The Korean Society For Biotechnology And Bioengineering

Current Issues

Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 32 , No. 2

[ Research Paper ]
Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 32, No. 2, pp.90-95
ISSN: 1225-7117 (Print) 2288-8268 (Online)
Print publication date 30 Jun 2017
Received 16 Mar 2016 Revised 01 Oct 2016 Accepted 04 May 2017
DOI: https://doi.org/10.7841/ksbbj.2017.32.2.90

CHO 세포 배양을 통한 Recombinant Human Erythropoietin의 생산에서 저혈청 배지와 배양 첨가물질이 미치는 영향
이경선 ; 차현명 ; 임진혁 ; 김동일*
인하대학교 공과대학 생물공학과

Effects of Low-Serum Medium and Various Culture Additives on Production of Recombinant Human Erythropoietin in CHO Cell Cultures
Kyung-Sun Lee ; Hyun-Myoung Cha ; Jin-Hyuk Lim ; Dong-Il Kim*
Department of Biological Engineering, Inha University, Incheon 22212, Korea, Tel: +82-32-860-7515, Fax: +82-32-872-4046 (kimdi@inha.ac.kr)
Correspondence to : *Department of Biological Engineering, Inha University, Incheon 22212, Korea Tel: +82-32-860-7515, Fax: +82-32-872-4046 e-mail: kimdi@inha.ac.kr


© 2017 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering
Funding Information ▼

Abstract

Mammalian cell cultures have been used extensively to produce proteins for therapeutic agent because of their ability to perform post-translational modification including glycosylation. To produce recombinant protein, many factors and parameter are considered such as media composition, host cell type, and culture process. In this study, recombinant human erythropoietin (rhEPO) producing cell line was established by using glutamine synthetase system. To reduce serum concentration in media, we compared direct adaptation with step adaptation. Cell growth was faster in step adaptation. In low-level serum media, there were insufficient glucose for cell growth. Thus, we added glucose in low-level serum media from 2 g/L to 4.5 g/L. Titer of rhEPO was higher than other conditions at 4.5 g/L of glucose. Additionally, N-methyl-D-aspartate (NMDA), 13-cis-retinal, and pluronic F-68 (PF-68) were added to enhance productivity in CHO cell cultures. In conclusion, we applied CHO cell producing rhEPO to low-level of serum in media using step-adaptation. Also, we confirmed positive effect of NMDA, 13-cis-retinal, and PF-68.


Keywords: CHO cell culture, Erythropoietin, Glutamine synthetase, Low-serum media

1. INTRODUCTION

치료제나 백신으로 사용되는 생리활성 유용물질을 대량으로 생산하기 위해서는 유전자 조작기술의 이용으로 미생물이나 동물세포 또는 식물세포를 대량 배양하여 얻는 방법이 있다. 특히, 생산하려는 단백질에 결합되어 있는 당쇄가 활성 및 안정성에 관여하는 당단백질의 경우에는 동물세포 배양을 통하여 목적 단백질을 생산한다 [1]. 그러나 동물세포는 일반적으로 미생물에 비해 단백질의 생산성이 낮고 성장 속도가 느린 단점이 있으며 부착성을 가지고 있기 때문에 부유식 배양(suspension culture)이 어렵다. 이러한 동물세포 중 Chinese hamster ovary (CHO) 세포는 고유의 유전자 증폭 시스템을 이용할 수 있고, 대량 배양이 가능하여 현재까지 산업적으로 여러 종류의 당단백질 생산을 위한 세포주로 사용되고 있다 [2,3]. 또한, 대부분의 동물세포 배양에서는 주로 혈청이 포함된 배지를 사용하고 있지만 혈청이 포함된 배지는 화학적으로 성분이 명확하지 않은 복합 구성물이므로 단백질의 생산에 적합한 배지를 설계하는데 어려움이 따른다 [4,5]. 혈청을 사용할 때는 비용이나 재현성 확보의 문제뿐만 아니라 분리 및 정제에도 부정적인 영향을 줄 수 있기 때문에 무혈청 배지나 저혈청 배지의 개발이 중요하다.

