The Korean Society For Biotechnology And Bioengineering

Current Issues

Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 36, No. 2

[ Research Paper ]
Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 36, No. 2, pp.171-179
Abbreviation: KSBB J
ISSN: 1225-7117 (Print) 2288-8268 (Online)
Print publication date 30 Jun 2021
Received 17 May 2021 Revised 21 Jun 2021 Accepted 28 Jun 2021
DOI: https://doi.org/10.7841/ksbbj.2021.36.2.171

벤치규모 생물반응기에서 Shinella granuli CK-4에 의한 1,4-Dioxane의 생분해에 영향을 미치는 물리화학적 요인
최문섭1 ; 최기승2 ; 오계헌1, *
1순천향대학교 자연과학대학 생명과학과
2㈜씨디아이

The Effects of Several Physicochemical Factors on the Degradation of 1,4-Dioxane by Shinella granuli CK-4 in Bench-scale Bioreactors
Moon-Seop Choi1 ; Ki-Seung Choi2 ; Kye-Heon Oh1, *
1Department of Life Science, Soonchunhyang University, Asan 31538, Korea
2CDI Co., Ltd, Hwaseong 18543, Korea
Correspondence to : Department of Life Science, Soonchunhyang University, Asan 31538, Korea Tel: +82-41-530-1353, Fax: +82-41-530-1350 E-mail: kyeheon@sch.ac.kr


© 2021 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering
Funding Information ▼

Abstract

Our previous research has demonstrated that Shinella granuli CK-4 is capable of utilizing 1,4-dioxane as its sole source of carbon and energy when isolated from industrial wastewater [1]. In this study, we have extended this work to investigate the relationships between 1,4-dioxane degradation and the strain CK-4 and several relevant physicochemical environmental parameters in 3 L bench-scale bioreactors. One gram of 1,4-dioxane per liter was completely degraded within 96 hours of incubation, and the optimum temperature for 1,4-dioxane degradation was 30oC. 1,4-Dioxane degradation by CK-4 gradually increased as a function of airflow rate and agitation speed, and the optimum airflow rate and agitation speed were 2.5 L/min and 500 rotation per minutes, respectively, in this study. The addition of 50 mg/L tetrahydrofuran as a supplemental carbon source was found to stimulate the maximal bacterial growth and 1,4-dioxane degradation. The optimum results obtained from these experiments were combined and applied for 1,4-dioxane degradation. As a result, the complete degradation of 1,4-dioxane was achieved with the CK-4 culture within 72 hours of incubation. We explored the feasibility of using the cultures of S. granuli CK-4 for the degradation of 1,4-dioxane with the aim of microbial application in industrial wastewater treatment in bench-scale bioreactors.


Keywords: Shinella granuli CK-4, 1,4-dioxane, biodegradation, industrial wastewater

1. INTRODUCTION

1,4-Dioxane은 화장품, 의약품 제조, 석유화학 등 여러 산업 분야에서 용매로 널리 사용될 뿐만 아니라 폴리에스터 (polyester) 및 계면활성제 등의 제조 공정에서도 부산물로 생성된다 [2,3]. 1,4-Dioxane에 의한 환경오염의 주요 원인은 플라스틱 매립지의 침출수, 섬유산업 폐수의 유출, 폐기물의 투기 등으로 보고되고 있다 [4]. 지난 수십 년 동안 미국, 일본을 비롯한 선진국의 하천, 지하수, 해양 등의 수계를 오염시켜 왔으며 [5-8], 국내에서도 낙동강, 만경강 등의 수계에 1,4-dioxane이 유출되면서 인근 상수원에 음용수 권고 기준인 50 μg/L를 크게 초과하는 오염 문제가 발생한 바 있다 [9]. 이 화합물은 수계에서 가수 분해되거나 광분해 되지 않는 헤테로고리 에테르 구조를 가지고 있기 때문에 일단 유출되면 심각한 오염 물질로서 장기간 환경에 잔류될 수 있다. 또한 사람에게 노출될 경우에 폐, 간 또는 신장 등의 손상을 유발할 수 있으며, 국제 암 연구기관 (International Agency for Research on Cancer)에서는 Group 2B의 발암물질로 분류하고 있다 [10,11].

1,4-Dioxane을 제거하기 위한 방안으로 미생물학적 처리방법이 주목받고 있다. 다양한 환경 시료로부터 1,4-dioxane을 분해할 수 있는 미생물들이 분리되었으며, 대표적인 세균으로 Pseudonocardia sp.이 알려져 있으며 [12-15], Acinetobacter sp., Mycobacterium sp., Flavobacterium sp., Rhodococcus sp., Afipia sp. 등도 분해미생물로 보고되었다 [16-21]. 그러나 이들 미생물에 대한 연구는 주로 생태학적 측면이나 분해 경로에 대한 것들로서 생장이 느리고 비효율적으로 낮은 1,4-dioxane 분해능으로 인해 폐수처리 시스템에 적용하기에 부적합한 것으로 알려져 있다. 그럼에도 불구하고 일부 연구에서 Rhodanobacter sp. AYS5, Pseudonocardia sp. D17, Afipia sp. D1 등의 세균을 이용하여 낮은 농도 (<300 mg/L)의 1,4-dioxane 제거를 생물반응기에 적용하려는 시도가 보고된 바 있다 [15,20,21].

