The Korean Society For Biotechnology And Bioengineering

Current Issues

Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 33 , No. 3

[ Research Paper ]
Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal - Vol. 32, No. 4, pp.265-270
Abbreviation: KSBB J
ISSN: 1225-7117 (Print) 2288-8268 (Online)
Print publication date 31 Dec 2017
Received 21 Sep 2017 Revised 23 Oct 2017 Accepted 01 Nov 2017
DOI: https://doi.org/10.7841/ksbbj.2017.32.4.265

Collagen Binding Domain (CBD)과 융합된 재조합 Epidermal Growth Factor (EGF)의 과발현 및 가용화의 최적화
강민정1 ; 김동균2 ; 장원제1 ; 조화진1 ; 김장호1 ; 탁진영1 ; 양승환3 ; 김진만3, *
1부경대학교 생물공학과
2국립수산과학원 생명공학과
3전남대학교 생명산업공학과

Investigation of Optimal Condition for Overexpression and Solubilization of the Recombinant Epidermal Growth Factor (EGF) Fused with Collagen Binding Domain (CBD)
Min Jung Kang1 ; Dong-Gyun Kim2 ; Won Je Jang1 ; Hwa Jin Cho1 ; Jang-Ho Kim1 ; Jin Yeong Tak1 ; Seung Hwan Yang3 ; Jin Man Kim3, *
1Department of Biotechnology, Pukyong National University, Busan 48513, Korea
2Biotechnology Research Division, National Institute of Fisheries Science, Busan, 46083
3Department of Biotechnology, Chonnam National University, Yeosu 59626, Korea, Tel: +82-61-659-7304, Fax: +82-61-659-7300 (jinmank@jnu.ac.kr)
Correspondence to : *Department of Biotechnology, Chonnam National University, Yeosu 59626, Korea Tel: +82-61-659-7304, Fax: +82-61-659-7300 e-mail: jinmank@jnu.ac.kr


Copyright Ⓒ 2017 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering

Abstract

Previously, we constructed the recombinant plasmid which containing human epidermal growth factor and collagen binding domain for overproduction of fused biofunctional protein. However, this fusion protein was expressed in Escherichia coli as insoluble protein form in cytoplasm. Therefore, effective denaturation and dialysis process is critical for solubilization and refolding in protein purification process. We attempted several chemicals and buffer conditions for induction, dialysis, and solubilization. Using lactose instead of isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, expression of target protein was induced. 20 mM tris-HCl buffer for dialysis was suitable for the activity and soluble form of fusion protein. Furthermore, for the solubility of expressed inclusion protein, we conducted with various pH conditions and concentrations of urea and guanidine hydrochloride. The efficient solubility of inclusion body form of fusion protein was showed at alkaline pH condition containing urea.


Keywords: collagen binding domain, human epidermal growth factor, inclusion body, solubilization

1. INTRODUCTION

일반적으로 글리코실화반응과 같은 번역 후 변형이 필요하지 않는 재조합 단백질의 생산을 위한 균주로써 Escherichia coli 를 사용하며, 단백질 과량발현 체계로써 pET 발현 체계를 주로 사용한다. 이는 E. coli가 오랫동안 다양한 연구가 진행되어 유전학적으로 매우 잘 밝혀져 있기 때문이다 [2,9,11,12]. 또한 pET 발현 체계의 경우에는 T7 프로모터 등의 매우 강력한 프로모터 영역을 가지고 있으며, isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 와 같은 유도 물질의 첨가만으로 목적 단백질의 과발현을 유도할 수 있다 [4,6,8,11]. 추가적으로 polyhistidine tag과 같은 재조합 단백질 생산과정에서 매우 유용한 fusion partner를 가져 발현 후 affinity 정제 과정을 이용하여 효과적으로 목적 단백질만을 분리할 수 있다. 하지만 E. coli 내에서 pET 발현 체계를 이용하여 목적 단백질을 과발현하기 위해서는 IPTG와 같은 유도 물질이 있어야 한다. 산업적인 대량 생산을 위해서는 이러한 유도 물질의 생산 비용을 고려하여 가장 효과적인 유도 물질을 선정하는 것이 매우 중요하다.

