The Korean Society For Biotechnology And Bioengineering

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Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 32 , No. 3

[ Research Paper ]
Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 32, No. 2, pp.96-102
ISSN: 1225-7117 (Print) 2288-8268 (Online)
Print publication date 30 Jun 2017
Received 27 Mar 2017 Revised 10 May 2017 Accepted 15 May 2017
DOI: https://doi.org/10.7841/ksbbj.2017.32.2.96

Phanerochaete chrysosporium의 고상발효를 통한 리그노셀룰로오즈 분해 및 당화
Romualdus N. C.Utomo ; 이은광 ; 윤현식*
인하대학교 생명공학과

Solid State Fermentation of Phanerochaete chrysosporium for Degradation and Saccharification of Lignocellulose
Romualdus N. C. Utomo ; Eun-Kwang Lee, ; Hyun Shik Yun*
1Department of Biological Engineering, Inha University, Incheon 22212, Korea, Tel: +82-32-860-7517, Fax: +82-32-872-4046 (hyunshik@inha.ac.kr)
Correspondence to : *Department of Biological Engineering, Inha University, Incheon 22212, Korea Tel: +82-32-860-7517, Fax: +82-32-872-4046 e-mail: hyunshik@inha.ac.kr


© 2017 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering

Abstract

The lignocellulose that is a major component of spent coffee ground was degraded and saccharified. To implement the spent coffee, after several pre-treatments, inoculation of Phanerochaete chrysosporium and solid-state fermentation were conducted. The optimal temperature of the enzymes (lignin peroxidase, manganese peroxidase, xylanase, laccase, and cellulase) for degradation of lignocellulose by P. chrysosporium was found. We also measured the maximum activity of enzymes (lignin peroxidase 0.15 IU/mL, manganese peroxidase 0.90 IU/mL, laccase 0.11 IU/mL, cellulase 5.87 IU/mL, carboxymethyl cellulase 9.52 IU/mL, xylanase 1.16 IU/mL) used for the process. As a result, 4.73 mg/mL of reduced sugar was obtained and 61.02% of lignin was degraded by solid state fermentation of P. chrysosporium on spent coffee medium.


Keywords: Biomass, Spent coffee, Lignocellulose degradation, Lignin degradation, Phanerochaete chrysosporium

1. INTRODUCTION

최근 커피의 수요가 높아짐에 따라 이용하고 남은 커피찌꺼기의 양은 대략 6,000,000톤으로 추산되며, 계속해서 증가하는 추세이다 [1]. 커피찌꺼기의 주성분인 리그노셀룰로오즈 (lignocellulose) 는 자연상태에서 바이오매스 중 풍부한 양을 지니며 (60-80%), 재사용 가능한 자원이다 [2]. 커피찌꺼기 안의 리그노셀룰로오즈 성분을 이용하여 배양 가능한 당을 생산하기 위한 전처리는 필수적이며 [3], 이는 미세섬유의 결정을 약하게 하여 셀룰로오즈와 헤미셀룰로오즈의 다량체 사슬 구조를 변성시키는 역할을 한다 [4]. 전처리 방법에는 물리학적, 화학적, 생물학적 처리 방법이 있다.

물리학적 전처리 방법으로는 기계적인 분쇄방법과 300oC 이상의 온도에서 처리하는 열분해 방법이 존재한다. 화학적 방법으론 오존 분해, 산 가수분해, 알칼리 가수분해, 산화분해 등의 방법이 존재한다. 반면, 생물학적 전처리는 적은 양의 에너지를 필요로 하기 때문에 효율적이고, 많은 양의 슬러지를 생산하지 않는 점에서 친환경적이다 [5]. P. chrysosporium는 담자균류이며, 리그닌 퍼옥시다아제 (Lignin peroxidase, LiP), 망간 퍼옥시다아제 (Manganase peroxidase, MnP), 라카아제 (Laccase), 셀룰라아제 (Cellulase), 자일라나아제 (Xylanase) 가 존재한다 [6]. P. chrysosporium는 리그노셀룰로오즈를 분해하고, 빠른 성장을 보여 본 연구에 적합한 전처리 균주로 사용하였다 [7].