생물반응기에서 미생물의 생장과 화학물질의 생분해는 배지의 조성, 기질 농도, 온도, 통기량 (airflow rate), 교반 속도 (agitation speed) 등의 요인들에 크게 영향을 받는다. 이들 운전 요인의 최적화 (optimization)는 반응기 내의 미생물 활성과 화학물질의 효율적인 분해에 기여하기 때문에 이들 화학물질을 제거하는데 중요한 것으로 알려져 있다 [22-24]. Inoue 등 [19]과 Pugazhendi 등 [20]은 1,4-dioxane의 농도가 증가함에 따라 분해능이 감소되었으며, Sei 등 [13]과 Yamamoto 등 [15]은 15~30oC에서 온도가 상승할수록 분해능이 향상되는 결과를 보고하였다. 현재까지 알려진 1,4-dioxane의 분해에 관한 연구는 대부분 호기적 조건에서 진행되었다 [12-22]. 일부 연구는 미생물 군집 또는 혼합배양을 이용한 혐기적 조건에서 수행되었으나 [25,26], 분해효율이 상당히 낮은 것으로 보고되었다. 호기적으로 운용되는 생물반응기에서 통기량과 교반 속도는 산소뿐만 아니라, 물질 및 열 등의 전달에 영향을 미치며, 미생물의 생장 및 활성, 화합물의 분해 등과 같은 공정에 영향을 준다. 따라서 이들 조건의 확립은 생물 반응기를 이용한 미생물학적 처리에서 필수적이나 [22-24], 1,4-dioxane의 분해에서 통기량과 교반 속도가 미치는 영향에 관한 연구는 상대적으로 미미한 실정이다. 부가탄소원의 첨가는 화학물질의 효율적인 생분해에 영향을 미치는 중요한 요인으로 인식되고 있다. 특히 tetrahydrofuran (THF)은 1,4-dioxane의 생분해에서 부가탄소원으로 첨가되어 그 분해를 향상시키는 것으로 알려져 있다 [16,19,20,27].

본 연구에서는 벤치 규모의 생물반응기 내에서 산업 폐수로부터 분리된 Shinella granuli CK-4를 이용하여 생장과 1,4-dioxane의 분해에 영향을 미치는 다양한 요인 (예, 기질 농도, 온도, 통기량, 교반 속도, THF)에 대하여 조사하였다.


2. MATERIALS AND METHODS
2.1. 세균의 확보 및 배양조건

울산 지역의 S공단에서 채취한 폐수 표본으로부터 1,4-dioxane의 분해능을 가지는 균주를 농화 및 순수배양 기법을 통하여 CK-4를 분리하였다. 배양에는 ammonium mineral salts (AMS) 배지를 사용하였으며 [27], 진탕배양기 (30oC, 160 rpm)에서 배양한 후, 적당한 양을 생물반응기에 접종하며, 연속적인 실험을 진행하였다.

2.2. 생물반응기와 운전조건

1,4-Dioxane의 분해에 사용된 생물반응기 (H: 300 mm, Di: 125 mm, Vtotal: 3.7 L, VR: 3.0 L)는 Model KLF (Bioengineering AG, Zürich, Switzerland)를 변형하여 사용하였다. 반응기 내부에 2개의 임펠러 (impeller)가 장착되었으며, 반응기 상단에는 pH probe (Mettler Toledo Co., Columbus, OH, USA)와 에어펌프 (Model KH-60D, Kyungheung Co., Korea), 하단에는 자체 제작한 온도 센서, 가열 및 냉각 장치로 구성되었다 (Fig. 1). 운전은 호기적 조건 하에서 진행되었으며, 배양액의 부피는 3 L, 배양온도는 10~30oC, 교반 속도는 100~500 rpm, 통기량은 0.5~2.5 L/min 등의 조건을 유지하였다. 생물반응기가 운전되는 동안, 증발될 수 있는 배양액은 배양기 상단에 부착된 응축기를 통하여 회수되었다.


Fig. 1. 
Configuration of stirred tank reactor system used in this study.

2.3. 분해균주의 생장과 1,4-dioxane의 분석

CK-4 균주의 생장은 분광광도계 (Model Epoch, BioTek Instruments, Inc, Winooski, VT, USA)를 이용하여 600 nm에서 흡광도를 측정하여 평가하였으며, 배양기간 동안의 잔존 1,4-dioxane의 농도는 Scalia 등 [28]의 방법을 이용하여 HPLC로 분석하였다. HPLC system은 UV/Visible Detector 2489, Isocratic HPLC Pump 1515와 Autosampler 2707 (Waters, Milford, MA, USA)로 구성되었으며, 컬럼은 Eclipse XDB-C18 (4.6 × 250mm, 5 μm, Agilent, Santa Clara, CA, USA)을 사용하였다. 표준물질은 Sigma Co. (St. Louis, MO, USA)의 분석용 1,4-dioxane을 사용하였으며, 분석 시료의 경우 13,000 rpm에서 10분간 원심 분리하여 균체를 제거한 후, 0.45 μm syringe filter로 여과하여 분석하였다.