E. coli와 pET 발현 체계를 이용한 방법은 종종 진핵 생물의 단백질을 생산할 때 봉입체 (inclusion body)라는 in vivo 상태에서 불용성 형태의 비활성 aggregate form의 단백질을 생산한다 [4,6,8,9,11]. 이는 세포질 내에서 불용성의 형태로 발현되며, 활성을 위하여 in vitro 상에서 재접힘 (refolding) 과정을 통한 aggregate form의 단백질 비율을 낮추어야 한다 [7,9,11]. 불용성 형태의 봉입체는 발현 수율이 매우 높으며, 정제과정 시 원심분리만으로도 높은 순도의 목적 단백질을 분리 할 수가 있다 [7,9]. 그리고 불용성의 aggregate 형태로 발현되기 때문에 숙주 세포, 또는 외부의 단백질 분해 효소로부터 안정적이며, 발현 목적 단백질이 숙주 세포에 유독한 단백질인 경우에 숙주 세포의 성장을 저해하지 않는다 [7,9]. 그러나 이러한 장점에도 불구하고, 재접힘 효율이 좋지 않으면 활성에 큰 영향을 미치기 때문에 항원 단백질이나 재접힘 효율이 우수한 단백질 등에 적합하다 [7].

E. coli에서 발현되는 단백질이 봉입체를 형성하는 것을 막기 위하여, 낮은 발현 유도 온도, 최소배지조성, 신호 펩타이드를 이용하여 가용성의 목적단백질의 발현을 유도한다 [3,7,9]. 그러나 이러한 조건은 숙주 세포 내의 전체 단백질 발현 수율을 저하시킬 수 있다 [7,9]. 따라서, E. coli 내에서 봉입체 형태로 발현된 단백질은 가용성의 형태로 전환이 필요하며, 또한 적절한 재접힘 단계를 거쳐 활성이 있는 상태를 형성하는 것이 매우 중요하다 [7,9,11].

일반적으로 봉입체를 가용성으로 바꾸기 위해서 urea, guanidine hydrochloride (Gn-HCl), 그리고 thiocyanate 등의 chaotropic 물질을 이용하여 변성시킴으로써 용해도를 증가시킨다 [9,11]. 그러나 이러한 chaotropic 물질에 의한 변성은 재접 힘의 효율을 떨어지게 하며, 높은 농도 처리 시 활성의 유무에 영향을 미친다. 따라서 mild한 변성 조건을 통한 봉입체의 가용화의 구축과 적절한 재접힘 방법의 선택을 통한 활성을 가지는 형태로의 회복이 불용성 단백질의 성공적인 생산을 위하여 필요하므로 본 연구는 대장균에서 EGF의 발현 및 재접힘 최적 조건을 검토하였다.


2. MATERIALS AND METHOD
2.1. 균주 및 배양조건

본 실험에 사용한 균주 및 vector는 Table 1에 나타내었다. E. coli BL21 (DE3) 균주는 목적 단백질을 발현하기 위하여 사용하였으며 Luria-Bertani (LB) 배지를 사용하여 37°C에서 배양하였다. 배양 시 ampicillin (100 μg/mL) 을 첨가하여 배양하였다.

Table 1. 
Strain and plasmids used in this study
Strain or plasmid Relevant characteristics Source or reference
Escherichia coli BL 21 (DE3) F-ompT hsdSB(r B- mB-)gal dcm (DE3) Novagen
pET-28a(+) His-tag fusion expression vector; Ampr, T7 promoter, Six-histidine tag coding sequence Novagen
pEGF-CBD pET-28a(+) with collagen-binding domain fused epidermal growth factor [5]

2.2. EGF-CBD 단백질의 유도발현

pET-28a(+) vector에 collagen binding domain (CBD)과 human epidermal growth factor (EGF)가 융합된 fragment가 삽입된 plasmid 및 이를 E. coli BL21 (DE3)에 형질 전환하여 선별한 형질 전환체를 이전의 선행 연구과정에서 구축하였다 [5]. 따라서 본 연구에서 이 균주를 pEGF-CBD라고 명명하였으며, LB 배지에 ampicillin (100 μg/mL)을 첨가하여 37°C에서 배양하였다. 배양 중 세포는 optical density (O.D.) 600 nm를 사용하여 측정하였다. 배양액의 OD600=0.4에 도달하였을 때 1 M 의 IPTG를 최종농도가 1mM이 되도록, 그리고 lactose의 최종 농도가 1 mM이 되도록 각각 처리하였다. IPTG 및 lactose 를 처리한 뒤 4시간 동안 배양하여 EGF-CBD 단백질의 발현을 유도하였다. 4시간 뒤 각각의 배양액을 원심 분리하였다. 상층액을 제거하고 침전물은 protein sample buffer와 섞은 뒤 10분간 끓이고, 얼음에서 10분간 처리한 뒤 원심 분리를 통하여 가용성 분획만을 수집하였다. 이렇게 만들어진 sample들은 단백질의 농도를 동일하게 맞춘 뒤 SDS-PAGE를 통하여 발현 특징을 분석하였으며 coomassie blue 염색법을 통하여 가시화하였다. 또한 대조군으로서 IPTG 및 lactose를 첨가하지 않은 균체의 단백질을 수거하여 EGF-CBD 단백질의 대량 발현의 유무를 확인하였다.