P. chrysosporium에 존재하는 리그닌 퍼옥시다아제는 세포 외 헴 단백질로 P. chrysosporium에서 분비되는 효소로 알려져 있다 [8]. 이 효소는 페놀이 결합되지 않은 리그닌 단위체를 분해하고 [6], 지방족 곁사슬과 방향족이 핵을 이루는 리그닌을 양이온 라디칼로 산화시켜 분해한다 [9]. 다른 효소인 망간 퍼옥시다아제는 Mn (II), 수소이온과 과산화수소를 Mn (III) 와 물분자로 변환시키는 역할을 하는 것으로 알려져 있는데 Mn3+를 산화제로 생산해 내어 페놀류와 비페놀류의 리그닌 단위체를 산화시킨다 [6]. 망간 퍼옥시다아제, 리그닌 퍼옥시다아제는 리그닌 생분해를 위해 필요하며, 둘다 과산화수소가 관여한다 [10]. 또한 라카아제는 구리 산화제 효소로 많은 식물들과 일부 미생물에 의해 생산되고, ABTS와 같이 페놀류의 리그닌을 산화한다 [11]. 셀룰라아제는 셀룰로오즈를 단당류로 가수분해하며 [12] 자일라나제는 헤미셀룰로오즈 중 β-1,4-D-자일란을 가수분해하고 자일로즈와 반응시켜 자일로비오스 또는 자일로트리오스 자일로올리고당을 생성을 촉진하는 효소로 알려져 있다 [13].

본 연구에서 P. chrysosporium 균주를 커피찌꺼기에서 배양하여 효소 생산량과, 그 각각의 효소들의 활성도를 측정하였다. 온도 변화에 따른 균사 성장 속도 및 리그닌 분해도의 변화를 관찰하고, 리그노셀룰로오즈를 분해 및 당화하여 배지로 사용가능성을 확인하였다.


2. MATERIALS AND METHOD
2.1. 균주 및 배지

Phanerochaete chrysosoporium (ATCC 24725) 균주는 KCTC (Korean Collection for Type Culture) 생물지원센터에서 구입하였다. 이 균주는 0.5 %의 효모추출물이 들어간 감자한천배지 (Potato dextrose agar medium) 에서 보관하였고, 7 일 동안 30oC에서 호기 상태로 배양하였다.

커피찌꺼기는 커피전문점에서 공급받았으며, 초저온 냉장고에서 -70oC에서 하루간 냉동 후, 동결건조하였다. 5 g의 커피찌꺼기를 8 mL의 증류수에 녹인 후 121oC에서 15분 동안 멸균시켰다. 고상배양을 위해 7일동안 한천겔에서 배양한 P. chrysosporium 한천겔 조각 (8×8 mm2) 을 삼각플라스크 (500 mL)에 접종하였다. 이후 30oC의 호기상태에서 배양하고 3일 간격으로 21일간 샘플링하였다.

2.2. 효소 활성분석

P. chrysosporium 균주에 존재하는 리그닌 퍼옥시다아제, 망간 퍼옥시다아제, 라카아제, 셀룰라아제, 카르복시메틸 셀룰라아제, 자일란나아제의 활성도를 각각에 정해진 방법에 따라 주어진 온도 (20oC, 30oC, 40oC) 에서 분석했다. 효소를 추출한 방법은 정해진 배양 종료시점에 증류수 20 mL를 배양된 고상배지에 첨가 후, 120 rpm으로 30분 동안 혼합하였다.이후 원심분리기로 5000 rpm으로 10분 간 분리하고 그 상층액을 0.2 μm 주사기 필터로 (Minisart RC 4 Sartorius, Germany) 여과하였다. 여과액의 효소는 이후 효소분석 실험 및 단백질분석에 사용되었다.

리그닌 퍼옥시다아제 활성분석은 Tien과 Kirk방법을 이용하였다 [14]. pH 2.5인 타르타르산 (Sigma-Aldrich, USA) 125 mM 저장액 A와, 40 mM의 베라티릴 알코올 저장액 B, 그리고 8 mM의 과산화수소 (Junsei, Japan) 저장액 C를 제조하고, 50번의 분석을 위해, 20 mL의 저장액 A와 2.5 mL의 저장액 B, 그리고 2.5 mL의 저장액 C를 혼합하여 반응용액을 준비하였다. 시료를 반응용액에 첨가한 후 분광기 (Shimadzu, Japan)로 310 nm의 파장에서 1분간 분석하였으며 효소활성 (IU/mL)은 분당 형성되는 베라트룸 알데히드 몰수로 정의하였다 [14].