2.4. 생물반응기에서 운전 요인이 미치는 영향
2.4.1. 기질 농도

생물반응기에서 1,4-dioxane의 농도에 따른 CK-4의 생장과 분해능에 미치는 영향을 조사하였다. 배양기 내에 각각 1 g/L, 2 g/L, 3 g/L의 1,4-dioxane을 첨가한 후, 약 108 CFU/ml의 CK-4 균주를 5% (v/v) 접종하고, 배양온도는 30oC, 교반 속도는 300 rpm, 통기량은 1.5 L/min 조건을 유지하면서, 12시간 간격으로 시료를 채취하여 CK-4 균주의 생장과 1,4-dioxane의 잔존량을 조사하였다.

2.4.2. 온도

생물반응기에서 배양 온도에 따른 CK-4의 생장과 1,4-dioxane의 분해를 비교하였다. 1 g/L의 1,4-dioxane이 첨가된 AMS 배지에 약 108 CFU/ml의 CK-4 균주를 5% (v/v) 접종한 후, 교반 속도는 300 rpm, 통기량은 1.5 L/min 조건을 유지하면서, 각각 10oC, 20oC, 30oC에서 배양하며, 12시간 간격으로 CK-4 균주의 생장과 1,4-dioxane의 잔존량을 조사하였다.

2.4.3. 통기량

생물반응기에서 통기량에 따른 CK-4 균주의 생장과 1,4-dioxane의 분해를 비교하였다. 사용한 배지는 AMS 배지에 탄소원으로 1 g/L의 1,4-dioxane을 첨가하였으며, 약 108 CFU/ml의 CK-4 균주를 5% (v/v) 접종한 후, 배양온도는 30oC, 교반 속도는 300 rpm에서, 배양액 3 L에 대하여 통기량을 0.5 L/min, 1.5 L/min, 2.5 L/min으로 각각 유지하면서 12시간 간격으로 시료를 채취하여 CK-4 균주의 생장과 1,4-dioxane의 잔존량을 조사하였다.

2.4.4. 교반 속도

생물반응기에서 교반 속도에 따른 CK-4 균주의 생장과 1,4-dioxane의 분해를 비교하였다. 1 g/L의 1,4-dioxane이 첨가된 AMS 배지에 약 108 CFU/ml의 CK-4 균주를 5% (v/v) 접종한 후, 배양온도는 30oC, 통기량은 1.5 L/min 조건 하에서 교반 속도를 각각 100 rpm, 300 rpm, 500 rpm으로 유지하면서 12시간 간격으로 CK-4 균주의 생장과 1,4-dioxane의 잔존량을 조사하였다.

2.4.5 THF의 첨가

생물반응기를 이용하여 THF의 첨가와 농도에 따른 CK-4 균주의 생장과 1,4-dioxane의 분해를 조사하였다. 1 g/L의 1,4-dioxane이 첨가된 AMS 배지에 0 mg/L, 25 mg/L, 50 mg/L, 100 mg/L, 150 mg/L THF을 각각 첨가하고, 약 108 CFU/ml의 CK-4 균주를 5% (v/v) 접종한 후, 배양온도는 30oC, 교반 속도는 300 rpm, 통기량은 1.5 L/min으로 유지하며, CK-4 균주의 생장과 1,4-dioxane의 잔존량을 조사하였다.


3. RESULTS AND DISCUSSION
3.1. 1,4-Dioxane 분해균주의 확보

1,4-Dioxane 분해 균주는 이전에 수행된 연구에서 1,4-dioxane에 대한 분해능이 확인된 미생물 컨소시엄 CDIK-3로부터 순수 배양기법을 이용하여 분리한 S. granuli CK-4를 사용하였다 [27]. 분리균주 S. granuli CK-4의 특성과 1,4-dioxane 노출에 대한 세포 반응은 이미 보고된 바 있다 [1]. 분해균주는 AMS 배지에 접종하여 진탕배양기 (30oC, 160 rpm)에서 배양한 후, 생물반응기에 접종하며, 연속적인 실험을 진행하였다.

3.2. 1,4-Dioxane 분해에 미치는 요인
3.2.1. 1,4-Dioxane의 농도

1,4-Dioxane의 농도에 따라 생물반응기에서 CK-4의 생장과 1,4-dioxane 분해능을 조사하였다 (Fig. 2). 분리세균 CK-4는 기질로서 주어진 1,4-dioxane를 이용하여 생장하였으며, 1~3 g/L의 농도 범위에서 농도의 증가에 따라 생장도 증가하였다. 1,4-Dioxane는 CK-4 균주의 기질로서 사용되어 1 g/L에서 96시간, 그리고 2 g/L에서 156시간 이내에 완전히 분해되었다. 동일한 배양기간 동안 3 g/L에서는 약 70% 정도 분해되었다. Pugazhendi 등 [20]Rhodanobacter sp. AYS5를 이용하여 약 260mg/L의 1,4-dioxane을 60시간 동안 분해하였으며, Yamamoto 등 [15]이 분리한 Pseudonocardia sp. D17은 60시간 동안 약 6 mg/L의 1,4-dioxane을 분해하는 것으로 보고되었다. 또한, Lee 등 [29]이 산업 폐수에서 농화한 미생물 군집은 220시간 동안 2 g/L의 1,4-dioxane을 분해하였다. 이전 연구에서 수행된 CK-4의 사멸률 조사에서 10 g/L 이상의 1,4-dioxane 농도에서도 잘 견디는 것으로 발표된 바 있다 [1]. 이러한 결과와 비교할 때, 1,4-dioxane이 난분해성 화학물질 임에도 불구하고, CK-4는 생물반응기에서 진행된 1,4-dioxane의 농도 범위 (1~3 g/L)에서 생장과 분해는 농도가 증가함에 따라 향상되는 것으로 확인되었다.