Recombinant human erythropoietin (rhEPO)는 인간의 신장에서 생성되어 분비되며 분자량이 약 35 kDa으로 아미노산 165개로 구성된 당단백질 호르몬이다. rhEPO는 3개의 N-결합형 당쇄와 1개의 O-결합형 당쇄를 지니고 있고, 말단의 시알산 (sialic acid)이 효능에 중요한 역할을 한다 [6]. 전체 분자량의 약 50% 정도가 당쇄로 이루어진 rhEPO는 인간과 유사한 당쇄 구조 형성이 가능한 CHO 세포를 이용하여 주로 생산한다. CHO 세포에서 생산되는 rhEPO는 2012년 미국에서 약 1.9조원의 매출을 가지는 블록버스터 의약품이다. 또한 rhEPO의 변형을 통한 바이오베터 제품들도 높은 판매량을 보이고 있다. 따라서 CHO 세포에서 rhEPO의 생산성을 향상 시키기 위한 연구가 필수적이며 최근에는 세포 배양 시 배지조성을 다르게 하거나 첨가물을 이용하는 방법, 또는 온도나 pH 등의 배양 조건을 변화시켜 rhEPO의 생산성을 증대시키고자 하는 연구가 활발히 진행되어 왔으며, 생산한 EPO의 품질을 향상시키기 위해 glycosylation과 관련된 효소를 과발현시키는 방법도 보고되었다 [7]. 특히, 세포 배양 시 온도나 pH 등을 변화시키는 것은 간단하게 수행이 가능하여 다양한 연구가 진행되었다. 일반적으로 세포 배양 시 온도는 37°C로 유지되는데, 온도를 33°C로 낮추어서 배양을 진행하는 경우 세포의 생존도가 보다 높게 유지되었으며 그 결과로 EPO 생산량이 최대 2.5배까지 증가하였다 [8]. 또한, 온도를 32.5°C, pH를 7.0로 배양 조건을 유지하였을 때는 EPO 생산량이 최대 3배까지 증가하는 결과를 보였다 [9].

배양 조건을 변화시키는 방법 이외에 다양한 첨가물을 이용하여 목적 단백질의 생산성을 높이는 방법도 연구되었으며, 동물세포 배양에서 세포 내 glutamine synthetase를 증가시키기 위하여 N-methyl-D-aspartate (NMDA)와 a-tocopherol을 첨가하였다 [10]. Retinoic acid (RA)는 세포 내에서 항산화제 역할을 한다는 것이 알려져 있으며 항체의 생산성을 증가시키는 것으로 보고되었다 [11]. Sakai 등의 연구에 의하면 L-a-lysophosphatidic acid (LPA)와 L-a-phosphatidic acid (PA)는 성장인자 (growth factor)에 의해서 일어나는 신호전달 과정에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다 [12]. LPA는 G protein-coupled 수용체의 활성에 영향을 주기도 하며 배양 중 LPA 혹은 PA를 첨가하게 되면 세포의 성장과 목적 단백질의 발현을 향상시킬 수 있다. 또한, pluronic F-68 (PF-68)은 비이온성 계면활성제로 동물세포 배양에서 shear stress를 줄이기 위해서 사용하는 고분자이고, 세포막의 fluidity를 변화시켜 세포의 물질전달에도 영향을 미친다 [13,14].

본 연구에서는 재조합 rhEPO를 생산하는 CHO 세포를 direct adaptation과 step adaptation의 방법을 이용하여 저혈청 배지에 적응시키고 비교하였으며 저혈청 배지로 적응시킨 세포의 성장과 단백질의 생산성을 증진시키기 위하여 탄소원인 glucose 첨가 농도를 조절하였다. 또한, 단백질 생산성을 증진시킬 수 있는 여러 물질을 각각 농도별로 처리하여 CHO 세포의 성장과 rhEPO의 생산성에 미치는 영향을 확인하였다.