망간 퍼옥시다아제 활성도를 측정시 Kuwahara의 방법을 사용하였으며 망간 퍼옥시다아제 활성도 (IU/mL)는 분당 페놀 염료 (MP bio, USA)의 산화되는 몰수로 정의하였다 [15].

라카아제 활성도는 ABTS (2, 2’-azinobis (3-methylbenzthi-azoline-6-sulfonate), Sigma-Aldrich, USA), 방법으로 분석하였으며 반응혼합물은 100 μL의 시료와 900 μL의 pH 3인 0.1 M의 시트르산 인산염 완충제 (4.2 g 시트르산 (Samchun, Korea), 2.82 g 염화인산무수화물 (Sigma-Aldrich, USA) 이 1 L 증류수에 용해된 용액)에 용해된 5 mM의 ABTS로 구성되며 ABTS 산화는 분광계 (Shimadzu, Japan) 로 420 nm 파장에서 측정하였다. 효소활성도 (IU/mL) 는 분당 산화되는 ABTS의 몰수로 정의하였다 [16].

셀룰라아제 활성도는 국제순수응용화학연합에서 설명된 방법으로 측정되었고, Whatman No.1 여과지스트립 (Sigma-Aldrich, USA) 이 사용되었다. 우선 pH 4.8인 0.05 M의 시트르산나트륨 완충액 1 mL을 시험관에 옮겨, 시트르산 인산염완충제 (4.2 g 시트르산 (Samchun, Korea), 2.82 g 염화인산무수화물 (Sigma-Aldrich, USA)이 1 L 증류수에 용해된 용액)에 희석된 0.5 mL의 효소를 첨가하였다. 이 혼합액을 50oC에서 60분간 유지시켜준 후, 3 mL의 DNS용액 (10 g 염화수산화물), 192 g 칼륨 소듐 타타르염 (MP bio, USA), 10 g 다이니트로살리실산 (Sigma-Aldrich, USA), 2 g 페놀 (Samchun, Korea), 0.5 g 염화아황산염 (Samchun, Korea)이 1 L 증류수에 용해된 용액)을 첨가 후 5 분간 가열하였다. 이후 냉각수로 즉시 냉각하고 20 mL의 탈이온수를 첨가하였다. 완전히 섞은 후 분광광도계 (Shimadzu, Japan)를 이용하여 540 nm 파장에서 측정하였으며 효소활성도 (IU/mL)는 분당 반응하는 포도당의 몰수로 정의하였다 [17].

카르복시메틸 셀룰라아제 활성도를 측정하기 위해 0.5 mL의 2% 카르복시메틸 셀룰로오즈 용액을 카르복시메틸 셀룰라아제 효소용액에 첨가해 30분간 50oC로 유지시켰다. 이후 3 mL의 DNS용액 (10 g 염화수산화물, 192 g 칼륨 소듐 타타르염 (Sigma-Aldrich, USA), 10 g 다이니트로살리실산 (Sigma-Aldrich, USA), 2 g 페놀 (Samchun, Korea), 0.5 g 염화아황산염 (Samchun, Korea) 이 1 L 증류수에 용해된 용액) 을 첨가 후 5 분간 가열하였다. 이후 냉각수로 즉시 냉각하고 20 mL의 탈이온수를 첨가하였다. 완전히 혼합 후 분광광도계를 (Shimadzu, Japan) 이용하여 540 nm 파장에서 측정하였으며 효소활성도 (IU/mL) 는 분당 반응하는 포도당의 몰수로 정의하였다 [17].

