류는 astaxanthin, violaxanthin, neoxanthin, α-carotene, β-carotene, lutein 등의 다양한 형태의 carotenoid를 생합성 할 수 있으며, 이러한 carotenoid는 천연에 널리 존재하는 화합물로 비타민A의 전구체로 항산화성 및 면역 체계를 향상시키는 물질로 알려져 있다. 특히, 천연 carotenoid의 한 종류인 β-carotene, zeaxanthin, lutein은 강한 항산화능과 암세포 억제 효과를 가지고 있고 보고되었다 [11,24]. Mychonastes 속 4종의 색소를 HPLC로 분석한 결과, β-carotene과 lutein이 다량 함유하고 있는 것으로 나타났다. 특히 Mychonastes sp. 246와 Mychonastes sp. 247은 β-carotene 함유량이 각각 2,607 ± 29 μg/g과 4,394 ± 101 μg/g로 비교군 중 가장 높았으며, Mychonastes sp. 247의 β-carotene 함유량은 Şahin et al. [25]에 의해 보고된 Chlorella vulgaris의 β-carotene 함유량 (258 ± 20 μg/g)보다 약 15배 이상 높다. Mychonastes sp. 246와 Mychonastes sp. 247의 lutein 함유량이 각각 820 ± 10 μg/g과 1,594 ± 13 μg/g로 다른 두 종에 비해 월등히 높았다. 또한 항산화력이 우수한 carotenoid의 한 종류인 zeaxanthin은 Mychonastes sp. 249를 제외한 모든 종에서 발견되었으며, 특히 Mychonastes sp. 246에서는 339 ± 19 μg/g으로 다른 종에 비해 약 2.7배 높은 수치다 (Table 3). 미세조류는 온도, 광도, 이산화탄소 농도 등의 배양환경에 따라 특정산물의 농도가 달라진다. 보고된 바에 의하면 배지 내 질소의 결핍은 NannochloropsisBotryococcus종에서는 지방의 축적을 증대시키고, Haematococcus pluvialis 종에서는 carotenoid의 한 종류인 astaxanthin의 함량이 증가하는 것으로 알려져 있다. 따라서 신규로 발굴된 Mychonastes 4종의 배양연구를 통해 특정 유용색소의 함량의 증대가 가능할 것으로 판단된다 [26-28].

Table 3. 
Carotenoid profiles of the four freshwater microalgae
Strain Carotenoid content(μg/g)
β-carotene Lutein Zeaxanthin
Mychonastes sp. 246 2,607 ± 29 820 ± 10 339 ± 19
Mychonastes sp. 247 4,394 ± 101 1,594 ± 13 118 ± 14
Mychonastes pushpae 248 1,441 ± 17 418 ± 7 126 ± 11
Mychonastes sp. 249 226 ± 37 138 ± 0 N.D.*
*N.D.: not detected

3.3. 미세조류 추출물의 항산화 활성

인체내의 세포들의 대사과정에서 생성되는 산소화합물인 활성산소는 세포의 지질과산화 (lipid peroxidation)와 산화적 DNA 손상 (oxidative DNA damage) 작용을 일으켜, 각종 질병과 세포의 노화의 주원인으로 알려져 있다 [29]. DPPH radical 소거 활성은 추출물 등에서 항산화능을 확인할 때 이용되며, 항산화 활성의 지표로 천연소재의 생리활성 평가에 널리 활용되어 왔다 [30].