2. MATERIALS AND METHODS
2.1. 세포 배양

본 연구에서 사용한 세포주는 목적 단백질인 EPO를 생산하도록 형질전환된 CHO 세포이다. EPO의 유전자와 glutamine synthetase (GS) 유전자가 함께 coding된 vector를 이용하였다. Vector를 GS-deficient CHO 세포주에 도입한 후, GS/MSX 유전자 증폭법을 사용하였다. 안정화된 세포주를 선별한 후 glutamine이 포함되지 않은 IMDM 배지 (Sigma, MO, USA)에 10% dialysed fetal bovine serum (FBS; Invitrogen, CA, USA)과 glutamine synthetase expression medium supplement (Sigma), 100 μM의 methionine sulphoximine (MSX; Sigma)을 첨가하여 T-flask (SPL Life science, Seoul, Korea)에서 배양하였다. 계대배양은 4일 간격으로 수행하였으며 trypan blue dye (sigma)와 hemocytometer를 이용하여 세포수를 측정하였다.

2.2. 저혈청 배지로 step adaptation

10% FBS가 포함된 배지에서 유지된 세포주를 단계적으로 저혈청 배지로 적응시켰다. 실험에 사용된 저혈청 배지는 CHO-S-SFM II (Invitrogen)를 기본배지로 사용하였고 5%, 3%, 1%로 혈청 농도를 단계적으로 낮추어 사용하였다. 모든 저혈청 배지에는 10μM 농도의 MSX를 첨가하여 사용하여 T-flask에서 배양하였다. 또한, 저혈청 배지에서는 탄소원으로 사용되는 glucose 농도가 낮기 때문에 배지에 추가적으로 glucose를 2 g/L, 3.15 g/L, 4.5 g/L의 농도로 처리하여 세포 증식 및 생산성을 확인하였다.

2.3. 배양 첨가물

단백질 생산성을 높이는 방법으로 다양한 물질을 세포 배양 시 첨가하였다. 세포 내 glutamine synthetase를 증가시킨다고 알려진 NMDA를 0 μM, 50 μM, 100 μM, 150 μM, 200 μM, 250 μM의 농도로 첨가하였다. 또한, 항체의 생산성을 증가시키는 것으로 알려진 RA를 10 nM, 100 nM, 1000 nM로 처리하였고, 세포 성장 및 목적 단백질 생산을 늘릴 수 있는 LPA와 PA를 0 mg/L, 5 mg/L, 10 mg/L, 15 mg/L, 20 mg/L, 25 mg/L의 농도로 처리하였다. Shear stress의 감소를 통하여 생산성을 높일 수 있는 PF-68을 0 mg/L, 5 mg/L, 10 mg/L, 15 mg/L, 20 mg/L, 25 mg/L의 농도로 각각 첨가하여 세포 성장 및 생산성에 미치는 영향을 확인하였다.

2.4. rhEPO 생산량 측정

rhEPO의 생산량은 indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 방법을 이용하여 측정하였다. ELISA는 96-well assay plate (Nunc, NY, USA)에서 수행하였으며 각 well에 시료를 4oC에서 반응시켜 부착시키고, 0.1% Tween-20이 포함된 washing buffer로 충분히 세척하였다. 그 후, 2% FBS가 포함된 blocking buffer에 1 : 100으로 rhEPO와 결합하는 1차 항체 (KPL, MD, USA)를 희석하여 37oC에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후에는 peroxidase가 표지된 2차 항체(KPL)를 1:1000으로 희석하여 37oC에서 1시간 동안 반응 후 TMB substrate (KPL)를 첨가하여 10분 동안 발색하고, Microplate reader (Bio-Rad, CA, USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 또한, EPO의 specific productivity는 아래와 같은 수식을 이용하여 계산하였다.

Specific productivity ng/106 cells/days=EPO2V2-EPO1V1t1t2XVdt(1) 

식 (1)에서 t는 시료를 채취한 시기 (day), EPO1V1EPO2V2는 각각 t1t2에서 생산성, XV는 총 세포수를 의미한다.

2.5. 통계처리

실험으로부터 얻은 결과는 평균값 ± 표준편차로 표시하였으며 그래프는 Sigmaplot (Systat Software Inc., CA, USA)을 이용하여 나타내었다.