자일란나아제 활성도는 국제순수응용화학연합에서 설명된 방법으로 측정되었다 [17]. 25 mL의 삼각플라스크에 1 mL의 buffer (pH 4.8 0.1 M 시트르산)와 1 mL의 자일란 그리고 1 mL의 자일란나아제 준비 용액을 60분 동안 혼합 후, 즉시 3 mL의 DNS용액 (10 g의 염화수산화물과 192 g의 칼륨 소듐 타타르염 (Sigma-Aldrich, USA)과 10 g의 다이니트로살리실산 (Sigma-Aldrich, USA)과 2 g의 페놀 0.5 g의 염화아황산염이 1 L에 용해된 용액)을 첨가하였다. 이후 시험관에 옮겨 15분간 가열하고, 분광계 (Shimadzu, Japan)를 이용하여 파장 640 nm에서 분석하였다 [18]. 효소활성도 (IU/mL)는 분당 형성되는 자일로즈의 몰수로 정의하였다 [17].

2.3. 세포외 단백질 분석

단백질 분석은 Bradford 방법으로 측정하였다 [19]. BSA (Bovine Serum Albumin, Sigma, USA)를 0.2 mg/mL부터 0.9 mg/mL의 농도로 분석 기준으로써 제조하고, 100 μL의 기준용액과 채취된 용액을 각각 시험관에 옮겨 5 mL의 염색 시료를 혼합 하였다. 실온에서 5분 반응시키고, 분광계로 595 nm에서 흡광도를 측정하여 분석하였다 [19].

2.4. 리그닌 분석

P. chrysosporium에 의한 생물학적 전처리 후, 60oC 온도의 오븐에서 약 24 시간 정도 두어 완전히 물기를 제거하였다. 이후 대조시료와 전처리한 시료의 무게는 약 0.3 g으로 하였고, 이후 황산 처리하였다. 산에 용해성이 있는 리그닌을 분석하기 위해, 각 시료는 흡인 장치로 여과 후 50 mL씩 분주하고 분광광도계를 통하여 측정하였다. 산에 대해 불용성인 리그닌은 50 mL의 증류수로 세척 후, 105oC에서 4시간 건조 후 상온에서 서서히 냉각시켰다. 이후 고온 전기로 (WiseTherm, DAIHAN Scientific, KOREA) 를 이용하여 575oC에서 24시간 (고온 전기로 프로그램에 따른 시간: 실온에서 105oC까지 가열하여 12분 동안 유지시킨 후, 250oC까지 10oC당 1분 유지, 250oC에서 30분 유지시켰다. 이후 575oC까지 가열시키고, 20oC당 1분 유지하고 575oC에서 180분 유지하고 서서히 105oC까지 냉각시켰다.) 동안 처리해 준 후 데시케이터에서 온도를 서서히 냉각하였다. 이후 재의 무게로 리그닌을 분석하였다 [20].

2.5. 환원당 분석

환원당은 DNS방법으로 측정하였다 [17]. 고상배지의 1 mL 상층액에 3 mL의 DNS (10 g 염화수산화물, 192 g 칼륨 소듐타타르염과 (Sigma-Aldrich, USA), 10 g 다이니트로살리실산 (Sigma-Aldrich, USA), 2 g 페놀, 0.5 g 염화아황산염이 1 L 증류수에 용해된 용액) 용액을 첨가하였다. 이후 5분간 끓는 물에서 반응시킨 후, 실온에서 서서히 냉각하였다. 이후 분광계(Shimadzu, Japan)를 통해 540 nm의 파장에서 측정하였다 [17].


3. RESULTS AND DISCUSSION
3.1. Phanerochaete chrysosporium의 고상배양

P. chrysosporium의 균사체의 성장에 가장 적합한 온도는 37oC이며 리그닌 퍼옥시다아제 생산에 가장 적합한 온도는 30oC이다 [21]. 커피찌꺼기를 활용한 P. chrysosporium의 고상배양에서 온도에 따른 균사의 성장 속도 변화를 측정하기 위해 20oC, 30oC, 40oC에서 배양하였다. Fig. 1에서 확인할 수 있듯이, 30oC와 40oC의 온도에서 균사의 최종 성장 크기는 102 mm로 같았으나 30oC에서는 8일 경과 후 최대값 (102 mm) 에 도달하고 40oC에서는 13일 경과 후 최대치 (102 mm) 에 도달한 것을 보았을 때, 30oC에서 성장속도가 높다는 것을 알 수 있었다. 20oC에서 배양하였을 때 균사의 크기가 75 mm로 30oC와 40oC에 비하여 현저하게 작아, 균사 성장을 고려할 때, P. chrysosporium 균주를 커피배지에서 고상배양하는데 30oC가 최적 온도로 나타났다.