본 연구에서도 항산화 활성의 지표가 되는 DPPH radical 소거활성을 이용하여 Mychonastes 속 4 종의 methanol 추출물의 항산화 효과를 평가하였다. Mychonastes 속 4종의 methanol 추출물을 1, 10, 25, 50 mg/mL의 농도로 처리한 결과, 모든 처리군에서 농도 의존적으로 항산화능이 높아지는 것으로 나타났다 (Fig. 3). M. pushpae 248과 Mychonastes sp. 249 추출물은 50 mg/mL의 농도로 처리하였을 때, 각각 23 ± 7%와 17 ± 8%의 항산화 활성을 보였다. 이는 다른 연구에서 항산화 활성이 있다고 보고된 미세조류 추출물 (10 mg/mL 처리시 10~20%)과 유사한 수치이다 [31]. 특히 Mychonastes sp. 246과 Mychonastes sp. 247 추출물은 최대 처리농도 (50 mg/mL)에서 각각 31 ± 7%와 27 ± 8%의 상대적으로 높은 radical 소거능을 나타내었다. 이러한 결과는 Mychonastes 속 4종의 β-carotene과 lutein의 함유량과 추출물의 항산화 효과와 유사성을 보여주었다. 이는 항산화 효능이 우수하다고 알려진 β-carotene과 lutein으로 인해 Mychonastes 속 4종의 추출물에서 항산화 효과와의 상관성이 있는 것으로 판단된다.


Fig. 3. 
Antioxidant activities of microalgal extracts (Mychonastes sp. 246, Mychonastes sp. 247, M. pushpae 248, and Mychonastes sp. 249). To evaluate radical scavenging effects, each concentration of microalgal extracts were incubated with DPPH reaction mixture, in which DPPH radical was induced by sonication. Data were expressed as means and S. of triplicate measurements. *P < 0.05, **P < 0.01, and ***P < 0.001 compared with non-treated control.

3.4. 미세조류 추출물의 세포 독성 및 암세포 성장억제 효과

Mychonastes 속 4종의 methanol 추출물에 대상으로 정상세포에 대한 독성을 확인하기 위해 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포 (hBM-MSC)를 사용하였다. Mychonastes 속 4종의 methanol 추출물을 hBM-MSC에 10, 100, 200 μg/mL의 농도로 처리한 결과, 모든 처리군에서 Mychonastes sp. 246 처리군을 제외하고 유의적인 세포독성이 관찰되지는 않았다 (Fig. 4). Mychonastes sp. 246의 경우 처리농도에 상관없이 약 10%의 세포독성이 있는 것으로 나타났다 (Fig. 4(A)). 반면 Mychonastes sp. 247, M. pushpae 248, Mychonastes sp. 249 추출물을 세포에 처리시 대조군에 비해 9~15% 생장을 촉진하는 것을 확인하였다 (Fig. 4(A)-Fig. 4(D)).


Fig. 4. 
Cytotoxic effect of microalgal extracts(Mychonastes sp. 246, Mychonastes sp. 247, M. pushpae 248, and Mychonastes sp. 249) on human bone marrow mesenchymal stem cells. The cells were treated with extract of Mychonastes sp. 246(A), Mychonastes sp. 247(B), M. pushpae 248(C), and Mychonastes sp. 249(D) for 48 hr and the cell viability was assessed by Cell Counting Kit-8 assay. Data were represented as means and SD of triplicate measurements. *P < 0.05 and **P < 0.01 compared with non-treated control.

Mychonastes 속 4종의 methanol 추출물에 대상으로 위암세포 (A549), 췌장암세포 (BxPC-3), 간암세포 (HepG2), 난소암세포 (SKOV-3)에 대해 암세포 생장억제 효과를 확인하였다. Mychonastes 속 4종의 추출물은 인체 유래의 위암세포, 췌장암세포, 간암세포, 난소암세포의 증식을 처리군 모두에서 농도 의존적으로 억제효과가 높아지는 것으로 나타났다 (Fig. 5). Mychonastes sp. 246 추출물은 100 μg/mL과 200 μg/mL 농도를 위암세포, 췌장암세포에 각각 처리 시 36 ± 5%와 44 ± 1%의 항암능을 보였다 (Fig. 5(A)). 또한 Mychonastes sp. 247 추출물은 200 μg/mL 농도로 위암세포, 췌장암세포, 간암세포, 난소암세포에 처리 시 35% 이상의 생장억제효과를 보였으며, 특히 위암세포, 췌장암세포에서 각각 57 ± 2%, 62 ± 6%로 비교군중 가장 우수한 암세포 생장억제효능을 보였다 (Fig. 5(B)). M. pushpae 248 추출물의 경우 100 μg/mL의 농도에서 위암세포의 생장을 50 ± 1% 저해시키는 것을 확인하였으며 (Fig. 5(C)), 반면에 Mychonastes sp. 249 추출물의 경우 모든 처리농도 (10~200 μg/mL)에서 34% 이하의 낮은 항암 활성을 보여 암세포 생장억제에 미미한 것으로 나타났다 (Fig. 5(D)). Mychonastes 4종의 추출물은 위암세포, 췌장암세포, 간암세포, 난소암세포에 대해 항암능을 보였으며, 특히 위암세포와 췌장암세포에 대한 증식억제 활성이 우수함을 보여주었다.


