The Korean Society For Biotechnology And Bioengineering

Current Issues

Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 32 , No. 3

[ Research Paper ]
Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 32, No. 2, pp.108-116
ISSN: 1225-7117 (Print) 2288-8268 (Online)
Print publication date 30 Jun 2017
Received 14 Apr 2017 Revised 22 May 2017 Accepted 02 Jun 2017
DOI: https://doi.org/10.7841/ksbbj.2017.32.2.108

에스오메프라졸 마그네슘 이수화물을 함유하는 장용성 제제의 안정성 개선
조영호1 ; 전효빈1 ; 이종화2 ; 이계원1, *
1건양대학교 제약생명공학과
2안전성평가연구소 독성연구센터

Stability Improvement of Esomeprazole Magnesium Dihydrate Enteric-Coated Tablet by Adding Alkalizing Agents
Young Ho Cho1 ; Hyo Bin Jeon1 ; Jong-Hwa Lee2 ; Gye Won Lee1, *
1Department of Pharmaceutics & Biotechnology, Konyang University, Daejeon 35365, Korea, Tel: +82-42-600-8502, Fax: +82-42-600-8502 (pckmon@konyang.ac.kr)
2Toxicology Evaluation and Research Center, Korea Institute of Toxicology, Daejeon 34114, Korea
Correspondence to : *Department of Pharmaceutics & Biotechnology, Konyang University, Daejeon 35365, Korea Tel: +82-42-600-8502, Fax: +82-42-600-8502 e-mail: pckmon@konyang.ac.kr


© 2017 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering

Abstract

Omeprazole, a benzimidazole derivative, suppresses gastric acid secretion by inhibiting H+/K+ ATPase in gastric parietals cells, and by reducing H+ concentration. To improve stability of esomeprazole magnesium dihydrate (ESMD), enteric-coated preperation was composed of core tablet, subcoating and enteric coating layer. We were evaluated in vitro dissolution characteristics between test and reference ESMD preparation and stability. We could prepare enteric-coated formulation of ESMD by controlling disintegrating agent and coating ratio which could rapidly dissolved in neutral or alkali medium. The formulation D5 with crospovidone of 1.25% and coating ratio of 16.25% had a similar dissolution behavior compare to reference preparation. Difference factor (f1) and similarity factor (f2) were 0~15 and 50~100 and there was no significant difference in bioequivalence between formulations. The content and dissolution rate of formulation D5 were 96.54±0.21 and 78.56±0.87% without change of color in accelerated condition (40oC, RH 75%, high density polyethylene (HDPE) container) for 6 months. This study concluded that our enteric coated preparation of ESMD could be an useful method to improve stability of unstable drug without direct contact with coating material.


Keywords: Alkalizing agent, Enteric coating, Esomeprazole Magnesium Dihydrate, Stability, High density polyethylene

1. INTRODUCTION

현대에는 식습관의 문제, 흡연, 음주, 스트레스 등의 여러 요인과 유전적 소인에 의해 위산분비조절에 문제가 생길 수 있고 이로 인해 위장관 질병의 발생빈도가 증가하는 추세를 보이고 있다 [1]. 이로 인해 미란성 식도염, 위궤양, 졸링거-엘리슨 증후군과 같은 위장관 질병이 발생한다 [2-4]. 이런 위장관 질환에는 아세틸콜린, 히스타민과 가스트린을 조절하고 벽세포 분비세포가 H+/K+ ATPase proton 펌프에 비가역적으로 결합함으로써 위산분비를 차단하여 16~18시간동안 pH 4이상으로 유지시켜 줄 수 있는 proton 펌프 억제제가 부작용이 적으면서 효과가 우수하여 가장 많이 사용되어지고 있다 [5-7].

에스오메프라졸 마그네슘은 간 대사율과 체내 제거율이 낮고 부작용이 적어 강력한 산 분비 억제력을 나타내는 오메프라졸의 개량신약이다 [8-10]. 그러나 오메프라졸과 마찬가지로 산성 환경에서 불안정하여 분해되므로, 경구투여 시 위에서 붕괴되어 약효를 기대할 수 없고 위 점막이 자극되어 구토를 일으키는 등의 문제를 일으킬 수 있다 [11-13]. 따라서 에스오메프라졸 마그네슘을 포함하는 제제가 안정하게 약효를 나타내게 하기 위해서는 안정성이 유지되면서 장내에서 붕해되도록 하기 위한 기술이 필요하며 이러한 문제를 개선하기 위하여 여러 가지 연구들이 진행되고 있다 [14-16]. 현재 시판되고 있는 에스오메프라졸 마그네슘 제제로는 에스오메프라졸 마그네슘 삼수화물이 장용성 펠렛 형태로 함유된 정제로 개발되어 시판되고 있으며 대한민국 식약처로부터 특허로 보호받고 있다 [17].

그러나 기존 정제는 장용성 펠렛의 형태로 만드는 공정이 들어가 제조과정이 복잡하므로 기존 특허를 회피하면서 제조 과정을 단순화하여 생산비용을 절감할 수 있는 기술개발이 필요하다.

따라서 본 연구에서는 proton 펌프 억제제인 에스오메프라졸 마그네숨 이수화물 (이하 ESMD로 약함)의 산성 매질에서의 안정성을 개선하여 코어정 (나정), subcoating, 장용피복층 세 부분으로 구성된 장용성 제제를 개발하고자 하였다. 이 때 ESMD의 안정성을 높여줄 수 있도록 적당한 알칼리화제와 장용피복층의 코팅 비율에 따른 in vitro 약물 방출 시험을 통하여 대조제제인 넥시움정과 용출특성 및 안정성을 비교하였다.