Fig. 1. 
Effect of temperature on mycelia growth of P. chrysosporium during solid state fermentation.

3.2. 커피찌꺼기 배지를 이용한 고상배양에서의 P. chrysosporium의 효소활성

리그닌 퍼옥시다아제는 20oC나 40oC에서 얻은 것보다 30oC의 고상배양에서 얻어진 것이 활성이 높았다 (Fig. 2a): 30oC의 고상배양에서 가장 높은 활성을 나타날 땐 배양 12일차이고 (0.15 IU/mL), 20oC에선 배양 18일차에 (0.08 IU/mL), 40oC에선 배양 15일차 (0.10 IU/mL)에 가장 높은 활성이 나타났는데, 이는 온도에 따라 균사의 성장속도 영향으로 보여진다. 본 실험의 P. chrysosporium의 리그닌 퍼옥시다아제 최대 활성도 (0.15 IU/mL)는 Ghasemi의 실험에서 얻어진 P. chrysosporium의 리그닌 퍼옥시다아제 활성에 대비하여 조금 낮았으며 (0.18 IU/mL) [5], Ryu의 실험에서 P. chrysosporium의 리그닌 퍼옥시다아제의 활성도보다 높았다 (0.01 IU/mL) [22].


Fig. 2. 
(a) Lignin peroxidase activity of P. chrysosporium on solid state fermentation, (b) Manganese peroxidase activity of P. chrysosporium on solid state fermentation.

망간 퍼옥시다아제 활성도는 30oC에서 배양할 때 9일 후에 최대값 (0.90 IU/mL)에 도달하였으며 40oC에선 배양 15일차에서 최고치의 활성도를 보였고 (0.57 IU/mL), 20oC에선 배양 18일차에서 가장 높은 활성도를 보였으나 (0.35 IU/mL), 3가지의 온도 (20oC, 30oC, 40oC) 조건 중에서 가장 낮은 활성을 보였다 (Fig. 2a) 이번 실험의 결과값의 최대치 (0.90 IU/mL)는 Ghasemi의 최대 효소 활성도보다 높고 (0.85 IU/mL) [5], Ryu의 최대 효소 활성도보다 높았다 (0.025 IU/mL) [22].

Fig. 3a를 보면 최대 라카아제 활성은 30oC에서 배양 15일차에서 나타났는데 (0.11 IU/mL), 이는 Ryu가 실험한 효소 활성도보다 높았다 [22]. 이후 그 활성도가 감소하는 경향성을 보였고 20oC에서는 배양 12일차에서 가장 높은 활성을 나타냈으나 그 값이 낮았으며 (0.01 IU/mL), 그 이후 다시 활성도가 줄어든 값을 보였다. 40oC에서는 활성도가 증가했으며, 배양 21일차에서 가장 높은 활성을 나타냈다 (0.09 IU/mL). 이는 30oC에서 배양한 균주의 배양 21 일차의 활성도보다 높은 값이다.


Fig. 3. 
(a) Laccase activity of P. chrysosporium on solid state fermentation, (b) Cellulase activity of P. chrysosporium on solid state fermentation.

셀룰라아제 활성도는 Fig. 3b에서와 같이 셀룰라아제 활성도는 30oC, 배양 18일차에서 가장 높았다 (5.87 IU/mL). 반면 20oC에서 활성도의 최대값은 배양 21 일차에서 가장 높았다 (3.76 IU/mL). 이 활성도는 40oC에서 같은 배양 일차에서 보인 활성도보다 (3.02 IU/mL) 높은 값이다. 40oC에서 가장 높은 활성도를 (4.74 IU/mL) 보인 배양 일차는 18일 째이다. 이 실험에서 가장 높은 활성도 (5.87 IU/mL) 는 Kanmani가 실험한 P. chrysosporium을 코이어찌꺼기에서 배양 28일차 고상 배양하여 얻은 효소 활성도보다 (5.3 IU/mL) 높았다 [23].

