The Korean Society For Biotechnology And Bioengineering

Current Issues

Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 33 , No. 3

[ Research Paper ]
Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 32, No. 4, pp.245-250
Abbreviation: KSBB J
ISSN: 1225-7117 (Print) 2288-8268 (Online)
Print publication date 31 Dec 2017
Received 24 Jul 2017 Revised 01 Oct 2017 Accepted 01 Nov 2017
DOI: https://doi.org/10.7841/ksbbj.2017.32.4.245

제주산 왁스애플 추출물의 항염 활성
김민진1, ; 이주영2, ; 김상숙3 ; 성기철4 ; 임찬규4 ; 박경진3 ; 안현주3 ; 최영훈3 ; 김승영5, * ; 이남호2 ; 현창구2, *
1국립낙동강생물자원관
2제주대학교 화학·코스메틱스학과
3농촌진흥청 국립원예특작과학원 감귤연구소
4농촌진흥청 국립원예특작과학원 온난화대응농업연구소
5선문대학교 BT융합제약공학과

Anti-inflammatory Activity of Wax apple (Syzygium samarangense) Extract from Jeju Island
Min-Jin Kim1, ; Juyeong Lee2, ; Sang Suk Kim3 ; Ki Cheol Seong4 ; Chan Kyu Lim4 ; Kyung Jin Park3 ; Hyun Joo An3 ; Young Hun Choi3 ; Seung-Young Kim5, * ; Nam Ho Lee2 ; Chang-Gu Hyun2, *
1Nakdonggang National Institute of Biological Resources, Gyeongbuk 37242, Korea
2Department of Chemistry and Cosmetics, Jeju National University, Jeju 63243, Korea, Tel: +82-64-754-3542, Fax: +82-64-756-3561 (cghyun@jejunu.ac.kr)
3Citrus Research Institute, National Institute of Horticulture and Herbal Science, RDA, Seogwipo 63607, Korea
4Agricultural Research Institute for Climate Change, National Institute of Horticulture and Herbal Science, RDA, Jeju 63240, Korea
5Department of BT Convergent Pharmaceutical Engineering, Sunmoon University, Chungnam 31460, Korea, Tel: +82-41-530-2390, Fax: +82-41-530-2939 (sykim01@sunmoon.ac.kr)
Correspondence to : Department of BT Convergent Pharmaceutical Engineering, Sunmoon University, Chungnam 31460, Korea Tel: +82-41-530-2390, Fax: +82-41-530-2939 e-mail: sykim01@sunmoon.ac.kr
Correspondence to : Department of Chemistry and Cosmetics, Jeju National University, Jeju 63243, Korea Tel: +82-64-754-3542, Fax: +82-64-756-3561 e-mail: cghyun@jejunu.ac.kr
Contributed by footnote: These two authors contributed equally.


© 2017 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering
Funding Information ▼

Abstract

The present study aimed to investigate comparative anti-inflammatory effects of Syzygium samarangense (SS, Wax apple) leaf and branch extract considering the balance of safety and efficacy. SS is a plant species in the family Myrtaceae, native to an area that includes the Greater Sunda Islands, Malay Peninsula but now cultivated in Jeju Island. Dose response studies were conducted to determine the inhibitory effect of extracts on the expression of inflammatory enzymes: Prostaglandin (PGE2) and nitric oxide (NO) inflammatory cytokine production, TNF-α, interleukin (IL)-6, interleukin (IL)-1β and inducible nitric oxide synthase (iNOS), and cyclooxygenase (COX-2) in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated RAW 264.7 cells. As a result, SS were shown higher anti-inflammatory activity. SS inhibited production of PGE2, NO and mRNA expression of iNOS, COX-2 and decreased TNF-α, IL-6, IL-1β induced by LPS stimulation in RAW 264.7 cells. SS at 800 μg/mL showed inhibitory effects on almost all the inflammatory mediators we examined except for all study regulation. In conclusion, this study suggest that SS could be a potential source as a new natural anti-inflammatory agent.