Fig. 2. 
Growth of the S. granuli CK-4, (A) and the degradation of 1,4-dioxane (B) at different 1,4-dioxane concentrations. The strains were incubated at 1 g/L (○,●), 2 g/L (□,■), 3 g/L (△,▲), respectively. Temperature, airflow rate, and agitation speed were set at 30oC, 1.5 L/min, and 300 rpm. Error bars indicate the standard deviations of three replicates.

3.2.2. 배양온도

생물반응기에서 배양온도 변화에 따른 CK-4의 생장과 1,4-dioxane 분해를 조사하였다 (Fig. 3). 10~30oC의 온도 범위에서 수행된 CK-4의 생장과 1,4-dioxane의 분해는 배양 온도가 증가함에 따라 증가하였다. 10oC에서 1 g/L의 1,4-dioxane은 배양 168시간 이내에 약 65%의 부분적인 분해가 진행되었으며, 20oC에서는 144시간 이내에 완전히 분해되었다. 반면에 30oC에서 동일한 농도의 1,4-dioxane을 96시간 이내 1 g/L를 완전히 분해하였다. 일반적으로 탄화수소(hydrocarbons)의 생분해는 Arrhenius 방정식에 근거하여 온도에 영향을 받는다 [30]. Sei 등 [13]Afipia sp. D1, Mycobacterium sp. D11, Mycobacterium sp. D6, Pseudonocardia sp. D17 등을 이용하여 15~45oC의 배양온도에서 0.1 g/L의 1,4-dioxane의 분해율을 관찰하였으며, 온도가 20oC에서 30oC로 상승하였을 때 분해능이 약 50~60%가 향상됨을 보고하였다. Inoue 등 [19]Rhodococcus aetherivorans JCM 14343을 이용하여 5~45oC의 배양온도 범위에 따른 1,4-dioxane의 분해 연구를 통하여 10oC에서 30oC로 온도가 상승함에 따라 분해율이 약 0.3 mg/L/h에서 1.2 mg/L/h로 향상됨을 보고한 바 있다. 본 연구에서 수행된 배양온도에 따른 1,4-dioxane의 분해는 30oC에서 가장 효율적인 것으로 나타났으며 이들 연구와 유사한 결과를 제시하고 있다. 제한된 용량을 처리하는 생물반응기에서 온도에 따른 1,4-dioxane의 분해는 가능하지만, 실제로 현장(in situ)에서 이 화학물질이 포함된 폐수를 처리하는데 있어서 온도는 계절적 요인에 영향을 받아 비용적인 문제를 야기할 수 있다. 다만 본 연구의 CK-4는 기존에 보고된 미생물들과 비교하여 낮은 온도에서도 고농도의 1,4-dioxane의 분해를 보여주었으며, 추후 CK-4의 1,4-dioxane 분해능과 온도에 따른 보다 구체적인 연구가 수행되어야 할 것으로 보인다.


Fig. 3. 
Growth of the S. granuli CK-4, (A) and the degradation of 1,4-dioxane (B) at different incubation temperature. The strains were incubated at 10℃ (○,●), 20℃ (□,■), 30℃ (△,▲), respectively. Initial concentration of 1,4-dioxane was 1 g/L 1,4-dioxane. Airflow rate and agitation speed were set at 1.5 L/min and 300 rpm. Error bars indicate the standard deviations of three replicates.

3.2.3. 통기량

통기량에 따른 CK-4 균주의 생장과 1,4-dioxane 분해를 조사하였다 (Fig. 4). 반응기에서 CK-4의 생장은 통기량의 증가에 따라 비례하여 증가하였다. 통기량의 증감에 따른 1,4-dioxane의 분해는 통기량 0.5 L/min에서 108시간, 1.5 L/min에서 96시간, 2.5 L/min에서 84시간 이내에 각각 1.0 g/L의 1,4-dioxane을 완전 분해하였다. 따라서 1,4-dioxane의 분해는 통기량이 증가함에 따라 완전분해를 위한 배양시간은 감소되는 것으로 나타났다. Yabuki 등 [22]은 매립지에서 농화시킨 혼합배양을 이용하여 500 mL 용량의 유리용기(glass bottle)에서 수행된 1,4-dioxane의 분해 연구를 통해서 통기하지 않은 것과 비교하여 1.5 L/min으로 통기하였을 때, 그 제거율이 8.6%에서 12.5%로 향상되었다는 것을 보고하였다. 연구와 비교할 때, 통기량이 증가할수록 배지 내의 용존 산소량이 증가하여 세포로의 산소 전달 및 산소 흡수가 향상되고 기포에 의해 발생되는 교반(bubble agitation) 효과가 증가되기 때문에 물질전달이 향상되어 1,4-dioxane의 분해가 증가되는 것으로 판단된다.


Fig. 4. 
Growth of the S. granuli CK-4, (A) and the degradation of 1,4-dioxane (B) at different airflow rates. The media were adjusted at 0.5 L/min (○,●), 1.5 L/min (□,■), 2.5 L/min (△,▲), respectively. Initial concentration of 1,4-dioxane was 1 g/L 1,4-dioxane. Temperature and agitation speed were set at 30oC and 300 rpm. Error bars indicate the standard deviations of three replicates.