카르복시메틸 셀룰라아제 활성도 (Fig. 4a)는 배양 9일 이후, 30oC에서 배양하였을 때 40oC에서 배양한 균주의 효소보다 높은 활성을 보였고 이후 배양 18일차에 가장 높은 활성을 보였다 (9.52 IU/mL). 반면 20oC에서 배양된 카르복시메틸 셀룰라아제는 활성도가 매우 낮아 2 IU/mL를 넘지 못하였다. 이번 실험의 최고 활성도는 Kanmani가 코이어찌꺼기를 활용한 P.chrysosporium 고체배양 시 관찰되는 카르복시메틸 셀룰라아제 실험에서 보인 효소 활성도 (8 IU/mL)보다 높은 것을 알 수 있다 [23].


Fig. 4. 
(a) Carboxymethyl cellulase activity of P. chrysosporium on solid state fermentation, (b) Xylanase activity of P. chrysosporium on solid state fermentation.

자일란나아제 활성도는 Fig. 4b에서와 같이 온도 30oC, 배양 18일에서 여러 조건 중에서 가장 높은 활성도를 보였다 (1.16 IU/mL). 20oC에선 배양 21일에 가장 높은 활성 (0.56 IU/mL) 을 보였고 40oC에선 21일에 가장 높은 활성 (0.43 IU/mL)을 보였다. Dobozi 실험에서 나타난 옥수수 배지를 이용한 고체배양의 자일라나아제 활성도 (1 IU/mL) 보다 높은 것으로 관찰되었다 [24].

3.3. 커피찌꺼기 고체배양에서 P. chrysosporium의 세포외 기질 단백질 농도

세포외기질 단백질은 Fig. 5에서와 같이 30oC, 배양 9일차에서 가장 높았다 (0.36 mg/mL) . 배양온도 40oC, 배양 18일에서 두번째로 높은 세포외 기질 단백질 농도 수치를 보였다 (0.320 mg/mL). 배양 15일차 이후 배양온도 40oC 조건에선 점점 단백질 농도가 줄어들어 배양 21일차에는 같은 일차의 배양온도 20oC의 세포외 기질 단백질 농도 (0.26 mg/mL) 보다 낮은 값 (0.25 mg/mL)을 보였다. 배양온도 20oC에서 농도는 배양 6일차까지 세포외 단백질이 발견되지 않았다. 이 결과는 30oC에서 균주 P. chrysosporium를 배양하는 것이 효소발현에 가장 최적화된 온도라는 것을 의미한다. 또한 0.32 mg/mL의 단백질 농도는 이후 커피 배지에 배양에 필요한 질소원을 제공할 것으로 보여진다.


Fig. 5. 
Change in extracellular protein concentration during solid state fermentation of P. chrysosporium.

3.4. Phanerochaete chrysosporium에 의한 커피찌꺼기 리그닌의 생분해

Fig. 6에서 보여지는 것과 같이, 리그닌은 배양 21일차에 61.02%까지 분해되었고 12-15일에 가장 리그닌 양이 분해되었다. Kanmani의 코이어찌꺼기를 이용한 리그닌 분해 실험에서 보인 생분해율은 68%에 비교하여 낮은 값을 보인다. 반면에, 이번 연구에서 커피찌꺼기를 이용한 고상배양에서 21일에 리그닌의 최대 생분해율은 61.02% 이었으며 Kanmani의 연구에서 코이어찌꺼기를 이용한 리그닌 생분해는 배양 28일에 최대값에 도달하였다 [23]. 이전 연구 [24] 에 비해 높은 분해율을 보인 이유는 본 연구에서 얻어진 리그닌 퍼옥시다아제의 활성도 (0.15 IU/mL), 망간퍼옥시다아제 활성도 (0.90 IU/mL) [6,23]가 높기 때문인 것으로 여겨진다.


Fig. 6. 
Biodegradation of lignin by P. chrysosporium on solid state fermentation.