Keywords: cosmetic, Syzygium samarangense, anti-inflammatory, wax apple

1. INTRODUCTION

염증은 인체에 발생하는 가장 흔한 질환 중의 하나이며 화학적 또는 물질적 조직 손상, 병원체의 감염 등으로부터 인체를 보호하기 위해 일어나는 1차적 면역 반응이지만, 염증 반응이 과도해지면 동맥경화증, 기관지염, 류마티스 관절염, 천식, 다발성 경화증 등을 유발하는 원인이 된다고 보고되어 있다 [1]. 체내 염증과정에서는 과량의 nitric oxid (NO) 및 prostaglandin E2 (PGE2) 중의 염증인자가 NO synthase (NOS) 및 cyclooxygen (COX)에 의해 형성되는데, 이중 NO synthase는 NOS 라는 유도성 또는 상존성 효소에 의하여 생성되는 반응성 radical로서 체내 방어기능, 신호전달기능, 신경독성, 혈관확장 등의 다양한 생리 기능을 가지고 있다 [2-5]. 대식세포는 염증 유발물질 lipopolysacharid (LPS)에 의해 cyclooxygenase-2 (COX-2)/prostaglandin E2 (PGE2)와 inducible nitric oxide synthase (iNOS)/nitric oxide (NO)의 생성이 증가되고 염증성 cytokine인 tumor necrosis factor-alpha (TNF-α), interleukin-1 (IL-1), IL-6 분비가 증가된다고 알려져 있으며 그 세포내 신호전달경로도 알려져 있다 [6,7]. Interleukin-6 (IL-6)는 전 염증성 및 항 염증성 cytokine으로 작용하는 인터루킨이다. IL-6는 외상, 특히 화상이나 기타 조직 손상에 대한 면역 반응을 자극하여 염증을 일으키는 T 세포와 대식세포에 의해 분비된다. 또한, IL-6는 신경계, 내분비계 및 골에서 일어나는 다양한 생리학적 사건을 조절한다. COX에는 COX-1 및 COX-2가 존재하며 COX-1은 대부분의 세포에서 지속적으로 발현되고 항상성을 유지하는 프로스타글란딘 생산에 관여한다 [8]. 또한, COX-2는 염증성 자극에 반응하여 염증 세포에서 상향 조절되고 염증 부위에서 프로스타글란딘 생산에 관여하는 것으로 알려져 최근 COX-2 억제제의 유용성에 대한 관심이 증가하고 있는 추세이다 [9-12].

왁스애플 (Wax apple)은 도금양과 (Myrtaceae)에 속하며 학명은 Syzygium samarangense로서 열매를 식용하는 것으로 알려져 있으며, 꽃과 열매는 잎과 가지부분에 국한되지 않으며, 줄기와 가지 표면 거의 모든 지점에 맺힐 수 있어, 성숙된 나무는 최대 700개의 과일을 수확한다. 왁스애플은 말레이시아가 원산지 이지만 필리핀을 비롯한 동남아 지역에서 많이 재배하고 있으며 최근에는 따뜻해지는 기후로 인해 우리나라 제주도에서도 생산하고 있다 [13]. 왁스애플의 효능으로는 해열·이뇨 작용, 혈압강하 [14], 항산화 [15,16] 작용이 있다고 알려져 있으나 왁스애플의 가지 및 잎 추출물을 이용한 항염증 효과에 대하여 보고된 바는 거의 없는 실정이다. 본 연구에서는 왁스 애플의 잎과 가지 추출물을 이용하여 LPS로 활성화된 대식세포에서 NO 생성 억제활성, prostaglandin E2 (PGE2), 전염증성 cytokines (TNF-α, IL-6, IL-1β) 생성 억제 활성과 염증성 단백질 발현에 미치는 영향을 비교 분석하여, 항염증 활성을 갖는 천연 소재로의 활용 가능성을 탐색하고자 하였다.


2. MATERIALS AND METHOD
2.1. 왁스애플 추출물 제조

본 연구에 사용된 왁스애플 (Syzygium samarangense)은 2016년 제주도에서 채집되었으며, 채집된 잎과 가지는 70% 에탄올을 이용하여 24시간동안 실온 침출하여 사용하였다. 각각의 침출액은 필터를 이용하여 여과한 후 감압농축기를 사용하여 농축하였으며, 농축된 추출물은 -20°C에서 동결 건조하여 PBS (phosphate buffer saline)에 용해하여 실험에 사용하였다.