2.3. Lactose를 이용한 과발현
2.3.1. 배양시간에 따른 과발현

OD600에서 배양액의 현탁도를 측정하여 0.4 값이 되는 순간 1 M의 lactose를 최종 농도 1 mM이 되도록 처리한 뒤 배양 시간에 따른 단백질의 발현 양을 측정하였다. Lactose를 처리한 뒤 1시간마다 샘플을 수집하여 최대 6시간까지 배양액 샘플을 수집하였다. Lactose를 처리하지 않은 대조군 및 lactose를 처리한 배양액을 원심 분리하여 균체를 모았으며, 이 때 수집한 침전물을 sample buffer와 혼합하여 끓인 뒤 동일한 양의 단백질을 SDS-PAGE에 loading하여 목적 단백질의 발현 양을 비교, 분석하였다.

2.3.2. Lactose 농도에 따른 과발현

배양액을 OD600에서 측정하여 0.4 값이 되는 순간 1 M의 lactose를 0.1, 0.5, 1 그리고 5 mM이 되도록 각각 처리하였다. Lactose를 처리하고 4시간 뒤 원심분리를 통하여 배양액 내의 균체를 수집하였으며, 수집한 sample은 protein sample buffer와 섞어 끓임으로써 균체 내의 단백질을 얻은 뒤, SDSPAGE를 수행하여 lactose의 농도에 따른 EGF-CBD 단백질의 과발현을 분석하였다.

2.3.3. Skim milk를 이용한 과발현

pEGF-CBD 균주를 OD600에서 측정하여 0.4에 도달하였을 때, skim milk를 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 그리고 1%가 되도록 각각 첨가하였다. 그리고 4시간 뒤 원심분리를 통하여 균체를 모두 수거하였다. 원심분리로써 모은 균체를 SDS sample buffer에 녹인 후 10분 끓이고, 얼음에 10분간 처리한 뒤에 원심 분리하여 침전물을 제거하고 SDS-PAGE에 loading하여 skim milk 농도에 의한 EGF-CBD 단백질의 발현 양상에 대하여 비교, 분석하였다.

2.4. 불용성 단백질의 가용화
2.4.1. 약염기성 조건에서의 용해도

균주를 OD600=0.4까지 배양한 뒤, IPTG를 이용하여 과발현을 유도하였다. 4시간 배양 후 원심분리를 통하여 균체를 수집한 뒤 50 mM Tris-HCl 완충용액 (pH 8.0)에 다시 녹여 sonication (SONIFIER250)을 사용하여 30% Duty cycle, 3 Output control 조건으로 세포를 파쇄하였다. 파쇄된 세포 용액을 원심 분리하여 가용성 분획과 불용성 분획으로 나누었다. SDSPAGE를 통하여 목적 단백질이 봉입체 형태로 과발현됨을 확인하고 불용성 분획의 단백질을 pH 8.0의 조건하에서 urea와 Gn-HCl을 chaotropic 물질을 사용하여 다양한 농도에서 봉입체의 용해도를 측정하였다.

2.4.2. 알칼리성 pH 내에서의 용해도

EGF-CBD 단백질의 과발현 뒤 원심분리를 통하여 균체를 수집하고 sonication을 사용하여 30% Duty cycle, 3 Output control 조건으로 세포를 파쇄하였다. 파쇄된 세포 용액에서 원심분리를 통하여 봉입체를 수집한 뒤 pH 12.5의 50 mM Tris-HCl를 이용하여 다양한 농도의 urea와 Gn-HCl을 사용하여 봉입체의 용해도를 측정하였다. 200 mL의 배양액에서 수거한 봉입체를 5 mL의 urea 또는 Gn-HCl을 포함하는 50 mM Tris-HCl, pH 12.5 완충용액을 첨가하여 4°C에서 24시간 반응하였다. 24시간 반응 뒤 원심분리를 통하여 가용성 단백질과 불용성 단백질로 분리한 뒤 가용성 단백질의 농도를 bradford 시약으로 반응시켜 OD595에서 흡광도를 측정하여 봉입체의 용해도를 비교하였다.