2. MATERIALS AND METHOD
2.1. 시약 및 재료

시약으로는 에스오메프라졸 마그네슘 이수화물 (esomeprazole magnesium dihydrate, ESMD)은 Jigs Chemical (Gujarat, India)에서 구입하였다. 규소화미결정셀룰로오스 (이하 Prosolv HD 90으로 약함)는 JRS Pharma (Roenberg, Germany)에서, Lactose는 DFE Pharma (Norten-Hardenberg, Germany)에서, Crospovidone CL은 BASF (Nienburg, Germany)에서, 스테아르산 마그네슘은 Faci Asia Pacific Pte (Merlimau PI, Singapore)에서, Colloidal silicon dioxide (이하 SiO2로 약함)은 Fuji Silysia Chemical (NC, USA)에서, 산화마그네슘 (MgO)은 Sakamoto (Saitama, Japan)에서 공급받아 사용하였다. 또한 비교용출을 위한 대조약물로는 Nexium 40mg정® (한국아스트라제네카, Seoul, Korea, 이하 대조약으로 명명함, Lot No. 6000 7658)을 사용하였다. 분석에 사용된 HPLC용 아세토니트릴은 J.T Baker (Seoul, Korea)사에서 구입하여 사용하였으며, 그 외 기타 시약과 용매는 특급 또는 일급을 사용하였다.

기기로서 타정기는 ZPS-8 (Shanghai Universal Pharmaceutical Machinery, Shanghai, China)를, 코팅기는 SFC-30F (Sejong Pharmatech, Incheon, Korea)를, 경도측정기는 4930 (Fujihara Seisakusho, Yamanashi, Japan), 용출시험기는 DRS-14 (Campbell Electronics, Mumbai, India)를 사용하였고 그리고 분석기기로는 HPLC System 20AD (Shimadzu, Kyoto, Japan)을 사용하였다.

2.2. 알칼리화제 및 코어정의 검색

ESMD에 3종의 알칼리화제 (인산일수소나트륨, 산화마그네슘, 아르기닌)를 각각 1:0.5, 1:1, 1:2의 중량 비율로 혼합하여 가속조건 (40oC, 75% RH)에서 보관하면서 30일 동안 성상변화를 관찰하였다. 따로 0.01% 알칼리화제에 ESMD 20 mg 넣고 pH의 변화를 측정하였다.

세 가지 알칼리화제를 전체 중량대비 10%로 고정하여 Table 1의 처방에 따라 직접 압축법으로 ESMD를 함유하는 코어정을 제조하여 가속 조건에서 60일 동안 보관하면서 성상변화와 함량감소 추이를 관찰하였다.

Table 1. 
The composition of esomeprazole magnesium dihydrate tablet containing various alkalizing agents
Ingredient Formulation (%)
A B C D E
ESMD 10.89 10.89 10.89 10.89 10.89
Lactose 50.11 50.11 55.11 50.11 45.11
Prosolv HD 90 28.00 28.00 28.00 28.00 28.00
Na2HPO4 10.00 - - - -
Arginine - 10.00 - - -
MgO - - 5.00 10.00 15.00
SiO2 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50
Mg. Stearate 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50

따로 안정화 효과가 가장 좋은 산화마그네슘을 ESMD와 0.5:1, 1:1 및 1.5:1의 비율에 해당하도록 전체 중량의 5, 10 및 15%로 달리 첨가하여 직접 압축법으로 코어정을 제조하여 compatibility를 평가하기 위하여 30일 동안 보관하면서 성상변화와 함량감소 추이를 관찰하였다.

2.3. 장용성 제제의 제조 및 평가
2.3.1. 장용성 제제의 제조

ESMD를 함유하는 장용성 제제는 Scheme 1과 같이 약물을 함유하는 코어정(나정), subcoating 및 장용코팅으로 구성하여 Table 2의 처방에 따라 제조하였다. 즉, ESMD 40 mg을 함유하는 코어정은 알칼리화제로 산화마그네슘을, 활택제로 스테아르산마그네슘과 경질무수규산을, 붕해제로 크로스포비돈을 사용하여 직접 압축법으로 제조하였다. 이 때 평균질량은 400 mg, 경도는 8 kp 이상, 마손도는 0.1% 이하였다.


Scheme 1. 
The procedure of enteric-coated tablet containing esome-prazole magnesium dihydrate.

Table 2. 
Formulation of enteric-coated tablet containing esomeprazole magnesium dihydrate
Ingredient Weight (%) / Tablet
D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7
Core tablet ESMD 10.89 10.89 10.89 10.89 10.89 10.89 10.89
Lactose 35.11 35.11 35.11 47.61 38.86 50.22 -
Prosolv HD 90 28.00 28.00 28.00 28.00 38.00 28.00 56.86
Crospovidone 15.00 15.00 15.00 2.50 1.25 - 6.25
Povidone K30 - - - - - - 10.00
MgO 10.00 10.00 10.00 10.00 10.00 10.00 10.00
SiO2 0.25 0.25 0.25 0.25 0.50 0.50 0.50
Mg. Stearate 0.75 0.75 0.75 0.75 0.50 0.50 0.50
Subcoating HPMC 2910 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00
PEG 6000 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75
Talc 0.35 0.35 0.35 0.35 0.35 0.35 0.35
TiO2 0.35 0.35 0.35 0.35 0.35 0.35 0.35
Enteric coated layer Acryl-EZE 8.25 12.52 16.52 8.25 16.52 16.52 16.52
Weight variation (mg) 479.62±0.14 483.41±0.54 484.50±1.12 481.53±0.58 480.92±1.13 478.72±1.82 476.24±0.22
Content (%) 101.87±0.22 100.50±0.59 103.59±0.32 99.23±0.90 99.57±0.68 99.34±0.51 102.90±0.40

제조된 코어정에 HPMC를 이용하여 전체 중량의 3.5%로 10 μm 이상의 두께로 코팅을 하여 약물과의 직접적인 접촉을 차단한 후, 프탈산히드록시프로필메틸셀룰로오스와 메타크릴산 코폴리머의 20% 분산액으로 전체 중량의 8.25, 12.52 및 16.5%의 비율로 코팅하여 장용성 제제를 제조하였다 (처방 D1~D7). 이 때 코팅팬의 회전속도는 3~6 rpm, 분사속도는 5 mL/min 및 64oC의 조건으로 코팅을 실시한 이후, 50oC에서 20분 동안 1~3 rpm으로 팬을 회전시키면서 건조하였다.