2.2. 세포 배양

Murine macrophage cell line인 RAW 264.7 세포는 ATCC (American Type Culture Collection)로부터 분양받아 100 units/mL penicillin-streptomycin과 10% fetal bovine serum (FBS)이 함유된 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Gibco, Grand Island, NY, USA) 배지를 사용하여 37°C, 5% CO2 항온기에서 3일 간격으로 계대 배양을 실시하였다.

2.3. 세포 독성 측정

왁스애플의 독성은 RAW 264.7 cell를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 3.0 × 105 cells/mL로 24 well plate에 넣고 18시간 배양 후 시료와 LPS (1 μg/mL)를 동시 처리하여 24시간 배양하였다. 이후 배양 배지를 3,000 rpm에서 5분간 원심분리 하였다. lactate dehydrogenase (LDH) assay는 nonradioactive cytotoxicity assay kit (Promega, WI, USA)를 이용하여 측정했으며, 96 well plate에 원심 분리하여 얻은 배양 배지 50 μL와 reconstituted substrate mix 50 μL를 넣고, 실온에서 30분 반응시킨 후 50 μL의 stop solution을 넣고 microplate reader (Bio-TEK Instruments Inc., Vermont, WI, USA)를 사용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료군에 대한 흡광도 값을 구하였으며, 대조군의 흡광도 값과 비교하여 세포독성을 평가하였다.

2.4. Nitric oxide (NO) 생성 억제 활성 측정

RAW 264.7 세포 (3.0 × 105cell/mL)를 18시간 전배양 후 시료와 LPS (1 μg/mL)를 동시 처리하여 24시간 배양하고, 생성된 NO는 Griess 시약을 이용하여 세포 배양액 중에 존재하는 NO2-의 형태로 측정하였다. 세포배양 상층액 100 μL와 Griess 시약을 동량 혼합하여 10분간 실온암소에서 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준농도 곡선은 sodium nitrite (NaNO2)를 serial dilution하여 얻었다 (10~100 uM).

2.5. Prostaglandin E2 (PGE2) 생성 억제 활성 측정

RAW 264.7 세포 (3.0 × 105cell/mL)에 시료와 LPS (1 μg/mL)를 동시 처리하여 24시간 배양하고, 배양 배지를 원심분리(12,000 rpm, 3 min)하여 얻어진 상층액의 PGE2 함량을 측정하였다. 모든 시료는 정량 전까지 냉동보관 (-20°C)하였다. PGE2는 mouse enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 정량하였으며 standard에 대한 표준곡선의 r2값은 0.99 이상이었다.

2.6. 전염증성 cytokines (TNF-α, IL-6, IL-1β) 생성 억제 활성 측정

RAW 264.7 세포는 3.0 × 105cell/mL로 조절한 후 전배양하여 시료와 LPS (1 μg/mL)를 동시 처리하여 24시간 배양하고, 배양 배지를 원심분리 (12,000 rpm, 3 min)하여 얻어진 상층액의 전염증성 cytokine 생성 함량을 측정하였다. 모든 시료는 정량 전까지 냉동보관 (-20°C)하였다. 전염증성 cytokine은 mouse enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 정량하였으며 standard에 대한 표준곡선의 r2값은 0.99 이상이었다.