Fig. 5. 
Inhibitory effect of microalgal extracts extracts(Mychonastes sp. 246, Mychonastes sp. 247, M. pushpae 248, and Mychonastes sp. 249) on growth of A549, BxPC-3, HepG2, and SKOV-3 cancer cells. The indicated cancer cells were treated with extract of extracts Mychonastes sp. 246(A), Mychonastes sp. 247(B), M. pushpae 248(C), and Mychonastes sp. 249(D) for 24 hr and the cell viability was assessed by Cell Counting Kit-8 assay. Data were represented as means and SD of triplicate measurements. *P < 0.05, **P < 0.01, and ***P < 0.001 compared with non-treated control.

Nannochloropsis oculata의 추출물에서는 간암세포의 세포 생장 억제에 영향을 주지 못한다고 알려진 반면 [20], Mychonastes 속 4종의 추출물은 간암세포에 대해 약 20% 이상의 항암 효과를 보여주었다. 또한 Mychonastes sp. 247 추출물은 우수한 약리활성으로 인해 생약재로 주로 쓰이는 두충잎의 아세톤 추출물의 위암세포 억제능이 58%로 동등한 항암능을 보였다 [32]. 이러한 결과는 Mychonastes 속 4 종의 항산화 활성평가의 결과와 유사하게 β-carotene과 lutein의 함유량과 추출물의 항암능과의 상관성이 있는 것으로 판단된다.

Carotenoid는 폐암세포의 세포증식, 세포형질전환, 소핵 (Micronucleus)생성을 억제함으로써 항암능을 가진다고 알려져 있으며 [11], 이는 Mychonastes 속 4종이 함유하고 있는 β-carotene과 lutein 이 추출물에 대한 암세포 생장 억제 효과에 영향을 주는 것으로 판단된다.

이상의 결과에서 Mychonates 속 4 종의 methanol 추출물은 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포에 대한 세포 독성이 상대적으로 낮으면서도 인체의 위암세포, 췌장암세포, 간암세포, 난소암세포에 대한 증식억제 활성을 보여주었다. 특히 Mychonastes sp. 247은 유용 색소 함유량이 우수하였고, 정상세포 생장 촉진과 암세포 억제 능력이 우수하여 항암 및 항산화 소재로서의 활용가능성을 확인하였다. 향후 Mychonastes 속 4 종의 methanol 추출물의 암세포의 성장을 억제하는 유효성분 분리 및 분석과 억제능에 대한 규명 연구를 진행할 예정이다.


4. CONCLUSION

본 연구에서는 국내 담수 수계에서 녹조류 Mychonastes 속 4종을 분리 및 동정하여, 생리활성이 우수한 유용색소에 대한 분석을 통해 β-carotene과 lutein이 다량 함유하고 있는 것으로 확인하였다. 또한 미세조류 methanol 추출물을 제조하여 항산화, 세포독성, 암세포 억제효과를 평가하여 생리활성물질로 활용가능성에 대한 평가를 수행하였다. 연구결과 미세조류 추출물은 처리한 농도에 비례하여 항산화능이 높아지는 것을 확인할 수 있었으며, 세포독성은 상대적으로 낮으면서도 위암세포, 췌장암세포, 간암세포, 난소암세포에 대해 암세포 생장억제을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다. 향후 암세포에 대한 유효성분 분석과 항암 기작에 대한 추가적인 연구를 진행하여 토착 담수미세조류의 생리활성 효과를 규명한다면 생물소재로서 활용가치를 높일 수 있을 것으로 기대된다.