3. RESULTS AND DISCUSSION
3.1. CHO 세포 배양에서 저혈청 배지 환경 조성

rhEPO를 발현하는 CHO 세포의 배양에서 혈청 농도를 1%로 낮춘 저혈청 배지를 사용하여 세포의 성장을 확인하였다. 급속도로 배지 내 혈청 농도를 낮추는 것은 세포 성장을 저해하기 때문에 저혈청 배지에서 세포를 배양하기 위해서는 점차적으로 배지 내의 혈청 농도를 낮추는 것이 필요하다. 이를 확인하기 위하여 계대배양을 진행하면서 혈청 농도를 1%로 급격히 낮춘 direct adaptation 방법과 3일차부터 3% 혈청 농도로 배양하고 6일차에서 1% 혈청으로 적응시킨 step adaptation 방법을 비교하였다. 그 결과, 계대배양을 한 번 진행한 6일차에는 공통적으로 배지 내의 혈청 농도가 줄어듦에 따라 3일차보다 낮은 세포 성장을 보인 반면 한 번의 계대배양을 더 수행한 후 9일차에는 6일차에 비해 세포 성장이 눈에 띄게 증가하였으며 direct adaptation 방법보다 step adaptation의 방법을 이용한 경우가 높은 세포 성장률을 보였다 (Fig. 1). 이는 혈청 내에 존재하는 여러 가지 성장 조절인자가 단계적으로 감소하여 세포가 저혈청 배양 환경에 안정적으로 적응하였기 때문이다. 또한, 배양 3일차와 6일차의 세포수보다 9일차의 세포수가 급격하게 늘어난 것을 확인하였는데, 이는 10% FBS가 포함된 IMDM 배지에서 1% FBS가 포함된 CHO-S-SFM II 배지로 교환하면서 배지 내의 혈청 이외에 다른 성분의 농도가 달라졌기 때문인 것으로 사료된다.


Fig. 1. 
Comparison of cell density in adaptation to serum-free media. In direct adaptation (●), serum percentage corresponds to culture passages as follows: 5% (day 0 to 3) and 1% (day 3-9). In step adaptation (○), serum percentage corresponds to culture passages as follows: 5% (day 0 to 3), 3% (day 3-6) and 1% (day 6-9).

3.2. 저혈청 배지에서의 세포 성장과 rhEPO의 생산량 확인

낮은 혈청 농도에서도 세포의 부착성과 생존이 유지된 step adaptation 방법으로 저혈청 배양 조건을 확립하고 배양 중 세포 성장과 rhEPO의 생산량을 확인하였다. 세포의 성장은 배양 3일차에 매우 높은 수준까지 증가하였지만 배양 4일차가 되면서 세포의 수가 급격히 감소하는 것으로 관찰되었다 (Fig. 2a). 이는 세포의 수가 증가하면서 배지 내 영양소의 급격한 감소와 더불어 배양 용기의 면적 제한으로 세포의 증식에 부정적인 영향을 주었을 것으로 사료된다. 저혈청 배지에서 CHO 세포의 rhEPO 생산량은 세포의 증식률이 높아지기 시작한 배양 1일차에 급격히 증가하여 높은 생산량이 유지되었다 (Fig. 2b). 일반적으로 glutamine은 세포 내에서 redox potential을 조절하고 단백질의 합성에 영향을 준다 [10]. 그러므로 배지 내에 glutamine이 존재하지 않게 되면 glutamine synthetase (GS)-MSX 증폭 시스템에 의해서 세포는 GS 유전자를 활성화하여 glutamine을 빠른 속도로 합성하게 되고 GS 유전자의 증폭과 동시에 목적 단백질인 rhEPO의 발현이 증가한다 [10,15]. 본 연구에서는 glutamine이 포함되지 않은 IMDM 배지를 이용하였으며 배양 초기에 세포가 성장하면서 필요한 glutamine을 합성하는 과정이 일어남과 동시에 목적 단백질인 EPO의 생산량이 급격하게 증대된 것으로 사료된다 (Fig. 2b).


Fig. 2. 
Analysis of (a) cell density and (b) titer of rhEPO in low-serum media.