2.5. 재접힘 조건

봉입체 형태의 EGF-CBD 단백질을 urea를 사용하여 가용성의 형태로 전환한 뒤 투석과정을 달리하여 Ni-NTA affinity column을 이용한 정제를 수행하였다. 하나의 실험군은 50 mM Tris-HCl (pH 8.0)로 투석을 하였으며 다른 대조군은 100 mM urea를 완충용액에 첨가하여 4°C에서 24시간 투석하여 aggregate의 생성유무를 비교하였다 [1]. 또한 affinity column 을 이용한 정제과정 이후에 50 mM Tris-HCl 완충용액 (pH 8.0)을 이용한 투석을 한 번 수행하여 정제후의 aggregate의 생성 유무를 관찰하였다.


3. RESULTS AND DISCUSSION
3.1. 유도물질에 따른 EGF-CBD 단백질의 발현

본 실험에서는 EGF를 포함하는 Vibrio mimicus 유래의 CBD 가 융합된 재조합 단백질을 E. coli에서 대량생산할 때의 생산의 어려움에 관하여 연구하였다. E. coli를 이용한 대량 생산 시, 특히 진핵 세포 유래의 단백질을 대량 생산 시에는 봉입체의 형태로 발현된다는 문제점이 있으며, 이는 유도 물질의 선택과 함께 용해 및 재접힘이라는 생산시의 생산비의 경제적 문제점을 유발한다 [9,11]. 따라서 IPTG를 제외한 유도물질의 검토와 봉입체의 가용화, 그리고 활성 형태로의 재접 힘 조건을 검토하였다. 현재 IPTG의 경우 1 g당 127,000원 (Sigma, USA), lactose는 1 g당 308원 (Sigma, USA) 그리고 skim milk의 경우 1 g당 142원 (Calbiochem, Merck, USA)의 가격을 이루고 있다. 따라서 경제적 면에서 유리한 inducer 후보 물질들의 발현 유도능에 대하여 비교, 분석하였다. EGFCBD 단백질을 과발현시키기 위하여 pEGF-CBD 균주를 ampicillin (100 μg/mL)이 첨가된 LB에서 배양하며 IPTG와 lactose를 처리하여 과발현의 유무를 확인하였다. Negative control로써 IPTG 또는 lactose를 첨가하지 않고 배양한 세포를 사용하여 IPTG 또는 lactose를 처리하였을 때와 비교하였다 (Fig. 1). 유도된 단백질을 제외한 나머지 단백질의 발현양을 동일하게 유지하여 EGF-CBD 단백질의 발현을 비교하였다. OD600=0.4 값 이후에 IPTG와 lactose를 처리함으로써 처리하지 않았을 때보다 ~9 kDa 부근에서 훨씬 많은 양의 EGF-CBD 단백질이 발현됨을 알 수 있었다. 또한 SDS-PAGE 확인 결과, IPTG가 아닌 lactose를 처리함에도 IPTG와 같은 수준의 단백질이 발현됨을 알 수 있었다 (Fig. 1). 그리고 IPTG와 비슷한 온도에서 발현의 증가를 나타내어 IPTG를 대체하여 EGFCBD 단백질의 발현을 유도할 수 있음을 관찰하였다.


Fig. 1. 
Induction of overexpression of recombinant protein using lactose. Lane 1, standard molecular weight proteins; Lane 2, control cell lysate; Lane 3, IPTG treated cell lysate; Lane 4, lactose treated cell lysate.

3.2. Lactose에 의한 단백질 발현 유도
3.2.1. Lactose의 첨가 후 시간에 따른 발현양상

OD600에서 배양액의 현탁도를 측정하여 0.4 값이 되는 순간 1 M의 lactose를 최종농도 1 mM이 되도록 처리한 뒤 1시간 마다 샘플을 수집하여 EGF-CBD 단백질의 발현양을 비교, 분석하였다. 그 결과 lactose를 처리하고 1시간 후부터 EGF-CBD 단백질이 과발현 유도됨을 알 수 있었으며, 2시간 후부터는 과발현 양이 매우 증가하였다 (Fig. 2). 3시간 후부터는 과발현의 양이 시간이 지남에도 큰 차이가 없음을 알 수 있었다.