3.5. P. chrysosporium을 이용한 커피찌꺼기 고체배지내의 환원당

Fig. 7에서 보여지는 것과 같이, 고상배양 21일 내내 가장 높은 농도의 환원당을 얻은 배양온도 조건은 30oC이며, 배양 18일에 가장 높은 농도를 보였다 (4.73 mg/mL). 두번째로 높은 농도를 보인 조건은 배양 온도 40oC, 배양 18일에 보였다 (4.09 mg/mL). 본 연구에서 보이는 환원당의 최대값은 (4.73 mg/mL) Liu의 계면활성제인 (PEG 4000) 을 첨가한 실험에서 보이는 환원당 최고 값 (2 mg/mL)보다 높았다 [25]. 이전 연구보다 환원당 수치가 높은 것은 리그닌 분해에 관련된 효소인 리그닌 퍼옥시다아제, 망간퍼옥시다아제, 라카아제 등이 이전 연구 [23]에 비교해 높은 활성도 (0.15 IU/mL, 0.90 IU/mL, 0.11 IU/mL)를 보였고, 셀룰라아제, 카르복시메틸 셀룰라아제, 자일란나아제와 같이 헤미셀룰로오즈 분해에 관련된 효소들의 활성도 (5.87 IU/mL, 9.52 IU/mL, 1.16 IU/mL)가 코이어찌꺼기 또는 옥수수를 이용한 이전 실험 [24,25]의 활성도보다 높은 데 요인이 있는 것으로 보여진다.


Fig. 7. 
Change in reducing sugar concentration of during solid state fermentation of P. chrysosporium.


4. CONCLUSION

온도에 따른 균사 성장속도 비교 실험을 통해 20oC에서 최대 75 mm, 30oC에서 최대 102 mm, 40oC에서 최대 102 mm의 균사성장도를 관찰하였고 40oC보다 30oC에서 배양 시, 더 빠르게 (8일차) 그 최대값에 도달하였다. P. chrysosporium에 존재하는 리그닌 분해 관련효소들의 활성도를 분석한 결과 리그닌 퍼옥시다아제 0.15 IU/mL, 망간퍼옥시다아제 0.90 IU/mL, 라카아제 0.11 IU/mL, 셀룰라아제 5.87 IU/mL, 카르복시메틸 셀룰라아제 9.52 IU/mL, 자일란나아제 1.16 IU/mL의 활성도를 보였다. 또한 모든 효소활성도에서 30oC에서 가장 높은 활성도를 보였다. 리그닌의 생분해율은 61.02%로 나타났고 리그닌 및 헤미셀룰로오즈의 분해 이후 당화 과정의 결과물을 확인할 수 있는 환원당 분석을 통해 4.73 mg/mL의 환원당이 관찰되었다. 이상 결과들을 종합해 보았을 때, 커피찌꺼기가 균주 Phanerochaete chrysosporium 이용한 생물학적 전처리를 통해, 그 구성물인 리그노셀룰로즈를 분해 및 당화되어, 배양 배지로써 이용 가능성을 확인할 수 있었다.