Acknowledgments

이 연구는 환경부의 재원으로 국립낙동강생물자원관에서 지원을 받아 수행된 연구입니다 (NNIBR202102104).


REFERENCES
1. Joe, M. H., D. H. Kim, D. S. Choi, and S. Bai (2018) Optimization of phototrophic growth and lipid production of a newly isolated microalga, Desmodesmus sp. KAERI-NJ5. Microbiol. Biotechnol. Lett. 46: 377-389.
2. Mahdieh, M., S. Shabani, and M. R. Amirjani (2019) Characterization of the growth, total lipid and fatty acid profiles in microalga, Nannochloropsis oceanica under different nitrogen sources. Microbiol. Biotechnol. Lett. 47: 11-19.
3. Park, H., D. Hoh, D. W. Shin, Z. H. Kim, S. J. Hong, S. M. Lim, and C. G. Lee (2019) Isolation and characterization of five isolates of Tetraselmis sp. with rapid growth rates in low temperatures. J. Mar. Biosci. Biotechnol. 11: 23-28.
4. Baer, S., M. Heining, P. Schwerna, R. Buchholz, and H. Hubner (2016) Optimization of spectral light quality for growth and product formation in different microalgae using a continuous photobioreactor. Algal Res. 14: 109-115.
5. Shin, D. W., J. H. Bae, Y. Cho, Y. J. Ryu, Z. H. Kim, S. M. Lim, and C. G. Lee (2016) Isolation of new microalga, Tetraselmis sp. KCTC12236BP, and biodiesel production using its biomass. J. Mar. Biosci. Biotechnol. 8: 39-44.
6. Borowitzka, M. A (2013) High-value products from microalgaetheir development and commercialisation. J. Appl. Phycol. 25: 743-756.
7. Joshi, S., R. Kumari, and V. N. Upasani (2018) Applications of algae in cosmetics: An overview. Int. J. Innov. Res. Sci. Eng. Technol. 7: 1269.
8. Kim, Z. H., H. Park, Y. J. Ryu, D. W. Shin, S. J. Hong, H. L. Tran, and C. G. Lee (2015) Algal biomass and biodiesel production by utilizing the nutrients dissolved in seawater using semi-permeable membrane photobioreactors. J. Appl. Phycol. 27: 1763-1773.
9. Carvalho, A. P. and F. X. Malcata (2000) Effect of culture media on production of polyunsaturated fatty acids by Pavlova lutheri. Cryptogram. Algol. 21: 59-71.
10. Harun, R., M. Singh, G. M. Forde, and M. K. Danquah (2010) Bioprocess engineering of microalgae to produce a variety of consumer products. Renew. Sustain. Energy Reviews 14: 1037-1047.
11. Seo, Y. B. and G. D. Kim (2017) Microbial production of carotenoids: biological functions and commercial applications. J. Life Sci. 27: 726-737.
12. Inbaraj, B. S., J. T. Chien, and B. H. Chen (2006) Improved high performance liquid chromatographic method for determination of carotenoids in the microalga Chlorella pyrenoidosa. J. chromatogr. A. 1102: 193-199.
13. Kumar, S. S., T. P. Devasagayam, B. Bhushan, and N. C. Verma (2001) Scavenging of reactive oxygen species by chlorophyllin: an ESR study. Free Radic. Res. 35: 563-574.
14. Noda, K., N. Ohno, K. Tanaka, N. Kamiya, M. Okuda, T. Yadomae, K. Nomoto, and Y. Shoyama (1996) A water-soluble antitumor glycoprotein from Chlorella vulgaris. Planta Med. 62: 423-426.
15. Kim, H. M., H. Oh, J. H. Jeong, S. C. Lee, H. J. Moon, and Y. S. Jeong (2017) Functional evaluation of marine micro-algae Amphidinium carterae extract. Korean J. Food Preserv. 24: 673-679.
16. Meng, Y., R. M. Van Wagoner, I. Misner, C. Tomas, and J. L. Wright (2010) Structure and biosynthesis of amphidinol 17, a hemolytic compound from Amphidinium carterae. J. Nat. Prod. 73: 409-415.