Fig. 2. 
Comparison of expression levels of recombinant protein induced by lactose over time. Lane 1, standard molecular weight proteins; Lane 2, control cell lysate; Lane 3, after 1 hr; Lane 4, after 2 hr; Lane 5, after 3 hr; Lane 6, after 4 hr; Lane 7, after 5 hr; Lane 8, after 6 hr.

3.2.2. Lactose 농도에 따른 발현양상

1 M의 lactose를 최종농도 0.1, 0.5, 1, 5 그리고 10 mM이 되도록 각각 처리하여 EGF-CBD 단백질의 발현양을 비교, 분석하였다. Lactose를 처리하고 세포 내의 모든 단백질을 얻은 뒤, SDS-PAGE를 수행하여 lactose의 농도에 따른 EGF-CBD 단백질의 과발현 양을 확인하였다 (Fig. 3). SDS-PAGE의 밴드 굵기로 발현 정도를 평가한 결과 본 실험에 사용한 0.1 mM에서 5 mM까지 농도를 달리하여 처리를 하더라도 EGFCBD 단백질의 발현양은 비슷함을 알 수가 있었다.


Fig. 3. 
Comparison of expression levels of recombinant protein induced by lactose of variety concentrations. Lane 1, standard molecular weight proteins; Lane 2, control cell lysate; Lane 3, 0.1 mM; Lane 4, 0.5 mM; Lane 5, 1 mM; Lane 6, 5 mM.

3.3. Skim milk에 의한 단백질 발현 유도

과발현을 위한 유도 물질로써 skim milk를 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 그리고 1%가 되도록 각각 첨가하였다. SDS-PAGE에 sample을 loading 하여 skim milk 처리 및 농도에 의한 EGF-CBD 단백질의 발현에 대하여 비교, 분석하였다. Skim milk를 농도별로 처리 시 EGF-CBD 단백질의 발현은 lactose 또는 IPTG보다 낮은 수준을 보였다. 0.01%의 skim milk를 처리하였을 때는 발현양의 증가를 관찰할 수 없었으며, 0.05 및 0.1%를 각각 처리하였을 때부터 발현양이 증가함을 알 수 있었다. 그리고 0.1% 이상의 skim milk를 처리하였을 때에는 EGF-CBD 단백질의 발현은 증가하지 않았으며, 30 kDa 근처의 다른 단백질의 발현이 증가함을 알 수 있었다 (Fig. 4). 따라서 skim milk의 경우 적합하지 않음을 알 수 있었다.


Fig. 4. 
Comparison of expression levels of recombinant protein induced by skim milk of variety concentrations. Lane 1, standard molecular weight proteins; Lane 2, control cell lysate; Lane 3, 0.01%; Lane 4, 0.05%; Lane 5, 0.1%; Lane 6, 0.5%; Lane 7, 1%.

3.4. pH, urea, Gn-HCl에 따른 봉입체의 가용화
3.4.1. 약염기성 조건에서의 가용화

봉입체의 형태로 발현되는 단백질의 경우 적절한 가용화 물질의 선택과 활성 형태로의 재접힘 조건이 발현단백질의 활성 및 생산가격에 매우 중요하다 [9,11]. 따라서 본 실험에서는 pH 및 chaotropic agent인 urea 그리고 Gn-HCl을 이용한 조건들에 관하여 검토하였다. Sonoda 및 Singh and Panda의 연구 결과에서 인간 성장 호르몬의 경우 산성의 조건에서는 봉입체의 가용화가 거의 일어나지 않음을 알 수 있었다 [9,11]. 따라서 본 연구에서는 약염기성 조건 (pH 8.0)과 염기성 조건 (pH 12.5)에서의 EGF-CBD 단백질의 용해도를 비교하였다.

EGF-CBD 단백질을 과발현 유도 후 원심분리를 통하여 균체를 수집한 뒤 sonication을 이용하여 파쇄하였다. 원심분리하여 가용성 분획과 불용성 분획으로 나누었고 불용성 분획의 단백질을 0, 0.5, 1, 2, 4 그리고 8 M의 urea 또는 Gn-HCl을 포함하는 50 mM Tris-HCl (pH 8.0)을 첨가하여 가용성의 형태로 녹였다. 그리고 원심 분리 후 가용성 단백질을 회수하여 농도를 측정하였다. 기존의 가용화 방법인 6 M의 urea를 이용한 조건을 100%의 기준으로 하였을 때 다양한 용해도를 나타냄을 알 수 있었다 (Fig. 5A). Gn-HCl을 이용한 sample의 용해도는 큰 변화가 없었으며, urea를 사용한 sample들의 경우 urea의 농도가 높아질수록 용해도는 더욱 높아짐을 알 수 있었다. 하지만 8 M urea를 처리하였을 때의 용해도는 4 M 또는 6 M의 urea를 처리하였을 때 보다 낮은 수준을 나타내었다. Urea 4 M이 첨가된 sample에서 최고의 용해도를 나타내었다.