2.7. Western blot analysis

RAW 264.7 세포 (1.0 × 106cell/mL)를 18시간 전 배양 후 시료와 LPS (1 μg/mL)를 동시 처리하여 24시간 배양하였다. 이후 세포를 PBS로 2회 세척하고 lysis buffer [1×RIPA (Upstate Cell Signaling Solution, Lake Placid, NY, USA), 1 mM pheylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 1 mM Na3VO4, 1 mM NaF, 1 μg/mL aprotinin, 1 μg/mL pepstain, and 1 μg/mL leupeptin]를 이용해 1시간 동안 lysis 시킨 후 원심분리하여 단백질 상등액만 분리하였다. 단백질 농도는 BSA kit (Bio-Rad, USA)를 이용하여 정량하였다. 정량한 단백질을 8~12%의 polyacrylamaide gel에 전기영동하고 Poly-vinylidene difluoride (PVDF) membrane (Milipore, USA)에 200 mA, 2시간 동안 전이시켰다. 단백질이 전이된 membrane을 5% 탈지분유를 포함한 0.05% Tween 20/Tris-buffered saline (0.05% T/TBS)에 넣고 상온에서 blocking 시킨 후, 1차 항체와 반응시켰다. 1차 항체반응은 iNOS antibody (1:5000, Calbiochem, USA), COX-2 antibody (1:1000, BD Biosciences Pharmingen, USA), β-actin antibody (1:10,000, Sigma, USA)를 이용하여 4°C에서 24시간 반응시킨 후 TBST로 4회 세척한 다음 2차 항체 (Jackson ImmunoResearch, USA)를 1:5,000 또는 1:10,000으로 희석하여 상온에서 1시간 반응한 뒤 TBST로 3회 세척하였다. 단백질은 ECL kit (Bio-Rad, USA) 사용하여 imaging densitometer (model GS-700, Bio-rad, USA)를 통해 측정하였다.

2.8. 통계처리

실험결과는 mean±S.D.으로 나타냈으며 student's t-test로 통계학적 유의성을 검증하였다.


3. RESULTS AND DISCUSSION
3.1. 왁스애플 추출물의 세포 독성 측정

마우스의 대식세포인 RAW 264.7 세포에 대한 왁스애플 추출물의 세포독성을 알아보기 위해 LDH분석을 이용하여 세포생존율을 조사하였다. LPS (1 μg/mL)의 단독처리 또는 왁스 애플의 잎과 가지추출물을 각각 200, 400, 800 μg/mL로 동시에 처리하여 24시간 배양한 후 LDH assay에 의해 확인한 결과, 왁스애플 부위별 추출물의 LDH 활성은 800 μg/mL에서 대조군 대비 0% 이하의 활성이 관찰되었으므로 왁스애플 추출물은 RAW 264.7 세포에서 800 μg/mL 이하의 농도에서는 세포독성이 낮아 세포의 생존율에 영향을 주지 않는다는 사실을 알 수 있었다 (Fig. 1). 따라서 NO 생성 억제 활성과 PGE2, 전염증성 cytokine 생성 억제 활성 연구는 800 μg/mL의 농도까지 실험을 진행하였다.

3.2. 왁스애플 추출물의 Nitric oxide (NO) 생성 억제 활성

본 연구에서는 활성산소 중 염증 유발에 중요한 역할을 한다고 알려진 Nitric oxide (NO)의 생성에 왁스애플 추출물이 어떤 영향을 미치는지 알아보았다 (Fig. 1). RAW 264.7 세포에 왁스애플 각 부위별 (잎, 가지) 추출물 (200, 400, 800 μg/mL) 과 LPS (1 μg/mL)를 동시 처리하여 24시간 배양한 후 생성된 NO의 양은 Griess 시약을 이용하여 세포 배양액에 존재하는 NO2-의 형태로 측정하였다. 측정한 결과, LPS 단독 처리군은 NO의 생성을 유도하는 것을 관찰할 수 있었으며, 잎과 가지 추출물은 LPS 단독 처리군에 비교했을 때 200 μg/mL농도에서 각각 90.6%, 55.1%로 NO 생성을 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 최고농도인 800 μg/mL에서는 49.8%, 24.4%로 억제하는 것으로 확인하였다. 이를 통해 가지추출물이 잎추출물보다 강한 NO 생성 억제 활성이 있는 것으로 추측할 수 있다.


Fig. 1 
Inhibitory effects of Syzygium samarangense extract on nitric oxide production in RAW 264.7 cells. The production of nitric oxide was assayed in the culture medium of cells stimulated with LPS (1 μg/mL) for 24 h in the presence of Syzygium samarangense extract (200, 400 and 800 μg/mL). Cytotoxicity was determined by LDH assay. Values are the mean±SEM of triplicate experiments. *p<0.05; **p<0.01.