3.2.4. 교반 속도

교반 속도에 따른 CK-4 균주의 생장과 1,4-dioxane 분해를 조사하였다 (Fig. 5). CK-4는 교반 속도의 증가에 따라 생장도 증가하였으며, 500 rpm에서 최대의 생장을 보여주었다. 그러나 본 연구에서 진행된 가장 낮은 교반 속도인 100 rpm에서는 배양 중 세포가 응집되어 침전되는 현상이 발생되었으며, 다른 증가된 교반 속도와 비교하여 낮은 생장이 관찰되었다. 또한 교반 속도에 따른 1,4-dioxane의 분해는 100 rpm에서 132시간, 300 rpm에서 96시간, 500 rpm에서 84시간 이내에 1.0 g/L의 1,4-dioxane을 완전히 분해하였다. 교반 속도가 증가함에 따라 CK-4의 생장과 1,4-dioxane의 분해는 효율적으로 향상되었다.


Fig. 5. 
Growth of the S. granuli CK-4, (A) and the degradation of 1,4-dioxane (B) at different agitation speed. The media were adjusted at 100 rpm (○,●), 300 rpm (□,■), 500 rpm (△,▲), respectively. Initial concentration of 1,4-dioxane was 1 g/L 1,4-dioxane. Temperature and airflow rate speed were set at 30oC, 1.5 L/min. Error bars indicate the standard deviations of three replicates.

1,4-Dioxane의 생분해에서 생물반응기의 교반 속도에 따른 분해능에 관한 연구는 거의 보고된 바가 없다. 다만, Yesilada 등 [23]Coriolus versicolorFunalia trogii를 이용한 올리브 공장 폐수처리에서 교반 속도를 50 rpm에서 200 rpm으로 증가시켜 페놀의 분해가 약 15% 향상되었으며, Abboud 등 [24]Acinetobacter calcoaceticusPantoea agglomerans를 이용한 계면활성제 sodium dodecyl sulfate와 linear alkylbenzosulfonate의 분해에 관한 연구에서 교반 속도를 75 rpm에서 250 rpm으로 증가시켰을 때, 각각 분해능이 약 80%와 30%가 향상됨을 보고한 바 있다. 이러한 연구와 비교하였을 때, 생물반응기에서 교반은 매우 중요한 요인으로서 통기를 통해서 공급되는 기포를 미세기포로 분산시켜 기체상에서 배지로 산소 전달을 향상시킬 뿐만 아니라, 배지 내의 온도 및 1,4-dioxane의 농도 구배를 유지시키며, 배양 중 CK-4 세포가 응집되어 침전되는 현상을 감소시켜 1,4-dioxane의 분해가 향상되는 것으로 판단된다.

3.3. THF의 첨가

부가탄소원으로서 THF이 CK-4의 생장과 1,4-dioxane의 분해에 미치는 영향을 조사하였다 (Fig. 6). CK-4의 생장은 첨가된 THF의 농도가 증가함에 따라 생장률도 증가하였으며, 150 mg/L의 THF에서 최대 생장을 보여주었다. 1,4-Dioxane 분해는 일정농도 (25~150 mg/L)의 THF가 첨가되었을 때, 첨가하지 않은 것과 비교하여 향상되었다. THF의 농도에 따른 1 g/L 1,4-dioxane의 완전 분해에 걸리는 기간은 25 mg/L에서 84시간, 50 mg/L에서 78시간, 100 mg/L에서 84시간, 150 mg/L에서 90시간으로서, 50 mg/L의 THF가 첨가된 배양액에서 가장 높은 분해능을 나타내었다. THF에 의해 유도되는 THF monooxygenase은 1,4-dioxane을 분해할 수 있는 것으로 알려져 있다 [19]. Masuda 등 [12]Pseudonocardia sp. strain ENV478에서 THF의 농도에 따라 THF monooxygenase (thm)의 유도가 증가되며, 이 효소에 의해 1,4-dioxane이 분해됨을 보고하였다. Pugazhendi 등 [20]은 분리한 Rhodanobacter AYS5 균주가 THF이 미첨가된 배지에서 1 g/L의 1,4-dioxane을 10일 동안 95% 정도 분해되던 것이 200 mg/L의 THF이 첨가된 배지에서 동일 농도의 1,4-dioxane을 8일 이내에 완전 분해시키는 것을 관찰하였으며, Kelley 등 [16]이 분리한 Amycolata sp. CB1190은 부가탄소원으로 40 mg/L의 THF을 첨가하여 25 mg/L의 1,4-dioxane을 완전 분해하는데 17일에서 10일로 단축시키는 것을 확인하였다. Sun 등 [18]Flavobacterium sp.을 이용한 15일간에 걸친 100 mg/L 1,4-dioxane의 분해 연구에서 10 mg/L 및 100 mg/L의 THF 첨가한 결과, 1,4-dioxane은 각각 30% 및 95%의 분해되었음을 보여주었다. 그러나 Lee 등 [29]은 미생물컨소시엄에 의한 100 mg/L의 1,4-dioxane 분해 연구에서 THF가 미첨가된 배양에서 55시간 동안 99% 분해되는 것과 비교하여, THF이 각각 75 mg/L와 150 mg/L 첨가된 배양에서 동일한 기간 동안 각각 70%와 50%로 분해가 지연된다는 결과를 발표하였는데, 이는 THF가 1,4-dioxane과 유사한 구조를 가지고 있어, 이들 화합물을 분해하기 위하여 동일한 분해효소를 사용하기 때문에, THF는 1,4-dioxane을 경쟁적으로 억제하기 때문이라고 설명하였다. 이와 같이 이전에 보고된 THF의 첨가가 1,4-dioxane의 분해에 미치는 영향에 관한 결과들은 사용된 미생물의 종류에 따라 차이를 보여주었다.