References
1. Kondamudi, N., S. K. Mohapatra, and M. Misra, (2008), Spent coffee grounds as a versatile source of green energy, J. Agric. Food Chem, 5624, p11757-11760.
2. Zhang, H. Mo., and H. Nam, (2011), Bioconversion of cellulose to bioalcoho, Proceedings of 2011 International Conference on Agricultural and Biosystems Engineering (ICABE 2011), February 20, Hong Kong, China.
3. Hahn-Hägerdal, B., M. Galbe, M.-F. Gorwa-Grauslund, G. Lidén, and G. Zacchi, (2006), Bio-ethanol the fuel of tomorrow from the residues of today, Trends Biotechnol, 2412, p549-556.
4. Srivastava, A. K., and P. Agrawal, (2012), Saccharification with Phanerochaete chrysosporium and ethanol production with Saccharomyces cerevisiae, J. Atoms Molecules, 24, p321.
5. Ghasemi, F., F. Tabandeh, B. Bambai, and K. S. Rao, (2010), Decolorization of different azo dyes by Phanerochaete chrysosporium RP 78 under optimal condition, Int. J. Environ. Sci. Technol, 73, p457-464.
6. Levasseur, A., E. Drula, V. Lombard, P. M. Coutinho, and B. Henrissat, (2013), Expansion of the enzymatic repertoire of the CAZy database to integrate auxiliary redox enzymes, Biotechnol. Biofuels, 6, p41-44.
7. Asgher, M., M. Asad, and R. Legge, (2006), Enhanced lignin peroxidase synthesis by Phanerochaete chrysosporium in solid state bioprocessing of a lignocellulosic substrate, World J. Microbiol. Biotechnol, 225, p449-453.
8. Christian, V., R. Shrivastava, D. Shukla, H. Modi, and B. Vyas, (2005), Degradation of xenobiotic compounds by lignin-degrading white-rot fungi: Enzymology and mechanisms involved, Indian. J. Exp. Biol, 43, p301-312.
9. Popp, J. L., B. Kalyanaraman, and T. K. Kirk, (1990), Lignin peroxidase oxidation of manganese (2+) in the presence of veratryl alcohol, malonic or oxalic acid, and oxygen, Biochem, 2946, p10475-10480.
10. Glenn, J. K., L. Akileswaran, and M. H. Gold, (1986), Mn (II) oxidation is the principal function of the extracellular Mn-peroxidase from Phanerochaete chrysosporium, Arch Biochem. Biophys, 2512, p688-696.
11. Han, M. J., H. T Choi, and H. G Song, (2005), Purification and characterization of laccase from the white rot fungus Trametes versicolor, J. Microbiol, 43, p555-560.
12. Pandit, N., and S. Maheshwari, (2012), Optimization of cellulase enzyme production from sugarcane pressmud using oyster mushroom-pleurotus sajor-caju by solid state fermentation, J Bioremed. Biodegrad, 3, p140-144.
13. Flores, M., R. Pérez, and C. Huitrón, (1997), β-Xylosidase and xylanase characterization and production by Streptomyces sp. CH-M-1035, Lett. Appl. Microbiol, 245, p410-416.
14. Tien, M., and T. K. Kirk, (1984), Lignin-degrading enzyme from Phanerochaete chrysosporium: Purification, characterization, and catalytic properties of a unique H2O2-requiring oxygenase, Proc. Natl. Acad. Sci, 818, p2280-2284.
15. Kumar, A.G., G. Sekaran, and S. Krishnamoorthy, (2006), Solid state fermentation of Achras zapota lignocellulose by Phanerochaete chrysosporium, Bioresour. Technol, 9713, p1521-1528.
16. Lu, L., M. Zhao, B.-B. Zhang, S.-Y Yu, X.-J. Bian, W. Wang, and Y. Wang, (2007), Purification and characterization of laccase from Pycnoporus sanguineus and decolorization of an anthraquinone dye by the enzyme, Appl. Microbiol. Biotechnol, 746, p1232-1239.
17. Ghose, T., (1987), Measurement of cellulase activities, Pure Appl. Chem, 592, p257-268.
18. Ghose, T., and V. S. Bisaria, (1987), Measurement of hemicellulase activities: Part I Xylanases, Pure Appl. Chem, 5912, p1739-1751.
19. Bradford, M. M., (1976), A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Anal. Biochem, 721-2, p248-254.
20. Sluiter, A., B. Hames, R. Ruiz, C. Scarlata, J. Sluiter, D. Templeton, and D. Crocker, (2008), Determination of Structural Carbohydrates and Lignin in Biomass, NREL/TP-510-42618, US National Renewable Engergy Laboratory, Golden Colorado.
21. Asther, M., C. Capdevila, and G. Corrieu, (1988), Control of lignin peroxidase production by Phanerochaete chrysosporium INA-12 by temperature shifting, Appl. Environ. Microbiol, 5412, p3194-3196.
22. Ryu, W. R., S. H. Shim, M. Y. Jang, Y. J. Jeon, K. K. Oh, and M. H. Cho, (2000), Biodegradation of pentachlorophenol by white rot fungi under ligninolytic and nonligninolytic conditions, Biotechnol. Bioprocess Eng, 53, p211-214.
23. Kanmani, P., and P. Karuppasamy, (2009), Studies on lignocellulose biodegradation of coir waste in solid state fermentation using Phanerocheate chrysosporium and Rhizopus stolonifer, Afr. J. Biotechnol, 8, p6880-6887.
24. Dobozi, M. S., G. Szakács, and C. V. Bruschi, (1992), Xylanase activity of Phanerochaete chrysosporium, Appl. Environ. Microbiol, 5811, p3466-3471.
25. Liu, Y.-H., (2011), Surfactant enhanced the hydrolysis of lignocellulose using Phanerochaete chrysosporium, Proceedings of 2011 International Conference on Agricultural and Biosystems Engineering (ICABE 2011), February 20, Hong Kong, China.