3.3. Prostaglandin E2 (PGE2) 생성 억제 활성

Nitric oxide (NO) 생성 억제 활성 측정과 동일한 조건으로 PGE2 ELISA kit를 이용하여 PGE2 생성 억제 활성을 측정한 결과, 잎과 가지추출물은 LPS단독 처리군과 비교했을 때, 각각의 처리 농도에서 PGE2의 생성에 농도 의존적으로 억제 효과가 있는 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 2). 최고농도인 800μg/mL농도에서는 잎과 가지 추출물의 활성이 42%와 6.3%로 나타나 가지 추출물이 잎 추출물보다 PGE2 생성 억제에 효과가 더 좋은 것으로 나타냈다.


Fig. 2 
Inhibitory effects of Syzygium samarangense extract on PGE2 production in RAW 264.7 cells. The production of PGE was assayed in the culture medium of cells stimulated with LPS (1 μg/mL) for 24 h in the presence of Syzygium samarangense extract (200, 400 and 800 μg/mL). Values are the mean±SEM of triplicate experiments. *p<0.05; **p<0.01.

3.4. 전염증성 cytokines (TNF-α, IL-6, IL-1β) 생성 억제 활성

Cytokine은 면역세포가 분비하는 단백질로서 면역세포의 활성, 증식 및 분화를 조절하여 염증반응을 매개하는 인자이다.염증성 질환의 원인과 치료를 규명하기 위하여 cytokine의 역할은 매우 중요하며, TNF-α, IL-1β 및 IL-6은 in vitroin vivo 모두에서 염증반응을 조절하는 물질로 대표적인 pro-inflammatory cytokine으로 알려져 있다 [17]. RAW 264.7 세포에서 왁스애플 각 부위별 (잎, 가지) 추출물이 전염증성 cytokine인 TNF-α, IL-6 및 IL-1β의 발현에 미치는 영향을 ELISA kit를 이용하여 조사하였다. 왁스애플 각 부위별 (잎, 가지) 추출물 (200, 400, 800 μg/mL)과 LPS (1 μg/mL)를 동시 처리하여 24시간 배양한 후 TNF-α의 생성 억제 활성을 확인한 결과 LPS 단독 처리 군과 비교했을 때 잎과 가지추출물 모두 농도 의존적으로 TNF-α의 생성을 억제시키는 것으로 확인되었으며 최고농도인 800 μg/mL에서 왁스애플 잎추출물의 억제 활성이 67.7%, 가지추출물의 억제 활성이 41.7%로 나타나 가지추출물이 잎추출물보다 TNF-α 생성 억제에 보다 더 좋은 활성이 있는 것으로 확인되었다 (Fig. 3). IL-6의 생성 억제 활성은 400 μg/mL에서 잎과 가지 추출물은 72.9%, 9.5%의 활성이 나타났으며 유의적으로 농도 의존적으로 감소하는 수치가 나타나 IL-6생성 억제에 효과가 있는 것으로 확인되었다 (Fig. 4). 또한, IL-1β의 발현에 미치는 영향을 조사한 결과 TNF-α, IL-6와 마찬가지로 농도 의존적으로 활성이 억제되는 것을 확인할 수 있었으며 TNF-α, IL-6와 동일하게 가지 추출물의 활성이 잎 추출물의 활성보다 높은 억제효과를 가진 것으로 나타났다 (Fig. 5).


Fig. 3 
Inhibitory effects of Syzygium samarangense extract on TNF-α production in RAW 264.7 cells. The production of TNF-α was assayed in the culture medium of cells stimulated with LPS (1 μg/mL) for 24 h in the presence of Syzygium samarangense extract (200, 400 and 800 μg/mL). Values are the mean±SEM of triplicate experiments. *p<0.05; **p<0.01.


Fig. 4 
Inhibitory effects of Syzygium samarangense extract on IL-6 production in RAW 264.7 cells. The production of IL-1β was assayed in the culture medium of cells stimulated with LPS (1 μg/mL) for 24 h in the presence of Syzygium samarangense extract (200, 400 and 800 μg/mL). Values are the mean±SEM of triplicate experiments. *p<0.05; **p<0.01.