3.3. 저혈청 배지에서 탄소원 농도 결정

무혈청 배지에서는 탄소원인 glucose 농도가 현저히 낮기 때문에 세포의 성장을 유지하고 높은 농도의 목적 단백질을 생산하기 위해서는 배지에 추가적으로 glucose를 첨가하여야 한다. 본 실험에서는 다른 농도의 glucose를 CHO 세포 배양에 첨가하여 세포 증식과 생산성을 확인하였다. 2g/L의 glucose를 첨가한 경우가 배양 3일차에 세포 농도가 가장 높았으며 3.15 g/L의 glucose를 첨가한 경우에는 다른 조건과 달리 배양 4일차에 가장 높은 증식률을 나타내었다 (Fig. 3a). rhEPO의 비생산성 (specific productivity)은 4.5g/L의 glucose를 첨가한 경우가 2 g/L의 glucose를 첨가한 것에 비해 1.58배 높았다(Fig. 3b). 이 결과를 바탕으로 4.5g/L의 glucose 농도에서 세포의 성장이 유지되고, 높은 비생산성을 나타내어 효율적인 rh EPO 생산이 가능한 것을 확인하였다. 최종적으로, 1% 혈청이 포함된 저혈청 배지에 CHO 세포를 적응시키고 탄소원인 glucose 농도를 4.5g/L로 유지하여 배양 조건을 확립하였다.


Fig. 3. 
Comparison of glucose concentration on (a) cell density and (b) specific rhEPO productivity in CHO cell culture. Cell cultures were initiated in a medium with 2 g/L glucose, 3.15 g/L glucose, and 4.5 g/L glucose, respectively.

3.4. 생산성 증진을 위한 배지 첨가물의 영향 확인

확립된 저혈청 배지 조건에서 rhEPO의 생산을 극대화하기 위하여 단백질 생산성을 증진시키는 여러 물질을 배양 중에 첨가하였다. 먼저 NMDA를 첨가한 경우 목적 단백질의 생산은 증진되었다 (Fig. 4a). 특히, 150 μM의 NMDA를 첨가한 경우에서 1.6배 생산량이 증가하였고, 비생산성은 1.9배 향상되었다 (Fig. 4b). 이는 NMDA의 처리로 인해 GS 활성이 증가하여 GS-MSX 증폭 시스템의 효율이 높아진 것으로 사료된다.


Fig. 4. 
Effects of NMDA on (a) cell density, titer, and (b) specific productivity in CHO cell culture.

다음으로 rhEPO의 생산성을 높이기 위해 retinoid 계열 물질인 13-cis-retinal과 All-trans-retinoic acid, All-trans-retinol을 농도별로 첨가한 후 배양 3일차에 세포의 성장과 생산성에 미치는 영향을 확인하였다. 100 nM의 13-cis-retinal을 첨가한 경우에 세포 성장이 가장 높았으며 다른 종류의 retinoid 계열의 물질을 처리했을 때는 유사한 결과를 보였다 (Fig. 5a). rhEPO의 생산량도 13-cis-retinal을 100 nM 처리한 배양조건에서 가장 높았지만 농도가 더 높아지면 부정적인 영향을 주었다 (Fig. 5b). 반면에, All-trans-Retinoic acid와 All-trans-Retinol의 두 가지 trans- 형태의 retinoid를 첨가한 경우 10 nM 처리한 배양 조건에서 가장 높은 rhEPO 생산량을 보였고, 처리 농도가 높아지면서 부정적인 영향을 보였다 (Fig. 5b). Retinoid 계열의 물질들이 단백질의 생산을 증가시키는 기작은 자세히 알려져 있지 않지만 그 기작에 대한 가설이 제시된 바 있다 [11]. 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 retinoid response element가 특정 프로모터 내에 존재하는데 이 부위에는 retinoid receptor (RAR)가 존재한다고 알려져 있다. 그러므로 retinoid 계열의 물질이 존재하게 되면 RAR에 결합하게 되어 프로모터가 활성화되고, 결과적으로 단백질의 합성이 증가한다 [11]. 하지만 trans- 형태의 retinoid의 경우 nitric oxide synthesis 등의 다양한 기작에 관여하며 이로 인하여 첨가 농도가 높아짐에 따른 목적 단백질의 생산량이 감소할 수 있다 [16,17].