Fig. 5. 
Comparison of solubility of target protein at (A) pH 8.0, (B) pH 12.5 with various concentrations of urea or Gn-HCl buffer.

3.4.2. 알칼리성 pH 조건에서의 가용화

0, 0.5, 1, 2, 4 그리고 8 M의 urea 또는 Gn-HCl을 포함하는 pH 12.5의 50 mM Tris-HCl를 이용하여 봉입체의 용해도를 측정하였다 (Fig. 5B). Gn-HCl의 경우 첨가 농도가 증가할수록 봉입체의 용해도는 더욱 감소하였다. 하지만 urea를 이용하여 봉입체를 용해하였을 때에는 Gn-HCl 또는 50 mM Tris-HCl (pH 8.0)만을 처리하였을 때 보다 높은 용해도를 나타내었다. Urea를 0.5 또는 1 M의 농도로 처리하였을 때 가장 높은 용해도를 나타내었으며, 농도가 높아질수록 용해도는 더욱 감소하였다.

가용화의 결과는 Gn-HCl을 이용한 완충용액보다는 urea를 이용한 완충용액에서 보다 높은 용해도를 확인할 수 있었으며, 약염기성 완충용액 (pH 8)보다는 pH 12.5에서 봉입체의 용해도가 훨씬 높음을 알 수 있었다.

3.5. 봉입체의 활성화를 위한 재접힘

봉입체 형태로 발현된 EGF-CBD 단백질의 활성을 회복하기 위한 재접힘은 20 mM Tris-HCl (pH 8.0) 및 100 mM의 urea를 포함하는 완충용액을 사용하여 투석하였다. 그 결과 100 mM urea가 포함된 20 mM Tris-HCl로 투석시 aggregation이 발생 하였다. 하지만 20 mM Tris-HCl만을 처리하였을 때에는 aggregation이 일어나지 않아 가용화 상태를 유지함을 알 수 있었다.

Affinity column을 이용하여 EGF-CBD 단백질을 분리하였다. 분리한 단백질을 20 mM Tris-HCl (pH 8.0)을 이용하여 투석을 한 sample과 투석을 하지 않은 sample을 4°C에 보관시 투석을 하지 않은 sample에서는 EGF-CBD 단백질의 aggregation이 발생하였다.


4. CONCLUSION

이전 연구 과정에서, human epidermal growth factor와 collagen binding domain이 결합된 융합단백질을 E. coli와 pET 발현 체계을 이용하여 생산하였다. 하지만 E. coli에서 생산된 재조합 융합 단백질은 세포질에서 발현되어 불용성의 aggregate 형태인 봉입체로 존재함을 알 수 있었다. 따라서 재조합 단백질을 활성을 가지는 형태로 분리하기 위해서는 적절한 변성 및 투석 과정을 통하여 봉입체의 가용화 및 재접힘이 매우 중요하다. 본 연구에서는 다양한 chemical agent와 완충용액 조건을 달리하여 EGF-CBD 단백질의 발현, 변성, 그리고 투석을 통한 재접힘을 수행하였다. isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)와 같은 유도 물질 대신에 lactose와 skim milk를 이용하여 융합단백질의 과발현의 유무를 실험하였으며, 그 결과 lactose를 이용하여 성공적으로 과발현을 유도할 수 있었다. 이렇게 발현된 봉입체의 가용성을 위하여 pH 및 다양한 농도의 chaotropic agent를 이용하여 용해도를 측정하였다. 약염기성의 조건 (pH 8)보다는 알칼리성의 조건 (pH 12.5)에서 봉입체의 용해도가 더욱 높았으며, guanidine hydrochloride (Gn-HCl)보다는 urea를 이용한 변성 과정에서 용해도가 높았다. 봉입체의 재접힘을 위한 완충용액으로는 20 mM Tris-HCl (pH 8.0)이 효과적이였다.


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