17. Nuzzo, G., A. Cutignano, A. Sardo, and A. Fontana (2014) Antifungal amphidinol 18 and its 7-sulfate derivative from the marine dinoflagellate Amphidinium carterae. J. Nat. Prod. 77: 1524-1527.
18. Echigoya, R., L. Rhodes, Y. Oshima, and M. Satake (2005) The structures of five new antifungal and hemolytic amphidinol analogs from Amphidinium carterae collected in New Zealand. Harmful Algae 4: 383-389.
19. Huang, S. J., C. M. Kuo, Y. C. Lin, Y. M. Chen, and C. K. Lu (2009) Carteraol E, a potent polyhydroxyl ichthyotoxin from the dinoflagellate Amphidinium carterae. Tetrahedron Lett. 50: 2512-2515.
20. Cha, S. H., M. J. Kim, H. Y. Yang, C. B. Jin, Y. J. Jeon, T. Oda, and D. K. Kim (2010) ACE, α-glucosidase and cancer cell growth inhibitory activities of extracts and fractions from marine microalgae, Nannochloropsis oculata. Korean J. Fish. Aquat. Sci. 43: 437-444.
21. Tamura, K., G. Stecher, D. Peterson, A. Filpski, and S. Kumar (2013) MEGA6: molecular evolutionary genetics analysis version 6.0. Mol. Biol. Evol. 30: 2725-2729.
22. Kano, M., T. akayanagi, K. arada, K. akino, and F. Ishikawa (2005) Antioxidative activity of anthocyanins from purple sweet potato, Ipomoera batatas cultivar Ayamurasaki. Biosci. Biotechnol. Biochem. 69: 979-988.
23. Tukey, J. W. (1949) Comparing individual means in the analysis of variance. Biometrics 99-114.
24. Hong, S. P., M. H. Kim, and J. K. Hwang (1998) Biological functions and production technology of carotenoids. J. Korean Soc. Food Sci. Nutr. 27: 1297-1306.
25. Şahin, S., N. T. Nasir, İ. Erken, Z. E. Çakmak, and T. Çakmak (2019) Antioxidant composite films with chitosan and carotenoid extract from Chlorella vulgaris: optimization of ultrasonic-assisted extraction of carotenoids and surface characterization of chitosan films. Mater. Res. Express. 6: 095404.
26. Kim, Z. H., H. S. Lee, and C. G. Lee, (2009) Red and Blue Photons Can Enhance the Production of Astaxanthin from Haematococcus pluviatis. Algae. 24: 121-127.
27. Tran, H. L., J. S. Kwon, Z. H. Kim, Y. Oh, and C. G. Lee (2010) Statistical optimization of culture media for growth and lipid production of Botryococcus braunii LB572. Biotechnol. Bioprocess Eng. 15: 277-284.
28. Converti, A., A. A. Casazza, E. Y. Ortiz, P. Perego, and M. Del Borghi (2009) Effect of temperature and nitrogen concentration on the growth and lipid content of Nannochloropsis oculata and Chlorella vulgaris for biodiesel production. Chem. Eng. Process. 48: 1146-1151.
29. Hong, S. C., J. B. Jeong, G. H. Park, J. S. Kim, E. W. Seo, and H. J. Jeong (2009) Anti-oxidant effect of Agastache rugosa on oxidative damage induced by H2O2 in NIH 3T3 cell. Korean J. Plant Res. 22: 498-505.
30. Kang, Y. H., Y. K. Park, S. R. Oh, and K. D. Moon (1995) Studies on the physiological functionality of pine needle and mugwort extracts. Korean J. Food Sci. Technol. 27: 978-984.
31. Assuncao, M. F., R. Amaral, C. B. Martins, J. D. Ferreira, S. Ressurreição, S. D. Santos, J. M. Varejão, and L. M. Santos (2017) Screening microalgae as potential sources of antioxidants. J. Appl. Phycol. 29: 865-877.
32. In, M. J., E. J. Kim, and D. C. Kim (2018) In vitro anticancer and antioxidant effects of acetone extract of Eucommia ulmoides Oliver leaves. J. Appl. Biol. Chem. 61: 119-124.