Fig. 6. 
Growth of the S. granuli CK-4, (A) and the degradation of 1,4-dioxane (B) at the presence of 0 mg/L (○,●), 25 mg/L (□,■), 50 mg/L (△,▲), 100 mg/L (◇,◆), 150 mg/L (▽,▼) of THF concentration. Initial concentration of 1,4-dioxane was 1 g/L 1,4-dioxane. Temperature, airflow rate, and agitation speed were set at 30oC, 1.5 L/min, and 300 rpm, Error bars indicate the standard deviations of three replicates.

3.4. 최적 운전조건에서 1,4-dioxane 분해

본 연구에서 얻어진 최적의 운전 요인들을 생물반응기에 적용하여 CK-4의 생장과 1,4-dioxane의 분해를 조사하였다 (Fig. 7). 적용된 운전조건은 반응기에 1 g/L의 1,4-dioxane를 준비하여, 온도 30oC, 통기량 2.5 L/min, 교반 속도 500 rpm, 그리고 부가탄소원으로서 50 mg/L의 THF를 첨가하였으며, 배양은 168시간에 걸쳐서 진행되었다. 배양 시간이 경과한 후, 그 결과는 CK-4의 생장과 1,4-dioxane의 분해가 크게 향상됨을 관찰하였다. CK-4의 생장에서 유도기는 확인되지 않았으며, 84시간이 경과한 후, 최대 생장이 관찰되었다. 배양액의 pH는 초기 8.0에서 72시간이 경과한 후, 7.2로 감소되었으며, 그 후에는 거의 변화없이 일정하게 유지되었다. 본 연구에서 사용된 S. granuli CK-4는 pH 8 내외의 산업폐수로부터 농화배양으로 분리하여 초기 pH로 설정하였으며 [1], 또한 미생물에 의한 1,4-dioxane의 분해과정에서 중간대사산물로서 oxalic acid, glyoxylic acid 등의 유기산을 생성하는 것으로 보고된 바 있기 때문에 [17,20], 배양기간 중의 pH 측정은 추후 이 균주의 1,4dioxane 분해기작을 연구하는데 유용한 자료가 될 것으로 사료된다. 1,4-Dioxane의 분해는 CK-4 균주를 접종한 후, 감소하기 시작하였으며, 1.0 g/L의 1,4-dioxane을 72시간 이내 완전히 분해하였다. 최근에 여러 가지 형태의 생물반응기에서 미생물을 이용한 1,4-dioxane의 분해 연구가 진행되어 왔다. Pugazhendi 등 [20]은 5 L의 교반 탱크 반응조에서 Rhodanobacter sp. AYS5를 이용하여 폐수에 포함된 약 260 mg/L의 1,4-dioxane를 약 5일 이내에 제거하였으며, Yamamoto 등 [15]은 1 L의 생물반응기에서 Pseudonocardia sp. D17을 이용한 1,4-dioxane의 분해 연구를 통해서 약 6 mg/L의 1,4-dioxane을 약 40시간 이내에 제거된다는 것을 발표하였다. 또한, Nam 등 [31]Phylum sp. TM7을 포함하는 미생물 컨소시엄이 접종된 2 L의 원통형 반응기에서 5일 동안 배양하여 약 180 mg/L의 1,4-dioxane을 약 20 mg/L로 분해하는 것을 확인하였다. 이들 연구에서 보여주는 바와 같이, 생물반응기를 이용한 1,4-dioxane의 미생물학적 처리가 보고되고 있으나, 300 mg/L 이하의 낮은 농도에서 진행되어 효율적인 1,4-dioxane의 처리에 부적절한 것으로 보인다. 그 이유는 (i) 1,4-dioxane에 대한 미생물의 분해능뿐만 아니라, (ii) 생물반응기의 여러 가지 운전 조건에 의한 문제인 것으로 보인다. 본 연구에서는 1,4-dioxane의 탁월한 분해능을 가진 사용된 S. granuli CK-4 [1]를 이용하여 여러 요인들의 비교 연구로 얻어진 최적의 결과를 조합시킨 생물반응기에서 1 g/L의 1,4-dioxane을 약 13.9 mg/L/h의 분해율로 완전 분해하는 것으로 확인되었다.


Fig. 7. 
Cell cultures of S. granuli CK-4 tested for its growth (○), pH (□), and residual 1,4-dioxane (●). The cells were grown on an AMS liquid medium containing 1 g/L 1,4-dioxane and 50 mg/L THF as a supplemental carbon source. Temperature, airflow rate, and agitation speed were set at 30oC, 2.5 L/min, and 500 rpm, respectively. The rates of 1,4-dioxane degradation over the incubation time course of this experiment were determined in bench-scale bioreactors. Error bars indicate the standard deviations of three replicates.