2.3.2. 장용성 제제의 평가

처방 D1~D7을 일정분량씩 취하여 각각에 대한 질량편차, 함량 및 산 저항성 실험을 실시하여 장용성 제제로서의 적합여부를 평가하였다.

2.4. 용출시험 분석법 밸리데이션

용출시험에 사용되는 분석 방법의 타당성을 증명하기 위하여 분석법 밸리데이션을 ICH 가이드라인에 따라 특이성 (specificity), 직선성 (linearity), 정확성 (accuracy), 정밀성 (precision), 검출한계 (limit of detection, LOD) 및 정량한계 (limit of quantitation, LOQ)를 평가하였다 [18,19]. 이 때 분석은 HPLC system (Shimadzu, Japan)을 이용하였다. 즉, 이동상은 아세토니트릴과 인산염완충액 (pH 7.0, 10 M 수산화나트륨용액으로 조절)을 35:65 (V/V%), 컬럼은 Luna C18 (4.6 mm × 15 cm, particle size 5 μm, Phenomenex, USA), 컬럼 온도는 40oC, 파장은 302 nm, 유속은 1.0 mL/min 그리고 주입량은 20 μL이었다.

2.4.1. 특이성

검액과 표준액 제조 시 사용되는 시험액 및 ESMD를 제외한 부형제가 용출시험법에 영향을 미치지 않음을 확인하기 위하여 blank, placebo, 표준액, 표준액과 placebo 혼합액을 취하여 즉시 0.25 mol/L 인산염완충액 (pH 11.0)으로 희석하고 용출시험법의 분석조건에 따라 시험하여 얻어진 피크의 유지시간이 ESMD의 피크와 겹치는지의 여부를 평가하였다.

2.4.2. 직선성

ESMD 표준원액 (444 μg/mL)을 0.25 mol/L 인산염완충액 (pH 11.0)으로 적당히 희석하여 8.88, 17.76, 26.64, 35.52, 44.40 및 53.28 μg/mL의 표준액을 제조하였다. HPLC에 주입하여 얻은 농도별 표준액에 대한 피크면적을 구하여 검량선을 작성한 후, 작성된 검량선으로부터 직선의 상관계수 (R2 > 0.99)를 구하여 직선성을 검토하였다. 재현성 확보를 위하여 3회 반복하여 실험하였다.

2.4.3. 정확성

정확성은 참값에 대한 분석을 통해 얻어진 시험결과의 근접성으로 확인할 수 있다. 표준원액을 0.25 mol/L 인산염완충액 (pH 11.0)로 희석하여 각각 8.8, 44.4 및 53.2 μg/mL로 한 액을 HPLC로 각각 3회 반복 분석을 수행하였고 검량선에 의한 농도 %로 산출하였다. 이때 회수율이 98.00~102.00%의 값이 얻어져야 시험법이 정확함을 의미한다.

2.4.4. 정밀성

정밀성은 하나의 시료로부터 취한 여러 개의 등분체로 반복분석을 통하여 개개 측정치의 근접성을 확인한다. 표준원액을 0.25 mol/L 인산염완충액 (pH 11.0)로 희석하여 44.4 μg/mL로 한 액을 HPLC로 6회 반복 분석을 수행하였고 검량선에 의한 농도 %로 산출하였다. 이 때 회수율은 98.00~102.00%의 값이 얻어져야 정밀하다는 것을 의미한다.

2.4.5. 검출한계와 정량한계

검량선의 직선성 범위가 좋은 부분을 이용하여 다음과 같은식을 이용하여 검출한계 (LOD)와 정량한계 (LOQ)를 산출하였다.

LOQ=10×y   
LOD=3.3×y   
2.5. 비교용출

식품의약품안전청 고시 [20]에 따라 인공장액 (pH 6.8)에서 37±0.5oC, 50 rpm으로 제조된 시험약 (처방 D1~D7)과 대조약 (넥시움정)의 비교용출을 진행하였다. 즉, 일정시간 간격 (5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 180, 240, 300 및 360분)으로 용출액 5 mL를 취하여 0.45 um 막여과기로 여과한 후, 즉시 0.25 mol/L 인산염 완충액 (pH 11.0) 1 mL를 혼합하여 HPLC에 주입하고 미리 작성된 검량선식으로부터 용출량을 계산하였다.

용출시험 결과는 용출률 (%), 용출시간, 용출 유사성으로 확인하였다. 일반적으로 용출 유사성은 Model-independent를 사용하여 차이인자 (difference factor, f1), 유사인자 (similarity factor, f2) value로 평가하였다 [21-23]. 이 때 차이인자 (f1)와 유사인자 (f2)는 다음의 식으로 산출하였다.

f1=j=1nRj-Tjj=1nRj×100
f2=50×log1+1nj=1nRj-Tj2-0.5×100

여기에서 n은 용출률 (%)을 측정하는 시점의 수이고, RjTj는 각각 시점 j에서 대조약과 시험약의 평균 용출률 (%)이다.

2.6. 안정성

처방 D5를 고밀도 폴리에틸렌용기 (이하 HDPE로 약함)와 유리병 (glass bottle)에 담은 후, 가속조건 (40oC, 75% RH with UV-Vis light)에서 6개월 동안 보관하면서 정해진 기간에 따라 성상 및 함량 변화, 용출률 변화를 평가하여 ESMD의 안정성에 미치는 온도, 습도 및 빛의 영향을 검토하였다.