Fig. 5 
Inhibitory effects of Syzygium samarangense extract on IL-1β production in RAW 264.7 cells. The production of IL-1β was assayed in the culture medium of cells stimulated with LPS (1 μg/mL) for 24 h in the presence of Syzygium samarangense extract (200, 400 and 800 μg/mL). Values are the mean±SEM of triplicate experiments. *p<0.05; **p<0.01.

3.5. Western blot을 통한 iNOS 및 COX-2 단백질 발현 억제 효과 측정

염증반응에서 NO 및 PGE2의 생성은 염증반응에 관여하는 효소인 iNOS 및 COX-2에 의해 각각 조절된다고 알려져 있다 [18,19]. 왁스애플의 잎과 가지추출물에 의한 NO 생성 저해 기전을 확인하기 위해 western blot을 실시하여 iNOS의 단백질 발현을 측정하였으며, PGE2의 형성 저해 기전을 확인하기 위해 COX-2의 발현을 측정하였다. 실험한 결과, Fig. 6에서와 같이 LPS에 의해 증가된 iNOS와 COX-2 단백질 발현양이 왁스애플 잎과 가지 추출물을 처리하였을 때 농도 의존적으로 감소된 것을 확인할 수 있었으나, NO와 PGE2의 생성 억제 결과와 달리 잎 추출물이 가지 추출물에 비해 더 높은 iNOS와 COX-2 단백질 발현을 억제하는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 Kwak과 Lee [20]의 달맞이순 추출물이 농도 의존적으로 IL-6 생성을 감소시키는 결과를 나타냈으나, 동일조건에서 TNF-α에는 영향을 나타내지 않는 것처럼 비슷한 결과를 나타냈었다. 그러나왁스애플 각 추출물이 NO 분비조절과 전염증성 cytokine 생성 억제 활성에 미치는 영향과 동일한 패턴의 결과로, 왁스애플의 각 부위별 추출물은 모두 iNOS 및 NO 조절 경로를 거치며 COX-2 발현 조절에도 관련이 있는 것으로 사료된다.


Fig. 6 
Inhibitory effects of Syzygium samarangense extract on the protein level of iNOS and COX-2 expression in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. Cells (1.0×106 cells/ml) were preincubated for 18 hr, and then treated with LPS (1 μg/mL) and Sample for 24 hr. The protein levels of iNOS, COX-2 were analyzed by Western blot.


4. CONCLUSION

본 연구에서는 왁스애플 잎과 가지 추출물의 항염 효과를 확인하기 위해 Nitric oxide (NO) 저해 활성, Prostaglandin E2 생성 저해 활성 및 전염증성 cytokines 생성 억제 활성을 확인하였다. 왁스애플 추출물의 항염 활성을 확인하기 위해 LPS로 염증이 유도된 대식세포에서 NO 저해 활성을 분석한 결과 왁스애플 가지추출물이 잎추출물보다 탁월하게 NO를 저해하는 것을 알 수 있었다. 또한, PGE2 생성 억제 활성을 측정한 결과에서도 왁스애플 잎과 가지추출물은 LPS단독 처리군과 비교했을 때, PGE2의 생성을 크게 억제 하는 것으로 나타났다. 더군다나 면역세포가 분비하는 단백질로서 면역세포의 활성, 증식 및 분화를 조절하여 염증반응을 매개하는 인자인 전염증성 cytokine에 왁스애플 추출물이 어떠한 영향을 미치는지 연구한 결과, 왁스애플 추출물은 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 모두에서 활성을 억제시키는 것으로 나타나 항염증 효능이 우수한 것으로 확인되었다. 마지막으로 Western blot을 통하여 염증반응에 관여하는 효소인 iNOS 및 COX-2 단백질 발현 억제 효과를 측정한 결과, 왁스애플 추출물은 iNOS 및 COX-2의 발현을 농도의존적으로 현저히 감소시키는 것으로 나타났다. 따라서 이상의 연구결과는 왁스애플 추출물이 독성이 적은 항염증 효능을 가진 기능성 화장품 소재로써 개발 가능성이 있다고 사료된다.


Acknowledgments

이 논문은 농촌진흥청 연구사업 (세부과제번호: PJ01093408 2015)의 지원을 받아 수행된 연구입니다.


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