본 연구에서는 1,4-dioxane을 분해하는 CK-4를 산업적으로 적용하기 위해 벤치 규모의 생물반응기에서 다양한 운전 요인에 따른 생장과 1,4-dioxane의 분해 연구를 실시하여 효율적인 최적의 조건을 확인하였다. 얻어진 최적 조건을 생물 반응기에 적용한 CK-4 균주는 지금까지 보고된 미생물과 비교하여 우수한 1,4-dioxane 분해능을 가진다는 것이 입증되었으며, 이 결과를 토대로 하여, 산업폐수에서 1,4-dioxane의 미생물학적 처리에 대한 이용 가능성을 제시하였다. 향후 본 연구에서 얻어진 최적 조건을 바탕으로 1,4-dioxane이 포함된 산업 폐수를 벤치 규모의 생물반응기에 적용하기 위한 연구가 진행될 것이다.


4. CONCLUSION

이전 연구에서 산업폐수로부터 1,4-dioxane을 유일 탄소원 및 에너지원으로 이용할 수 있는 S. granuli CK-4를 분리하여 그 특성에 대하여 보고하였다 [1]. 본 연구에서는 3 L 벤치 규모의 생물반응기에서 CK-4 균주의 생장과 1,4-dioxane의 분해에 미치는 물리화학적 환경 요인들에 대하여 조사하였다. CK-4는 배양된 후, 96시간 이내에 1 g/L의 1,4-dioxane이 완전히 분해시켰으며, 분해의 최적온도는 30캜였다. CK-4에 의한 1,4-dioxane의 분해는 통기량과 교반 속도의 함수 관계에 따라 점차 증가하였으며, 최적의 공기 유동율과 교반 속도는 각각 2.5 L/min와 500 rpm이었다. THF을 첨가하였을 때, 첨가하지 않은 것과 비교하여 1,4-dioxane의 분해능은 향상되었으며, 50 mg/L의 THF에서 최고의 분해를 보여주었으며 그 이상의 농도에서는 점차 감소되었다. 생물반응기의 각 운전 요인 연구에서 얻어진 최적 조건을 종합하여 수행되었으며, 그 결과 CK-4는 배양 72시간 이내에 최대의 생장과 1 g/L의 1,4-dioxane의 완전히 분해를 보여주었다. 결론적으로 생물반응기에서 운전 요인의 최적화는 산업적으로 1,4-dioxane을 처리하기 위한 중요한 단서를 제공하며, 1,4-dioxane이 포함된 산업 폐수의 처리에 적용될 수 있다는 가능성을 확인하였다.


Acknowledgments

본 연구는 순천향대학교 학술연구비지원사업의 일부지원으로 수행되었음.