이 때 용출실험은 0.1 mol/L 염산 300 mL을 사용하여 패들법으로 2시간 동안 37±0.5oC, 100 rpm으로 시험하였다 (first stage). 미리 37±0.5oC로 가온한 0.086 mol/L 인산일수소나트륨 700 mL을 first stage의 용출액에 추가하여 1000 mL로 하고 37±0.5oC, 100 rpm으로 30분 동안 시험하였다 (final stage). 용출액 5 mL을 취하여 0.25 mol/L 인산염 완충액 (pH 11.0)로 즉시 희석한 액을 검액으로 하였다. 검액의 분석은 함량시험법의 분석조건과 동일하게 진행하였다.

2.7. 통계처리

모든 실험은 3회 반복 실험하였으며 Ducan's multiple range test를 행하여 각 시험군의 평균과 표준편차를 산출하고 각 시험군 간의 유의차를 5% (p<0.05) 유의 수준에서 검증하였다.


3. RESULTS AND DISCUSSION
3.1. 알칼리화제 및 코어정의 검색

일반적으로 오메프라졸은 H+가 반응의 촉매로서 작용하는 특수 산-염기 촉매반응이 일어나므로 pH가 증가함에 따라 겉보기 분해속도상수는 감소하여 안정성이 높아진다고 알려져 있다 [24,25]. 선택된 3종의 0.01% 알칼리화제 용액에 ESMD를 첨가하기 전후의 pH 변화를 측정한 결과 약물 단독은 9.32이었으며 알칼리화제를 첨가한 경우에는 전반적으로 pH가 높아졌다. 즉, 인산일수소나트륨은 8.92이었던 pH가 ESMD가 첨가된 이후 9.47로 높아져서 ESMD의 영향을 많이 받는 것으로 나타났으나 산화마그네슘과 아르기닌은 pH가 10.48과 9.59로서 ESMD의 영향을 받지 않고 일정하게 유지되는 것으로 보아 안정화 효과가 클 것으로 기대되었다(Table 3).

Table 3. 
The change of pH and physical appearance of esomeprazole magnesium dihydrate in various alkalizing agents
Type pH Physical appearance
Only Mix Ratio 7 15 30
ESMD 9.32 9.32 +++ ++++ ++++
Na2HPO4 8.92 9.47 1:0.5 + +++ ++++
1:1 + ++ +++
1:2 + ++ ++
MgO 10.45 10.48 1:0.5 + + +
1:1 + + +
1:2 + + +
Arginine 9.60 9.59 1:0.5 + ++ ++
1:1 + ++ ++
1:2 + ++ ++
+ means a white or buff, ++ means a light brown, +++ means a brown, and ++++ means a dark brown

ESMD와 3종의 알칼리화제를 1:0.5, 1:1 및 1:2의 중량비로 혼합하여 가속조건에서 30일 후에 산화마그네슘을 첨가한 모든 비율에서는 변색없이 일정하게 유지되었지만 알칼리화제를 첨가하지 않은 ESMD의 색은 미백색에서 어두운 갈색으로 변화하면서 온도와 습기에 의해 쉽게 안정성이 감소함을 확인 할 수 있었다. pH가 유지되어 안정화 효과가 기대되었던 아르기닌은 15일 이후에 연한 갈색으로 변색되었으며 ESMD에 의한 영향을 많이 받아 pH의 변화가 컸던 인산일수나트륨의 경우에는 양이 적게 첨가될수록 15일 이후부터 변색하기 시작하여 30일 이후에 어두운 갈색으로 변색되어 안정성이 떨어짐을 관찰할 수 있었다. 이는 알칼리화제 첨가 전후의 pH 변화와 동일한 결과라 할 수 있을 뿐만 아니라 오메프라졸의 안정성에 미치는 연구에서와 동일하게 pH가 10 이상의 경우에 안정화 효과가 크다는 것을 확인할 수 있는 결과라 할 수 있다 [26].

세 가지 알칼리화제를 함유하는 코어정을 제조하는 과정에서 ESMD의 안정성에 미치는 영향을 60일 동안 관찰하여 Table 4에 나타내었다. 즉, 60일 경과 후 산화마그네슘을 이용한 코어정에서는 갈색으로, 인산일수소나트륨과 아르기닌이 첨가된 코어정은 진한 갈색으로 변색되었다. ESMD의 함량은 30일까지 성상의 변화는 관찰되어도 거의 일정하게 유지되다가 60일후에 감소되기 시작하여 산화마그네숨이 첨가된 경우 가장 안정한 것을 볼 수 있었다. ESMD는 유사일차 (pseudo first-order) 반응식에 따라 분해가 일어난다는 것을 알 수 있었다. 직선의 기울기로부터 구해진 유사 일차분해 속도상수 K (day-1)는 특히 산화마그네슘을 사용하였을 때 3×10-4으로 가장 작은 것으로 나타났으며 반감기도 길었다 (p<0.01). 따라서 산화마그네슘이 ESMD의 안정성을 개선하는데 가장 바람직한 알칼리화제로 판단되었다.

Table 4. 
First-order degradation rate constants (k), half life (t1/2) and physical appearance change of esomeprazole magnesium dihydrate in core tablet with various alkalizing agents
Formulation Parameter Physical appearance
K-1 (×10-3, day-1) t1/2 (day) 15 30 60
A 0.6 1,155 +++ ++++ ++++
B 0.7 990 ++ +++ ++++
D 0.3 2,310 + ++ +++
+ means a white or buff, ++ means a light brown, +++ means a brown, and ++++ means a dark brown.
Formulation A, B and D contained 10% of sodium hydrogen phosphate (Na2HPO4), arginine and magnesium oxide (MgO).