마지막으로 본 실험에서는 PA와 PF-68을 각각 농도별로 첨가하여, 세포의 성장과 rhEPO 생산량의 변화를 관찰하였다. 배양 3일차에 세포의 성장을 확인하였을 때 PA의 경우는 5 mg/L의 농도에서 가장 높은 세포 농도를 나타내었으며 이보다 높은 농도에서는 세포 성장이 저해되는 결과를 나타냈다. 반면에 PF-68을 첨가한 경우에는 모든 농도에서 증식이 감소되었다 (Fig. 6a). PA를 배양 중 첨가하면 세포의 성장과 목적 단백질의 합성을 증가시킨다고 알려져 있으나 25 mg/L의 PA를 처리한 경우를 제외하고는 모든 농도에서 생산량이 감소하였다. 배양 중 첨가한 PF-68은 20 mg/L 농도에서 rhEPO의 생산을 1.4배 증가시켰다 (Fig. 6b). 이는 PF-68이 세포막의 fluidity를 변화시켜 생산된 목적 단백질이 배지 내로 분비 (secretion) 되는 양이 증가된 것으로 사료된다. 또한, 두 물질을 각각 첨가하였을 때 특정 농도에서만 긍정적인 효과를 얻은 것으로 미뤄보아 첨가 농도를 결정하는 것이 매우 중요한 요인임을 알 수 있다.


Fig. 5. 
Effect of different type of retinoid on (a) cell density and (b) titer of EPO. The amounts of supplements added range from 10 to 1000 nM. Cell cultures were performed with 13-cis-retinal (●), All-trans-retinoic acid (○) and All-trans-retinol (▼).


Fig. 6. 
Comparison of PA and PF-68 on (a) cell density and (b) specific productivity in CHO cell cultures. The amounts of PA and PF-68 added range from 0 to 25 mg/L.


4. CONCLUSION

본 연구에서는 rhEPO를 생산하는 CHO 세포를 저혈청 배지에 적응시키고, 여러 첨가물을 배지에 처리하여 목적 단백질의 생산성을 향상시켰다. 1% 농도까지 혈청을 단계적으로 낮춘 step-adaptation 방법을 이용하여 효과적으로 세포를 적응시켰고, 탄소원으로 4.5 g/L의 glucose를 첨가하여 저혈청 배지에서 고농도 배양 방법을 확립하였다. 또한, 저혈청 배지에 단백질의 생산성을 증진시키는 첨가물을 처리하여 rhEPO의 생산에 미치는 영향을 확인하였다. NMDA를 첨가하였을 때는 모든 농도에서 생산성이 증가하였고, retinoid 계열의 물질을 첨가한 경우에는 100 nM의 13-cis-retinal을 처리한 조건에서만 높은 생산성을 보였다. 마지막으로, PA와 PF-68을 각각 다른 농도로 배지에 처리하여 생산성 증진에 효과적인 농도를 선별하였다. 현재 CHO 세포는 부유식 배양을 통해 상업적으로 치료용 단백질을 생산하고 있는 반면, rhEPO의 생산은 대부분 부착식 배양으로 roller bottle 시스템을 이용하고 있다. 세포의 부착을 유도하기 위하여 동물세포 배양에서는 혈청이 포함된 배지를 사용하지만 안전성을 포함한 여러 문제가 발생되기 때문에 저혈청 및 무혈청 배지의 개발이 요구된다. 따라서 저혈청 배지를 이용한 배양공정 확립과 생산성을 높여주는 효과적인 첨가물을 선별한 연구는 rhEPO의 생산에서 경제성을 높이는데 기여될 것으로 사료된다.


Acknowledgments

본 연구는 정부 (미래창조과학부)의 재원으로 한국연구재단 바이오 · 의료기술개발사업 (No. NRF-2013M3A9B6075887)으로 수행되었으며 이에 감사드립니다.