REFERENCES
1. Choi, M. S., K. S. Choi, and K. H. Oh (2021) Characterization of Shinella granuli CK-4, a novel bacterium isolated from industrial wastewater capable of degrading 1,4-dioxane. KSBB J. 36: 76-85.
2. Agency for toxic substances and disease registry, Toxicological profile for 1,4-dioxane. https://www.atsdr.cdc.gov/toxprofiledocs. (2012).
3. Popoola, A. V. (1991) Mechanism of the reaction involving the formation of dioxane by product during the production of poly(ethylene terephthalate). J. Appl. Polym. Sci. 43: 1875-1877.
4. Zenker, M. J., C. B. Robert, and A. B. Morton (2003) Occurrence and treatment of 1,4-dioxane in aqueous environments. Environ. Eng. Sci. 20: 423-432.
5. Johns, M. M., W. E. Marshall, and C.A. Toles (1998) Agricultural by-products as granular activated carbons for adsorbing dissolved metals and organics. J. Chem. Technol. Biotechnol. 71: 131-140.
6. Zenker, M. J., C. B. Robert, and A. B. Morton (2000) Mineralization of 1,4-dioxane in the presence of a structural analog. Biodegradation 11: 239-246.
7. Abe, A. (1999) Distribution of 1,4-dioxane in relation to possible sources in the water environment. Sci. Total Environ. 227: 41-47.
8. Yasuhara, A., H. Shiraishi, M. Nishikawa, T. Yamamoto, O. Nakasugi, T. Okumura, K. Kenmotsu, H. Fukui, M. Nagase, and Y. Kawagoshi (1999) Organic components in leachates from hazardous waste disposal sites. Waste Manage. Res. 17: 186-197
9. Sin, S. G. (2012) A study on the modeling and management of 1,4-dioxane in the water system of nakdong river. Busan Development Institute, Busan, Korea.
10. Han, T. H., J. S. Han, M. H. So, J. W. Seo, C. M. Ahn, D. H. Min, Y. S. Yoo, D. K. Cha, and C. G. Kim (2012) The removal of 1,4-dioxane from polyester manufacturing process wastewater using an up-flow biological aerated filter (UBAF) packed with tire chips. J. Environ. Sci. Health, Part A. 47: 117-129.
11. National Cancer Institute (1978) Bioassay of 1,4-dioxane for possible carcinogenicity. Technical Report Series No. 80 DHEW Publication No. (NIH) 78-1330 Bethesda, MD, USA.
12. Masuda, H., K. McClay, R. J. Steffan, and G. J. Zylstra (2012) Biodegradation of tetrahydrofuran and 1,4-dioxane by soluble diiron monooxygenase in Pseudonocardia sp. strain ENV478. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 22: 312-316.
13. Sei, K., K. Miyagaki, T. Kakinoki, K. Fukugasako, D. Inoue, and M. Ike (2013) Isolation and characterization of bacterial strains that have high ability to degrade 1,4-dioxane as a sole carbon and energy source. Biodegradation 24: 665-674.
14. Yamamoto, N., Y. Saito, D. Inoue, K. Sei, and M. Ike (2018) Characterization of newly isolated Pseudonocardia sp. N23 with high 1,4-dioxane-degrading ability. J. Biosci. Bioeng. 125: 552-558.
15. Yamamoto, N., D. Inoue, K. Sei, Y. Saito, and M. Ike (2018) Field test of on-site treatment of 1,4-dioxane-contaminated groundwater using Pseudonocardia sp. D17. J. Water Environ. Technol. 16: 256-268.
16. Kelley, S. L., E. W. Aitchison, M. Deshpande, J. L. Schnoor, and P. J. J. Alvarez (2001) Biodegradation of 1,4-dioxane in planted and unplanted soil: effect of bioaugmentation with Amycolata sp. CB1190. Water Res. 35: 3791-3800.
17. Kim, Y. M., J. R. Jeon, K. Murugesan, E. J. Kim, and Y. S. Chang (2009) Biodegradation of 1,4-dioxane and transformation of related cyclic compounds by a newly isolated Mycobacterium sp. PH-06. Biodegradation 20: 511-519.
18. Sun, B., K. Ko, and J. A. Ramsay (2011) Biodegradation of 1,4-dioxane by a Flavobacterium. Biodegradation 22: 651-659.
19. Inoue, D., T. Tsunoda, N. Yamamoto, M. Ike, and K. Sei (2018) 1,4-Dioxane degradation characteristics of Rhodococcus aetherivorans JCM 14343. Biodegradation 29: 301-310.
20. Pugazhendi, A., J. Rajesh Banu, J. Dhavamani, and I. T. Yeom (2015) Biodegradation of 1,4-dioxane by Rhodanobacter AYS5 and the role of additional substrates. Ann. Microbiol. 65: 2201-2208.
21. Isaka, K., M. Udagawa, Y. Kimura, K. Sei, and M. Ike (2016) Biological wastewater treatment of 1,4-dioxane using polyethylene glycol gel carriers entrapping Afipia sp. D1. J. Biosci. Bioeng. 121: 203-208.
22. Yabuki, Y., G. Yoshida, T. Daifuku, J. Ono, and A. Banno (2018) Biological treatment of 1,4-dioxane in wastewater from landfill by indigenous microbes attached to flowing carriers. J. Water Environ. Technol. 16: 245-255.
23. Yesilada, O., S. Sik, and M. Sam (1998) Biodegradation of olive mill wastewater by Coriolus versicolor and Funalia trogii: effects of agitation, initial COD concentration, inoculum size and immobilization. World J. Microbiol. Biotechnol. 14: 37-42.
24. Abboud, M. M., K. M. Khleifat, M. Batarseh, K. A. Tarawneh, A. Al-Mustafa, and M. Al-Madadhah (2007) Different optimization conditions required for enhancing the biodegradation of linear alkylbenzenesulfonate and sodium dodecyl sulfate surfactants by novel consortium of Acinetobacter calcoaceticus and Pantoea agglomerans. Enzyme Microbiol. Technol. 41: 432-439.
25. Shen, W., H. Chen, and S. Pan (2008) Anaerobic biodegradation of 1,4-dioxane by sludge enriched with iron-reducing microorganisms. Bioresour. Technol. 99: 2483-2487.
26. Ramalingam, V. and C. M. Alison (2020) Anaerobic 1,4-dioxane biodegradation and microbial community analysis in microcosms inoculated with soils or sediments and different electron acceptors. Appl. Microbiol. Biotechnol. 104: 4155-4170.
27. Choi, M. S., K. S. Choi, and K. H. Oh (2020) Effects of several physicochemical factors on the biodegradation of 1,4-dioxane by microbial consortium CDIK-3 enriched from industrial wastewater. J. KSEE 42: 381-392.
28. Scalia, S., M. Guarneri, and E. Menegatti (1990) Determination of 1,4-dioxane in cosmetic products by high-performance liquid chromatography. Analyst 115: 929-931.
29. Lee, K. H., Y. M. Wie, and Y. S. Lee (2020) Characterization of 1,4-dioxane biodegradation by a microbial community. Water 12: 3372.
30. Brown, D. M., L. Camenzuli, A. D. Redman, C. Hughes, N. Wang, E. Vaiopoulou, D. Saunders, A. Vilalobos, and S. Linington (2020) Is the Arrhenius-correction of biodegradation rates, as recommended through REACH guidance, fit for environmentally relevant condition? an example from petroleum biodegradation in environmental systems. Sci. Total Environ. 732: 139293.
31. Nam, J. H., J. S. Ventura, I. T. Yeom, Y. Lee, and D. Jahng (2016) Structural and kinetic characteristics of 1,4-dioxane-degrading bacterial consortia containing the Phylum TM7. J. Microbiol. Biotechnol. 26: 1951-1964.