산화마그네슘의 양에 따른 ESMD의 안정성에 미치는 영향을 검토하여 그 결과를 Table 5에 나타내었다. 즉, 산화마그네슘의 양이 10% 이하인 경우에는 15일 이후부터 변색이 나타나면서 30일 이후에는 함량이 91.90%로 감소되어 불안정하였으나 10과 15%에서는 안정하게 유지되었다. 따라서 코어층으로 사용되는 나정은 10% 이상의 알칼리화제를 함유하도록 고정하여 제조하는 것이 바람직한 것으로 사료된다.

Table 5. 
The change of physical appearance and content of esoemprazole magnesium dihydrate in core tablet with 5, 10, and 15% of magnesium oxide
Formulation Days
% Remaining drug Physical appearance
0 15 30 15 30
C 101.22±0.52 100.72±0.83 91.9±4.16 +++ +++
D 100.25±0.21 99.91±0.91 100.16±0.79 ++ ++
E 101.82±0.28 101.11±1.02 102.27±4.68 ++ ++
+ means a white or buff, ++ means a light brown, +++ means a brown, and ++++ means a dark brown.
Formulation C, D and E contained 5, 10, and 15% of magnesium oxide.
Each value represents of three determinations ± the standard deviations.

3.2. 장용성 제제의 제조 및 평가

ESMD를 코어정에 함유하는 장용성 제제를 제조하여 각각의 질량 편차와 함량을 측정한 결과 평균 질량은 480±5 mg과 99% 이상의 균일한 함량을 나타내었다. 또한 인공위액(pH 1.2) 300 mL에서 2시간 동안 50 rpm으로 패들법으로 산저항성을 평가한 결과 모든 처방에서 용출되지 않음을 확인할 수 있어 균일하게 장용성 제제가 제조되었음을 확인할 수 있었다.

3.3. 용출시험 분석법 밸리데이션
3.3.1. 특이성

특이성은 시료 내 다른 물질의 공존 시 해당 분석물질을 분리하고 정량하는 분석능력을 나타낸다. 주성분 피크의 유지시간은 2.941분으로서 시험액과 placebo 용액과 겹치지 않고 명확하게 분리되었다. 또한 Placebo와 Placebo+표준액을 첨가한 시험용액에서의 회수율은 99.71%로서 placebo의 영향을 받지 않고 정량성을 가짐을 확인하였다 (data not shown).

3.3.2. 직선성

직선성은 8.88~53.28 μg/mL농도의 표준액으로 제조하여 HPLC로 분석하였을 때, 얻은 피크면적을 Y축, 표준액 농도를 X축으로 하여 검량선을 작성하여 나타내었다. 이 때 얻어진 검량선 식은 ‘면적 = 50.54760 × ESMD의 농도 - 6.58561’이었으며, 상관계수는 0.99997로 양호한 직선성을 나타내었다 (data not shown).

3.3.3. 정확성 및 정밀성

용출률 20, 100 및 120%에 해당하는 8.88, 44.44, 53.28 μg/mL의 농도로 주입하였을 때 얻어진 회수율은 98.0~102.0% 범위에 있었으며, 회수율의 상대표준편차는 2.0% 이하로서 정확성을 확인할 수 있었다.

또한, 용출률 100% 해당하는 농도인 44.44 μg/mL를 6회 반복 주입하였을 때 얻어진 피크면적에 대한 상대 표준편차는 0.7%로서 기준인 2.0% 이하를 나타내어 정밀성을 확인할 수 있었다.

3.3.4. 정량한계 및 검출한계

가장 직선성이 좋은 8.88~53.28 μg/mL의 농도범위를 이용하여 검출한계 및 정량한계를 측정하였을 때 각각 0.36과 1.11 μg/mL이었다.

이상의 실험결과를 바탕으로 용출실험에 적합한 분석법으로 사료된다.

3.4. 비교용출 평가

외부에서부터 알칼리성 코어로 확산하는 수소이온과 알칼리성 코어로부터 표면으로 확산하는 히드록실 이온이 반응할 수 있는 pH완충지역으로 인공위액 (pH 6.8)에서 용출시험을 실시하여 처방 (D1~D7)과 대조약 (넥시움 정)의 용출양상을 비교하여 Fig. 1에 나타내었다. 대조약인 넥시움정은 10분의 lag time이 관찰되었으며 초기 용출은 붕해제와 코팅 비율에 따라 영향을 받는 것으로 나타났다. 즉, 코팅비율을 전체 중량의 8.25%로 고정하고 붕해제인 크로스포비돈의 양을 15.00% (처방 D1)에서 2.50% (처방 D4)로 감소하였을 때 초기 붕해가 지연되어 5분의 lag time을 나타내었다 (Fig. 1(a)). 또한 붕해제를 15.00%로 고정하고 코팅비율을 8.25, 12.52 및 16.52%로 증가시킬수록 lag time이 서서히 증가하여 5분을 나타내었으나 10분의 대조약보다는 조금 빠른 경향을 나타내었다 (Fig. 1(b)).


Fig. 1. 
Dissolution profiles of esomeprazole magnesium dihydrate from various enteric-coated tablet containing esomeprazole magnesium dihydrate in simulated intestinal fluid (pH 6.8). Each value represents the average of six determinations ± the standard deviations. (a) The effect of 15% (Formulation D1) and 2.5% (Formulation D4) of disintegrating agents on dissolution profile at a coating ratio of 8.25%, (b) The effect of 8.25% (Formulation D1), 12.52% (Formulation D2), and 16.52% (Formulation D3) of coating ratio on dissolution profile at a disintegrating agent of 15%, (c) The effect of Povidone K30 and disintegrating agent on dissolution profile at a coating ratio of 16.52%.