References
1. Yang, M., and M. Butler, (2000), Effects of ammonia on CHO cell growth, erythropoietin production, and glycosylation, Biotechnol. Bioeng, 68, p370-380.
2. Spier, R. E., (1980), Recent developments in the large scale cultivation of animal cells in monolayers, Adv. Biochem. Eng, 14, p119-162.
3. Merk, W. A., (1981), Large-scale production of human fibroblast interferon in cellfermenters, Dev. Biol. Stand, 50, p137-140.
4. Zhang, H., H. Wang, M. Liu, T. Zhang, J. Zhang, X. Wang, and W. Xiang, (2013), Rational development of a serum-free medium and fed-batch process for a GS-CHO cell line expressing recombinant antibody, Cytotechnology, 65, p363-378.
5. Kim, S. H., and G. M. Lee, (2009), Development of serum-free medium supplemented with hydrolysates for the production of therapeutic antibodies in CHO cell cultures using design of experiments, Appl. Microbiol. Biotechnol, 83, p639-648.
6. Gandor, C., C. Leist, A. Fiechter, and F. A. Asselbergs, (1995), Amplification and expression of recombinant genes in serum-independent Chinese hamster ovary cells, FEBS Lett, 377, p290-294.
7. Cruz, H. J., J. L. Moreira, G. Stacey, E. M. Dias, K. Hayes, D. Looby, B. Griffiths, and M. J. Carrondo, (1998), Adaptation of BHK cells producing a recombinant protein to serum-free media and proteinfree medium, Cytotechnology, 26, p59-64.
8. Byrne, B., G. G. Donohoe, and R. O’Kennedy, (2007), Sialic acids: Carbohydrate moieties that influence the biological and physical properties of biopharmaceutical proteins and living cells, Drug Discov. Today, 12, p319-326.
9. Lee, J. S., T. K. Ha, S. J. Lee, and G. M. Lee, (2012), Current state and perspectives on erythropoietin production, Appl. Microbiol. Biotechnol, 95, p1405-1416.
10. Yoon, S. K., J. Y. Song, and G. M. Lee, (2003), Effect of low culture temperature on specific productivity, transcription level, and heterogeneity of erythropoietin in Chinese hamster ovary cells, Biotechnol. Bioeng, 82, p289-298.
11. Yoon, S. K., S. L. Choi, J. Y. Song, and G. M. Lee, (2005), Effect of culture pH on erythropoietin production by Chinese hamster ovary cells grown in suspension at 32.5°C and 37.0°C, Biotechnol. Bioeng, 89, p345-356.
12. Matés, J. M., C. Pérez-Gómez, I. N. de Castro, M. Asenjo, and J. Márquez, (2002), Glutamine and its relationship with intracellular redox status, oxidative stress and cell proliferation/death, Int. J. Biochem. Cell Biol, 34, p439-458.
13. Inoue, Y., M. Fujisawa, M. Shoji, S. Hashizume, Y. Katakura, and S. Shirahata, (2000), Enhanced antibody production of human-human hybridomas by retinoic acid, Cytotechnology, 33, p83-88.
14. Sakai, K., T. Matsunaga, C. Hayashi, H. Yamaji, and H. Fukuda, (2002), Effects of phosphatidic acid on recombinant protein production by Chinese hamster ovary cells in serum-free culture, Biochem. Eng. J, 10, p85-92.
15. Ghebeh, H., A. Handa-Corrigan, and M. Butler, (1998), Development of an assay for the measurement of the surfactant pluronic F-68 in mammalian cell culture medium, Anal. Biochem, 262, p39-44.
16. Palomares, L. A., M. González, and O. T. Ramírez, (2000), Evidence of Pluronic F-68 direct interaction with insect cells: Impact on shear protection, recombinant protein, and baculovirus production, Enzyme Microb. Technol, 26, p324-331.
17. Lieth, E., K. F. LaNoue, D. A. Berkich, B. Xu, M. Ratz, C. Taylor, and S. M. Hutson, (2001), Nitrogen shuttling between neurons and glial cells during glutamine synthesis, J. Neurochem, 76, p1712-1723.
18. Achan, V., C. T. Tran, F. Arrigoni, G. S. J. Whitley, J. M. Leiper, and P. Vallance, (2002), All-trans-Retinoic Acid increases nitric oxide synthesis by endothelial cells a role for the induction of dimethylarginine dimethylaminohydrolase, Circ. Res, 90, p764-769.
19. Mehta, K. A. P. I. L., T. McQueen, S. Tucker, R. Pandita, and B. B. Aggarwal, (1994), Inhibition by all-trans-retinoic acid of tumor necrosis factor and nitric oxide production by peritoneal macrophages, J. Leukoc. Biol, 55, p336-342.