또한, 코팅비율을 16.52%로 고정하고 붕해제인 크로스포비돈과 결합제인 포비돈 K30의 양을 달리하여 처방 D5, D6 및 D7을 제조하여 용출률을 검토한 결과를 Fig. 1(c)에 나타내었다. 즉, 크로스포비돈이 첨가되지 않은 처방 D6의 lag time은 15.00% 함유된 처방 D3과 비슷하였지만 lag time 이후에 처방 D3는 15분후에 급격하게 용출률이 증가하여 60%이상이었지만 처방 D6은 서서히 용출률이 증가되는 양상을 나타내어 전체적인 방출양상은 크로스포비돈의 양에 의해 결정되어지는 것으로 사료되며, lag time 이후의 방출양상이 대조약인 넥시움정과 일치하기 위해서는 적당한 크로스포비돈과 장용코팅의 비율이 중요한 것으로 판단된다. 따라서 코팅비율을 16.52%로 고정하고 크로스포비돈 1.25% 그리고 포비돈 K 30과 1:1.6의 중량비율로 혼합하여 첨가한 처방 D5와 D7을 비교하였을 때 포비돈 K30을 첨가한 경우 전체적인 방출양상은 비슷하였지만 결합력의 증가로 오히려 대조약보다 용출이 지연되어 15분의 lag time이 관찰되었다. 즉, 이는 Kumar 등 [27]의 연구결과에서처럼 사용하는 부형제나 결합제의 종류에 따라 ESMD의 초기 용출은 영향을 받을 수 있다는 것을 시사해주는 결과로서 친수성이 높을수록 다공성을 통해 빠르게 침투되어 수화되어 용해되기 때문이라 할 수 있다. 또한, 크로스포비돈을 1.25% 함유한 처방 D5는 대조약과 유사한 용출양상과 lag time을 나타내었다. 모든 처방에서 시간에 따라 용출률이 증가하지 않고 일정하게 유지되거나 감소하는 현상은 ESMD가 시간에 따라 분해되기 때문인 것으로 사료된다 [28].

이상의 결과를 바탕으로 ESMD의 용출률을 제어하기 위해서는 적당한 붕해제와 코팅비율을 가지도록 조절해야 할 것으로 판단된다. Fig 1의 방출곡선으로부터 방출시간에 따른 겉보기 약물방출속도 (Δ%/ΔTime)로 시간별 약물 방출양상을 추정할 수 있다 [29]. 코팅비율이 8.25와 12.52%에서는 5분 동안 급격한 방출이 이루어졌으나 16.52%로 증가시켰을 때 10분 정도의 lag time을 나타내면서 15분 이후에 급격한 방출 양상을 나타내었다. 즉, 산성에서는 ESMD의 안정성을 유지하며 pH 5.5 이상의 약산성 환경하에서 완전히 빠르게 용해시켜주는 장용성 코팅기제인 Acryl-EZE가 서서히 수화되어 용해되면서 약물이 방출되는 것으로 사료된다 [27]. 또한, 붕해제와 코팅비율을 조절함에 따라 처방 D5는 대조약인 넥시움 정과 가장 유사한 겉보기 약물 방출속도를 계속해서 유지하는 것을 볼 수 있었다 (Table 6). 유사인자 (ƒ2)는 0에서 100으로 나타내며, 0에 가까워질수록 두 용출 곡선의 유사성은 감소하고 100에 가까워질수록 두 용출 곡선이 완벽히 일치함을 보여주게 된다. 따라서 유사인자가 클수록 두 용출곡선의 유사성이 증가된다. 현실적으로 동일한 제품들을 대상으로 한 실험에서도 유사인자 수치가 100이 되는 경우는 거의 존재하지 않는다. 이는 batch와 batch 간 또는 로트와 로트 간의 편차가 항상 존재하기 때문이다. 일반적으로 차이인자 (f1)는 0~15, 유사인자는 50~100 범위 안의 수치를 나타내면 두 용출곡선은 유사한 것으로 간주되어진다. 즉, 여러 시점 각각에서 대조약과 시험약의 절대 평균률 차이가 10% 미만이면 유사인자 수치는 50 이상이 되어 두 제제의 용출곡선이 유사한 것으로 판정된다.

Table 6. 
Apparent release rate (Δ%/ΔTime) of reference and enteric-coated test tablet containing esomeprazole magnesium dihydrate in simulated intestinal fluid (pH 6.8)
Time (min) Apparent release rate (Δ%/ΔTime)
D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 Reference
5 12.33 12.40 0.00 0.06 0.00 0.00 0.00 0.00
10 0.38 0.31 0.77 12.35 0.00 1.43 0.00 0.00
15 1.32 1.33 10.95 0.87 2.90 1.55 0.00 1.43
30 0.10 0.09 0.65 0.27 2.58 1.04 1.38 2.88
45 0.03 0.03 0.25 0.03 0.70 1.58 1.36 0.94
60 0.06 0.06 0.00 0.01 0.36 1.20 0.82 0.19
90 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.53 0.03

비교용출시험 결과의 유사성을 비교하기 위해서 차이인자와 유사인자를 산출하였다. Table 7에 나타낸 바와 같이 처방 D5에서 차이인자는 4.04, 유사인자는 62.77로 FDA가 인정하는 용출유사성 범위에 가장 적합한 것으로 확인되어 안정성 시험을 진행하였다.

Table 7. 
Difference factor (f1) and similarity factor (f2) for reference versus enteric-coated test tablet containing esomeprazole magnesium dihydrate in simulated intestinal fluid (pH 6.8)
Formulation Difference factor (f1) Similarity factor (f2)
D1 41.74 24.00
D2 29.09 29.25
D3 18.90 39.50
D4 29.86 29.25
D5 4.04 62.77
D6 12.38 54.25
D7 14.13 45.25

3.5. 안정성 평가

처방 D5를 HDPE와 glass bottle에 넣고 가속조건 (40oC, 75% RH)에서 6개월 동안 보관하면서 온도, 습기 및 빛에 대한 영향을 관찰한 결과를 Table 8에 나타내었다. 즉, ESMD를 HDPE에 넣고 보관한 경우에는 보관기간동안 색의 변화가 관찰되지 않았지만, glass bottle에서는 60일 이후부터 갈색으로 변화하여 90일 이후부터는 어두운 갈색으로 급격하게 변색되었다. 그러나 실제 색깔의 변색이 일어나도 함량은 각각 96.54와 96.25%로 일정하게 유지되는 것으로 나타났다.

Table 8. 
The change of dissolution rate, content and physical appearance of esomeprazole dihydrate from enteric-coated tablet containing esomeprazole dihydrate during 6 months at 40oC, 75% RH in storage container of HDPE and glass bottle
Storage
container
Parameter Time (day)
0 30 60 90 180
HDPE Physical appearance + + + + +
Content (%) 99.23±0.90 100.21±0.27 97.86±0.21 98.21±0.47 96.54±0.21
Dissolution rate (%) 76.94±0.49 77.24±0.56 76.99±0.62 79.49±0.54 78.56±0.87
Glass bottle Physical appearance + + ++ +++ +++
Content (%) 99.23±0.90 99.98±0.08 97.21±0.05 97.38±0.41 96.25±0.35
Dissolution rate (%) 78.82±0.05 78.65±0.15 79.26±0.45 78.55±0.55 79.49±0.45
+ means a white or buff, ++ means a light brown, +++ means a brown, and ++++ means a dark brown.
Each value represents the average of three determinations ± the standard deviations.

HDPE와 glass bottle에서 모두 6개월 간 60분 이내에 도달하면서 70% 이상의 평균 용출률을 나타내는 것으로 보아 외관과 달리 용출률은 빛에 의해 영향을 받지 않는 것으로 나타났다.

가속조건 하에서 6개월간 안정성이 유지된다면 실온에서 3년 동안 안정성이 유지될 수 있으므로 [30] 개발된 ESMD을 함유하는 장용성 제제는 HDPE에 보관하여 빛을 차단하여 보관한다면 온도나 습기에 거의 영향을 받지 않고 3년 동안 안정성이 유지될 수 있을 것으로 기대된다.

이러한 결과는 알칼리화제를 함유하는 코어정 위에 약산성장용성 코팅 물질의 직접적인 접촉을 차단하여 적용한다면 ESMD와 같이 수분이나 온도의 영향을 받는 불안정한 물질의 안정성을 개선할 수 있는 제제학적인 방법으로 사료된다.


4. CONCLUSION

빛, 수분 및 온도에 영향을 받아 불안정하고 취급이 어려운 에스오메프라졸 마그네슘 이수화물을 함유하는 코어정 (나정), subcoating, 장용피복층 세 부분으로 구성된 장용성 제제를 개발하고자 알칼리화제 및 장용피층의 코팅 비율에 따른 in vitro 약물 방출을 통하여 시판제제와의 용출 특성 및 안정성을 평가하여 다음과 같은 결론을 얻었다.

1. ESMD는 유사 일차 반응식에 따라 분해가 일어났으며 인산일수소나트륨, 아르기닌 및 산화마그네슘에서의 반감기는 각각 1,155, 990 및 2,310일이었으며, 특히 10%의 산화마그네슘에서 가장 안정하였다.

2. 8.88~53.28 μg/mL의 농도범위에서 양호한 직선성 (R2=0.9997)을 나타내었고, 정량한계와 검출한계는 각각 1.11과 0.36 μg/mL이었다. 또한 정확성과 정밀성은 회수율과 표준편차가 각각 98.0~102.0%와 2.0% 이하로서 용출시험에 적합한 분석방법이었다.

3. 붕해제와 코팅비율을 조절하여 중성이나 알칼리성 미디움에서 신속히 용출되어질 수 있는 코어정, subcoating 및 장용성 코팅층으로 구성된 균일한 ESMD를 함유하는 안정한 장용성 제제를 제조할 수 있었다.

4. 대조약과 처방 D5의 용출률 차이는 10% 이내로 나타났으며, 차이인자 (f1)와 유사인자 (f2)는 각각 4.04과 62.77로서 0~15와 50~100 사이에 있는 것으로 나타나 제제학적 동등성이 있음을 확인하였다.

5. ESMD를 함유하는 장용성 제제는 HDPE에서 차광하여 6개월 동안 보관하였을 때 성상의 변화가 일어나지 않았고 함량과 용출률은 각각 96.54±0.21과 78.56±0.87%이었다.

이상의 실험 결과에 따라 코어정, subcoating 및 장용성 코팅층으로 구성된 약산성 장용성 코팅 물질의 직접적인 접촉을 피한 장용성 제제는 안정성을 개선할 수 있는 제제학적인 방법으로 기대된다.


References
1. Goh, K. L., (2004), Changing epidermaology of gastro esophageal reflux disease in the Asian-Pacific region: An overview, J. Gasroenterol. Hepatol, 19, pS22-S25.
2. Mullin, J. M., M. Gabello, L. J. Murray, C. P. Farrell, J. Bellows, K. R. Wolov, K. R. Kearney, D. Rudolph, and J. J. Thornton, (2009), Proton pump inhibitors: actions and reactions, Drug Discov. Today, 14, p647-660.
3. Kim, J. H., J. G. Oh, G. S. Khang, J. K. Jeong, J. S. Lee, S. Y. Jeung, and H. B. Lee, (2002), The effect of sodium alginate coating on the storage stability and dissolution rate of enteric coated Lansoprazole, J. Kor. Pharm. Sci, 32, p277-284.
4. Bisws, B. K., M. S. Islam, F. Begum, and A. S. S. Rouf, (2008), In vitro release kinetic study of esomeprazole magnesium from methocel K15M and methocel K100 LVCR matrix tablets, Dhaka Univ. J. Pharm. Sci, 7, p39-45.
5. Richter, J. E., P. J. Kahrilas, J. Johanson, P. Maton, J. R. Breiter, C. Hwang, V. Marino, B. Hamelin, and J. G. Levine, (2001), Efficacy and safety of esomeprazole compared with omeprazole in GERD patients with erosive esophagitis: A randomized controlled trial, Am. J. Gastroenterol, 96, p656-665.
6. Kristl, A., and F. Vrecer, (2000), Preformulation investigation of th novel proton pump inhibitor lansoprazole, Drug Dev. Ind. Pharm, 26, p781-783.
7. Baradell, L. B., D. Faulds, and D. McTavish, (1992), Lansoprazole: A review of its pharmacodynamic and pharmacokinetic properties and its therapeutic efficacy in acid-related disorders, Drugs., 44, p225-250.
8. Jeong, S. H., (2007), The implication of incrementally modified drug technology and the current trends in psychopharmacology, Korean J. Psychopharmacol, 18, p373-383.
9. Kim, J. J., S. Y. Lee, P. L. Rhee, S. J. Myung, J. H. Kim, M. Y. Gyu, S. Y. Kim, O. Y. Lee, J. S. Rew, Y. E. Joo, S. C. Choi, T. H. Kim, S. K. Kim, H. Y. Jeong, B. S. Lee, D. H. Kang, J. Y. Koo, and J. C. Rhee, (2003), Multicenter study to evaluate the effect of esomeprazole in Gastro-esophageal reflux disease, Korean J. Neurogastroenterol. Motil, 9, p92-101.
10. Pantoflickova, D., G. Dorta, M. Ravic, P. Jornod, and A. L. Blum, (2003), Acid inhibition on the first day of dosing: comparison of proton pump inhibitors, Aliment Pharmacol. Ther, 17, p1507-1514.
11. Ia, H., H. Stenhoff, and M. Liljeblad, (2007), Determination of esomeprazole and its two main metabolites in human, rat and dog plasma by liquid chromatography with tandem mass spectrometry, J. Chromatogra. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci, 848, p317-322.
12. Andersson, T., M. Hassan-Alin, G. Hasselgren, and K. Rohss, (2001), Drug interaction studies with esomeprazole, the (S)-isomer of omeprazole, Clin. Pharmacokinet, 40, p523-537.
13. Shim, C. K., Y. H. Han, J. S. Woo, and C. H. Lee, (1993), Effect of arginine of sodium phosphate dibasic on the stability of omeprazole in aqueous solution, J. Kor. Pharm, 4, p225-229.
14. Zhang, X., N. Sun, B. Wu, Y. Lu, T. Guan, and W. Wu, (2008), Physical characterization of lansoprazole/PVP solid dispersion prepared by fluid-bed coating technique, Powder Technol, 182, p480-485.
15. Ingmar, L. K., F. A. Gunnar, Y. Mitsuru, M. Satoshi, O. Minoru, and O. Naohiro, (1987), Omeprazole preparation for oral use, KR Patent 19870004132.
16. Tabata, T., T. Makino, J. Kikuta, S. Hirai, and N. Kitamori, (1994), Manufacturing method of stable enteric granules of a new antiulcer drug (lansoprazole), Drug Dev. Ind. Pharm, 20, p1661-1672.
17. Ho, H. O., H. L. Su, T. Tsai, and M. T. Sheu, (1996), The preparation and characterization of solid dispersions on pellets using a fluid bed system, Int. J. Pharm, 139, p223-229.
18. US Pharmacopeia National Formulary, (2003), USP 26-NF21, 3rd ed., p2439, Mack Printing Company, Easton, USA.
19. Ministry of Food and Drug Safety, Guideline on validation of analytical procedure, http://www.mfds.go.kr (2015).
20. Ministry of Food and Drug Safety, Guideline on bioequivalence test, http://nifds.go.kr (2016).
21. Yuksel, N., A. E. Kanik, and T. Baykara, (2000), Comparison of in vitro dissolution profiles by ANOVA-based, model-dependent and -independent methods, Int. J. Pharm, 209, p57-67.
22. Moore, J. W., and H. H. Flanner, (1996), Mathematical comparison of curves with an emphasis on in vitro dissolution profiles, Pharm. Tech, 20, p64-74.
23. Shah, V. P., Y. Tsong, P. Sathe, and J. P. Liu, (1998), In vitro dissolution profile comparison-statistics and analysis of similarity factor, f2. Pharm. Res, 15, p889-896.
24. Lee, Y. J., W. K. Whang, and S. W. Cho, (2009), Effect of other medications on the stability of omeprazole in aqueous solution for the peptic ulcer disease, J. KAIS, 11, p3494-3499.
25. Kim, Y. J., (1995), Stabilization of omeprazole by complexation with ethylenediamine, M.S. Thesis, Ewha Womans University, Seoul, Korea.
26. Lee, E. J., K. D. Han, H. J. Shin, J. W. Kim, and C. K. Kim, (1997), Effect of L-arginine on the stability of omeprazole, J. Kor. Pharm. Sci, 27, p23-27.
27. Kumar, P. R., S. Shyale, M. M. Gouda, and S. M. S. Kumar, (2011), Development of tablet formulation of enteric coated esomeprazole with Acrl EZE, Der Pharmacia Sinica, 2, p31-42.
28. Nexium®, http://www.rxlist.com/nexium-drug.htm (2017).
29. Yoon, Y. N., S. J. Kim, S. H. Jung, H. J. Kim, E. S. Park, S. J. Hwang, Y. W. Lee, H. S. Seong, B. C. Chin, and S. H. Cho, (2009), Pharmacokinetic evaluation and gastric ulcer symptoms comparison of ketorolac tromethamine sustained release pellets after oral administration in beagle dogs, J. Pharm. Sci, 39, p401-409.
30. Ministry of Food and Drug Safety, Guideline on stability test, http://nifds.go.kr (2014).